含有疏水蛋白的充氣食品的製作方法

2023-05-24 09:59:46 1

專利名稱：含有疏水蛋白的充氣食品的製作方法
技術領域：
本發明涉及包含疏水蛋白的冷凍產品。
背景技術：
冷凍產品在貯藏過程中，其中存在的冰晶因動力學過程如重結晶其大小往往會增大。這會導致不良的產品特性，如不良的外觀和不可接受的口感，和/或導致產品損害。之前已有建議使用稱為「抗凍蛋白」(也稱「制約冰晶結構的蛋白質(ice structuring protein)」)的蛋白質來抑制冰重結晶過程。
發明概述我們發現，在真菌中發現的一類稱為疏水蛋白的蛋白質也能夠抑制冷凍產品中的冰晶生長。
因此，本發明提供冷凍組合物，如冷凍食品，所述組合物包含疏水蛋白，優選分離形式的疏水蛋白。在相關的方面，本發明提供冷凍組合物如冷凍食品，其包含能夠在空氣-液體表面裝配的形式的疏水蛋白，並提供加入了所述形式的疏水蛋白的冷凍組合物，如冷凍食品。
優選疏水蛋白是II類疏水蛋白。
在優選的實施方案中，疏水蛋白的含量是至少0.001wt％，更優選至少0.01wt％。
在一個實施方案中，冷凍組合物是充氣的。在另一個實施方案中，冷凍組合物是不充氣的。
在相關的方面，本發明提供用以生產本發明的冷凍食品的組合物，所述組合物包含疏水蛋白，優選分離形式的疏水蛋白，以及至少一種所述食品的其餘成分，所述組合物為非冷凍形式。優選所述組合物包含所述食品的所有其餘成分。
在相關的實施方案中，本發明提供用以生產本發明的冷凍食品的幹組合物，所述組合物包含疏水蛋白，優選分離形式的疏水蛋白，以及至少一種所述食品其餘的非液體成分。優選所述組合物包含所述食品所有其餘的非液體成分。
本發明還提供疏水蛋白在抑制冷凍組合物中冰晶生長的方法中的用途。優選疏水蛋白用以抑制冰重結晶。
在相關的方面，本發明還提供疏水蛋白在改變冷凍組合物中冰晶習性的方法中的用途。
本發明進一步提供抑制冷凍組合物中冰晶生長例如冰重結晶的方法，所述方法包括在所述組合物冷凍之前和/或冷凍過程中向組合物加入疏水蛋白。
在相關的方面，本發明提供改變冷凍組合物中冰晶習性的方法，所述方法包括在所述產品冷凍之前和/或冷凍過程中向組合物加入疏水蛋白。
在上述用途和方法的優選實施方案中，所述組合物是冷凍食品。
發明詳述除非另有定義，本文使用的所有技術和科學術語具有相關領域(如冷卻糖食品/冷凍糖食品製造、化學和生物技術領域)普通技術人員通常理解的相同含義。冷卻/冷凍糖食品製造中使用的各種術語和技術的定義和描述見於Ice Cream，第4版，Arbuckle(1986)，VanNostrand Reinhold Company，New York，NY。用於分子和生化方法技術可見於Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.和Ausubel等，Short Protocols in Molecular Biology(1999)第4版，JohnWiley Sons，Inc.，完全版本名為Current Protocols in MolecularBiology)。
疏水蛋白疏水蛋白是定義明確的一類蛋白質(Wessels，1997，Adv.Microb.Physio.381-45；Wosten，2001，Annu Rev.Microbiol.55625-646)，能夠在疏水/親水界面自裝配，具有以下保守序列Xn-C-X5-9-C-C-X11-39-C-X8-23-C-X5-9-C-C-X6-18-C-Xm(SEQ ID No.1)其中X代表任何胺基酸，n和m獨立代表整數。通常，疏水蛋白的長度最多達125個胺基酸。保守序列中的半胱氨酸殘基(C)是二硫鍵的一部分。在本發明情形中，術語疏水蛋白具有更寬的含義，包括仍顯示在疏水-親水界面自裝配產生蛋白質膜的特性的功能等價蛋白質，如包含以下序列或其部分、仍顯示在疏水-親水界面自裝配產生蛋白質膜的特性的蛋白質Xn-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-100-C-X1-100-C-X1-50-C-X0-5-C-X1-50-C-Xm(SEQ ID No.2)按照本發明的定義，自裝配可通過將蛋白質吸附到特氟隆(Teflon)上，並用圓二色性確定二級結構(一般是α-螺旋)的存在來檢測(De Vocht等，1998，Biophys.J.742059-68)。
膜的形成可通過將特氟隆薄片(sheet)在蛋白質溶液中溫育，然後用水或緩衝液至少洗滌三次來確定(Wosten等，1994，Embo.J.135848-54)。蛋白質膜可用任何合適的方法來顯現，如用螢光標誌進行標記，或者使用螢光抗體，這在本領域是已經確立的。m和n的數值通常在0-2000的範圍，但更通常是m和n加起來小於100或200。在本發明情形中，疏水蛋白的定義包括疏水蛋白和另一種多肽的融合蛋白以及疏水蛋白與其它分子如多糖的綴合物。
目前為止得到鑑定的疏水蛋白一般可歸類為I類或II類疏水蛋白。這兩種類型的疏水蛋白在真菌中已被鑑定為分泌蛋白，可在疏水-親水界面自裝配成兩性膜。I類疏水蛋白的裝配物相對不可溶，而II類疏水蛋白的裝配物則容易溶解於各種溶劑中。
還在絲狀細菌如放線菌(Actinomycete sp.)和鏈黴菌(Steptomycessp.)中鑑定出疏水蛋白樣蛋白質(WO01/74864)。這些細菌蛋白質與真菌疏水蛋白相比，只能最多形成一個二硫鍵，因為它們只有兩個半胱氨酸殘基。這種蛋白質是具有SEQ ID No.1和2所示共有序列的疏水蛋白功能等價物的實例，落入本發明的範圍之內。
可用任何合適的方法從天然來源如絲狀真菌提取獲得疏水蛋白。例如，可通過培養能將疏水蛋白分泌到生長培養基中的絲狀真菌，或者通過用60％乙醇從真菌菌絲體提取，來獲得疏水蛋白。特別優選從能天然分泌疏水蛋白的宿主生物分離疏水蛋白。優選的宿主是絲孢菌(例如木黴屬)、擔子菌和子囊菌。特別優選的宿主是食品級生物，如能分泌稱為cryparin的疏水蛋白的慄疫病菌(Cryphonectriaparasitica)(MacCabe和Van Alfen，1999，App.Environ.Microbiol 655431-5435)。
或者，可用重組技術獲得疏水蛋白。例如可對宿主細胞(通常是微生物)進行修飾以表達疏水蛋白，然後疏水蛋白可根據本發明進行分離和使用。用以將編碼疏水蛋白的核酸構建物引入到宿主細胞中的方法是本領域公知的。已經從16種以上的真菌克隆了超過34個編碼疏水蛋白的基因(參見例如WO96/41882，該專利給出了在雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)中鑑定出的疏水蛋白的序列；和Wosten，2001，Annu Rev.Microbiol.55625-646)。也可以用重組技術來修飾疏水蛋白序列或者合成具有需要的/改進特性的新型疏水蛋白。
通常，用編碼所需疏水蛋白的核酸構建物轉化適當的宿主細胞或生物。可將編碼所述多肽的核苷酸序列插入到編碼轉錄和翻譯的必需元件的合適表達載體中，插入的方式要使得所述核苷酸序列在適當條件下會被表達(例如在適當的方向上和正確的讀框中，有適合的靶向和表達序列)。構建這些表達載體所需的方法是本領域技術人員公知的。
有多種表達系統可用來表達多肽編碼序列。這些表達系統包括但不限於細菌、真菌(包括酵母)、昆蟲細胞系統、植物細胞培養系統和植物，它們都用用適當的表達載體轉化。優選的宿主是被認為是食品級——公認為安全(GRAS)的宿主。
合適的真菌包括酵母如(但不限於)酵母菌屬(Saccharomyces)、(Kluyveromyces)、畢赤氏酵母屬(Pichia)、漢遜酵母屬(Hansenula)、假絲酵母屬(Candida)、裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)等屬酵母和絲狀真菌如(但不限於)麴黴屬(Aspergillus)、木黴屬(Trichoderma)、毛黴屬(Mucor)、鏈孢黴屬(Neurospora)、鐮刀菌屬(Fusarium)等屬絲狀真菌。
編碼疏水蛋白的序列優選在胺基酸水平上與在自然界鑑定的疏水蛋白有至少80％的同一性，更優選有至少95％或100％的同一性。但是，本領域技術人員可作出不降低疏水蛋白的生物活性的保守置換或其它胺基酸變化。對於本發明的目的，這些擁有與天然疏水蛋白的高水平同一性的疏水蛋白，也包括在術語「疏水蛋白」當中。
疏水蛋白可例如按WO 01/57076描述的程序從培養基或細胞提取物中純化，所述程序涉及將含疏水蛋白的溶液中存在的疏水蛋白吸附到表面上，然後將該表面與表面活性劑如Tween 20接觸，以從該表面洗脫出疏水蛋白。另參見Collen等，2002，Biochim Biophys Acta.1569139-50；Calonje等，2002，Can.J.Microbiol.481030-4；Askolin等，2001，Appl Microbiol Biotechnol.57124-30和De Vries等，1999，Eur J Biochem.262377-85。
冷凍組合物冷凍組合物/冷凍產品包括冷凍食品和冷凍生物材料。冷凍食品包括冷凍植物來源材料如水果和蔬菜，冷凍動物來源材料如冷凍肉和魚，以及冷凍加工食品如現成膳食、調味汁和冷凍糖食如冰淇淋、乳冰、冷凍酸乳酪、冰糕、糖漿飲料、冷凍蛋奶甜羹、水凍冰塊、清涼果汁飲料、格蘭尼它冰糕(Granitas)和冷凍果泥。
本發明的冷凍組合物可以是充氣的或不充氣的。術語「充氣」指已例如通過機械手段有意地將氣體引入到了產品中。氣體優選是任何食品級氣體，如空氣、氮氣或二氧化碳。充氣程度，尤其是在充氣食品的情形中，通常以「膨脹度」來定義。在本發明的情形中，％膨脹度按體積定義為((充氣終產品的體積-混合料的體積)/混合料的體積)×100產品的膨脹度須根據所需的產品特性而變。例如，冰淇淋的膨脹度水平通常是約70-100％，而水凍冰塊則是25-30％。
不充氣組合物如冷凍食品的膨脹度優選低於20％，更優選低於10％。不充氣冷凍食品沒有經歷故意的處理步驟如攪打以增加氣體含量。儘管如此，應認識到在不充氣冷凍食品的製作過程中，可能有低水平的氣體如空氣摻入到其中。
冷凍糖食品冷凍糖食包括通常包含乳或乳固體的糖食，如冰淇淋、乳冰、冷凍酸乳酪、冰糕和冷凍蛋奶甜羹，以及不含乳或乳固體的冷凍糖食，如水凍冰塊、清涼果汁飲料、格蘭尼它冰糕和冷凍果泥。
冷凍糖食可為複合產品的形式，產品中至少一部分或區域(如芯或覆層)不含有疏水蛋白。其實例是以下產品，其中冰淇淋芯沒有疏水蛋白，包覆芯的冰淇淋、乳冰或水凍冰塊覆層則含有疏水蛋白。應認識到，在複合產品的情況下，所加入的疏水蛋白的wt％只針對糖食中含有疏水蛋白的成分而不是針對整個產品來計算。
充氣冷凍糖食的膨脹度優選是25％-300％，如25％-150％，更優選50-150％。
本發明冷凍組合物中存在的疏水蛋白的量一般須根據產品配方而變，在充氣產品的情況下根據空氣相的體積而變。通常，產品須含有至少0.001wt％疏水蛋白，更優選至少0.005或0.01wt％。通常產品須含有低於1wt％疏水蛋白。疏水蛋白可來自單一來源或多個來源，例如疏水蛋白可以是兩種或多種不同的疏水蛋白多肽的混合物。
優選疏水蛋白是II型疏水蛋白。
本發明還涵括用以生產本發明的冷凍食品的組合物，所述組合物包含疏水蛋白。一般地，疏水蛋白須為分離形式，通常至少部分純化，如以固形物重量計至少10％或20％純。因此，疏水蛋白並不是作為天然表達疏水蛋白的天然生物如蘑菇的一部分來加入。相反，疏水蛋白通常須是從天然來源提取得到的，或者是通過在宿主生物中重組表達獲得的。
這種組合物包括液體預混合料，例如用以生產冷凍糖食品的預混合料，和幹混合料例如粉末料，其在冷凍之前或冷凍過程中加入含水液體如乳或水。
用以生產本發明的冷凍食品的組合物除包含疏水蛋白外，還須包含食品中通常包括的其它成分，例如糖、脂肪、乳化劑、調味劑等。所述組合物可包含製作所述食品所需的所有其餘成分，使得它可容易地加工形成本發明的冷凍食品。
用以生產本發明的冷凍食品的幹組合物除包含疏水蛋白外，還須包含食品中通常包括的其它成分，例如糖、脂肪、乳化劑、調味劑等。所述組合物可包含製作所述食品所需的所有其餘非液體成分，使得使用者所要做的只是加入含水液體如水或乳，所述組合物就可容易地加工形成本發明的冷凍食品。這些幹組合物的實例包括粉末料和顆粒料，可被設計成供工業使用和零售使用，且得益於體積減少和貨架期延長。
向組合物中加入的疏水蛋白的形式和數量，要使得疏水蛋白能抑制冰晶生長如冰重結晶和/或改變冰晶習性。術語「加入」我們用以指有意地將疏水蛋白引入到組合物中，目的是利用它的抑制冰晶生長和/或改變冰晶習性的能力。因此，對於存在或加入了含有真菌汙染物的成分，而真菌汙染物可能含有疏水蛋白多肽的情況，這並不等同於本發明情形當中的加入疏水蛋白。
通常，加入到產品中的疏水蛋白的形式是能夠在空氣-液體表面自裝配的形式。
通常，疏水蛋白以分離形式加入的本發明的組合物中，通常至少部分純化，如固形物重量計至少10％純。所謂「以分離形式加入」我們指疏水蛋白並不是作為天然表達疏水蛋白的天然生物如蘑菇的一部分來加入。相反，疏水蛋白通常須是從天然來源提取得到的，或者是通過在宿主生物中重組表達獲得的。
所加入的疏水蛋白可用以減少或抑制冰晶的生長，例如以抑制冰重結晶的過程，和/或改變冰晶習性(即冰晶形狀)。抑制和/或改變可在冷凍過程中和/或冷凍之後如貯藏過程中發生。在冷凍過程中對冰晶生長和/或冰晶習性的抑制可用來改變產品的質地。冰重結晶的抑制可提高產品對熱濫用的穩定性。
疏水蛋白也可用來抑制細胞生物材料中的冰晶生長如冰重結晶和/或冰晶習性。這會有助於減少用以保存生物材料的冷凍方法對細胞造成的損害。這種生物材料包括單細胞生物和細胞系的培養物；配子如精子和卵子；和衍生自多細胞生物(動植物)的組織和器官。
因此，本發明還提供冷凍的細胞生物材料，其包含分離形式的疏水蛋白，優選包含至少0.001wt％疏水蛋白，條件是將人排除在外。
本發明進一步提供疏水蛋白在冷凍細胞生物材料中抑制冰晶生長如冰重結晶和/或改變冰晶習性的用途。抑制/改變可在生物材料的冷凍過程中和/或冷凍之後發生。
現參考以下只是示例性而非限制性的實施例對本發明作進一步的描述。
附圖簡述

圖1是顯示充氣冷凍產品的剪切方案(regime)的示圖。
圖2是充氣冷凍產品微結構的掃描電子顯微照片-新鮮的和熱濫用後的(放大倍數×100)。
圖3是充氣冷凍產品微結構的掃描電子顯微照片-新鮮的和熱濫用後的(放大倍數×300)。
圖4顯示不充氣產品的掃描電子顯微照片(無HFBII)(50×放大倍數)。
圖5顯示不充氣產品的掃描電子顯微照片(有HFBII)(50×放大倍數)。
實施例1-充氣冷凍產品用3種類型的蛋白質製備充氣冷凍產品A酪蛋白酸鈉(Na Cas)B脫脂奶粉(SMP)C來自裡氏木黴(Trichoderma reesei)疏水蛋白(HFB II)對各產品在溫度濫用方案之前和之後的微結構特性和物理特性進行比較。
材料所用材料的具體細節在表1中總結，用以製備每種充氣冷凍產品的配方在表2中顯示。
表1.所用材料
表2.所用配方
充氣冷凍產品的製備混合料(乳狀液)製備所有的混合料均按100g批量製備。對於混合料A和B(分別含有酪蛋白酸鈉和脫脂奶粉)，將蛋白質與蔗糖混合，用磁力攪拌器分散到冷水中。然後將溶液攪拌加熱至60℃，保持5分鐘，接著冷卻至40℃。然後加入熔化的椰子脂，立即用Branson Sonifer(帶6.4mm錐形探頭)在70％振幅下將含水混合料超聲處理3分鐘，探頭浸沒在溶液中。然後將所得乳狀液在-10℃水浴中快速冷卻，直到溶液溫度為5℃，以使脂肪滴結晶。將混合料在5℃下貯藏備用。
對於混合料C(含有HFB II)，首先將蔗糖攪拌分散到冷水中。然後，將一半所需濃度的HFB II作為等分試樣加入。接著將溶液在超聲浴中溫和超聲處理30秒，以使HFB II完全分散。然後將此溶液在磁力攪拌器上攪拌和加熱至40℃。在加入熔化的脂肪之前，再將溶液在超聲浴中超聲處理30秒。然後加入熔化的脂肪，所得混合料按對混合料A和B的描述進行乳化和冷卻。接著向此冷溶液中加入另一HFB II等分試樣，以使HFB II濃度達到0.2％。第一個0.1％HFBII用以使脂肪乳化和穩定化。HFB II的第二次加入則會提供足夠過量的HFB II，以提供良好的充氣作用和泡沫穩定性。
用Malvern Mastersizer 2000對冷凍的乳狀液進行顆粒大小分析。
乳狀液的分析按照這一方法，我們能夠製備出具有小脂肪滴的乳狀液。表3總結了所測出的油滴大小。
表3.用Malvern Mastersizer 2000測出的乳狀液顆粒大小
剪切冷凍方法將80ml混合料在圓柱形垂直安裝帶夾套的不鏽鋼容器中同時進行剪切和冷凍，該容器的內部大小是高度105mm，直徑72mm。該容器的蓋佔滿其內部體積的54％，只留下46％(180ml)給樣品。用以剪切樣品的轉子由正確大小的矩形推進器(尺寸72mm×41.5mm)組成，以在容器旋轉過程中刮擦容器的表面邊界(surface edge)。轉子上還連接有兩個半圓形(60mm直徑)高剪切葉片，該葉片與該矩形附加裝置成45°角定位。容器外包圍著夾套，夾套裡有冷卻劑流過。
充氣和冷凍樣品(prototype)大體上如下產生用推進器在高剪切速度下混合密閉容器裡的混合料，以摻入空氣。同時，冷卻劑流過容器夾套，使混合料冷凍下來。推進器還刮擦容器內壁，將內壁上形成的冰除去並摻入到混合料當中。開始時用高剪切使混合料充氣，然後將剪切速度降下來，以便更好地進行冷凍。每種混合料所用的剪切方案在圖1中圖示。
對於混合料A和B(分別含有酪蛋白酸鈉和脫脂奶粉)的冷凍和充氣步驟，設定冷凍劑(設定在-18℃)從時間＝0分鐘開始循環。混合料A和B在開始時攪拌速度較慢，是為了便於冷卻混合料和產生一定的粘度(通過冰的形成和摻入)，然後才用較高的剪切速度進行充氣。在高速度下短時間就將空氣摻入，然後逐步降低速度，以讓樣品達到至少-5℃。
對於混合料C(含有HFB II)，將容器冷卻至約5℃，加入樣品，啟動高剪切充氣。冷卻劑(設定在-18℃)在第9分鐘才開啟進行循環，因為要產生100％膨脹度所需的時間增加。一旦開啟冷卻劑進行循環(第9分鐘)，則採取和前面的A和B一樣的剪切-冷卻模式。
在整個過程結束時，測量膨脹度，將樣品(大約15g)放入小罐中。將每種產品在設定在-80℃的冷凍裝置中再冷卻10分鐘，然後在-20℃下貯藏。
充氣冷凍產品的分析所有的充氣冷凍產品均按兩種溫度方案進行貯藏(a)-20℃。隨後在生產後一星期內進行分析，我們認為這種產品是「新鮮」產品。
(b)使溫度濫用樣品經歷-10℃貯藏1或2個星期，然後分析前在-20℃下貯藏。
表4.從混合料A、B和C製備的產品的過程細節和產品膨脹度。
終產品作如下分析剛製得的產品的膨脹度新鮮產品和溫度濫用產品的SEM分析新鮮產品和溫度濫用產品的熔化行為膨脹度每種產品的膨脹度在表4中總結。所有的混合料都是可充氣的，摻入了大量的空氣。
微結構穩定性方法掃描電鏡術(SEM)每種產品的微結構用低溫掃描電鏡術(LTSEM)來顯現。將樣品在乾冰上冷卻至-80℃，切出樣品斷片。用Tissue TekOCTTM化合物(PVA 11％、Carbowax 5％和85％非反應性成分)，將大小約5mm×5mm×10mm的此斷片安放在樣品支持器上。將樣品包括支持架投入液氮漿(slush)中，並轉移到低溫製備室Oxford Instrument CT1500HF中。製備室處在約10-4巴真空下，樣品升溫至-90℃。冰被慢慢蝕刻，暴露出不由冰本身產生的表面細節，因此在此溫度下要在恆定真空下除水60-90秒。樣品一旦蝕刻好，就將其冷卻至-110℃以結束升華作用，並使用氬等離子體包覆以金。這個過程也發生在真空下，施加10-1毫巴壓力、6毫安電流45秒。然後將樣品轉移到常規的掃描電子顯微鏡(JSM 5600)，該掃描電子顯微鏡裝配有溫度-160℃的Oxford Instruments冷臺。檢查樣品，並通過數字影像擷取軟體捕獲目的區域。
冷凍斷裂透射電鏡術(TEM)將樣品放在置於乾冰床上的鋁盤上，用冷的解剖刀切出大約5mm×3mm×3mm的小塊。使用Tissue-Tek O.C.T化合物(Sakura Finetek，Europe BV)，將樣品塊垂直安放在大的「禮帽」冷凍斷裂支持器中。立即在液氮下將該支持器放入Cressingtion CFE-50的轉移裝置中，並轉移到冷凍斷裂室(-180℃)中。樣品用擺動式切片刀擊打一次發生斷裂，然後在-95℃下蝕刻10分鐘。蝕刻出的表面用鉑/碳旋轉造影(rotary shadow)(45°)至2nm的厚度，然後用碳包覆至10nm的厚度。將包覆樣品移出冷凍斷裂室和轉移裝置，金屬複製品就漂浮離開樣品到水上。將複製品在鉻酸中清洗，用水洗滌數次，然後收集在400目銅EM網格上。讓網格乾燥，然後進行TEM檢查。
用在100KV下操作的JEOL 1200EX II顯微鏡進行TEM檢查。用Bioscan照相機和Digital Micrograph軟體(Gatan Inc)獲取影像。
微結構分析結果用掃描電鏡術(SEM)檢查了新鮮的和溫度濫用的冷凍產品的微結構。不同放大倍數的代表性影像見圖2和3。
新鮮樣品的結果顯示，含有HFB II的產品(從混合料C製備)顯著地且令人驚異地不同於含有更多常規蛋白質(即混合料A或B)的產品。所觀察到的不同特性有氣胞更小，冰晶稜角更多和冰晶融合稍多。對於產品A和B，我們估計新鮮樣品中冰晶大小為直徑50-100μm。對於產品C，我們估計冰晶大小為直徑40-60μm。
溫度濫用後，SEM影像清楚顯示，含有HFB II的產品(從混合料C製備)還保留著它原來的微結構，即相對來說冰晶顯現和氣泡粗化的情況極少。在-10℃下貯藏1個星期和2個星期也是這樣。但是，含有Na Cas和SMP(分別來自混合料A和B)的樣品僅僅在-10℃的溫度濫用下一個星期後，就顯示出非常嚴重的氣泡和冰結構粗化現象。
總的來說，現清楚，被製成含HFBII的冷凍產品比用酪蛋白酸鈉或脫脂奶粉製成的冷凍產品顯示出對溫度濫用高得多的穩定性。HFBII對氣泡和冰晶大小和穩定性兩方面都有影響。
熔化行為方法將冷凍產品的樣品放在室溫(20℃)下的金屬網格上。觀察產品隨時間的熔化情況，特別是形狀保持力和泡沫穩定性。
熔化行為結果這些微結構上的差異(穩定的泡沫和穩定的冰)對冷凍產品的熔化行為有一定的影響。從混合料C(含有HFBII)製得的充氣冷凍樣品，比起用酪蛋白酸鈉或脫脂奶粉(即分別混合料A和B)製得的產品，在熔化時能更好地保持其形狀。
隨著冰發生熔化形成水，水會流過金屬網格。但是，對於含HFBII的產品，許多泡沫仍保留在網格上，網格下面可觀察到少數穩定的泡沫滴(數據未給出)，這兩個特性在常規的蛋白質(酪蛋白酸鈉和脫脂奶粉)上均沒有觀察到。這說明每種所用的蛋白質之間在泡沫穩定性方面的差異。
產品A、B和C之間的質地差異三種樣品在-10℃下貯藏一個星期後(即穩定濫用樣品)，也可觀察到它們之間在質地方面有明顯的差異。在觸摸用酪蛋白酸鈉(A)和脫脂奶粉(B)製得的產品時，注意到這些產品具有非常鬆軟和非常易成薄片的質地，難以從用於襯墊樣品罐的塗矽紙乾淨地取下來。另一方面，用HFB II製得的產品(C)非常結實，能非常乾淨地從襯墊樣品罐的塗矽紙釋放出來。換句話說，用HFB II製備的產品比用酪蛋白酸鈉或脫脂奶粉製備的產品，在微觀和宏觀規模上對溫度濫用都顯示出高得多的穩定性。
實施例2非充氣冷凍產品製備了兩種溶液，一種含有來自裡氏木黴的疏水蛋白HFB II。另一種不含疏水蛋白。兩種溶液的組成在表5中顯示。
表5-非充氣產品的配方
HFB II由上述VTT Biotechnology提供，蔗糖由Tate Lyle提供。黃原膠由CP Kelco(美國亞特蘭大)提供，屬冷水可分散級(KeltrolRD)。
非充氣冷凍產品的製備和分析兩種溶液均按100g批量製備。如下製備蔗糖/黃原膠溶液將所需量的室溫去離子水加入到蔗糖和黃原膠的幹混合物中，然後用磁力攪拌器混合至溶質完全溶解。在樣品2的情況下，然後將HFB II以5.3mg/ml溶液的等分試樣加入，接著將溶液在磁力攪拌器上再混合10分鐘。
非充氣溶液的冷凍以靜止方式進行(即不同時施加剪切)。用每種溶液充滿8ml體積的小平皿。然後將平皿放入-18℃家用冷藏櫥櫃中24小時，在這個時間內樣品發生冰凍。
冰凍後，用實施例1所述的相同製備方法，通過SEM分析每種樣品的微結構。
微結構分析-結果每種樣品50×放大倍數的代表性SEM影像可見於圖4和5。可辨別出，含有HFB II的溶液(樣品2)的微結構更細，含有特徵尺寸更小的冰晶。例如，樣品1(圖4)的伸長的樹枝狀結構比樣品2(圖5)見到的更寬更長。這說明了疏水蛋白對減少冰晶生長過程——導致尺寸更小的冰晶的影響。
上文各單獨節內容提及到的本發明各個不同的特徵和實施方案，在適當的情況下作了必要的修正也適用於其它節。因此，在適當的情況下可將在一節中載明的特徵與在其它節中載明的特徵結合在一起。
以上說明書中提到的所有出版物通過引用結合到本文中。不背離本發明的範圍對已描述的本發明方法和產品所作的各種修改和變化，對本領域技術人員來說將是顯而易見的。雖然本發明已結合具體的優選實施方案進行了描述，但應認識到，要求保護的本發明不應不適當地限制於這些具體實施方案。實際上，對已描述的本發明各實施方式所作的各種對相關領域技術人員來說顯而易見的修改，都意在落入以下權利要求的範圍內。
序列表110Unilever et al.
120冰凍食品130F3383140PCT/EP2005/0069971412005-06-27150EP04254483.31512004-07-27150EP05251282.91512005-03-271602170PatentIn version 3.3210121115212PRT213假定的220重複221
222(1)..(1)223n個重複220
221重複222(3)..(3)22311-39個重複220
221重複222(6)..(6)2235-8個重複220
221重複222(8)..(8)2238-23個重複220
221重複222(10)..(10)2235-9個重複220
221重複222(13)..(13)2236-18個重複220
221重複222(15)..(15)223m個重複4001Xaa Cys Xaa Cys Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Cys Xaa Cys Xaa1 5 10 15
210221117212PRT213序列表220
221重複222(1)..(1)223n個重複220
221重複222(3)..(3)2231-50個重複220
221重複222(5)..(5)2230-5個重複220
221重複222(7)..(7)2231-100個重複220
221重複222(9)..(9)2231-100個重複220
221重複222(11)..(11)2231-50個重複220
221重複222(13)..(13)2230-5個重複220
221重複222(15)..(15)2231-50個重複220
221重複222(17)..(17)223m個重複4002Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys Xaa Cys1 5 10 15Xaa
權利要求
1.一種冷凍組合物，所述組合物包含分離形式的疏水蛋白。
2.權利要求1的冷凍組合物，所述組合物包含至少0.001wt％的疏水蛋白。
3.一種冷凍組合物，所述組合物包含至少0.001wt％的疏水蛋白。
4.權利要求1-3中任一項的冷凍組合物，其中所述疏水蛋白是II型疏水蛋白。
5.權利要求1-3中任一項的冷凍組合物，所述組合物是不充氣的。
6.前述權利要求中任一項的冷凍組合物，所述組合物是食品。
7.權利要求6的冷凍食品，所述食品是冷凍糖食品。
8.一種用以生產權利要求6或7的冷凍食品的組合物，所述組合物包含分離形式的疏水蛋白以及所述食品的其餘成分，所述組合物是未冷凍形式。
9.一種用以生產權利要求6或7的冷凍食品的幹組合物，所述組合物包含分離形式的疏水蛋白以及所述食品其餘的非液體成分。
10.疏水蛋白在抑制冷凍組合物中冰晶生長的用途。
11.權利要求10的用途，其中所述冷凍組合物是食品。
12.疏水蛋白在改變冷凍組合物中冰晶習性的用途。
13.權利要求12的用途，其中所述冷凍組合物是食品。
14.疏水蛋白在改進冷凍組合物的溫度耐受性中的用途。
15.權利要求14的用途，其中所述冷凍組合物是食品。
全文摘要
提供了包含疏水蛋白的冷凍組合物。還提供了疏水蛋白在抑制冷凍食品中冰晶生長和/或改變冰晶習性的用途。
文檔編號A23G9/38GK101039596SQ200580032210
公開日2007年9月19日 申請日期2005年6月27日 優先權日2004年7月27日
發明者D·L·阿爾德裡德, M·J·貝裡, D·J·切布拉, A·R·科克斯, M·D·戈爾丁, S·戈爾丁, R·D·基南, M·E·馬洛恩, S·特威格 申請人:荷蘭聯合利華有限公司