載脂蛋白-Ⅲ及其功能、製備方法和應用與流程

2023-10-17 16:32:24 2

技術領域：

本發明涉及生物醫藥技術領域，涉及載脂蛋白-ⅲ的結構及其獲得方法、新的生理功能以及在生物醫藥領域應用。具體地說，本發明涉及載脂蛋白-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段的結構及其製備生產方法與功能，以及其在微生物及其相關分子模式檢測診斷、促進昆蟲血淋巴黑色素產生、誘導昆蟲合成抗菌肽等生物醫藥領域中的應用，製備載脂蛋白-ⅲ及其衍生物或類似物或活性片段抗體及其在生物醫藥領域的應用。

背景技術：
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載脂蛋白(apolipophorin，apolp)作為重要的載脂功能蛋白，可以轉運甘油三酯、甾醇類物質等，但是現在未發現在昆蟲免疫中有什麼作用。載脂蛋白ⅲ(apolipophoriniii，apolp-ⅲ)是繼apolp-ⅰ和apolp-ⅱ之後發現的又一載脂蛋白apolipophorin超家族的一員，分子量約為18-20kda，具有水溶性、熱穩定性等特性，在昆蟲中普遍存在，且在脂肪體中合成後釋放到血淋巴中，主要在昆蟲飛行中起到轉運脂的作用。這種血淋巴蛋白在昆蟲體內主要以兩種形式，即非結合脂形式和結合脂形式存在。

現有研究結果表明，載脂蛋白-ⅲ主要是轉運中等大小的脂類物質。昆蟲體內apolp-ⅲ含量分析結果表明，一方面，由於在飛行過程提供轉載脂質體的功能，apolp-ⅲ在昆蟲成蟲體內的含量要遠遠高於幼蟲；另一方面，雖然幼蟲體內apolp-ⅲ的含量少，但仍比轉脂所需用量高很多，由此可以推測幼蟲體內apolp-ⅲ可能具有其他的生物學功能。1995年sun等在研究菸草天蛾時發現，apolp-ⅲ可能參與了先天性免疫反應的某些作用？當注射適量的菸草天蛾apolp-ⅲ到菸草天蛾幼蟲體內時發現，昆蟲體液的抗菌能力、溶菌能力有一定的增強，並刺激了吞噬作用的產生。相似結果也在美國白蛾中出現。而在家蠶中，將摻入了脂多糖(lps)的載脂蛋白注入昆蟲體內，這種結合物可很快從家蠶體液中被清除。

綜上所述，apolp-ⅲ是昆蟲體內普遍存在的一種具有載脂能力的功能蛋白，可能參與了昆蟲體內的先天性防禦中的某些作用。

目前尚未見對鱗翅目(lepidoptera)的天(大)蠶蛾科昆蟲apolp-ⅲ的結構、製備、生物學功能以及功能應用的研究。

技術實現要素：
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本發明所解決的技術問題是提供一系列載脂蛋白-ⅲ及其製備方法。

所述的載脂蛋白-ⅲ的胺基酸序列如id：1或id：2所示；

編碼所述載脂蛋白-ⅲ的胺基酸序列的基因序列如id：1所示。

本發明還提供了所述載脂蛋白-ⅲ的衍生物或類似物或活性片段及其重組載脂蛋白-ⅲ的衍生物或類似物或活性片段。

所述的載脂蛋白-ⅲ衍生物或類似物或活性片段包括id：3-12所述的胺基酸序列。

本發明進一步提供了所述載脂蛋白-ⅲ及其衍生物或類似物或活性片段，重組載脂蛋白-ⅲ及其衍生物或類似物或活性片段，以載脂蛋白-ⅲ及其衍生物或類似物或活性片段、重組載脂蛋白-ⅲ及其衍生物或類似物或活性片段作為抗原的抗體在生物領域中的應用，包括(1)針對微生物的預防、檢測診斷、治療等生物醫藥領域應用；(2)針對微生物相關分子模式的預防、檢測診斷、治療等生物醫藥領域應用；(3)針對載脂蛋白-ⅲ、載脂蛋白-ⅲ衍生物或類似物或活性片段、重組載脂蛋白-ⅲ、重組載脂蛋白-ⅲ衍生物或類似物或活性片段的檢測與追蹤等生物醫藥領域應用；(4)誘導昆蟲抗菌肽合成及其獲得的抗菌肽在生物醫藥領域應用。

具體地，所述應用包括(1)激活酚氧化酶原激活系統，(2)誘導昆蟲抗菌肽合成及其獲得的抗菌肽(3)在微生物及其相關分子模式檢測中的應用，(4)載脂蛋白-ⅲ、載脂蛋白-ⅲ衍生物或類似物或活性片段、重組載脂蛋白-ⅲ、重組載脂蛋白-ⅲ衍生物或類似物或活性片段的檢測與追蹤。

本發明是針對鱗翅目的天(大)蠶蛾科昆蟲體內的apolp-ⅲ，研究天然apolp-ⅲ的製備方法、一級結構(基因和蛋白質)、生物學功能以及其應用，利用基因工程技術獲得重組apolp-ⅲ及其衍生物或類似物或活性片段以及其生物學功能和應用。此外，利用天然、重組apolp-ⅲ及其衍生物或類似物或活性片段作為抗原，刺激機體產生抗體，同時研究了該抗體的應用。

本發明是通過如下技術方案實現的：

首先利用蛋白提取、分離、純化技術，從鱗翅目天(大)蠶蛾科昆蟲中分離、純化獲得天然apolp-ⅲ。其次，利用蛋白質化學技術以及分子生物學技術，解析apolp-ⅲ的一級結構(基因和蛋白質)並獲得其基因。再次，利用基因工程技術，實現apolp-ⅲ基因在宿主細胞的表達，結合蛋白提取、分離、純化技術獲得重組apolp-ⅲ。同時，利用基因重組技術，獲得apolp-ⅲ的衍生物或類似物或部分片段。天然、重組apolp-ⅲ以及其衍生物或類似物或部分片段，能特異性識別脂多糖、β-1,3-葡聚糖、肽聚糖、脂磷壁酸、甘露聚糖等多種微生物相關分子模式以及細菌、真菌等微生物。上述結合，一方面激活昆蟲體液免疫中的酚氧化酶原激活系統，另一方面激活昆蟲細胞免疫，即通過激活toll途徑誘導抗菌肽的合成。本發明的天然、重組apolp-ⅲ以及其衍生物或類似物或部分片段以及其抗體的生物學功能，可廣泛應用於針對微生物的預防、檢測診斷、治療等生物醫藥領域；同時，利用本發明的天然、重組apolp-ⅲ以及其衍生物或類似物或部分片段誘導昆蟲大量表達抗菌肽，由此製備獲得的抗菌肽可應用於微生物的預防、檢測診斷、治療等生物醫藥領域。

本發明的apolp-ⅲ，其胺基酸序列如id：1和id：2所示。

其製備方法如下：

一、天然apolp-ⅲ的製備

本發明所獲得天然apolp-ⅲ是通過如下技術方案實現的，包括：

以昆蟲血淋巴作為原料，分別通過親和層析、疏水層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、鹽析、超濾或上述方法的不同組合，分離純化得到不同純度乃至電泳純或hplc純的apolp-ⅲ。

其中，昆蟲血淋巴(簡稱血淋巴)，是昆蟲血液(或血細胞裂解物)和淋巴液的混合物、昆蟲壓榨或勻漿的體液，用緩衝溶液或酸性溶液或鹼性溶液溶解提取，離心除去不溶雜質得到的抽提液；

apolp-ⅲ的提取、分離、純化體系基本條件的特徵：(1)溶液的酸鹼度在ph2～ph10，優選ph4-ph9；(2)調節溶液酸鹼度的化學試劑是常規、通用的酸或鹼及其溶液。酸及其溶液優選hcl、hac、磷酸、檸檬酸、硫酸、硼酸。鹼及其溶液優選naoh、koh、tris、檸檬酸鈉或鉀鹽、磷酸鈉或鉀鹽、硼砂；(3)緩衝液是常規、通用緩衝離子對緩衝液，優選檸檬酸根緩衝離子對、hcl-tris緩衝離子對、檸檬酸根-磷酸根緩衝離子對、磷酸根緩衝離子對、醋酸根緩衝離子對、硼酸根緩衝離子對、硼酸-tris緩衝離子對、上述各緩衝離子的組合；(4)溶液或緩衝液的離子強度在0.001mol/l～0.8mol/l，優選0.01mol/l～0.3mol/l。上述條件既不破壞提取、分離、純化所採用介質的理化性質，又不影響apolp-ⅲ的生物活性。

昆蟲血淋巴的收集：將昆蟲用蒸餾水或去離子水反覆清洗，採用常規方法，如蠟盤法、離心法、背血管取血法、灌注法、壓榨、勻漿法、反射流血法、撕裂法、切割法、剪開法、穿刺法等，在10℃至～5℃條件下收集昆蟲血淋巴。

本發明的分離分析方法包含如下中的兩種或兩種以上的組合：

1.離子交換層析分離純化apolp-ⅲ

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件的特徵，用酸性溶液或鹼性溶液調ph至要求條件範圍下。將處理好的樣品上樣於預先用緩衝液平衡好的離子交換層析，先用緩衝液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以採用鹽濃度階段方式，分別用0.1mol/l、0.2mol/l、0.5mol/l、1mol/l、2mol/l、3mol/l鹽溶液進行階段洗脫；也可以採用鹽濃度梯度方式，梯度為0.00mol/l～3mol/l。利用抗apolp-ⅲ抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有apolp-ⅲ的洗脫液合併儲存備用；也可以採用常規、通用透析或超濾方法，除去洗脫合併液的鹽，或再進一步用需要的低濃度緩衝液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

離子交換層析分離純化的特徵：(1)層析介質選擇陽離子交換層析填料，如cm-離子交換層析填料或sp-離子交換層析填料或s-離子交換層析填料等陽離子交換層析填料，此時緩衝液酸鹼度選擇在ph2-ph7；(2)層析介質選擇陰離子交換層析填料，如q-離子交換層析填料或deae-離子交換層析填料或qae-離子交換層析填料等離子交換層析填料，此時緩衝液酸鹼度選擇在ph7-ph12；(3)緩衝液及其濃度選擇，按上述apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件所描述的特徵；(4)洗脫的鹽溶液可以選擇要求濃度的緩衝液或在緩衝液中加中性鹽到需要的濃度；(5)中性鹽選擇(nh4)2so4或na2so4或nacl或kcl，優選nacl；(6)分離純化操作溫度按上述apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件所描述的特徵。上述條件既不影響apolp-ⅲ的生物活性，又不影響活性成分的分離純化。

2.親和層析分離純化apolp-ⅲ

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件的特徵，用酸性溶液或鹼性溶液調ph至apolp-ⅲ的提取、分離、純化體系基本條件特徵的要求條件範圍內。將處理好的樣品液上樣於預先用緩衝液平衡好的親和層析，先用緩衝液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以採用鹽(或化學試劑)濃度梯度(0.0mol/l～3.0mol/l或0.0mol/l～6.0mol/l或0.0mol/l～8.0mol/l)方式洗脫；也可以採用鹽(或化學試劑)階段濃度洗脫方式，分別採用0.1mol/l、0.2mol/l、0.5mol/l、1mol/l、2mol/l、3mol/l、4mol/l、5mol/l、6mol/l、7mol/l、8mol/l鹽溶液進行階段方式洗脫。利用抗apolp-ⅲ抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有apolp-ⅲ的洗脫液合併儲存備用；也可以採用常規、通用透析或超濾方法，除去洗脫合併液的鹽(或化學試劑)或再進一步用需要的低濃度緩衝液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

親和層析分離純化的特徵：(1)親和填料的配基選擇apolp-ⅲ抗體、肝素、刀豆素、甲醛固定後的細菌或真菌、絲氨酸蛋白酶抑制劑(如苯甲咪)、sepharosecl-4b、甘露糖、n-乙醯氨基葡萄糖胺、肽聚糖、脂磷壁酸、脂多糖、葡聚糖等；(2)分離純化操作溫度、緩衝液、酸鹼度選擇，是按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件所描述的特徵；(3)洗脫的鹽(或化學試劑)溶液可以選擇要求濃度的緩衝液或在緩衝液中加鹽(或化學試劑)到需要的濃度；(4)洗脫用鹽(或化學試劑)可以選擇(nh4)2so4或na2so4或nacl或kcl或尿素或鹽酸胍；(5)洗脫用鹽(或化學試劑)選擇(nh4)2so4或na2so4或nacl或kcl的最高濃度為3.0mol/l，選擇尿素的最高濃度為8.0mol/l，選擇鹽酸胍的最高濃度為6.0mol/l；(6)如果洗脫用鹽(或化學試劑)選擇了尿素或鹽酸胍而使apolp-ⅲ發生變性作用，可以通過常規、通用的蛋白質復性方法進行復性而獲得apolp-ⅲ。

3.疏水層析分離純化apolp-ⅲ

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件的特徵，用酸性溶液或鹼性溶液調ph至apolp-ⅲ的提取、分離、純化體系基本條件特徵的要求條件範圍內。加中性鹽至2mol/l濃度，上樣於預先用2mol/l中性鹽-緩衝液溶液平衡的疏水層析柱，先用2mol/l中性鹽-緩衝液溶液充分洗滌去除不吸附的雜蛋白。洗脫方式，可以採用中性鹽濃度梯度(2.0mol/l～0.0mol/l)方式洗脫；也可以採用鹽濃度階段洗脫方式，分別採用1.5mol/l、1.0mol/l、0.5mol/l、0.25mol/l、0.2mol/l、0.1mol/l、0.0mol/l中性鹽溶液進行階段方式洗脫。利用抗apolp-ⅲ抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有apolp-ⅲ的洗脫液合併儲存備用；也可以採用常規、通用透析或超濾方法，除去洗脫合併液的鹽或再進一步用需要的低濃度緩衝液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

疏水層析分離純化的特徵：(1)疏水層析介質選擇苯基-疏水層析填料或正辛烷-疏水層析填料-或己烷-疏水層析填料-或丁烷-疏水層析填料；(2)中性鹽選擇(nh4)2so4或na2so4或nacl；(3)分離純化操作溫度、緩衝液、酸鹼度選擇，是按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件所描述的特徵。

4.凝膠層析分離純化apolp-ⅲ

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件的特徵，用酸性溶液或鹼性溶液調ph至apolp-ⅲ的提取、分離、純化體系基本條件特徵的要求條件範圍內。樣品液上樣於預先用緩衝液平衡好的凝膠過濾層析柱並進行分離純化洗脫，利用抗apolp-ⅲ抗體檢測目的蛋白的存在情況，將含有apolp-ⅲ的洗脫液合併儲存備用；也可以採用常規、通用透析或超濾方法，除去洗脫合併液的鹽或再進一步用需要的低濃度緩衝液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

凝膠層析分離純化的特徵：(1)層析介質可以選擇sephacryls-100hr或sephacryls-200hr或sephadexg-50或sephadexg-75或sephadexg-100或sephadexg-150或superose12prepgrade或superose6prepgrade或superdex30prepgrade或superdex75prepgrade或superose12hr或superose6hr或superdexpeptidehr或superdex75hr或superdexpeptidepe等凝膠層析填料；(2)分離純化操作溫度、緩衝液、酸鹼度選擇，是按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件所描述的特徵，此外洗脫液的濃度，優選在離子濃度大於0.15m及以上。

5.鹽析分離純化apolp-ⅲ

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件的特徵，用酸性溶液或鹼性溶液調ph至apolp-ⅲ的提取、分離、純化體系基本條件特徵的要求條件範圍內。在樣品溶液中加入蛋白質鹽析常規、通用的中性鹽，至濃度達到apolp-ⅲ仍處於溶解狀態，而一些雜蛋白處於沉澱。離心取其上清溶液繼續加入鹽析常規、通用的中性鹽至濃度達到apolp-ⅲ沉澱狀態。離心棄上清，沉澱溶於apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件特徵的溶液或緩衝液儲存備用；沉澱的溶解液，也可以採用常規、通用透析或超濾方法，除去其中的鹽或再進一步用需要的低濃度緩衝液透析或超濾處理，儲存上述樣品溶液備用。

鹽析分離純化的特徵：(1)分離純化的緩衝液、酸鹼度選擇，是按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件所描述的特徵；(2)鹽析使用的中性鹽，選擇(nh4)2so4或na2so4或nacl，優選(nh4)2so4或na2so4；(3)在使apolp-ⅲ處於溶解狀態時，選擇中性鹽在5％—30％，優選15％—30％；(4)在使apolp-ⅲ處於沉澱狀態時，選擇中性鹽在30％—90％，優選35％—75％。

6.超濾分離純化apolp-ⅲ以及處理apolp-ⅲ溶液

取上述方法所獲昆蟲血淋巴，按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件的特徵，用酸性溶液或鹼性溶液調ph至apolp-ⅲ的提取、分離、純化體系基本條件特徵的要求條件範圍內。利用常規、通用超濾方法，分離純化apolp-ⅲ。一種方案，選擇一定規格的超濾膜，使apolp-ⅲ透過超濾膜，而一些雜蛋白則被超濾膜截留，從而使apolp-ⅲ得以分離純化；透過超濾膜的apolp-ⅲ溶液，再選擇一定規格的超濾膜，使apolp-ⅲ被截留，而一些雜蛋白則透過超濾膜，從而使apolp-ⅲ得以分離純化。另一種方案，是選擇一定規格的超濾膜，使apolp-ⅲ先被超濾膜截留，隨後再選擇一定規格的超濾膜，使apolp-ⅲ透過超濾膜，從而使apolp-ⅲ得以分離純化。

超濾處理apolp-ⅲ溶液的目的，是除去apolp-ⅲ溶液中的鹽或小分子雜質或更換緩衝液。此外，對apolp-ⅲ溶液進行濃縮。處理方法同上所述，選擇一定規格的超濾膜，使apolp-ⅲ被超濾膜截留，而鹽或小分子雜質或緩衝液的緩衝離子對則透過超濾膜，從而實現去除鹽、小分子雜質或更換緩衝液或濃縮的目的。

超濾分離純化和處理的特徵：(1)透過apolp-ⅲ的超濾膜選擇分子量為20kda或30kda或40kda或50kda或60kda規格的超濾膜，優選20kda～50kda的超濾膜，大於或小於優選規格的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；(2)截留apolp-ⅲ的超濾膜選擇是分子量為3kda或10kda或20kda或30kda的超濾膜，優選10kda～30kda的超濾膜，大於或小於優選規格的超濾膜，其收率或超濾效率均受影響；(3)超濾分離純化或處理的操作溫度、緩衝液及其酸鹼度或濃度選擇，是按apolp-ⅲ提取、分離、純化體系基本條件所描述的特徵。

通過上述任何一種方法所獲得的apolp-ⅲ純度，有時無法滿足相應需要。

本發明是從昆蟲血淋巴中分離純化高純度apolp-ⅲ，並可以達到電泳純乃至hplc純度。其特徵在於，將上述六種分離純化方法(離子交換柱層析、親和柱層析、疏水柱層析、凝膠過濾柱層析、鹽析、超濾)，進行兩種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或三種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或四種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，或五種分離純化方法自由組合及其順序重排組合，純化方法自由組合及其順序重排組合，直至樣品純度得到預期要求。

本發明所指昆蟲是鱗翅目昆蟲，鱗翅目昆蟲優選天(大)蠶蛾科(saturniidae)昆蟲，選自柞蠶、蓖麻蠶、天蠶、印度柞蠶、琥珀蠶、美國柞蠶、樗蠶、大山蠶、美洲天蠶、樟蠶、楓蠶，昆蟲為任何地域的天然或人工放養或人工飼養的昆蟲。為使本專業技術人員更全面、清晰理解本發明，以柞蠶作為代表來描述下面的內容，而選擇柞蠶作為代表來描述並不是以任何方式限制本發明權利要求的範圍。

本發明所述的重組載脂蛋白-ⅲ、重組載脂蛋白-ⅲ衍生物或類似物或活性片段是利用基因工程表達獲得，包括(1)原核生物系統的表達載體，表達宿主細胞為大腸桿菌細胞或枯草桿菌細胞，(2)酵母細胞系統的表達載體，表達宿主細胞為酵母細胞，(3)昆蟲細胞系統的表達載體，表達宿主細胞為昆蟲細胞，(4)哺乳動物細胞系統的表達載體，表達宿主細胞為哺乳動物細胞，(5)上述表達形式為細胞內表達或分泌形式表達，(6)上述表達體系中的表達產物作為製備重組載脂蛋白-ⅲ、重組載脂蛋白-ⅲ衍生物或類似物或活性片段的來源。

所述「宿主細胞」包括原核細胞和真核細胞，常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主細胞包括酵母細胞、昆蟲細胞和哺乳動物細胞等。

本發明所指微生物以及其相關分子模式是真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌以及其相關分子模式。為使本專業技術人員更全面、清晰理解本發明，以畢赤酵母、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌等作為微生物(真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌)代表來描述下面的內容，以lys-pgn、dap-pgn、脂磷壁酸、甘露聚糖、β-1,3-葡聚糖、脂多糖等作為微生物相關分子模式代表來描述下面的內容，而選擇上述具體的微生物或具體的微生物相關分子模式作為代表來描述並不是以任何方式限制本發明權利要求的範圍。

二、apolp-ⅲ結構解析以及其基因序列解析

按照常規蛋白質化學與分子生物學的技術、方法、手段，對apolp-ⅲ進行結構解析。包括：(1)利用生物質譜測定天然apolp-ⅲ的分子量；(2)採用常規蛋白水解酶及其水解條件，針對發明內容所獲得apolp-ⅲ進行降解，通過hplc分離降解片段，利用生物質譜或edman降解方法解析部分胺基酸序列，從而獲得apolp-ⅲ分子內許多片段的胺基酸序列；(3)利用分子生物學技術、方法，從昆蟲脂肪體提取總rna，利用race技術構建昆蟲cdnapool。根據目的蛋白降解片段的胺基酸序列，設計引物，pcr擴增片段基因。隨後結合race技術獲得apolp-ⅲ基因—cdna，通過基因序列測定分析獲得其鹼基序列並由其開放閱讀框鹼基序列推導獲得apolp-ⅲ全長一級結構；(4)利用分子生物學技術、方法等，從昆蟲脂肪體提取其染色體基因。設計pcr擴增上下遊引物，以昆蟲染色體基因為模板，pcr擴增apolp-ⅲ染色體基因，通過基因序列測定分析獲得apolp-ⅲ染色體基因中的內含子、外顯子序列；(5)通過上述所獲得apolp-ⅲ的分子量、分子內部分胺基酸序列、cdna開放閱讀框序列、染色體基因中的外顯子序列，彼此相互驗證上述結構信息，獲得apolp-ⅲ全長一級結構序列及天然apolp-ⅲ或稱成熟apolp-ⅲ一級結構序列(參見id:1和id:2)。

三、重組apolp-ⅲ及其部分片段或衍生物或類似物的製備

本發明還包含具有apolp-ⅲ序列的重組apolp-ⅲ及其部分片段或衍生物或類似物。

所述的重組apolp-ⅲ選自met-載脂蛋白-ⅲ成熟肽、met-組氨酸標籤-載脂蛋白-ⅲ成熟肽、met-載脂蛋白-ⅲ成熟肽-his6標籤、met-his6標籤-凝血酶酶切位點-載脂蛋白-ⅲ成熟肽、met-gst標籤-凝血酶酶切位點-載脂蛋白-ⅲ成熟肽、met-載脂蛋白-ⅲ成熟肽-凝血酶酶切位點-gst標籤、met-his6標籤-載脂蛋白-ⅲ全序列、met-載脂蛋白-ⅲ全序列-his6標籤、met-gst標籤-凝血酶酶切位點-apolpⅲ全序列、met-apolpⅲ全序列-凝血酶酶切位點-gst標籤(參見id：3-12)。

本發明的重組apolp-ⅲ的部分片段或衍生物或類似物的序列(參見id：3-12)：(1)apolp-ⅲ成熟肽胺基酸序列及其核苷酸序列；(2)met-apolp-ⅲ成熟肽胺基酸序列；(3)met-組氨酸標籤-apolp-ⅲ成熟肽胺基酸序列；(4)met-apolp-ⅲ成熟肽-his6標籤胺基酸序列；(5)met-his6標籤-凝血酶酶切位點-apolp-ⅲ成熟肽胺基酸序列；(6)met-gst標籤-凝血酶酶切位點-apolp-ⅲ成熟肽胺基酸序列；(7)met-apolp-ⅲ成熟肽-凝血酶酶切位點-gst標籤胺基酸序列；(8)met-his6標籤-apolp-ⅲ全序列胺基酸序列；(9)met-apolp-ⅲ全序列-his6標籤胺基酸序列；(10)met-gst標籤-凝血酶酶切位點-apolp胺基酸全序列；(11)met-apolpⅲ全序列-凝血酶酶切位點-gst標籤胺基酸序列。

本發明的重組apolp-ⅲ及其部分片段或衍生物或類似物通過基因工程表達製備獲得，通過如下技術方案實現，包括：(1)將apolp-ⅲ及其部分片段或衍生物或類似物編碼dna重組至表達載體；(2)用步驟⑴的重組表達載體轉化適當的宿主細胞(原核或真核細胞)；(3)在適合的誘導表達條件下，培養步驟⑵的被轉化的宿主細胞；(4)收穫並純化所得到的目的蛋白。

本發明同時提供上述重組apolp-ⅲ及其部分片段或衍生物或類似物的表達產物分離純化方法。可使用鹽析沉澱、超濾、親和層析、離子交換層析、疏水作用層析和凝膠過濾等方法以及上述方法的多種組合，從基因工程細胞的溶胞產物或培養液中分離並純化所需的表達產物。在表達產物的分離和純化過程中，可使用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳法(sds-page)、酶聯免疫吸附法(elisa)或蛋白免疫印跡法(western)檢測表達產物的存在及相應分子大小。

四、apolp-ⅲ及其部分片段或衍生物或類似物的結合特異性及其應用

本發明再一個目的是針對天然、重組apolp-ⅲ其部分片段或衍生物或類似物的體外結合特異性、對微生物的結合與凝集作用以及對激活酚氧化酶原激活系統和toll途徑的激活情況的對比，確定了天然、重組apolp-ⅲ及其部分片段或衍生物或類似物的生物活性。同時，考察apolp-ⅲ在機體免疫應答過程的表達，也研究了天然、重組apolp-ⅲ及其部分片段或衍生物或類似物的應用。

此外，本發明也研究了天然、重組apolp-ⅲ及其部分片段或衍生物或類似物作為抗原刺激機體產生抗體、抗體的製備以及其應用。

本發明所述的天然、重組apolp-ⅲ及其部分片段或衍生物或類似物獲得方法常規、簡單、產量高。

附圖說明：

圖1為分離純化天然apolp-ⅲ電泳圖譜

泳道1：實施例1中方法-1分離獲得天然apolp-ⅲ的電泳圖譜；

泳道2：實施例1中方法-2所獲天然apolp-ⅲ的電泳圖譜；

泳道3：實施例1中方法-3所獲天然apolp-ⅲ的電泳圖譜。

圖2為分離純化重組apolp-ⅲ(原核表達體系)電泳圖譜

泳道1：實施例2中方法-(1)所獲得重組apolp-ⅲ的電泳圖譜；

泳道2：實施例2中方法-(2)所獲重組apolp-ⅲ的電泳圖譜；

泳道3：實施例2中方法-(3)所獲重組apolp-ⅲ的電泳圖譜；

泳道4：實施例2中方法-(4)所獲重組apolp-ⅲ的電泳圖譜。

圖3為分離純化重組apolp-ⅲ(昆蟲表達體系)電泳圖譜

泳道1：實施例3中方法-1所獲得重組apolp-ⅲ的電泳圖譜；

泳道2：實施例3中方法-2所獲重組apolp-ⅲ的電泳圖譜。

圖4為分離純化重組apolp-ⅲ(酵母表達體系、哺乳動物細胞表達體系)電泳圖譜

泳道1：實施例4中方法所獲得重組apolp-ⅲ的電泳圖譜；

泳道2：實施例5中方法所獲重組apolp-ⅲ的電泳圖譜。

圖5為apolp-ⅲ的結合特異性

a-(1)酶聯免疫吸附方法檢測ap-apo-iii對可溶性微生物相關分子模式結合特異性；a-(2)熱泳動方法檢測ap-apo-iii對可溶性微生物相關分子模式的結合特異性；a-(3)蛋白質免疫印跡方法檢測ap-apo-iii與不溶性微生物相關分子模式的結合特異性；

b-(1)天然ap-apo-iii對微生物的結合特異性；b-(2)重組his-ap-apo-iii對微生物的結合特異性。

圖6為ap-apo-iii對微生物的凝集作用

圖7為ap-apo-iii結合微生物細胞後對酚氧化酶原系統的激活作用

圖8apolp-ⅲ在抗菌肽合成過程中的作用

8-a：apolp-ⅲ對抗菌肽合成的促進作用；8-b：ap-apo-iii幹擾對抗菌物質合成的影響。

圖9apolp-ⅲ抗體對酚氧化酶原系統的影響。

具體實施方式：

下面的實施例可以使本專業技術人員更全面地理解本發明，而不是以任何方式限制本發明權利要求的範圍。

實施例1

天然apolp-ⅲ的分離純化

1.方法-1

將溶於昆蟲生理鹽水的真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌混合物(10ul)注射柞蠶體內，誘導24～48小時後，將約200ml血淋巴於4℃，4l20mmtis-hcl(ph7.4，100mmnacl，2mmcacl2)緩衝體系中緩慢透析至少24h。4℃，3000rpm/min離心10min後，將上清液冰浴並超聲(50w，40～50s)，4℃，12000prm/min離心10min後，將上清液經0.22um濾膜過濾，再經過截留分子量為100kda濾膜以除去大分子量的蛋白，透過樣品再次經過截留分子量為30kda濾膜獲得進一步純化及濃縮的樣品。將截留的樣品溶於tris-hcl(20mm，ph7.5)緩衝溶液中，並上樣於用相同緩衝溶液平衡的deaesepharosecl-6b陰離子交換柱，流速為0.3ml/min。用tris-hcl(20mm，ph7.5)緩衝溶液洗滌色譜柱至a280<0.01。用含有0.8mnacl的tris-hcl(20mm，ph7.5)緩衝溶液梯度洗脫結合蛋白。將經進一步純化的含有目的蛋白的組分更換緩衝溶液為醋酸鈉-醋酸(20mm，ph5.0)緩衝溶液，上樣於monos陽離子交換柱，0-100％0.5mnacl(醋酸鈉-醋酸緩衝溶液，20mm,ph5.0)梯度洗脫條件下洗滌洗脫，得到具有天然活性的apolp-ⅲ純品。

試驗結果如圖1泳道1，天然apolp-ⅲ的純度約99.9％以上。

2.方法-2

將溶於昆蟲生理鹽水的真菌、革蘭陽性菌和革蘭陰性菌混合物(10ul)注射柞蠶體內，誘導24～48小時後，將約200ml血淋巴於4℃，4l20mmtis-hcl(ph7.4，100mmnacl，2mmcacl2)緩衝體系中緩慢透析至少24h。4℃，3000rpm/min離心10min後，將上清液冰浴並超聲(50w，40～50s)。經90℃水浴中加熱30min後48000rpm/min，10min離心，將上清液0.22um濾膜過濾，經過截留分子量為100kda濾膜以除去大分子量的蛋白，透過樣品再次經過截留分子量為30kda濾膜獲得進一步純化及濃縮的樣品。將截留的樣品溶於bis-tris-hcl(20mm，ph6.5)緩衝溶液中，並上樣於用相同緩衝溶液平衡的deaesepharosecl-6b離子交換柱，流速為0.5ml/min。用bis-tris-hcl(20mm，ph6.5)緩衝溶液洗滌色譜柱至a28010μg/孔時，a450趨於不變。

(2)採用微量熱泳動儀(mst)檢測三種apolp-ⅲ類似物、活性片段：met-his6標籤-凝血酶酶切位點-apolp-ⅲ成熟肽、met-apolp-ⅲ成熟肽-凝血酶酶切位點-gst標籤、met-apolp-ⅲ全序列-his6標籤對6種代表性、可溶性微生物相關分子模式的識別能力。相同濃度的微生物相關分子模式被包被在探頭上，將上述三種apolp-ⅲ類似物、活性片段分別與探頭共孵育，通過測定樣品在微觀溫度梯度場中分子的定向運動，檢測三種apolp-ⅲ類似物、活性片段與可溶性微生物相關分子模式的結合情況。如圖5-a(2)所示，與陰性對照澱粉相比，在0.03ng/μl—1μg/μl濃度範圍內，三種apolp-ⅲ類似物、活性片段與6種可溶性pamps均有明顯的識別結合作用。

(3)採用western-blot方法檢測三種apolp-ⅲ類似物、活性片段：met-gst標籤-凝血酶酶切位點-apolp-ⅲ成熟肽、met-apolpⅲ全序列-凝血酶酶切位點-gst標籤、met-gst標籤-凝血酶酶切位點-apolp全序列與3種不溶性微生物相關分子模式的結合能力。相同濃度的三種apolp-ⅲ類似物、活性片段與不溶性微生物相關分子模式共孵育後，分別取上清液(未結合部分)和沉澱(結合部分)進行sds/page，採用高效純化的兔源抗apolp-ⅲ多克隆抗血清檢測apolp-ⅲ與不可溶性微生物相關分子模式的結合情況。如圖5-a(3)所示，apolp-ⅲ對3種可溶性pamps均有結合能力。

2.apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段與典型微生物的結合特異性

本實驗採用elisa檢測天然apolp-ⅲ對4種微生物細胞的識別結合能力(畢赤酵母s.cerevisiae-真菌、白色念珠菌c.albican-真菌、金黃色葡萄球菌s.aureus-g+菌、大腸桿菌e.coli-g-菌)。相同濃度的微生物細胞被包被在96孔板上，與上述實驗方法相同，間接計算出apolp-ⅲ與微生物細胞的結合情況。如圖5-b(1)所示，天然apolp-ⅲ對4種微生物細胞均有不同程度的結合，但從整體趨勢看，apolp-ⅲ對白色念珠菌c.albican識別能力最強，對金黃色葡萄球菌s.aureus識別能力最弱。同時，隨著apolp-ⅲ含量的增加apolp-ⅲ對4種微生物細胞的結合能力也增加，當蛋白濃度從0μg增加至5μg時，隨著蛋白濃度增加，a450值增加趨勢最明顯，當蛋白濃度繼續增加，達到約50μg/孔時，a450增加趨勢趨於穩定，由此可以看出，隨著蛋白濃度增加，apolp-ⅲ對微生物細胞的結合能力也隨之增強，同時這種結合能力也可被飽和。

採用相同試驗方法，考察三種apolp-ⅲ類似物、活性片段：met-his6標籤-凝血酶酶切位點-apolp-ⅲ成熟肽、met-apolp-ⅲ成熟肽-凝血酶酶切位點-gst標籤、met-apolp-ⅲ全序列-his6標籤對6種微生物細胞的識別能力(畢赤酵母、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌)，如圖5-b(2)所示，其試驗結果與天然apolp-ⅲ對微生物細胞的識別能力一致。

3.apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段對微生物的凝集作用

在0.1mmca2+存在的情況下，將10ul100ug/ml重組his-apolp-ⅲ(溶於pbs)與10ul溴乙錠染色的微生物細胞—大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、酵母菌、藤黃微球菌、白色念珠菌、綠膿桿菌(2×108個/ml)於室溫下孵育30min。以牛血清白蛋白(bsa)作為陰性對照。取10ul孵育後的混合物置於載玻片上，在螢光顯微鏡下觀察細胞凝集情況。如圖6所示，重組his-apolp-ⅲ對三種微生物具有明顯的凝集作用。

4.參與昆蟲的酚氧化酶原激活系統以及激活toll信號傳遞途徑

根據「昆蟲、昆蟲血淋巴及其組裝活性物和應用」(張嶸，專利申請號201210436927.0)，以及專利「β-1,3-葡聚糖識別蛋白及其製備方法和應用」張嶸，專利申請號201210437330.8)所述，昆蟲體內存在受微生物及其相關分子模式誘導的酚氧化酶原激活系統以及toll信號傳遞途徑。

考察apolp-ⅲ結合微生物細胞後對pro-po系統的影響，如圖7所示：3個陰性對照，即單純柞蠶血淋巴、柞蠶血淋巴與重組apolp-ⅲ孵育以及柞蠶血淋巴與抗apolp-ⅲ抗體孵育對血淋巴pro-po系統幾乎無影響，在圖中省略顯示，僅顯示天然血淋巴與微生物細胞孵育以及血淋巴與微生物細胞和重組apolp-ⅲ共孵育後產生po活力柱狀圖，如圖所示：額外加入重組蛋白後，po活力激活程度均遠遠高於天然血淋巴被單純微生物細胞激活產生po活力的程度，且重組蛋白組產生的額外po活力要遠遠高出天然血淋巴組200％以上(藤黃微球菌m.luteus組除外)。

分別將重組apolp-ⅲ、微生物細胞(大腸桿菌)以及重組apolp-ⅲ和大腸桿菌的共孵育混合物分別注射5齡期柞蠶幼蟲體內，經24h誘導後，提取各組柞蠶血淋巴，將誘導血淋巴與生長於固體lb培養基中的大腸桿菌共孵育，通過管碟法檢測誘導血淋巴產生抑菌圈的大小，從而鑑定各組誘導血淋巴中抗菌(抑菌)物質含量的多少。如圖8-(a)所示，作為陰性對照，單純柞蠶血淋巴及昆蟲生理鹽水誘導的血淋巴幾乎不存在抗菌物質；重組apolp-ⅲ和微生物細胞(大腸桿菌)分別誘導產生的血淋巴的抑菌活性與單純血淋巴產生的抑菌活力相比，均有明顯提高；而重組apolp-ⅲ和大腸桿菌的共孵育混合物所誘導產生的血淋巴抑菌活力與其他組產生的抑菌活力相比，抑菌效果更為顯著。

以dsegfp為陰性對照，採用顯微注射法將apolp-ⅲ特異性dsrna導入柞蠶幼蟲體內，再將微生物細胞(金黃色葡萄球菌)注射入柞蠶幼蟲體內，經24h誘導後，收集脂肪體，測定抗菌物質的mrna含量以判斷apolp-ⅲ對抗菌肽合成的影響。如圖8-(b)所示，將apolp-ⅲ特異性dsrna導入柞蠶幼蟲體內可顯著降低apolp-ⅲ的合成，且apolp-ⅲ表達量的降低能夠顯著抑制attacin、cecropinb、lysozyme等抗菌物質的合成。

上述實驗結果表明：本發明專利的天然、重組apolp-ⅲ以及其衍生物、類似物、活性片段作為昆蟲體內模式識別蛋白與微生物及其分子模式結合後，可以激活昆蟲體內酚氧化酶原激活系統，也可激活toll信號傳遞途徑。

實施例8：

天然、重組apolp-ⅲ以及其衍生物、類似物、活性片段及其抗體的應用

為使本專業技術人員更全面地理解本發明，而不是以任何方式限制本發明特批權利要求的範圍，本實施例以apolp-ⅲ的生物活性為代表進行描述，apolp-ⅲ衍生物、類似物、活性片段也具有相同的生物活性。同時也以柞蠶作為鱗翅目昆蟲的生物活性實驗昆蟲為代表進行描述。本專業技術人員可以以apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段及其抗體的生物活性為核心與基礎，進一步拓展apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段及其抗體的應用範圍。

1.apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段誘導昆蟲產生抗菌肽

如實施例7中所描述，利用微生物或結合了微生物相關分子模式的apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段可以誘導昆蟲產生抗菌肽。基於此，從產生抗菌肽的昆蟲體內製備相應的抗菌肽，該抗菌肽可以用於醫藥領域。

2.apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段用於微生物的檢測

如實施例7中所描述，apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段作為酚氧化酶原激活系統的成分—起始激活因子，與微生物或其分子模式結合後，能夠激活昆蟲體內酚氧化酶原激活系統(激活的酚氧化酶引發黑化)進而也激活toll信號傳遞途徑的生物活性。

取任何待檢測真菌的樣品，首先與apolp-ⅲ包括及其衍生物、類似物、活性片段)混合，注入柞蠶幼蟲體內，在一定時間觀察柞蠶黑化程度和死亡率；對照組是將同樣劑量的待檢測微生物的樣品注入柞蠶幼蟲體內，在相同時間觀察柞蠶黑化程度和死亡率。實驗組與對照組具有顯著差異，表明檢測樣品中含有微生物或其相關分子模式。

同樣，利用柞蠶血淋巴替代柞蠶觀察血淋巴的黑化程度。在一定時間，實驗組與對照組的黑化程度具有顯著差異；或血淋巴黑化程度達到同一程度所需時間縮短並具有顯著差異；表明檢測樣品中含有微生物或其相關分子模式。

3.apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段抗體的應用

針對實施例6獲得的apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段作的抗體，利用免疫學以及分子生物學等常規、通用技術、方法等，通過apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段的抗體，用於鱗翅目昆蟲樣品的apolp-ⅲ免疫檢測。同樣，也適用於從鱗翅目昆蟲分離純化製備apolp-ⅲ過程中的免疫檢測跟蹤分析以及樣品的定性、定量檢測分析。此方面的實驗已經在上述的天然、重組apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段分離純化製備過程中的實施例應用。

將足夠劑量的apolp-ⅲ抗體首先注入柞蠶幼蟲體內，再將脂磷壁酸注入該柞蠶幼蟲體內後，脂磷壁酸並不能引發柞蠶的黑化乃至死亡；同樣，用柞蠶血淋巴替代柞蠶，事先加入足夠劑量的apolp-ⅲ抗體也可以阻斷柞蠶血淋巴的黑化。同理，如圖9所示，將充分結合apolp-ⅲ凝集素抗體的脂磷壁酸注入柞蠶幼蟲體內，脂磷壁酸不引發柞蠶的黑化乃至死亡；同樣，用柞蠶血淋巴替代柞蠶，充分結合apolp-ⅲ蛋白抗體的脂磷壁酸也不引發柞蠶血淋巴的黑化。以其他類型微生物相關分子模式代替脂磷壁酸重複上述試驗，均可得到相同的試驗結果，說明apolp-ⅲ抗體可以抑制由微生物及其相關分子模式誘導的酚氧化酶原激活系統的激活。

在任何待檢測微生物的樣品中，加入足夠劑量的apolp-ⅲ抗體。按照本實施例中的apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段用於微生物的檢測所述方法，進行待檢測樣品的微生物檢測。同上結果，即便是樣品中有能夠被檢測出微生物的量也不能檢測出(陰性結果)，此實驗的設計作為樣品微生物檢測的陰性對照組加以應用。

上述結果表明：apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段的抗體，通過與apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段的結合而屏蔽了與微生物及其相關分子模式的結合生物活性，從而使apolp-ⅲ及其衍生物、類似物、活性片段失去了原有的生物活性。基於這種結合屏蔽作用原理可以廣泛應用。