與Bcl－2家族抗凋亡蛋白相互作用的新肽的製作方法

2024-04-03 06:18:05

專利名稱：與Bcl－2家族抗凋亡蛋白相互作用的新肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及與Bcl-XL和/或Bcl-2和/或Bcl-W相互作用的新肽，並且也涉及允許鑑定能夠調節該相互作用的化合物的篩選方法。
背景技術：
大多數生物過程涉及蛋白-蛋白相互作用。蛋白質組學設立的目標之一就是製得這些相互作用的圖譜。由於它們參與多數信號傳導機制，這些相互作用是藥物研發中優選的靶標。
存在著許多方法學使得蛋白的相互作用得以鑑定。最普遍的一種是由Fields等(US 5,283,173；US 5,468,614；US 5,667,973)最初描述和發展的雙雜合系統。
這個系統基本上是由兩個重組蛋白質之間的體外試驗組成的。其中第一，通常稱為「誘餌」蛋白，是融合於能夠結合報告基因上遊的DNA結合結構域(BD)的嵌合蛋白。常用的結合結構域為Gal4或大腸桿菌LexA的結構域。
第二個蛋白質還是嵌合蛋白，一般稱之為「捕獲」蛋白，含有激活結構域(AD)，一般來自Gal4。
然而，這些傳統方法有其局限性。眾所周知的，例如，這些篩選方法可造成假陽性和/或假陰性，從而所得結果的生化確認是必須的。
專利申請WO9942612中描述了一種更有效的技術使得假陽性或陰性降到最低，並使用含有「誘餌」和「捕獲」蛋白的重組單倍體酵母。與本領域中使用的傳統方法相比，這個系統允許以更精確、更可再現和更靈敏的方式使用一個「誘餌」蛋白檢測大量的「捕獲」蛋白。
細胞凋亡是細胞死亡的過程，其在多細胞生物體中起到關鍵的作用。實際上，細胞死亡有兩種形式細胞壞死和細胞凋亡。細胞壞死發生在組織病變的情況中細胞腫脹，導致釋放細胞內容物，然後細胞裂解，引起周圍組織的炎症。
另一方面，細胞凋亡是一個程序性的和受調控的生理過程，由於每天我們的細胞有大約109個因這種機制死亡，其重要性不可低估。許多病理學與解除存在於細胞生長、存活和死亡之間的平衡的調控有關。
這裡尤其要提及的是自身免疫病、某些神經紊亂和癌症。
保持細胞存活或編程其死亡需要至少十個家族的不同蛋白質，其中Bcl-2家族起到主要的作用。該家族包括大約20種蛋白質，有Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W，是抗凋亡蛋白，利於細胞存活，相反的Bax、Bak和Bid是促凋亡蛋白。在細胞凋亡過程中將看到Bcl-2家族成員調節它們與其配偶體之間的相互作用，由此在細胞中產生不可逆的變化導致細胞死亡。
因此能鑑定能夠調節這些相互作用的化合物，以得到在涉及解除凋亡、特別是自身免疫病、某些神經退形性變的紊亂和癌症的調控的病理學方面有效的真正候選藥物是必需的。

發明內容
本申請人現在鑑定到一種新肽，其與Bcl-2家族抗凋亡蛋白、更特別是Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W相互作用。
這個具有22個胺基酸的肽對應於與Bcl-2家族抗凋亡蛋白、更特別是Bcl-2和/或Bcl-XL和/或Bcl-W的精確相互作用結構域，並具有「BH3」基序的典型結構特徵，相互作用結構域允許同源或異源二聚體的形成。
這個肽的小尺寸使其成為理想的候選物，以建立允許高效篩選能夠調節這些蛋白質之間相互作用的化合物的測試。
文獻中可見到許多篩選蛋白-蛋白相互作用的調節劑的測試，但是它們通常在靈敏度和高通量可行性方面具有局限性。傳統上所採用的方法必需要求使用複雜的工具(融合蛋白質之間、重組蛋白質之間等的相互作用)，這不十分適合高通量篩選。它們非常頻繁地產生高水平的背景噪音，並且從定量的觀點看具有低可信性它們提供減少了的閱讀窗口，不允許測試化合物的最佳篩選。
然而，本申請人建立了一種基於螢光偏振的高效篩選測試(Owicki J.C.等，《生物分子篩雜誌》5，2000，297-306)。這個技術使得，例如，螢光基團標記的配體和受體之間的相互作用得以測量。原理在於測量與游離配體相比當配體為受體所結合時發射的螢光偏振的增加。游離配體的螢光偏振取決於其分子量，並且上述配體分子量越高，則螢光偏振將越大。因此，當使用有固有的高水平螢光偏振的高分子量配體進行測試時，難於可信地評價游離配體與結合配體之間螢光偏振的差別。另一方面，使用減少尺寸的配體，將可以使得差別明顯，因此使得測定的精確性得以提高。從而可以更好的評價化合物的真實活性並進行高通量篩選。
更具體的，本發明涉及包含SEQ.ID.NO.1所述的胺基酸序列的肽，並涉及其功能性變體。。
「功能性變體」應理解為SEQ.ID.NO.1所述肽的任何片段或點突變體，其能與Bcl-2家族抗凋亡蛋白、更特別是Bcl-2和/或Bcl-XL和/或Bcl-W相互作用。
通過雙雜合方法用Bcl-XL、Bcl-W和Bcl-2作為「誘餌」蛋白鑑定到這個肽。篩選了三個人cDNA庫(胎盤、腦、細胞系CEMC7)，並允許鑑定了與序列HC21ORF80(登錄號NM-015227)的部分序列對應的「捕獲」片段。
然後通過雙雜合技術經實驗確定該序列上的一個片斷是實現與Bcl-XL和/或Bcl-2和/或Bcl-W相互作用所必須的並且也是足夠的，其對應於SEQ.ID.NO.1所述的22個胺基酸片段。
與Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W蛋白的相互作用由生化技術(共免疫沉澱、GST沉降)證實，並且有可能通過轉染和/或顯微注射進細胞中在顯示發生凋亡的情況下證實這個肽的生物活性。
本發明還涉及依照遺傳密碼由SEQ.ID.NO.1所述的胺基酸序列推導的核酸序列，並且還涉及從上文描述的功能性變體推導出的那些核酸序列。
更具體的，發明涉及核酸序列SEQ.ID.NO.2，其編碼SEQ.ID.NO.1所述的肽。
「核酸序列」應理解為從其自然環境中分離的核酸序列，並且特別意味著已經被分離、擴增和/或純化、以及視情況而定經遺傳工程修飾的序列。
本發明還涉及包含根據本發明的核酸序列的重組載體。
「載體」應理解為允許將核酸序列導入宿主細胞並表達多肽的任何類型的載體。
根據本發明的重組載體特徵在於其包含表達照根據本發明的肽，更具體的，SEQ.ID.NO.1所述的肽所必須的DNA序列。
尤其要提及的是衍生自細菌質粒、噬菌體、酵母質粒和染色體、病毒等的載體。
本發明還涉及由重組載體轉化的宿主細胞。這些細胞優選為細菌或真核細胞。作為舉例可提及的有大腸桿菌、酵母、昆蟲細胞或哺乳動物細胞。
本發明進一步涉及篩選能夠調節根據發明的肽，更具體地，SEQ.ID.NO.1所述的肽，和Bcl-2家族抗凋亡蛋白，更具體地Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W之間的相互作用的試劑的方法。調節這些相互作用的試劑將有利地是業已被化學合成或得自化合物庫的化合物。
根據本發明所述的篩選方法包括下列步驟a)製備根據本發明用螢光標記標記的肽；b)與待測化合物一起孵育；c)添加包括抗凋亡蛋白的融合蛋白；d)測量螢光偏振。
本發明尤其涉及篩選能夠抑制所述肽和所述抗凋亡蛋白之間的相互作用的化合物的方法，包括下列步驟a)製備根據本發明用螢光標記標記的肽；b)與或不與待測化合物一起孵育；c)添加包括抗凋亡蛋白的融合蛋白；
d)測量有或無待測化合物的螢光偏振；e)選擇與無待測化合物的觀測結果相比，有待測化合物時觀察到的螢光偏振增高顯著較低的化合物。
本發明還涉及篩選能夠增強所述肽和抗調亡蛋白之間的相互作用的化合物的方法，包括下列步驟a)製備根據本發明用螢光標記標記的肽；b)與或不與待測化合物一起孵育；c)添加包括抗凋亡蛋白的融合蛋白；d)測量有或無待測化合物的螢光偏振；e)選擇與無待測化合物的觀測結果相比，有待測化合物時觀察到的螢光偏振顯著更高的化合物。
根據上文描述的方法的優選實施方案，所述螢光標記將是，例如，俄勒岡綠(oregon green)、bodipy或螢光素，更特別是螢光素。
根據發明在篩選方法中使用的肽優選SEQ.ID.NO.1所述的肽。
根據發明的方法有利地使用Bcl-2家族抗凋亡蛋白進行，更特別地是Bcl-2、Bcl-XL和Bcl-W。
因此，本發明還涉及根據本發明的肽在根據本發明的方法中篩選能夠調節凋亡的活性化合物的用途。
更具體地，本發明還涉及根據本發明的肽在根據本發明的方法中篩選用於治療涉及解除凋亡調節的病理的化合物的用途。
本發明還涉及根據本發明的肽在根據本發明的方法中篩選用於治療自身免疫病、某些神經紊亂和癌症的化合物的用途。


圖1.「GST沉降」與SEQ.ID.NO.1所述的肽競爭的GST-Bcl-XL+TBid。
圖2.測定SEQ.ID.NO.1所述的肽對Bcl-XL的Kd。
圖3.測定SEQ.ID.NO.1所述的肽對Bcl-W的Kd。
如下實施例闡釋而不以任何方式限制本發明實施例1SEQ.ID.NO.1所述肽的鑑定在酵母中利用接合方案(Legrain等，Nature Genetics，1997，16，277-282)通過雙雜合技術(Fields等)對三個人類cDNA庫(胎盤、腦、細胞系CEMC7)進行了篩選。
1)「誘餌」和「捕獲」蛋白的製備a)所用「誘餌」為-融合於LexA DNA結合結構域的Bcl-XL(1-209)C-末端截短物-融合於LexA DNA結合結構域的Bcl-2(1-211)C-末端截短物-融合於LexA DNA結合結構域的Bcl-XL(1-209)C末端截短物將它們在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(CG1945或L40ΔGal4)中表達，並於30℃在缺乏色氨酸的合成培養基(DO-Trp)中預培養，直至DO600nm達到包括端值在內的0.1到0.5之間。將50ml預培養物稀釋液(DO600nm＝0.006)於30℃過夜孵育。
b)含有表達融合於Gal4轉錄激活結構域的cDNA庫的質粒的酵母集合是通過轉化繼之以在缺乏亮氨酸的培養基(DO-Leu)中選擇獲得的。將酵母等分成小份並貯存於-80℃。
2)接合使用比率為2的「誘餌」/「捕獲」比進行接合。
將得自步驟1)a)相當於50單位DO600nm的量的「誘餌酵母」細胞與得自步驟1)b)的「捕獲酵母」混合。離心後，將沉澱物重懸於YPGlu培養基中，塗布在YPGlu培養板上並在30℃孵育4小時30分鐘。在DO-Leu-Trp-His培養基中進行含有彼此能夠相互作用的「誘餌」和「捕獲」的接合酵母的選擇培養基中缺少亮氨酸和色氨酸使得有可能維持選擇壓力，只允許含有兩種類型質粒(「誘餌」/「捕獲」)的這些酵母生長；培養基中缺少組氨酸使得有可能選擇含有彼此能夠相互作用的「誘餌」質粒和「捕獲」質粒的接合酵母這種相互作用使得有可能激活HIS3基因，其編碼參與組氨酸生物合成的酶。
3)陽性克隆的鑑定通過PCR使用「捕獲」載體的特異引物自2)選擇的酵母克隆的粗裂解液擴增該克隆的「捕獲」片段。
ABS1 5』-GCTTTGGAATCACTACAGG-3』(SEQ.ID.NO.3)，ABS2 5』-CACGATGCACGTTGAAGTG-3』(SEQ.ID.NO.4)。
接著對PCR產物測序，並與資料庫對照以鑑定得到的序列。
在得到的陽性克隆中，有可能鑑定大約300個胺基酸的片段是序列HC21ORF80(登錄號NM-015227)的部分序列。
4)SEO.ID.NO.1所述肽的鑑定對HC21ORF80序列更小的片段依照上述步驟1)、2)和3)進行雙雜合實驗，允許鑑定到實現與Bcl-XL和/或Bcl-W和/或Bcl-2相互作用所必須且足夠的22個胺基酸的短肽Asp-Thr-Arg--Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-His-Leu-Arg-Glu-Val-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg(SEQ.ID.NO.1)。
實施例2實施例1中所述的肽與Bcl-W和/或Bcl-XL和/或Bcl-2之間相互作用的鑑定1)GST「沉降」通過測定有「BH3」基序的Bid蛋白與融合蛋白GST-Bcl-W、GST-Bcl-XL或GST-Bcl-2之間相互作用的變化來驗證得自實施例1中所述的肽與Bcl-W和/或Bcl-XL和/或Bcl-2之間的相互作用。
a)合成放射性標記的Bid使用TNT quick master試劑盒(Promega)得到標記蛋白。將40μl TNT混合物與2μl(相當於20μCi)35S-甲硫氨酸(Amersham)、1μg編碼Bid的質粒DNA和使體積達到50μl的足量水一起在30℃孵育90分鐘。
基於蛋白中的甲硫氨酸數目計算產生的放射性蛋白的fmole/μl數。
b)GST「沉降」
將4fmole的放射性Bid蛋白與3μg融合蛋白穀胱甘肽-S-轉移酶-Bcl-XL(GST-Bcl-XL)或穀胱甘肽-S-轉移酶-Bcl-2(GST-Bcl-2)或穀胱甘肽-S-轉移酶-Bcl-W(GST-Bcl-W)或僅僅GST一起在300μl結合緩衝液(142mM KCl、5mM MgCl2、10mM Hepes緩衝液、0.5mM DTT、1mMEDTA、蛋白酶抑制劑、pH7.4)和0.4％Triton X100中4℃孵育3小時。「穀胱甘肽瓊脂糖4速流」珠(Amersham)用所述結合緩衝液洗滌3遍，並用所述緩衝液重懸從而得到50％的溶液。向每個樣品加入20μl並在4℃旋轉孵育1小時。接著用結合緩衝液洗滌所述珠3次，然後加入25μl 2xSDS緩衝液Laemmli(Sigma)。然後將樣品保持在95℃5分鐘並接著施加到12％Tris-甘氨酸凝膠(Invitrogen)上。電泳後，隨後將凝膠在乾燥液(Invitrogen)中孵育30分鐘，然後在70℃乾燥150分鐘。經由KodakBioMax MS-1膜(Sigma)曝光顯示螢光蛋白。為進行待測肽的競爭測試，其向初始溶液添加的濃度範圍從5到20μM。
c)結果當得自實施例1的肽加入到初始溶液中時，Bid的放射自顯影信號消失。這個結果顯示得自實施例1的肽抑制Bcl-W和Bid之間、Bcl-XL和Bid之間以及Bcl-2和Bid之間的相互作用。
作為舉例，得自Bcl-XL和Bid之間的結果示於圖1。
2)螢光偏振實施例1得到的肽和抗凋亡蛋白質之間相互作用的Kd的測定在包括Na2HPO420mM pH 4，EDTA 1mM，NaCl 50mM和pluronicacid F-680.05％的緩衝液中，將15nM得自實施例1用螢光素標記N-末端的肽溶液與濃度範圍從1nM到5μM變動含有融合蛋白GST-Bcl-XL或GST-Bcl-W的溶液混合。然後用En顯示儀(Packard Perkin-Elmer)測量螢光偏振。
得到的結果示於圖2和3。
結果在得自實施例1的肽與含有Bcl-XL和Bcl-W的融合蛋白孵育時，觀察到螢光偏振顯著提高，證明其已與這些蛋白質結合。
Bcl-XL得到的Kd是2.15×10-7M(圖2)，而Bcl-W得到的Kd是4.11×10-7M(圖3)。
實施例3能夠抑制Bcl-W和/或Bcl-XL和/或Bcl-2與實施例1中所獲得的肽之間的相互作用的化合物的篩選試驗將待測化合物以10μg/ml的終濃度分配到384孔板(Corning平底)中。在一個孔中裝滿不含待測化合物的等量緩衝液/溶劑以形成對照。向各孔添加由螢光素標記的實施例1中所獲得的肽，從而得到15nM的終濃度。然後添加融合蛋白GST-Bcl-XL、GST-Bcl-W或GST-Bcl-2，從而在含Na2HPO420mM pH 4，EDTA 1mM，NaCl 50mM和pluronic acid F-680.05％的緩衝液中得到500nM(Bcl-XL、Bcl-2)和1μM(Bcl-W)的終濃度。然後通過En顯示儀(Packard Perkin-Elmer)測量螢光偏振。與無測試化合物(對照孔)所獲得的相比，在有測試化合物所進行的試驗中記錄到的螢光偏振顯著下降，則允許得出所述化合物具有抑制活性的結論。相反，測試化合物試驗中的螢光偏振與對照相比顯著升高，則允許得出所述化合物具有激活活性的結論。
序列表110瑟維爾實驗室哈伯裡健尼克斯公司120與Bcl-2家族抗凋亡蛋白相互作用的新肽130肽-1150FR 03.096971512003-08-061604170PatentIn version 3.1210121122212PRT213智人(Homo sapiens)4001Asp Thr Arg Arg Ser Met Val Phe Ala Arg His Leu Arg Glu Val Gly1 5 10 15Asp Glu Phe Arg Ser Arg20210221166212DNA213智人4002gatacccgtc gcagcatggt gtttgccagg cacctgcggg aggtgggaga cgagttcagg 60agcaga66
210321119212DNA213人工4003gctttggaat cactacagg 19210421119212DNA213人工4004cacgatgcac gttgaagtg 19
權利要求
1.與Bcl-2家族抗凋亡蛋白相互作用的肽，特徵在於其為序列SEQ.ID.NO.1Asp-Thr-Arg-Arg-Ser-Met-Val-Phe-Ala-Arg-His-Leu-Arg-Glu-Val-Gly-Asp-Glu-Phe-Arg-Ser-Arg。
2.如權利要求1所述的肽，其與抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-XL和/或Bcl-W相互作用。
3.如權利要求1或2所述的肽，特徵在於其對應於SEQ.ID.NO.1所述肽的片段或點突變體。
4.核酸序列，其編碼如權利要求1所述的肽，特徵在於其為序列SEQ.ID.NO.25』-GATACCCGTCGCAGCATGGTGTTTGCCAGGCACCTGCGGGAGGTGGGAGACGAGTTCAGGAGCAGA-3』。
5.核酸序列，其是由如權利要求1或2所述的胺基酸序列根據遺傳密碼推斷出來的。
6.核酸序列，其是由如權利要求3所述的胺基酸序列根據遺傳密碼推斷出來的。
7.重組載體，特徵在於其包含如權利要求4至6中任一項所述的核酸序列。
8.如權利要求7所述的重組載體，特徵在於所述載體為質粒，其中所述質粒包含為在宿主細胞中表達肽所必需的序列。
9.宿主細胞，特徵在於其已被如權利要求7或8中任一項所述的重組載體轉化。
10.鑑定能夠調節如權利要求1、2或3中任一項所述的肽與Bcl-2家族抗凋亡蛋白之間的相互作用的化合物的方法，特徵在於其包括如下步驟a)製備用螢光標記標記了的如權利要求1、2或3中任一項所述的肽；b)與待測化合物一起孵育；c)添加包含Bcl-2家族抗凋亡蛋白的融合蛋白；d)測量螢光偏振。
11.鑑定能夠抑制如權利要求1、2或3中任一項所述的肽與Bcl-2家族抗凋亡蛋白之間的相互作用的化合物的方法，特徵在於其包括如下步驟a)製備用螢光標記標記了的如權利要求1或2中任一項所述的肽；b)與或不與待測化合物一起孵育；c)添加包含Bcl-2家族抗凋亡蛋白的融合蛋白；d)測量螢光偏振；e)選擇與無待測化合物所觀察到的相比，有待測化合物所觀察到的螢光偏振的增加顯著更低的化合物。
12.鑑定能夠增強如權利要求1、2或3中任一項所述的肽與Bcl-2家族抗凋亡蛋白之間的相互作用的化合物的方法，特徵在於其包括如下步驟a)製備用螢光標記標記了的如權利要求1或2中任一項所述的肽；b)與或不與待測化合物一起孵育；c)添加包含Bcl-2家族抗凋亡蛋白的融合蛋白；d)測量螢光偏振；e)選擇與無待測化合物所觀察到的相比，有待測化合物所觀察到的螢光偏振的增加顯著更高的化合物。
13.如權利要求10至12中任一項所述的方法，其中抗凋亡蛋白為Bcl-2。
14.如權利要求10至12中任一項所述的方法，其中抗凋亡蛋白為Bcl-XL。
15.如權利要求10至12中任一項所述的方法，其中抗凋亡蛋白為Bcl-W。
16.如權利要求10至12中任一項所述的方法，其中所用的肽特徵在於其為序列SEQ.ID.NO.1。
17.如權利要求10至12中任一項所述的方法，其中所用的螢光標記為螢光素。
18.如權利要求1、2或3中任一項所述的肽在如權利要求10至17中任一項所述的方法中在鑑定凋亡調節化合物中的用途。
19.如權利要求1、2或3中任一項所述的肽在如權利要求10至17中任一項所述的方法中在鑑定可用於治療涉及解除凋亡調控的病理的化合物中的用途。
20.如權利要求1、2或3中任一項所述的肽在如權利要求10至17中任一項所述的方法中在鑑定可用於治療自身免疫病、某些神經紊亂和癌症的化合物中的用途。
全文摘要
本發明涉及與抗凋亡蛋白Bcl－2、Bcl－W和/或Bcl－XL相互作用的新肽的鑑定，並且也涉及允許鑑定那些相互作用的調節劑的篩選方法。
文檔編號G01N33/50GK1829737SQ200480021799
公開日2006年9月6日 申請日期2004年8月4日 優先權日2003年8月6日
發明者O·熱內斯特, J·希克曼, R·貝內特, J-C·雷恩 申請人:瑟維爾實驗室, 哈伯裡健尼克斯公司