一種新的蚓激酶基因突變體的製作方法
2023-10-09 08:45:09 1
專利名稱：一種新的蚓激酶基因突變體的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種新的蚓激酶基因突變體，尤其涉及以蚓激酶的cDNA及胺基酸序列為基礎，其中的真核細胞罕用密碼子被突變為有利於在真核細胞內表達的新的蚓激酶cDNA突變體。由該cDNA突變體翻譯出的蚓激酶可以有效地溶解纖維蛋白，廣泛應用於臨床上的溶血栓藥物組合物。
背景技術：
蚓激酶是來自於蚯蚓體內的一類可特異性溶解血栓、改善血液循環狀態的酶類，在醫學臨床上可以作為溶栓類藥物，用於血栓病如腦中風等的預防和治療。與其他溶栓藥物如組織型纖溶酶原激活劑(tPA)等相比，其最主要的優點在於①既有良好的治療效果，又有顯著的預防血栓性疾病作用；②可經腸道吸收，口服有效；③體內半衰期長達十幾分鐘，較tPA的半衰期(2-5分鐘)長數倍。
目前市售的蚓激酶藥物均為口服製劑，如蚯蚓粉或其粗提製品博洛克和普恩復等。由於多種雜蛋白的存在，從蚯蚓體內提純注射用蚓激酶十分困難，迄今未建立成熟的製備工藝。日本、韓國和中國的研究者近幾年來分別將他們的蚓激酶cDNA克隆工作發表在基因庫(GenBank)中，但是通過基因工程表達和製備出蚓激酶的研究一直未見報導，原因尚不清楚。我們在對蚓激酶cDNA的研究和分析中發現，在蚓激酶cDNA的編碼序列中存在著多個真核細胞稀有密碼子，它們可能對蚓激酶cDNA在真核細胞內的表達不利。
發明內容
本發明的目的在於提供一種新的蚓激酶基因突變體，是採用一種新的基於PCR反應原理的突變技術，以原有蚓激酶cDNA及胺基酸序列為基礎，在不改變蚓激酶胺基酸序列的前提下，對蚓激酶cDNA中的14個真核細胞罕用的胺基酸密碼子進行突變改造。同時設計合成了與同一DNA鏈互補的8條引物，共包含18個突變的鹼基。採用pfu DNA聚合酶對原有蚓激酶cDNA經過兩輪「PCR反應→轉化→測序鑑定」後，達到了預期突變結果。
本發明的技術方案是這樣實現的1、突變引物的設計；在DNA模板待突變密碼子及其兩端處設計引物，一般每突變一處密碼子，設計1條引物；當兩處突變較近(一般不超過20bp)時，可設計1條包含兩處突變的長引物；所有引物均與同一條DNA鏈互補；突變鹼基兩側的鹼基數均不少於10個；引物的Tm值不低於75℃；所有引物的5』端合成後都進行磷酸化處理。根據這些原則設計合成的8條引物為P15』-GCT CTT GCA TCA CTC GTA GCA GTG GGC TTT GCCP25』-CCA TAC GAG TTC CCA TGG CAG GTG TCC GTC AGA AGG AAGTCT TCCP35』-C ATC ATC AAC GAT AGG TGG GTT GTC TGCP45』-GAC AGG AGT GCA GCT AGT GCA GTA AGG CAG ACT CAT GACP55』-CAG TAC GTC TAC AGA AAG AGC CAG TGCP65』-CCC AAC ATT CTG AGA TAC GTA ACT CTG AAT GTC ACA ACP75』-GAT ATG ATT TGC GCT TCA GAC AAC ACT GGG
P85』-GGA GTC TAC TCC AGG GTC GGA TTC CAT AC2、突變過程及結果；將8條引物分成兩組，每組4條，P1、P2、P3、P4為一組，P5、P6、P7、P8為另一組，進行兩輪多位點突變PCR。首先在冰上將引物P1、P2、P3、P4各10pmol，帶MgSO4的10×PCR緩衝液5μl，四種dNTPs各2nmol，含蚓激酶cDNA的質粒pMD18-LK(3.6kb)100ng，pfu DNA聚合酶5U，加入100μl PCR反應管，加去離子水補足至體積50μl，混勻後，在ABI-2700 PCR儀上進行PCR反應，參數為95℃預變性3min後進入循環，95℃變性1min→55℃退火1min→68℃延伸7min，25個循環後，68℃延伸15min，降溫至4℃，結束PCR反應。50μl PCR產物內加入NEB DpnI限制性內切酶2μl(20U)，37℃水浴消化1h，取其中0.8μl，在冰上與30μlDH10B感受態大腸桿菌充分混勻，以1300V電壓電激轉化後，於1ml37℃ LB培養基中低速振蕩培養1h，塗布氨苄青黴素抗性的LB瓊脂平板，過夜培養後，以無菌牙籤挑取單菌落，置10ml含適量氨苄青黴素的LB培養基內增菌，12-16h後小量提取質粒供測序鑑定使用。對成功突變的質粒pMD18-LKml，以P5、P6、P7、P8引物進行第二輪PCR突變，方法及參數同前，得到包含全部預期突變的質粒pMD18-LKm2。
3、蚓激酶cDNA的表達；在pMD18-LKm2質粒中，蚓激酶cDNA突變體LKm2可以通過NotI和BamHI酶切釋出，並通過基因工程方法克隆到真核細胞表達載體(如哺乳動物細胞表達載體pIRESlneo，乳腺組織特異性表達載體pIbCP等)，轉染培養的真核細胞(如COS-7細胞、中國倉鼠卵巢細胞等)或注射到特定的組織(如乳腺組織等)後即可以在培養細胞上清或組織分泌液中檢測出蚓激酶的表達。表達蚓激酶的纖維蛋白溶解活性一般在500000-600000tPA Units/L。
本發明的積極效果在於突變後的蚓激酶cDNA可在哺乳動物細胞中高水平表達出具有纖溶活性的蚓激酶。表達的蚓激酶纖維蛋白溶解活性高。
圖1為tPA溶圈標準曲線；圖2為蚓激酶及其突變體穩定表達細胞上清的溶圈結果圖3為蚓激酶及其突變體在奶山羊乳腺中暫時表達結果
具體實施例方式實施例1蚓激酶突變體基因在中國倉鼠卵巢細胞系中的穩定表達應用多位點突變PCR技術完成蚓激酶基因的改造後，為驗證該突變體的表達能力，本試驗構建了蚓激酶突變體基因的真核表達載體，以脂質體介導，轉染中國倉鼠卵巢細胞系(CHO)，通過G418篩選，獲得了穩定表達蚓激酶的CHO細胞系，表達產物具有明顯的纖溶活性，可達到每毫升細胞培養上清500個tPA單位。
1、真核表達載體的構建帶有突變後目的基因的質粒pMD18-LKm2，以NotI和BamHI雙酶切，回收0.86kb的LKm2片段；再以相同的酶酶切pIRESlneo真核表達載體，回收5.23kb的線性化載體，二者以4∶1分子比，經T4 DNA連接酶12℃作用6-8h，42℃熱激轉化JM109感覺態大腸桿菌，塗布氨苄青黴素抗性的LB瓊脂平板，過夜培養後，以無菌牙籤挑取單菌落，於10ml LB培養基內擴大培養後，小量提取質粒，以NEB限制性內切酶Sca I酶切鑑定，結果為3795+1464+830bp的質粒為正確重組，將其命名為pILKm2neo，該質粒可表達新黴素抗性基因Neor，可以G418對轉染後細胞進行篩選。
以相同方法構建野生型蚓激酶的真核表達載體pILKneo。
2、CHO細胞對G418耐受濃度的測定以含10％胎牛血清的F12培養基為營養液，在37℃，5％CO2條件下培養CHO細胞。CHO細胞長成單層後，按1×105/孔傳入24孔細胞培養板，24h後長成薄單層，吸去培養基，在孔內加入分別含200、300、400、500、600、700μg/ml G418的F12營養液，每個濃度設4個孔，繼續培養，每3天換液，G418濃度保持不變。3周後倒置顯微鏡下觀察，結果300μg/ml及以上濃度G418細胞培養孔內的細胞全部死亡，200μg/ml G418孔內有成簇生長的CHO細胞克隆。說明CHO細胞可耐受200μg/ml G418，即其G418篩選濃度應為300μg/ml。
3、真核表達載體轉染CHO細胞及穩定表達細胞系的篩選轉染前24h CHO細胞傳代入50ml細胞培養瓶，使轉染時達到50-80％覆蓋。取質粒pILKm2neo 5μg，脂質體Lipofectamine(Invitrogen)12μl，以不含血清及抗生素的F12培養基分別稀釋到100μl後混勻，室溫下靜置20min。加入2.8ml上述F12，鋪到事先經F12衝洗過的細胞單層上。37℃，5％CO2條件下培養10-16h後，換F12營養液，繼續培養48h，按1∶5傳代，同時加入終濃度300μg/ml的G418進行篩選。20天後，出現細胞克隆，以無菌吸管挑取單個克隆入96孔細胞培養板，長成單層後消化，傳入24孔板，長滿後再傳入細胞瓶，取一定時間的細胞培養上清測定蚓激酶活性。
以相同方法進行野生型蚓激酶的穩定表達及篩選。
4、CHO穩定表達蚓激酶活性的測定試驗前一天，克隆的CHO細胞傳代，換新鮮營養液。於換液後24h、48h、72h、96h分別吸取少量培養上清，以纖維蛋白平板溶圈法(Fibrin Agarose Plate Assay，FAPA)測定培養上清的纖溶活性以磷酸鹽緩衝液(PBS，pH7.4)為溶劑，配製1.2％瓊脂糖，加熱溶解後，取8ml置玻璃瓶內，室溫冷卻至50-55℃，加入10mg/mL的纖維蛋白原1mL，搖勻後加入1U/mL的凝血酶1mL，輕柔搖勻後隨即倒入4.5×10cm2酶聯板蓋內，室溫下水平放置，令其自然凝固，即成纖維蛋白瓊脂平板。按需要在平板上打φ2.0mm圓孔，孔內加入待測樣品20μl，37℃溼盒內作用16h，以遊標卡尺測量各孔樣品的溶圈直徑。纖溶活性與溶圈面積成正比，先根據tPA標準品畫出纖溶活性單位(U)與溶圈面積(mm2)間的關係，作為標準曲線(圖1)，再按待測樣品的溶圈面積求得該樣品中蚓激酶的活性單位數(tPA-U)及其中樣品中的濃度。檢測結果表明，蚓激酶突變體的穩定表達細胞系上清中24h、48h、72h、96h的蚓激酶含量分別為90U/mL、230U/mL、390U/mL、490U/mL；而野生型蚓激酶真核表達載體未在CHO細胞系實現穩定表達，篩選獲得的6株細胞，其上清均無明顯溶纖活性。細胞上清溶圈情況見圖2。
實施例2蚓激酶及其突變體在山羊乳腺中的暫時表達比較1、乳腺定位真核表達載體的構建以SpeI+SacII雙酶切質粒pT-bCP，回收1.13kb的山羊β-酪蛋白啟動子序列，Klenow大片段補平，連入經NruI+EcoRV雙酶切的pIRESlneo載體質粒，獲得中間質粒pI-bCP。再以NotI+BamHI酶切pMD18-LK和pMD18-LKm2，分別回收0.86kb的蚓激酶及其突變體基因序列，連入經相同酶切的pI-bCP，獲得蚓激酶及其突變體的乳腺定位真核表達載體pI-bCP-LK和pI-bCP-LKm2。
2、蚓激酶及其突變體在山羊乳腺的暫時表達比較鹼裂解法大量製備並純化質粒pI-bCP-LK和pI-bCP-LKm2後，取二質粒各400μg，分別溶於1mL生理鹽水，以無菌注射器直接注射入穩定泌乳期(產仔後哺乳10-20天)的山羊左右乳腺。於注射後1.5h、3h、4.5h、6h、7.5h、9h採少量奶樣，以瓊脂糖平板溶圈法(FAPA)檢測表達情況。FAPA檢測及計算方法同實施例1。結果表明，蚓激酶突變體在山羊乳腺中的暫時表達量(以6h為例)為600U/mL，而野生型無明顯表達。奶樣溶圈情況見圖3。
突變前的蚓激酶cDNA及對應胺基酸序列；9 18 27 36 45 545』ATG TTA CTT CTC GCT CTT GCA TCG CTC GTA GCG GTG GGC TTT GCC CAA CCA CCAM L L L A L A S L V A V G F A Q P P63 72 81 90 99 108ATC TGG TAC CCC GGT GGT CAA TGC GGT CTC AGC CAG TAC TCA GAT GCT GGT GACI W Y p G G Q C G L S Q Y S D A G D
117 126 135 144 153 162ATG GAA CTT CCT CCC GGA ACA AAA ATT GTC GGA GGA ATT GAA GCT AGA CCA TACM E L P P G T K I V G G I E A R P Y171 180 189 198 207 216GAG TTC CCG TGG CAG GTG TCC GTC CGA AGG AAG TCT TCC GAT TCC CAT TTC TGCE F P W Q V S V R R K S S D S H F C225 234 243 252 261 270GGA GGT AGC ATC ATC AAC GAT CGT TGG GTT GTC TGC GCT GCT CAC TGC ATG CAGG G S I I N D R W V V C A A H C M Q279 288 297 306 315 324GGA GAG GCC CCC GCT CTG GTT TCA TTG GTC GTG GGT GAG CAC GAC AGG AGT GCAG E A P A L V S L V V G E H D R S A333 342 351 360 369 378GCG AGT GCA GTA CGT CAG ACT CAT GAC GTT GAT AGC ATC TTC GTT CAC GAG GACA S A V R Q T H D V D S I F V H E D387 396 405 414 423 432TAC AAC ACA AAT ACC CTA GAG AAC GAC GTT TCT GTC ATC AAG ACA TCT GTT GCCY N T N T L E N D V S V I K T S V A441 450 459 468 477 486ATC ACT TTC GAC ATC AAC GTT GGT CCA ATC TGT GCC CCA GAT CCA GCT CAA CAGI T F D I N V G P I C A P D P A Q Q495 504 513 522 531 540TAC GTC TAC CGT AAG AGC CAG TGC TCC GGA TGG GGA ACT ATC AAT TCA GGT GGAY V Y R K S Q C S G W G T I N S G G549 558 567 576 585 594ATC TGC TGT CCC AAC ATT CTG CGA TAC GTG ACG CTG AAT GTC ACA ACC AAC CAAI C C P N I L R Y V T L N V T T N Q603 612 621 630 639 648TTC TGC GAA GAT GTA TAC CCA CTA AAT TCA ATC TTC GAC GAT ATG ATT TGC GCGF C E D V Y P L N S I F D D M I C A657 666 675 684 693 702TCG GAC AAC ACT GGG GGT AAC GAC AGA GAC TCC TGC CAG GGT GAC TCC GGC GGCS D N T G G N D R D S C Q G D S G G711 720 729 738 747 756CCT CTG AGC GTC AAG GAT GGC AGT GGA ATC TTC AGC CTG ATT GGT ATT GTG TCTP L S V K D G S G I F S L I G I V S765 774 783 792 801 810TGG GGA ATT GGT TGC GCT TCT GGC TAT CCA GGA GTC TAC TCC CGC GTC GGA TTCW G I G C A S G Y P G V Y S R V G F819 828 837 846CAT ACT GCA TGG ATC ACC GAC ATC ATC ACC AAC AAC TAA 3』H T A W I T D I I T N N *本發明突變後的蚓激酶cDNA及對應胺基酸序列；
9 18 27 36 45 545』ATG TTA CTT CTC GCT CTT GCA TCA CTC GTA GCA GTG GGC TTT GCC CAA CCA CCAM L L L A L A S L V A V G F A Q P P63 72 81 90 99 108ATC TGG TAC CCC GGT GGT CAA TGC GGT CTC AGC CAG TAC TCA GAT GCT GGT GACI W Y P G G Q C G L S Q Y S D A G D117 126 135 144 153 162ATG GAA CTT CCT CCC GGA ACA AAA ATT GTC GGA GGA ATT GAA GCT AGA CCA TACM E L P P G T K I V G G I E A R P Y171 180 189 198 207 216GAG TTC CCA TGG CAG GTG TCC GTC AGA AGG AAG TCT TCC GAT TCC CAT TTC TGCE F P W Q V S V R R K S S D S H F C225 234 243 252 261 270GGA GGT AGC ATC ATC AAC GAT AGG TGG GTT GTC TGC GCT GCT CAC TGC ATG CAGG G S I I N D R W V V C A A H C M Q279 288 297 306 315 324GGA GAG GCC CCC GCT CTG GTT TCA TTG GTC GTG GGT GAG CAC GAC AGG AGT GCAG E A P A L V S L V V G E H D R S A333 342 351 360 369 378GCT AGT GCA GTA AGG CAG ACT CAT GAC GTT GAT AGC ATC TTC GTT CAC GAG GACA S A V R Q T H D V D S I F V H E D387 396 405 414 423 432TAC AAC ACA AAT ACC CTA GAG AAC GAC GTT TCT GTC ATC AAG ACA TCT GTT GCCY N T N T L E N D V S V I K T S V A441 450 459 468 477 486ATC ACT TTC GAC ATC AAC GTT GGT CCA ATC TGT GCC CCA GAT CCA GCT CAA CAGI T F D I N V G P I C A P D P A Q Q495 504 513 522 531 540TAC GTC TAC AGA AAG AGC CAG TGC TCC GGA TGG GGA ACT ATC AAT TCA GGT GGAY V Y R K S Q C S G W G T I N S G G
權利要求
1.一種新的蚓激酶基因突變體，在保持編碼胺基酸序列不變的前提下，對經反轉錄獲得的蚓激酶cDNA序列中的真核細胞罕用密碼子進行了突變改造，具體步驟如下(1)在冰上將突變引物各10pmol、帶MgSO4的10×PCR緩衝液5μl、dNTPs 2nmol、含蚓激酶cDNA的質粒pMD18-LK(3.6kb)100ng和pfu DNA聚合酶5U加入100μl PCR反應管，加入去離子水補足至體積50μl，混勻後，在ABI-2700 PCR儀上進行PCR反應，參數為95℃預變性3min後進入循環，95℃變性1min→55℃退火1min→68℃延伸7min，25個循環後，68℃延伸15min，降溫至4℃，結束PCR反應；(2)在50μl PCR產物內加入NEB Dpn I限制性內切酶2μl(20U)，37℃水浴消化1h，取其中0.8μl，在冰上與30μl DH10B感受態大腸桿菌充分混勻，以1300V電壓電激轉化後，於1ml 37℃ LB培養基中低速振蕩培養1h，塗布氨苄青黴素抗性的LB瓊脂平板，過夜培養後，以無菌牙籤挑取單菌落，置10ml含適量氨苄青黴素的LB培養基內增菌，12-16h後小量提取質粒供測序鑑定使用。
2.根據權利要求1所述的一種新的蚓激酶基因突變體，其特徵在於對蚓激酶cDNA固有序列的第8、11、57、63、80、109、113、166、188、190、191、216、217、267位胺基酸的14個相應的密碼子序列TCG、GCG、CCG、CGA、CGT、GCG、CGT、CGT、CGA、GTG、ACG、GCG、TCG、CGC進行了突變改造，突變後的密碼子序列分別為TCA、GCA、CCA、AGA、AGG、GCT、AGG、AGA、AGA、GTA、ACT、GCT、TCA、AGG，其中共有18個鹼基突變。
3.根據權利要求1所述一種新的蚓激酶基因突變體，其特徵在於所述的基因突變體，在克隆至真核表達載體或乳腺組織特異性表達載體並轉染到培養的細胞或注射到乳腺組織後，可在轉染細胞的上清或注射乳腺分泌的乳汁中檢出蚓激酶的纖維蛋白溶解活性，活性一般在500000-600000 tPA Units/L。
4.根據權利要求1所述一種新的蚓激酶基因突變體，其特徵在於所述的基因突變體用於製備治療溶血栓藥物及藥物組合物。
全文摘要
本發明涉及一種新的蚓激酶基因突變體，是以單步多位點突變多聚酶鏈式反應(Polymerase Chain Reation，PCR)方法對經反轉錄獲得的蚓激酶cDNA(complementary DNA)進行了突變，獲得了一個新的蚓激酶基因突變體。該突變體含有18個突變的鹼基，但鹼基突變後由其編碼的胺基酸序列不改變，突變的目的是使蚓激酶有利於在哺乳動物組織和細胞內表達。突變後的蚓激酶cDNA可在哺乳動物細胞中高水平表達出具有纖溶活性的蚓激酶。表達的蚓激酶纖維蛋白溶解活性高。
文檔編號C12N15/57GK1513999SQ0312708
公開日2004年7月21日 申請日期2003年6月18日 優先權日2003年6月18日
發明者張守峰, 扈榮良, 塗長春 申請人:中國人民解放軍軍需大學軍事獸醫研究所, 中國人民解放軍軍需大學軍事獸醫研究