一種與腫瘤易感性相關的單核苷酸多態性位點及其應用的製作方法

2023-12-09 06:28:56 5

專利名稱：：一種與腫瘤易感性相關的單核苷酸多態性位點及其應用的製作方法一種與腫瘤易感性相關的苷酸多態性位點及其應用
技術領域：
：本發明涉及一個與腫瘤易感性相關的苷酸多態性位點及其應用，屬於生命科^^:領域。背景駄腫瘤的^fe涉及環境、遺傳、生活飲食習慣等多種因氣具體到正常細胞轉化為癌細胞的過程，又與癌基因的歡活、抑癌基因的失活、細胞凋亡、細鵬期、信號轉導、DNA修復^基因的突^w關。隨著各種^生物學s^的成熟，研究人員己發現了大量與腫瘤s^m^相關的基因。基因在決定個體表型方面皿決定性作用，i!31賦予個體對疾病的易感性或皿力，以及影響機,環境因素的相互作用，基因對疾病的a^著間接皿接作用。最近大量的研究表明細胞端粒酶激活是多數惡魁中瘤發生的先決條件。端粒酶在惡'翻中瘤組織汲相落細胞中檢出率很高，由於端豐魏短和端粒酶無活性，體細M常逐,老死亡。僅有極少數細胞偶然ffl3i撒活端粒酶而M,性老化，其生存延長可能給另外的基因損傷的積累提供機會，導miS行性腫瘤性發展[2]。在大多數癌細胞系和腫瘤細胞中端粒酶均有高7]C平表達[3]。表明糹辭立酶的激活敏與細胞的無限增歹節密切絲，M^除細臓^31程中的增生受限，端粒酶的重新活化可能是體細胞向腫瘤轉化的，步驟。機體對各種慢性損傷的抗爭能力是有明顯個體差異的。誠差異的遺傳物質基te—就礦泛雜於基因中的SNPs。SNPs的存在並不直髓鵬胞的癌，中瘤的發生，但可能會賦予個體對某種特殊的環境因素易感。例如p53基因是，的細胞周期、凋亡調節基因，皿，鍵位點的突頓以直J魏成細胞增殖的異常。而在p53基因非熱點區，如72位密碼子的點突變(C《)會造成編碼胺基酸的改變(Pro—Arg)。這種多態性在自然人群中有一定的分布，並不直麟成細胞的癌變。因此在本發明中選擇TERT基因作為所研究的基因。同時選擇TERT基因上的SNP位點為所研究的方向。
發明內容本發明的目的^IM"^f立酶(telomerasereversetranscriptase,TERT)基因上的單^^酸多態性位點rs2736098謝辦異性的研究，提出一個可作為在判定腫瘤易感人群的方法中應用的易感SNP位點，以利於指導腫瘤的預防和治療。本發明所述的與腫瘤易感性相關的TERT基因序列，，苷,列如序列^0f示，皿428位為A。所述的與腫瘤易感性相關的TERT基因上的靴苷酸多態性位點，MlNCBIim庫，按常規方、織得，該基因餅列長度為41878bp的TERT基因；該基因的一糊苷酸多態性是rs2736098,rs2736098位於2號外顯子；rs2736098鹼基為G突變為A;rs2736098的SNP序列，為CCATCCGTGGGCCGCCAGCACCACGC[A/G]GGCCCCCCATCCACATCGCGGCCAC。獲得rs2736098SNP序列的具體步驟如下MMhttp:〃麗.ncbi.nlm.gov/snp繊庫，在TERT基因J^擇報苷酸多態性rs2736098;依據相應的鹼基序列合成引物5'—CGMGAAGCCACCTCTTTGGA—3'和5,—MGTGCTTGGTCTCGGCGTAC—3';PCR反應體系25(4:2.5|410XTaqBuffer，2Ml2.5mMdNTP，1|410mMPrimer，TemplateDNA，0.2uTaq，用(1(20補足25|4;PCR鵬^f牛94。C8min;94。C40sec，57°C30sec，72°Clmin，35個循環；72°C10min;擴增，為168bp，用2%的瓊月旨糖凝膠電泳，溴化乙,色檢測(見圖l)。戶艦的與腫瘤易感性相關的TERT基因序歹啲應用，fflim取^^基因組DNA進行雜苷酸多態性rs2736098的基因分型，其中rs2736098鵬為A的個體為腫瘤的易感人群。本發明的儲和積極鄉本發明的研究結果表明TERT基因劍中瘤相關的易感基因，rs2736098自為A的個體腫瘤易感性高，該對亥苷酸多態性位點可作為在判定腫瘤的易感人群的方法。圖1是顯示多態性位點rs2736098的序列擴增圖，其中，M為DNA舒量標準，1為PCR，。具條Jfc^實施例1.51取^#基因組DNA進行TO苷酸多態性rs2736098的基因分型，其中rs2736098鹼基為A的個體為腫瘤的易感人群。具體作腿-1.基因組DNA的提取Si^^J由夕卜周靜脈抽她2-3ml，翻酚氯份鵬取其基因組DNA，-70。C保存。2.PCR擴增目的片斷用以下引物5'—CGMGMGCCACCTCTTTGGA—3'禾口'一AAGTGCTTGGTCTCGGCGTAC—3'。PCR反應體系(25Pl):10XTaqBuffer，2rt2.5mMdNTP，lOmMPrimer，TemplateDNA，0.2uTaq，用ddH20補足。PCR鵬^f牛94。C8min;94。C40sec，57。C30sec，72。Clmin(35個循環)；72。C10min。擴增^為168bp，用2%的瓊月|^繊電泳，溴化乙錠^fe檢測(見圖1)。3.基因分型採用點雜交的方法進行基因分型。具#^、法如下將合成的寡核^W1E自同濃度點^M;W±，敏紫夕卜3min使樣品與辭固結合，鵬4。C備用。雜交袋(內含晶片一張)加300ul雜交液(注意^St到膜，將氣、艦走)然後將雜交翻封口豐旭寸好，在45。C斜牛下雜交30min。取PCR產物5-10ul，在10(TC7K浴中變性5min，立即冰浴5min。將，交^M^交箱中取出，將雜魏剪^f鬥口，輕^f到出予賺交液，辦300ul雜交液與變性探針一起加到雜交袋中，趕走氣泡將雜^if好，放到雜交箱中，45'C雜^1夜。將雜，中的晶片取出，室溫下用2XSSC/0.1%SDS洗兩次，每次2min。然後用0.2XSSC/0.1%SDS，42。C下洗兩次，每次3min。TNT溶液洗5min。將晶片平方JtA乾淨的塑膠袋中，力口入10X封閉液20iU，TN180ul，混勻，37。C30min。塑膠袋中的封閉液，然後加入新的10X封閉液20ul、TN180ul、P0D抗體0.3ul，輕輕混勻，37°C30min。將晶片從袋中取出，TNT漂洗3次，每次3min。將膜^A乾淨塑膠袋中，取DAB顯色液6P1，DAB繊液6u1、雙蒸7jC288y1，混勻後，立即加A^中，待顯fe^i通想^i^(一MM色10併中左右)，用1XPBS終lh&應。4.結果判定rs2736098MS為A的個體為腫瘤易感人群。r~s2736098M為G的個體為腫瘤非易感人群。^S例2、易ii基因的應用本研究以33例腫瘤患者為研究組，以33例非腫瘤患者為對照組。研^1且和對照組的^#均由夕卜周靜l/細血2-3ml，採用酚氯仿鵬取基因組DNA，-7(TC保存。病例-對照組研究結果顯示對照組(33人)和研究組(33人)中rs2736098位點基因型M、GG+AG分別為0、1.000和0.152、0.848(表2);TERT基因rs2736098鹼基為A的個體腫瘤易感性高。_表2基因型分布與^^基因頻率tableseeoriginaldocumentpage6根據本發明由TERT基因iS突，異性判定腫瘤的易感人群的方法，可對*^測中瘤臨床症狀的人群進，f^種方法的篩査rs2736098MS為A的個體為腫瘤易感人群。對腫瘤易感人S^曰常生活中鵬量^>誘發因氣可斷劃中瘤的發病率。根據本發明，可根據患者的基因型決定€^^@的拋中瘤藥物或者採用如基因敲^#因工程方,行有針對性的基因治療。TERT基因的^S突變，可倉,蛋白質^ii^功能異常。序列表〈110〉南開大學〈120〉一種與腫瘤易感性相關的靴苷酸多態性位點及其應用〈130〉〈160〉1〈170〉Patentlnversion3.1〈210〉1〈211〉850〈212〉DNA〈213〉Homosapiens〈220〉〈221〉1〈222〉(1)(850)〈400〉1cggacgggggtctgtgtcctcctcctcgggggccgccacagagccctggggcttctcccg60ggcacagacaccggctgctggggtgaccgcagctcgcagcgggcagtgcgtcttgaggag120caccccgtaggggcactgcgcgtggttcccaagcagctccagaaacaggggccgcatttg180ccagtagcgctggggcaggcggggcaacctgcggggagtccctggcatccagggcctgga240acccagaaagatggtctccacgagcctccgagcgccagtcaggctgggcctcagagagct300gagtaggaaggagggccgcagctgctccttgtcgcctgaggagtagaggaagtgcttggt360ctcggcgtacaccgggggacaaggcgtgtcccagggacgtggtggccgcgatgtggatgg420ggggcccgcgtggtgctggcggcccacggatgggtgggagtggcgcgtgcc卿gagcgc480accctccaaagaggtggcttcttcggcgggtctggcaggtgacaccacacagaaaccacg540gccactcggtccacgcgtcctgcccgggtgggcccaggacccctgcccaacgggcgtccg600ctccggctcaggggcagcgccacgcctgggcctcttgggcaacggcagacttcggctggc660actgcccccgcgcctcctcgcacccggggctggcaggcccagggggaccccggcctccct720gacgctatggttccaggcccgttcgcatcccagacgccttcggggtccactagcgtgtgg780cgggggccggggcctgagtggcagcgccgagctggtacagcggcggcccgcacacctggt840aggcgcagct850權利要求1、一種與腫瘤易感性相關的端粒酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)基因部分序列，其核苷酸序列如序列表所示，且第428位為A。2、根據權利要求1所述的與腫瘤易感性相關的TERT基因序列，辦徵在於，所述的與腫瘤易感性相關的TERT基因上的對雜酸多態性位點，通過NCBI資料庫，按常規方法獲得，該基因，列長度為41878bp的TERT基因；該基因的一單核苷酸多態性是rs2736098，rs2736098位於2號外顯子；rs2736098,為G突變為A;rs2736098的SNP序列為CCATCCGTGGGCCGCCAGCACCACGC[A/G]GGCCCCCCATCCACATCGCGGCCAC。3、根據權利要求2所述的與腫瘤易感性相關的TERT基因序列，其特徵在於，獲得rs2736098SNP序列的具體步驟如下通過http://www.ncbi.nlm.gov/snp資料庫，在TERT基因上選擇單核苷酸多態性rs2736098;依據相應的liS序列合成弓l物CGMGAAGCCACCTCTTTGGA和MGTGCTTGGTCTCGGCGTAC;PCR反應體系25μl:25μl10XTaqBuffer，2μl2.5mMdNTP，1μl10mMPrimer,1μlTemplateDNA，0.2uTaq，用ddH20補足25W;PCR反應件94°C8min;94°C40sec，57°C30sec，72°Clmin，35個循環；72°C10min;擴增,為168bp，用2%的瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠鵬檢測。4、一種權利要求1所述的與腫瘤易感性相關的TERT基因序列的應用，其特徵在於，通過提取受試者基因組DNA進行單核苷酸多態性rs2736098的基因分型，其中rs2736098自為A的個體為腫瘤的易感人群。全文摘要本發明涉及一種與腫瘤易感性相關的單核苷酸多態性位點及其應用，屬生命科學
技術領域：
。本發明的易感基因通過NCBI資料庫，按常規方法獲得，該易感基因是序列長度為41878bp的端粒酶(telomerasereversetranscriptase，TERT)基因；所研究的單核苷酸多態性是rs2736098，rs2736098位於2號外顯子；rs2736098鹼基為G突變為A。該易感基因作為在判定腫瘤的易感人群的方法中的應用。當rs2736098鹼基為A個體腫瘤易感性高、rs2736098鹼基為G的個體為不易發腫瘤。本發明的TERT基因上的該SNP位點對研究腫瘤易感性及建立基因診斷方法，指導腫瘤預防、開發新型治療腫瘤的藥物具有重要作用。文檔編號C12N15/54GK101200729SQ20071015011公開日2008年6月18日申請日期2007年11月9日優先權日2007年11月9日發明者虹倪,榮向,張朋軍,麗梁,影胡,英邢申請人:南開大學