可實現豬血清白蛋白鑑定及絕對定量的試劑盒及測定方法與流程
2023-10-09 14:55:54
本發明涉及一種可實現豬血清白蛋白鑑定及絕對定量的檢測試劑盒及測定方法，屬於檢驗測定技術領域。
背景技術：
血清白蛋白約佔血漿總蛋白的40～60％，是血漿中主要載體，起維持滲透壓、pH緩衝、載體和營養作用，許多水溶性差的物質可以通過與其結合而被運輸，如，膽紅素、長鏈脂肪酸、膽汁酸鹽、前列腺素、類固醇激素、金屬離子及藥物等。有關檢測血清白蛋白的檢測方法有免疫雙擴散法、免疫電泳法、雙縮尿法、鎢酸沉澱法和毛細管電泳法等。這些方法有易汙染、背景值高的缺點，常使檢測靈敏度降低，並且特異性較差；高壓毛細管電泳法雖有較高準確度，但常易受到分子量大小接近的蛋白幹擾，使檢測特異性、靈敏度降低，並且檢測時間較長，不適合痕/微量羊血清白蛋白的檢測。目前，關於檢測豬血清白蛋白的特異性方法報導較少。
技術實現要素：
技術問題：本發明的目的是提供一種豬血清白蛋白檢測試劑盒，給出一種採用本試劑盒可以克服現有技術缺點的豬血清白蛋白的鑑定和含量測定的方法。該試劑盒給出了檢測豬血清白蛋白的標準物質和對含血清白蛋白樣品進行酶解反應的反應試劑。可將標準物質和/或酶解反應產物(或含內標物質)注入(超)高效液相色譜-質譜儀中進行豬血清白蛋白含量測定。本發明提供了一種專屬性強、精密度高、結果準確可靠、操作簡便，可在臨床上用於樣品中豬血清白蛋白含量測定的一種檢測試劑盒及檢測方法。
技術方案：
一種可實現豬血清白蛋白鑑定及絕對定量的試劑盒，其特徵在於：包括標準物質：
標準物質包括特徵肽段及其內標肽段，肽段序列為：
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
組合方式如下：
(1)、所述標準物質特徵肽段單獨使用，或與其他特徵肽段配成兩種或多種混合特徵肽段使用；
(2)、內標肽段單獨使用，或與其他特徵肽段配成兩種或多種混合內標物質使用；
(3)、所述標準物質特徵肽段與其內標肽段配成的內標物質，是單一內標物質、雙混合內標物質或多混合內標物質，使用其中的一種、兩種或多種；
(4)、內標肽段與其他內標肽段配成兩種或多種混合使用。
該試劑盒還包括反應試劑：
反應試劑，由以下成分組成
1)標準物質
①用以實現本發明試劑盒的標準物質是特徵肽段，是單一標準物質，或配成雙混合標準物質或多混合標準物質，使用其中的一種或多種；
單一標準物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
單一標準物質II
特徵肽段2 ADFTEISK
單一標準物質III
特徵肽段3 LGLVGSR
雙混合標準物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
雙混合標準物質II
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
雙混合標準物質III
特徵肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
三混合標準物質
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
②用以實現本發明試劑盒的內標肽段是單一內標肽段，或配成多混合內標肽段，使用其中的一種、兩種或多種；
單一內標肽段I
內標肽段1 DLGEQYFK
單一內標肽段II
內標肽段2 ADFTEISK
單一內標肽段III
內標肽段3 LGLVGSR
雙混合內標肽段I
內標肽段1 DLGEQYFK
內標肽段2 ADFTEISK
雙混合內標肽段II
內標肽段1 DLGEQYFK
內標肽段3 LGLVGSR
雙混合內標肽段III
內標肽段2 ADFTEISK
內標肽段3 LGLVGSR
三混合內標肽段
內標肽段1 DLGEQYFK
內標肽段2 ADFTEISK
內標肽段3 LGLVGSR
③將上述特徵肽段與其內標肽段聯合使用，是單一內標物質、雙混合內標物質或多混合內標物質，使用其中的一種、兩種或多種；
單一內標物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
單一內標物質II
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
單一內標物質III
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
單一內標物質IV
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
單一內標物質V
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
單一內標物質VI
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段1 DLGEQYFK
單一內標物質VII
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
單一內標物質VIII
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
特徵肽段1 DLGEQYFK
單一內標物質IX
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
雙混合內標物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
雙混合內標物質II
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
雙混合內標物質III
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
雙混合內標物質IV
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
雙混合內標物質V
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
特徵肽段2 ADFTEISK
雙混合內標物質VI
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
特徵肽段1 DLGEQYFK
三混合內標物質
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
④用以實現本發明方法的豬血清白蛋白檢測試劑盒中的標準物質是單劑、或是雙劑或多劑，根據上述方法自由組合或選擇其中的一種、兩種或多種。
所述標準物質的內標肽段是特徵肽段中任一、二或多個胺基酸上的C、H、O、N被同位素標記後的肽段，其中，一個胺基酸上的C、H、O、N四個元素可同時被標記，或任意1～3個元素被標記。
所述標準物質配成單劑、雙劑或多劑。
所述胰蛋白酶為序列級胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一種。
所述反應試劑配成單劑。
利用上述的可實現豬血清白蛋白鑑定及絕對定量的試劑盒所實施的豬血清白蛋白含量測定方法，其特徵在於：該方法步驟如下：
(1)將樣品加入碳酸氫銨，渦旋，加入二硫蘇糖醇，溫育振蕩，再加入碘乙醯胺，溫育振蕩，放置至室溫後，再加入胰蛋白酶，溫育振蕩，最後加入甲酸終止反應。
(2)將標準物質和(1)步驟中最終酶解產物分別注入高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測或將內標物質和(1)步驟中最終酶解產物(含內標肽段)分別注入高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，檢測後通過母離子和子離子的質荷比(m/z)及特徵肽段的保留時間(tR)進行定性鑑別，色譜峰峰面積變化測算出豬血清白蛋白的絕對含量。
溫度控制在25～60℃範圍，溫育時間控制在0.5～12h，振蕩頻率控制在800～2500rmp，渦旋時間控制在2～10min，室溫控制在18-22℃範圍。
胰蛋白酶與被測樣品總蛋白量比例控制在1/1到1/100。
所述步驟(2)為：將特徵肽段(一種或兩種)和(1)步驟中最終酶解產物分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，或將內標物質和(1)步驟中最終酶解產物(含內標肽段)分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，通過m/z和tR進行定性，色譜峰峰面積變化測算出豬血清白蛋白的含量。
有益效果：本發明具有的有益效果為：本發明提供的檢測試劑盒和檢測方法能對樣品中豬血清白蛋白進行準確靈敏的定性和絕對定量，具有特異性強、靈敏度高、結果準確、操作簡便等優點，可用於豬肉/血旺及其製品中豬血清白蛋白的檢測。
本發明包括標準物質(由特徵肽段及其內標肽段組成)和酶解反應試劑；採用(超)高效液相色譜-串聯質譜儀進行檢測，這是一類採用高效液相色譜分離，串聯質譜檢測碎片離子的設備，能快速、精確、靈敏的對微/痕量的豬血清白蛋白進行絕對定量。該方法具有操作簡便、特異性強、靈敏度和準確度高的特點。
目前，尚未開發出測定豬血清白蛋白含量的特徵肽段及其內標肽段和酶解反應試劑的試劑盒。本發明成功的彌補了生物檢測領域的不足，能準確地對含微/痕量豬血清白蛋白的樣品進行絕對定性鑑別及絕對定量，具有特異性強、操作簡便、靈敏度和準確度高的優點。
附圖說明：
圖1為特徵肽段1的二級質譜圖(m/z＝500.2)
圖2為特徵肽段2的二級質譜圖(m/z＝455.7)
圖3為特徵肽段3的二級質譜圖(m/z＝351.2)
具體實施方式
通過以下實施例進一步說明本發明，但本發明的權利要求不僅限於實施例。
本發明包括豬血清白蛋白檢測試劑盒和含量測定方法兩部分。
豬血清白蛋白檢測試劑盒由標準物質和反應試劑兩部分組成：
1)標準物質
①用以實現本發明試劑盒的標準物質是特徵肽段，可以是單一標準物質，或配成雙混合標準物質或多混合標準物質，可使用其中的一種或多種。
單一標準物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
單一標準物質II
特徵肽段2 ADFTEISK
單一標準物質III
特徵肽段3 LGLVGSR
雙混合標準物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
雙混合標準物質II
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
雙混合標準物質III
特徵肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
三混合標準物質
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
②用以實現本發明試劑盒的內標肽段(任一、二或多個胺基酸上的C、H、O或/和N被同位素標記)，可以是單一內標肽段，或配成多混合內標肽段，可使用其中的一種、兩種或多種。
單一內標肽段I
內標肽段1 DLGEQYFK
單一內標肽段II
內標肽段2 ADFTEISK
單一內標肽段III
內標肽段3 LGLVGSR
雙混合內標肽段I
內標肽段1 DLGEQYFK
內標肽段2 ADFTEISK
雙混合內標肽段II
內標肽段1 DLGEQYFK
內標肽段3 LGLVGSR
雙混合內標肽段III
內標肽段2 ADFTEISK
內標肽段3 LGLVGSR
三混合內標肽段
內標肽段1 DLGEQYFK
內標肽段2 ADFTEISK
內標肽段3 LGLVGSR
③將上述特徵肽段與其內標肽段聯合使用，以下簡稱「內標物質」，更有利於豬血清白蛋白的定性和定量檢測。可以是單一內標物質、雙混合內標物質或多混合內標物質，可使用其中的一種、兩種或多種。
單一內標物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
單一內標物質II
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
單一內標物質III
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
單一內標物質IV
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
單一內標物質V
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
單一內標物質VI
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段1 DLGEQYFK
單一內標物質VII
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
單一內標物質VIII
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
特徵肽段1 DLGEQYFK
單一內標物質IX
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
雙混合內標物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
雙混合內標物質II
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
雙混合內標物質III
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
雙混合內標物質IV
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
雙混合內標物質V
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
特徵肽段2 ADFTEISK
雙混合內標物質VI
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
特徵肽段1 DLGEQYFK
三混合內標物質
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
④用以實現本發明方法的豬血清白蛋白檢測試劑盒中的標準物質可以是單劑、也可以是雙劑或多劑，可根據上述方法自由組合或選擇其中的一種、兩種或多種。
(2)反應試劑，用以實現本發明方法的反應試劑是單劑，包括：
本發明測定豬血清白蛋白含量的步驟如下：
(1)將樣品加入碳酸氫銨，振蕩混勻，加入二硫蘇糖醇，溫育振蕩，再加入碘乙醯胺，溫育振蕩，放置至室溫後，再加入胰蛋白酶，溫育振蕩，最後加入甲酸終止反應。
(2)將標準物質(或內標物質)和最終酶解產物(或含內標物質)分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，通過m/z和tR進行定性鑑別，色譜峰峰面積變化測算出樣品中豬血清白蛋白的含量。
通常步驟(1)溫育溫度控制在25～60℃範圍，溫育時間控制在0.5～12h，振蕩頻率控制在800～2500rmp。胰蛋白酶與被測樣品總蛋白量比例控制在1/1到1/100，渦旋時間控制在2～10min。
所述步驟(2)將特徵肽段(一種或兩種)和最終酶解產物分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，或將內標物質和最終酶解產物(含內標肽段)分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，通過m/z及tR進行定性鑑別，通過色譜峰峰面積變化，採用內標法或外標法測算出樣品中豬血清白蛋白的含量。
實施例1：
樣品：豬肉
雙混合內標物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
雙混合內標肽段I
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
(1)樣品的製備：取豬肉0.1g，加入1ml細胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入雙混合內標肽段I，加100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1000rmp)5min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液150μL，60℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫後，加入100mmol/L碘代乙醯胺溶液400μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)30min，加入5mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，50℃溫育振蕩(1000rmp)60min，放置至室溫後，加入10％甲酸水溶液300μL，終止反應，冷凍乾燥，得到最終酶解產物。
(2)將雙混合內標物質I和最終酶解產物分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測。特徵肽段1的檢出限為1ng，特徵肽段2的檢出限為2ng，相對標準偏差小於1.26％，回收率為94.3％～98.0％(n＝6)。
實施例2：
樣品：豬肉乾
單一內標物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
單一內標肽段I：
內標肽段1 DLGEQYFK
(1)樣品的製備：取豬肉乾0.1g，加入1ml細胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入內標肽段I，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1200rmp)2min，加入150mmol/L二硫蘇糖醇溶液300μL，60℃溫育振蕩(1200rmp)30min，放置至室溫後，加入40mmol/L碘代乙醯胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1200rmp)40min，加入5mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，55℃振蕩(1500rmp)溫育45min，放置至室溫後，加入20％甲酸水溶液50μL，終止反應，冷凍乾燥，得到最終酶解產物。
2)將單一內標物質I和最終酶解產物分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，檢出限為1ng，相對標準偏差小於3.14％，回收率為95.3％～100.8％(n＝6)。
實施例3：
樣品：豬血旺
雙混合標準物質II
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
1)取豬血旺0.2g，加入1ml細胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1000rmp)5min，加入150mmol/L二硫蘇糖醇溶液100μL，50℃溫育振蕩(1200rmp)25min，放置至室溫後，加入40mmol/L碘代乙醯胺溶液500μL，35℃溫育振蕩(1000rmp)2h，加入3mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，35℃溫育振蕩(1500rmp)4h，放置至室溫後，加入20％甲酸水溶液100μL，終止反應，冷凍乾燥，得到最終酶解產物。
2)將雙混合標準物質和最終酶解產物分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，特徵肽段1為1ng，特徵肽段3的檢出限3ng，相對標準偏差小於4.14％，回收率為95.7％～98.4％(n＝6)。
實施例4：
樣品：豬肉香腸
三混合內標物質
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
三混合內標肽段：
內標肽段1 DLGEQYFK
內標肽段2 ADFTEISK
內標肽段3 LGLVGSR
1)樣品的製備：取0.2g豬肉香腸，加入1ml細胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入三混合內標肽段，加入50mmol/L碳酸氫銨溶液1000μL，渦旋(800rmp)10min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液300μL，50℃溫育振蕩(1500rmp)3h，放置至室溫後，加入100mmol/L碘代乙醯胺溶液500μL，25℃溫育振蕩(2500rmp)30min，加入1mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，55℃振蕩(1500rmp)溫育180min，放置至室溫後，加入5％甲酸水溶液500μL，終止反應，冷凍乾燥，得到最終酶解產物。
2)將三混合內標物質和最終酶解產物分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，特徵肽段1、2和3的檢出限均為2ng，相對標準偏差小於4.21％，回收率為93.8～96.7％(n＝6)。
實施例5：
樣品：豬肉火腿
單一標準物質I
特徵肽段1 DLGEQYFK
單一標準物質II
特徵肽段2 ADFTEISK
單一標準物質III
特徵肽段3 LGLVGSR
單一內標肽段III
內標肽段3 LGLVGSR
1)樣品的製備：取豬肉火腿0.2g，加入1ml細胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內標肽段III，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(1000rmp)6min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液100μL，55℃溫育振蕩(1200rmp)30min，放置至室溫後，加入50mmol/L碘代乙醯胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)50min，加入3mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，35℃溫育振蕩(1800rmp)10h，放置至室溫後，加入5％甲酸水溶液500μL，終止反應，冷凍乾燥，得到最終酶解產物。
2)將單一標準物質I、II、III與單一內標肽段III混合後，與最終酶解產物分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，特徵肽段3檢出限為1ng，相對標準偏差小於1.23％，回收率為94.5％～97.6％(n＝6)，特徵肽段1和2作為佐證肽段。
實施例6：
樣品：豬血清
雙混合內標物質V
特徵肽段1 DLGEQYFK
內標肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
內標肽段3 LGLVGSR
特徵肽段2 ADFTEISK
雙混合內標肽段II
內標肽段1 DLGEQYFK
內標肽段3 LGLVGSR
1)樣品的製備：取豬血清0.1ml，加入1ml細胞裂解液，超聲破碎1min，冰浴裂解2h，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入雙混合內標肽段II，加入50mmol/L碳酸氫銨溶液1000μL，渦旋(1000rmp)6min，加入100mmol/L二硫蘇糖醇溶液100μL，55℃溫育振蕩(1200rmp)30min，放置至室溫後，加入50mmol/L碘代乙醯胺溶液500μL，30℃溫育振蕩(1000rmp)50min，加入5mg/ml胰蛋白酶溶液100μL，55℃溫育振蕩(1800rmp)3.5h，放置至室溫後，加入10％甲酸水溶液500μL，終止反應，冷凍乾燥，得到最終酶解產物。
2)將雙混合內標物質V與最終酶解產物分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，特徵肽段1和3檢出限為1ng，相對標準偏差小於3.68％，回收率為94.3％～98.2％(n＝6)，特徵肽段2作為佐證肽段。
實施例6：
樣品：豬血
單一內標物質VII
特徵肽段2 ADFTEISK
內標肽段2 ADFTEISK
特徵肽段1 DLGEQYFK
特徵肽段3 LGLVGSR
單一內標肽段I
內標肽段1 DLGEQYFK
單一內標肽段II
內標肽段2 ADFTEISK
單一內標肽段III
內標肽段3 LGLVGSR
1)樣品的製備：取0.2ml豬血，加入1ml細胞裂解液，超聲處理5min，精密吸取400μL勻漿液，加入1.6ml甲醇，離心(2000rpm)，棄取上清液，殘渣加入單一內標肽段I、II和III，加入100mmol/L碳酸氫銨溶液800μL，渦旋(800rmp)5min，加入400mmol/L二硫蘇糖醇溶液500μL，60℃溫育振蕩(2000rmp)3h，放置至室溫後，加入100mmol/L碘代乙醯胺溶液500μL，35℃溫育振蕩(2500rmp)30min，加入5mg/ml胰蛋白酶溶液200μL，55℃振蕩(1500rmp)溫育240min，放置至室溫後，加入10％甲酸水溶液600μL，終止反應，冷凍乾燥，得到最終酶解產物。
2)將單一內標物質VII|與單一內標肽段I和III混合後，與最終酶解產物分別注入(超)高效液相色譜-串聯質譜儀中檢測，特徵肽段1、2和3的檢出限均為2ng，相對標準偏差小於3.10％，回收率為93.4～98.1％(n＝6)。
以上實施例中：標準物質特徵肽段單獨使用或與其他特徵肽段配成兩種、三種混合標準物質使用。
標準物質特徵肽段與其內標肽段配成的內標物質，可以是單一內標物質、雙混合內標物質或三混合內標物質，可使用其中的一種、兩種或三種。
標準物質配成單劑、雙劑或多劑。
所述胰蛋白酶為序列級胰蛋白酶、胰蛋白酶中的至少一種。上述替換的實施例在這裡不做贅述。
總之，實驗證明，採用本發明的檢測試劑盒完全可以對樣品中豬血清白蛋白進行鑑定，並得出所需的絕對含量測定結果，並且靈敏度高、特異性好、精密度高、不受內、外源物質的汙染。
本發明的檢測試劑盒及檢測方法具有專屬性強、精密度高、結果準確可靠、操作簡便等優點，可用於樣品中豬血清白蛋白含量測定。
蛋白序列
豬血清白蛋白
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDTYKSEIAHRFKDLGEQYFKGLVLIAFSQHLQQCPYEEHVKLVREVTEFAKTCVADESAENCDKSIHTLFGDKLCAIPSLREHYGDLADCCEKEEPERNECFLQHKNDNPDIPKLKPDPVALCADFQEDEQKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYAIIYKDVFSECCQAADKAACLLPKIEHLREKVLTSAAKQRLKCASIQKFGERAFKAWSLARLSQRFPKADFTEISKIVTDLAKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDTISTKLKECCDKPLLEKSHCIAEAKRDELPADLNPLEHDFVEDKEVCKNYKEAKHVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRIAKIYEATLEDCCAKEDPPACYATVFDKFQPLVDEPKNLIKQNCELFEKLGEYGFQNALIVRYTKKVPQVSTPTLVEVARKLGLVGSRCCKRPEEERLSCAEDYLSLVLNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYKPKEFVEGTFTFHADLCTLPEDEKQIKKQTALVELLKHKPHATEEQLRTVLGNFAAFVQKCCAAPDHEACFAVEGPKFVIEIRGILA
豬血清白蛋白
MKWVTFISLLFLFSSAYSRGVFRRDTYKSEIAHRFKDLGEQYFKGLVLIAFSQHLQQCPYEEHVKLVREVTEFAKTCVADESAENCDKSIHTLFGDKLCAIPSLREHYGDLADCCEKEEPERNECFLQHKNDNPDIPKLKPDPVALCADFQEDEQKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLYYAIIYKDVFSECCQAADKAACLLPKIEHLREKVLTSAAKQRLKCASIQKFGERAFKAWSLARLSQRFPKADFTEISKIVTDLAKVHKECCHGDLLECADDRADLAKYICENQDTISTKLKECCDKPLLEKSHCIAEAKRDELPADLNPLEHDFVEDKEVCKNYKEAKHVFLGTFLYEYSRRHPDYSVSLLLRIAKIYEATLEDCCAKEDPPACYATVFDKFQPLVDEPKNLIKQNCELFEKLGEYGFQNALIVRYTKKVPQVSTPTLVEVARKLGLVGSRCCKRPEEERLSCAEDYLSLVLNRLCVLHEKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSALTPDETYKPKEFVEGTFTFHADLCTLPEDEKQIKKQTALVELLKHKPHATEEQLRTVLGNFAAFVQKCCAAPDHEACFAVEGPKFVIEIRGILA