用於膽固醇測定的裝置和方法

2023-10-30 10:55:57

專利名稱：用於膽固醇測定的裝置和方法
技術領域：
本發明涉及用於測定血液中總膽固醇的裝置和方法。特別地，本發明 涉及用於血液中總膽固醇分光光度測量的取樣裝置和方法。
背景技術：
膽固醇是對於身體細胞必不可少且主要由肝產生的固醇脂。由於膽固 醇是疏水性的，其不能在血流中直接溶解及運輸，但作為脂蛋白的一部分
而運輸。血液膽固醇的大部分(約80% )作為LDL (低密度脂蛋白)顆粒 的一部分而存在，但也有其他的脂蛋白，例如HDL (高密度脂蛋白)、運 輸膽固醇。出於臨床分析的目的，LDL和HDL膽固醇的水平都受到顯著 關注，此外總血液膽固醇濃度也非常重要。
在20世紀90年代末期的高膽固醇血症治療中，增加了與引入若干新 藥如斯特汀相關的用於篩選和監控膽固醇的即時檢驗(point of care )方法 的需求，並且具有可取的大約3%的不精確度的關於精確性和準確性的臨 床要求很高。顯然，對於血液中總膽固醇的定量測定的簡單、快速且非溫 度依賴型檢測對於診療室是重要的輔助手段。
用於總膽固醇測量的化學和^方法是已知的並且在醫院的中心實驗 室進行對血清或血漿中總膽固醇的測量。最常用的化學方法是利伯門-伯查 德(Liebermann-Burchard)反應，其中膽固醇作為典型的醇與強的、濃酸 反應產生有色物質。然而當今大多數使用的是酶促方法。酶促反應由膽固 醇酯的水解形成游離膽固醇開始，並且隨後由膽固醇氧化酶這一酶氧化該 游離膽固醇。該酶以良好的穩定性著稱，其易於使用並且其是市售可得的。
用於膽固醇測定的另 一種酶是膽固醇脫氫酶，其使用公開於專利公開號EP 0 244 825的分析部分中。根據此公開，必須在特定溫度下孵育樣品 規定的時間。膽固醇脫氬酶在膽固醇測定上的應用也^^開於例如美國專利 4 892 816和4 181 575中。兩專利都涉及通過溼化學方法的總膽固醇測定， 該方法包括長的孵育時間和限定的溫度。
為了提供對血液中總膽固醇測定的新型、快速且簡單的方法，尤其研 究了包括美國專利4 088 448中首次公開的那類幹反應劑的 一次性裝置(微 量吸收池)，這類微量吸收池的使用提供了若干優點。該微量吸收池允許 在用於隨後測量的相同的容器中進行液體取樣，將該樣品與適合的反應劑 (例如用於生色)混合。此外，簡化了取樣程序，減少了用具的數量並且 在多數情況下，視分析的類型而定，通過進行與實施該分析的操作者的操 作技術無關的分析程序明顯提高了分析的精度。該程序也顯著地加快，因 為其允許液體樣品立即與反應劑混合併且隨後允許此後很快進行測量而沒 有耗時的中間步驟。
發明目的
本發明的一個目的涉及用於血液中總膽固醇的簡單定量測定的取樣裝 置和方法。
本發明的另 一 目的涉及用於血液中總膽固醇的定量測定的取樣裝置和 方法，該方法可以在環境溫度下進行。
本發明的其它目的在於提供包括膽固醇反應劑組合物的取樣裝置，該 組合物可以被存儲更長的時間。
本發明的再一其它目的在於提供用於血液中總膽固醇的定量快速測定 的取樣裝置。
本發明的再一其它目的在於提供用於血液中總膽固醇的定量終點測定 的取樣裝置。
本發明的再一其它目的在於提供用於血清/血漿中總膽固醇的定量測 定的取樣裝置，其中將未稀釋的全血引入到該裝置中。發明概述
在研發本發明的取樣裝置和方法時，在根據美國專利4 088448的微量 吸收池(如上面所討論)中使用膽固醇氧化酶的若干嘗試都失敗了並且不 能獲得可重複的結果。據認為這些失敗是由於具有毛細管孔的微量吸收池 的構造在微量吸收池中產生特定的反應環境以及該環境不適於使用膽固醇 氧化酶的反應的事實。
另一種酶(膽固醇脫氫酶)與其他用於膽固醇測定所需的反應劑組合 也不能令人滿意地工作。然而，出乎意料地發現，如果將反應所需的緩衝 劑從該裝置中包括脫氫酶的反應劑組合物剩餘部分中分離出，可以獲得總 膽固醇成功的非溫度依賴型終點定量測定。
因而發現上述目的通過如下所限定的本發明取^"裝置以及也通過^^用 本發明方法而全部或部分實現。
本發明的取樣裝置是用於採取血樣以及用於提供該血樣以進行所# 樣中總膽固醇分析的取樣裝置，所述裝置包括用於通過毛細管作用接收 待分析血樣的接收腔，所述接收腔具有預定的小體積；和設置為與該接收 腔連通的分析腔，所述分析腔具有預定的光程距離；所述接收腔含有乾燥 的緩沖劑，而所述分析腔含有乾燥的反應劑。
本發明的方法是通過終點分析用於血清/血漿的血樣中總膽固醇濃度 定量測定的方法，包括a)將血清/血漿與乾燥的緩衝劑接觸，從而所述 緩沖劑溶解在血樣中並緩衝該血樣；b)將小的確定體積的經緩衝血清/血 漿與乾燥的反應劑接觸，所述反應劑包括膽固醇脫氫酶；膽固醇酯酶；來 自心肌黃酶、汾-秦石克酸甲酯、汾喚硫酸乙酯(phenazine ethosulphate )、 吩-秦石克酸苯酚(phenazine phenosulphate )和麥爾多拉藍組成的組的一或 多種物質；來自NAD、 NADP、硫代NAD、確/R NADP、煙醯胺嘌呤二 核苷酸、煙醯胺甲基噤呤二核苷酸和煙醯胺-2-氯-曱基嘌呤二核苷酸組成的 組的一或多種物質；由聚氧代乙烯類、烷基葡糖苷類、硫代葡糖苷類、共 聚物和膽酸類組成的組的一或多種表面活性劑；以及氧化還原指示劑染料； 和c)通過透射分光光度法在預定的光程距離測量確定體積的經緩衝血清/血漿中由反應劑與膽固醇反應所帶來的顏色變化，以定量測定其中的膽固 醇濃度。
附圖簡要說明
圖l是本發明取樣裝置的一個實施方式的示意性正視圖。圖l也示意 性地說明使用所述取樣裝置的方法的一個實施方式。
圖2是公開了根據本發明方法的實施方式進行膽固醇測定以及參照方 法相應測定之間的相關性的圖表。
發明詳細說明
本發明特別涉及在小體積血液中總膽固醇測定。該上下文中，術語"血 液，，旨在意指全血，血漿和/或血清。根據本發明優選的實施方式，引入該 裝置的血液既不是經稀釋過的也不是經預處理過的。術語"小體積"意指 0.1和0.001 ml之間的體積，優選0.03和0.001 ml之間的體積。
指明的"血清/血漿，，或"血漿/血清，，旨在包含血清、血漿和它們之間 的任何中間態。有時並不明確限定一血液級分為"血清"或"血漿"的原 因在於如果在從患者獲得血液後的幾分鐘內分析血樣而不加入抗凝劑，將 不會有時間形成真正的血清，而該測量是在除去血細胞後於血漿和血清間 的中間態中進行。如果在自患者獲得血液後幾乎直接進行細胞去除和測量， 那麼該測量將實質上是在血漿中進行。由於自血清中除去纖維蛋白原，血 漿和血清中都存在的血液成分在血漿中的濃度將以比在血清中的濃度小 3%存在。
該申請中，術語"腔"旨在被理解為由壁表面確定的體積或小室。然 而根據本發明的裝置的腔(體積)並不由這些表面完全限定或封閉，而具 有入口和/或出口，該處的表面不完全接合在一起。該腔(體積)通常不是 排空的，而可含有氣體(通常是空氣)，乾燥的反應劑和/或緩沖劑，液體 (例如當裝置使用時的血樣)等。
以這樣的方式設計本發明的取樣裝置，即其保持乾燥的緩衝劑與乾燥的反應劑隔開，從而當反應劑是乾燥形式時使得將該反應劑保持在與緩衝
劑pH無關的pH成為可能(例如，在取樣裝置的儲存期間)。通過能夠 最優化針對儲存穩定性的反應劑的pH而不考慮與血樣反應的最佳反應劑 的pH，可以大大提高本發明裝置的貯藏期限。這是通過用多個腔來裝備該 取樣裝置而實現的。
換言之，如果血樣首先與緩衝劑接觸並將其溶解，然後與反應劑接觸 並也將其溶解，那麼反應劑的化合物只經歷由在與血樣接觸後的緩衝劑所 引起的pH。由於乾燥的反應劑只在其需要與樣品反應時與之接觸，用該取 樣裝置避免了在緩衝劑引起的pH下反應劑化合物長期穩定性的問題。
在其最簡單的形式中，將血清/血漿樣品引入取樣裝置，並且這種情況
下，只需要接收和分析腔。然而，在其的市場上引起最多興趣的形式中， 將未稀釋的全血樣品引入該裝置。這種情況下，需要設計該裝置以便包括 其他適於通過離心除去樣品中血細胞的腔，因為該細胞如果存在於分析腔 中將幹擾膽固醇測定。公開了通過離心作用除去血細胞並且可以使用的裝 置是例如美國專利5 472 671的裝置(其在此通過引用作為參考)。
接收腔具有預定體積，該體積允許該腔接收預定的、不變體積的血液 (血清/血漿)，該血液隨後可轉移到分析腔。這保證了特定且已知體積與 分析腔中乾燥的反應劑反應。
分析腔具有預定的光程距離，其保證當在分析腔上使用光度計以獲得 測量值時，該數值可與其中的血樣的膽固醇濃度直接相關。
對於血清級分中總膽固醇的測定，本發明方法因而也可包括在取樣裝 置中全血離心以用於從全血中除去血細胞和纖維蛋白原，之後將由此獲得
的血清與乾燥反應劑接觸。
類似地，對於血漿級分中總膽固醇的測定，本發明的方法可包括在取 樣裝置中將未改變的全血與抗凝劑相接觸並將獲得的混合物進行離心以除 去血細胞，之後將由此獲得的血漿與乾燥反應劑接觸。
可在將血樣引入取樣裝置前任選地通過使用抗凝劑，或者在引入全血 後通過如取樣裝置的離心進行這些製備步驟，離心。參考

圖1，後一情況下可利用包括4個腔的取樣裝置第一腔l (ii^腔)，通過入口與取樣 裝置的周圍事物相連，並且任選地含有乾燥添加劑如溼潤劑和/或抗凝劑， 其用於通過毛細管作用自該裝置外接收血樣，優選全血；第二腔2(離心 接受腔)，優選為非毛細管，其與第一腔l相連並且ii^該腔的樣品可通 過離心作用而轉移；第三腔3 (接收腔)，優選為毛細管並且含有乾燥的 緩衝劑及任選的溼潤劑，其與第二腔2相連並且進入該腔的樣品的血清/ 血漿級分可在離心結束後通過毛細管作用而被轉移；和第四腔4(分析腔)， 其含有乾燥反應劑且與第三腔3相連並且進入該腔的樣品可通過離心作用 而淨皮轉移。
上述四腔裝置的優選用途是將來自患者針刺指尖的全血直接引入到該 裝置中。參考圖l,首先將血液通過毛細管作用吸至進入腔l (步驟IO)。 這可由在製造該裝置時沉積在進入腔1中的乾燥形式的溼潤劑，以及通過 具有尖部設計的裝置所輔助，該裝置在^腔1的入口處設有尖，該尖可 與針刺手指的血液接觸。該裝置可然後進行離心作用(步驟ll)以便將血 液自進入腔1轉移至離心接受腔2，並且以致使血液中的血細胞實質上與 血漿分離(步驟12)。在離心後，血漿通過毛細管作用從離心接受腔2被 吸至接收腔3 (步驟13)，在該接收腔3處，乾燥的緩衝劑迅速溶解在由 接收腔3的體積所限定的特定體積的血漿中。緩沖劑在血漿中溶解後對其 進行緩衝，使該裝置再次進行離心(步驟4)從而將經緩衝的血漿轉移至 分析腔4，在分析腔4中，用於膽固醇測定的乾燥的反應劑溶解在該經緩 沖的血漿中。在與反應劑反應後，通過吸收光度計測定血漿中的總膽固醇。
該取樣裝置可以是一次性的，即其設置為只使用一次。該取樣裝置提 供用來進行總膽固醇測定的試劑盒，其可以在4吏用前穩定地存儲很長時間， 因為該取樣裝置能夠接收液體樣品並且容納所有需要的反應劑以便呈現該 樣品用於膽固醇測量。這尤其在如果該取樣裝置適於只使用 一次時是允許 的並且可形成而不考慮清潔該取樣裝置及再利用反應劑的可能性。本發明 取樣裝置的相同單元可以極小的偏差容限而大量生產，從而可直接將使用 一個特定單元進行的測量與使用相同發明的取樣裝置的其他單元進行的測此外，取樣裝置可用塑料材料注塑而成並且從而可以低成本製造。因 此，使用一次性取樣裝置還可以是划算的。
此外，通過由剛性塑料材料形成取樣裝置，在該裝置的操作和使用期 間可使該設計不變形，從而確保在製造後裝置腔的不變體積和形狀，結果 是也確保不變的光程距離。
根據本發明方法的一個實施方式，用所示反應劑成分進行下面的反應 步驟
1) 膽固醇酯+1120 膽固醇脂酶,膽固醇+RCOOH
2) 膽固醇+NAD十膽固醇脫氫酶,膽甾基-4-烯-3國酮+NADH + H+
3) NADH + MTT心肌黃,甲臘+ NAD+
乾燥反應劑的成分並不局限於上面反應方案中示例的那些，但將在下
面更具體的討論。
膽固醇酯酶可獲自不同的物種，具有不同摩爾質量、最佳pH等。 輔酶可為NAD，優選[3-NAD、 NADP、硫代NAD、硫代NADP、煙
醯胺噤呤二核苷酸、煙醯胺甲基嘌呤二核苷酸和煙醯胺-2-氯-甲基嘌呤二核苷酸。
膽固醇脫氫酶也可以獲自不同的物種，具有不同摩爾質量、最佳pH 等。涉及膽固醇脫氫酶的出版物的實例是日本專利早期公開No. 89,183/1983和89,200/1983，其中公開了膽固醇脫氫酶的製備。本發明膽固 醇脫氫酶只包括NAD或NAD類似物依賴的酶。
心肌黃酶也可以獲自不同物種且市售可得。然而心肌黃酶可以由已知 物質所替代，例如吩溱硫酸甲酯、吩溱硫酸乙酯、吩嚷硫酸苯酚和麥爾多 拉藍等。也存在其他已知的NAD類似物，例如熟知的NADP，其可以被 膽固醇脫氫酶反應所還原並將該還原轉移至指示劑或著色體系。
氧化還原指示劑染料的實例是MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-l)-2，5-二苯 基-2H-四氮唑溴鹽)，其在用於本發明方法時產生良好的結果，當然可以使 用許多其他四氮唑化合物。也存在若干其他已知類型的變色物質，其在受到NADH和心肌黃酶影響時能夠改變顏色。四氮唑化合物是有利的，因為 在通常還原條件下不可逆地形成曱臘染料。根據MTT的優選實施方式， 將MTT用作氧化還原指示劑染料並且在630-680nm的範圍(最特別是 640nm)測量吸收，背景校正的測量在700-卯0nm的範圍或更具體在700 或840nm。
對於吸收測量的波長取決於所用的氧化還原染料。對於適合用於本發 明方法的染料，該波長可在500和750nm之間變化。
此外，反應劑可以含有非離子表面活性劑例如聚氧代乙烯和/或烷基葡 糖苷和/或硫代葡糖苷和/或共聚物和/或陰離子表面活性劑，例如膽酸或作 為裂解脂蛋白試劑的酶例如磷脂酶。此外可使用表面活性劑來潤溼乾燥反 應劑基質。理想地，表面活性劑應展現下述特性
1. 通過減小表面張力造成幹反應劑的快速凝結。
2. 裂解脂蛋白以釋放膽固醇和膽固醇酯。
3. 保持所形成的溶解的曱臘。
乾燥的反應劑組合物中不同成分的含量並不是關鍵，但對於lml未稀 釋的全血樣品的計算可優選下述範圍
物質數量
膽固醇酯酶20-5000U/mL
膽固醇脫氫酶20-5000U/mL
心肌黃酶(/類似物)20-50000U/mL
P -NAD (/類似物)12-100mmol/mL
氧化還原指示劑染料/四氮唑鹽 (MTT-Br) (/類似物)12-25mmol/mL
Triton X-1000，l-5%(w/w)
混合上述物質以便形成懸液，可在本發明取樣裝置的分析腔中將其冷 凍乾燥。通過下面非限制實例來說明本發明。 實施例
血清/血漿中膽固醇的測定
製備在水中的包括1% triton X-100的反應劑溶液。
將MTT (3-(4，5-二甲基噢唑-2-l)-2，5-二苯基-2H-四氮唑溴鹽)加入該溶 液並混合直至MTT溶解。向所獲得的溶液中加入膽固醇脫氫酶、膽固醇 脂酶、心肌黃酶和p-NAD的水性溶液並且將3-6^1的此溶液裝入本發明的 一次性取樣裝置的分析腔4中。
1 ml反應劑組合物中包括
200U膽固醇酯酶，Genzyme
200U膽固醇脫氬酶，Amano
1700U心肌黃酶，Unitika
20mM|5-NAD， Sigma
15mMMTT-Br， Acros
10mg Triton X-100， Merck
lmL經過離子交換的水
以類似方式將具有pH9.0的Tris緩衝溶液裝入本發明的一次性取樣裝 置的接收腔3中。
將包括反應劑和緩沖劑的取樣裝置在-45 °C冷凍並冷凍乾燥以便獲得 包括在各自腔中乾燥的反應劑和乾燥的緩衝劑的取樣裝置。 按下述使用 一種所獲得的取樣裝置
將確定的血清/血漿樣品體積通過毛細管作用吸到接收腔3中。在血清 /血漿中溶解乾燥的緩沖劑。然後將取樣裝置進行離心以便迫使經緩衝的血 清/血漿ii^含有乾燥的反應劑的分析腔4中。在血清/血漿中溶解乾燥的反 應劑組合物，由此pH變為8.5，並且血清/血漿膽固醇按如上述化學反應 所限定的與膽固醇酯酶及膽固醇脫氫酶反應。該化學反應導致染料濃度的 改變。通過在640nm的透射分光光度法測量以及對在840nm的背景進行補償，可以定量測定血清/血漿樣品中膽固醇的濃度。進行從提取樣品到測
量的整個過程通常花費小於5分鐘，通常約2分鐘。
圖2公開了用於終點測定的根據本發明的膽固醇測定和參照方法之間 的關係，並且可以看出其一致性良好。
權利要求
1.一種用於採取血樣以及用於提供該血樣以進行所述血樣中總膽固醇分析的取樣裝置，所述裝置包括接收腔(3)，用於通過毛細管作用接收待分析的血樣，所述接收腔具有預定的小體積；和分析腔(4)，設置為與該接收腔(3)連通，所述分析腔具有預定的光程距離；所述接收腔(3)含有乾燥的緩衝劑，而所述分析腔(4)含有乾燥的反應劑。
2. 根據權利要求l的裝置，其中所述裝置由剛性材料製造並且分析腔 (4)具有不變的光程距離。
3. 根據權利要求1或2的裝置，其中接收腔(3)中含有的緩衝劑具 有pH8-10,優選9。
4. 根據權利要求l-3中任一項的裝置，其中接收腔(3)含有溼潤劑。
5. 根據權利要求1-4中任一項的裝置，其中分析腔(4 )與接收腔(3 ) 連通以致阻止來自接收腔(3)的血樣向分析腔(4)的自發流動以及以致 可通過向該裝置施加離心作用而迫使血樣自接收腔(3 ) :^分析腔(4 )。
6. 根據權利要求1-5中任一項的裝置，其中分析腔(4)中含有的反應 劑包括膽固醇脫氫酶； 膽固醇酯酶；來自心肌黃酶、吩"秦石危酸甲酯、吩溱硫酸乙酯、吩溱-琉酸苯酚和麥爾 多拉藍組成的組的一或多種物質；來自NAD、 NADP、石克代NAD、石克代NADP、煙醯胺嘌呤二核苷酸、 煙醯胺甲基噪呤二核苷酸和煙醯胺-2-氯-曱基嘌呤二核苷酸組成的組的一 或多種物質；由聚氧代乙烯類、烷基葡糖苷類、硫代葡糖苷類、共聚物和膽酸類組成的組的一或多種表面活性劑；以及 氧化還原指示劑染料。
7. 根據權利要求6的裝置，其中氧化還原指示劑染料是3-(4，5-二曱基 瘞唑-2-l)-2，5-二苯基-2H-四氮唑溴鹽(MTT)。
8. 根據權利要求l-7中任一項的裝置，其中反應劑包括心肌黃酶。
9. 根據權利要求1-8中任一項的裝置，進一步包括 進入腔(l)，通過毛細管作用自該裝置外的位置採^ii樣；和 離心接受腔(2)，其設置為與進入腔(1)連通以致阻止血樣自ii^腔(1)向離心接受腔(2)的自發流動以及以致通過向該裝置施加離心作 用可迫使該血樣自進入腔(1)進入離心接受腔(2),所述離心接受腔(2)與接收腔(3)毛細管相連以允許通過毛細管作 用將血樣自離心接受腔(2 )向接收腔(3 )運輸。
10. —種通過終點分析來定量測定血清/血漿的血樣中總膽固醇濃度的 方法，包括a) 將血清/血漿與乾燥的緩沖劑接觸(13)，從而將所述緩衝劑溶解 在血樣中並緩衝該血樣；b) 將小的確定體積的經緩衝血清/血漿與乾燥的反應劑接觸(14)， 所述反應劑包括膽固醇脫氫酶； 膽固醇酯酶；來自心肌黃酶、吩"秦石克酸甲酯、吩溱石克酸乙酯、吩噪石克酸苯酚和 麥爾多拉藍組成的組的 一或多種物質；來自NAD、 NADP、石克代NAD、石克代NADP、煙醯胺噤呤二核苷 酸、煙醯胺曱基嘌呤二核苷酸和煙醯胺-2-氯-甲基噤呤二核苷酸組成的組的 一或多種物質；由聚氧代乙烯類、烷基葡糖苷類、硫代葡糖苷類、共聚物和膽酸 類組成的組的一或多種表面活性劑；以及 氧化還原指示劑染料；和C)通過透射分光光度法，在預定的光程距離測量在確定體積的經緩衝 血清/血漿中由反應劑與膽固醇反應所引起的顏色變化，以定量測定其中的 膽固醇濃度。
11. 根據權利要求10的方法，其中氧化還原指示劑染料是3-(4，5-二甲 基蓉唑-2-l)-2，5-二苯基-2H-四氮唑溴鹽(MTT)。
12. 根據權利要求10或11的方法，其中在630-680nm的範圍，優選 在640nm進行透射分光光度法測量。
13. 根據權利要求10-12中任一項的方法，還包括在高於700nm的波 長進行第二透射分光光度法測量以補償背景幹涉。
14. 根據權利要求10-13中任一項的方法，其中反應劑包括心肌黃酶。
15. 根據權利要求10-14中任一項的方法，其中經緩衝血漿或血清小的 確定體積在0.1和0.001ml之間。
16. 根據權利要求10-15中任一項的方法，所述方法還包括在進行步驟 a )之前從全血中除去血紅細胞的對全血的離心(12 )，用於確定所述全血 的血清/血漿級分中膽固醇濃度。
17. 根據權利要求10-16中任一項的方法，其中在血清/血漿的pH為 8-9，優選8.5進4亍測量。
全文摘要
本發明涉及用於採取血樣及用於提供該血樣進行所述血樣中總膽固醇分析的取樣裝置。該裝置包括用於通過毛細管作用接收待分析血樣的接收腔，所述接收腔具有預定的小體積；和設置為與接收腔連通的分析腔，所述分析腔具有預定的光程距離。所述接收腔含有乾燥的緩衝劑，而所述分析腔含有乾燥的反應劑。本發明也涉及通過終點分析對血清/血漿的血樣中總膽固醇濃度進行定量測定的方法。
文檔編號B01L3/00GK101583723SQ200780044567
公開日2009年11月18日 申請日期2007年11月21日 優先權日2006年12月6日
發明者E·布雷斯泰德, P·尼爾森, S·林德貝格 申請人:海莫庫公司