一種高靈敏性檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法
2024-03-02 12:59:15
專利名稱：一種高靈敏性檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法
技術領域：
本發明涉及一種檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法，尤其涉及ー種高靈敏性的應用RCA-PCR技術檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法。
背景技術：
柑橘冬生疫黴褐腐病原菌Phytophthora hibernalis Carne具有寄主範圍廣，為害柑橘生產嚴重，分布地域廣的特點，且都可以帶病果實、組織或無性繁殖材料進行遠距離傳播。我國柑橘種植區域分布廣泛，近年來這些病原菌隨著引進優質的種子苗木傳人我國的機率越來越大。一旦該病傳入，將對我國柑橘產業造成極大危害。柑橘冬生疫黴褐腐病原菌引起的柑橘冬生疫黴褐腐病害是在澳大利亞西部的柑橘果實上首次發現的，隨後在其他國家和地區也陸續發現。該疫病是侵染柑橘引起的是ー種毀滅性病害，侵染初期，果實表皮出現淺褐色變色，感染部位皮質堅硬，溼度適合時長出白色菌絲體。受害果實味苦、具腐臭味。中國的柑橘種植區域廣泛，地理氣候多祥，有適合病害發生的地區，故定殖可能性大。近距離傳播方式有風雨、工具等傳播途徑，遠距離傳播主要以土壤、果實、繁殖材料進行傳播。該病害一直持續困擾著義大利、葡萄牙等地的柑橘生產。目前針對疫黴屬真菌的系統發育已有部分研究，針對柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的分子檢測技術也有PCR檢測的報導。2008年，張海峰等比較分析了冬生疫黴和其它疫黴的ITS序列，在此基礎上設計了 I對檢測冬生疫黴的特異引物751F/752R，該對引物可從冬生疫黴菌中擴增到一條長616 bp的DNA條帶，而其它19種疫黴和其它真菌均無擴增條帯。其檢測限度可達到每25 UL反應體系只需10 fg基因組DNA的水平，但帶菌柑橘樣品的擴增條帶不特別明顯。因此提供ー種更高靈敏性的檢測方法，成了本領域內的研究熱點。
發明內容
本發明提供了一種高靈敏性檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法，該方法能夠快速、靈敏的檢測出柑橘冬生疫黴褐腐病原菌，本發明提供的檢測方法相比於傳統的利用PCR擴增的檢測方法，其靈敏性至少要高出10X49倍。實現本發明上述目的所採用的技術方案為一種高靈敏性檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法，包括以下步驟(1)、在無菌離心管中依次加入滅菌去離子水、phi29 DNA聚合酶緩衝液、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2以及目標物DNA，然後將其混合均勻後離心，將反應液離心至管底；(2)、將離心管用PCR儀在95°C下加熱3_5min，然後迅速冰浴10_20min ；(3)、在離心管中依次加入dNTPs混合物、BSA及phi29 DNA聚合酶，混合均勻後離心，將反應液離心至管底；(4)、將離心管置於PCR儀中，在30°C的條件下反應10_15h，反應結束後，將離心管在65°C條件下熱浴lOmin，使phi29 DNA聚合酶失去活性，即可製得RCA反應產物，所製得的RCA反應產物應及時使用或_20°C下低溫保存；(5)、另取ー只無菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩衝液、dNTPs混合物、正義引物PHIBl、反義引物PHIB2、RCA反應產物以及TaqDNA聚合酶，然後將反應液離心至管底；(6)、將離心管置於PCR儀上進行擴增，擴增後得到PCR反應產物；(7)、PCR產物用2%-3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化こ錠溶液染色12-20min後，在紫外透射儀上觀察PCR反應結果。步驟(I)中所述的phi29 DNA聚合酶緩衝液為10Xphi29 DNA聚合酶緩衝液，所加入的去離子水、phi29 DNA聚合酶緩衝液、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2以及目標物DNA之間的體積比為5. 9 :1 :0. 5 05 :1，其中正義引物PHIBl和反義引物PHIB2的濃度均為IOii M，目標物DNA的濃度為100-200 ng/U I ;步驟(3)中加入的dNTPs混合物、BSA、phi 29 DNA聚合酶與目標物DNA的體積比為0. 5 :0.1 :0. 5 :1，其中dNTPs混合物的濃度為
2.5mM each, BSA的濃度為1%，phi 29 DNA聚合酶的濃度為IOU/y I。步驟(2)中將離心管用PCR儀在95°C下加熱3min，然後迅速冰浴15min。步驟(5)中加入的組分為滅菌去離子水、PCR緩衝液、濃度為2. 5mM each的dNTPs混合物、濃度為1011|1的正義引物？11181、濃度為1011|1的反義引物？11182、1^^反應產物以及濃度為5U/U I的TaqD NA聚合酶，各物質之間的體積比為18 :2. 5 1 1 1 1 :0. 5。步驟(6)中擴增的程序為94°C3min,94°C 30S，62°C 30S，72°C 30S，循環 32-36次，最後72°C補時5min。本發明提供的檢測方法首先對總DNA進行RCA擴增，RCA有著優越的信號放大功能，是PCR技術的ー種補充發展。滾環擴增(RCA)不僅能直接擴增特定的DNA，實現這些靶核酸的信號放大，而且擴增是在恆溫下實現的，條件比較溫和。利用滾環擴增技術擴增DNA，通過對Pg數量級的微量模板進行滾環擴增，可以得到mg數量級的高質量擴增產物。在單獨的PCR擴增中，將多次稀釋後的菌絲總DNA作模板，即使以前ー輪PCR產物作為模版連續進行PCR擴增，也不能擴增目的片段，因為模板DNA分子太少，第一次PCR不能獲得任何結果。而本發明中，首先進行的RCA擴增為後續的PCR擴增提供了足夠數量的DNA模版保證，使得RCA-PCR比單獨的PCR更加靈敏。同時在本發明中，由於線性雙鏈DNA分子取代了傳統意義上RCA擴增的環狀雙鏈DNA分子，因此本研究不是嚴格意義上的DNA滾環複製，而僅僅是利用了 phi29 DNA聚合酶的超強DNA鏈替換活性和聚合活性，在室溫下完成DNA合成反應。phi29 DNA聚合酶還具有自行修復矯正的功能，因此不會影響DNA序型的保真性。本發明提供的RCA-PCR檢測方法操作簡便、快速，靈敏度高、重複性好，能夠作為ー種病原菌的理想的理想的病原菌檢測手段。
圖1為本發明的實施例1中的凝膠電泳結果圖。
具體實施方式
下面結合具體實施例對本發明做詳細具體的說明。本實施例中菌種柑橘冬生疫黴褐腐病原菌(Phytophthora hibernalis Carne)購自美國ATCC菌種保藏中心，編號為32995 ，並嚴格按照檢疫危險性菌種進行操作與使用。使用前經過DNA的PCR擴增、克隆和測序的驗證。本實施例中目標物DNA的提取方法如下將100 U I濃度為IO7孢子懸液塗布於鋪有滅菌玻璃紙的PDA和V8平板上，18°C下培養7-10天，刮取菌絲冷凍備用。取0. 5g菌絲，置於離心管中，加2ml己預熱(65°C)的CTAB提取緩衝液中，將離心管顛倒混勻，65°C水浴5min,輕輕混勻;加入等體積的苯酹:氯仿:異戍醇(25:24:1),混勻，12000r/min離心15min，取上清液於離心管中，再加入等體積氯仿異戊醇(24:1)混勻，12000r/min離心15min，取上清液於離心管中，加入2倍體積的100%こ醇顛倒混勻，12000r/min離心lOmin，傾去上清液，用70%こ醇將沉澱洗滌兩次。洗滌結束後將含有DNA的離心管置於37°C溫箱中乾燥。乾燥後加30 Ul TE溶解沉澱，於-20°C保存備用。以下實施例中正義引物PHIBl的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示5』 -TCGGGTCTGAGCTAGTAGTCTT-3』 ；反義引物 PHIB2 的核苷酸序列如 SEQ ID NO 2 所示5』 -CTTCCACAACCAATTCCATTATGC-3實施例1本實施例中RCA反應體系的總體積為10 ill。具體檢測方法如下(I)在無菌離心管中依次加入滅菌去離子水5.9iil、10Xphi29 DNA聚合酶緩衝液I yl、濃度為10 y M的正義引物PHIBl體積0. 5 u1、濃度為10 ii M的反義引物PHIB2體積0. 5 以及濃度為200ng/ul的目標物DNA體積I yl，然後將其混合均勻後離心，將反應液離心至管底；(2)、將離心管用PCR儀在95°C下加熱3min，然後迅速冰浴15min ；
(3)、在離心管中依次加入濃度為2. 5mM each的dNTPs混合物0. 5 y1、濃度為1%的BSA 0.1 ill及濃度為10 U/ ill的phi29 DNA聚合酶0. 5 y 1，混合均勻後離心，將反應液離心至管底；(4)、將離心管置於PCR儀中，在30°C的條件下反應llh，反應結束後，將離心管在65°C條件下熱浴lOmin，使phi29 DNA聚合酶失去活性，即可製得RCA反應產物，所製得的RCA反應產物應及時使用或_20°C下低溫保存；(5)、另取ー只無菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水18iU、10XPCR緩衝液2. 5 ii1、濃度為2. 5mM each的dNTPs混合物I y1、濃度為10 y M的正義引物PHIBl體積I U1、濃度為10 y M的反義引物PHIB2體積I ii 1.RCA反應產物I y I以及濃度為5U/ U I的TaqDNA聚合酶0. 5 U I，然後將反應液離心至管底；(6)、將離心管置於PCR儀上進行擴增，擴增程序為94°C下3min，94°C下30S，62°C下30S，72°C下30S，循環36次，最後72°C下補時5min，擴增後得到PCR反應產物；(7)、PCR產物用3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化こ錠溶液染色20min後，在紫外透射儀上觀察PCR反應結果，在瓊脂糖凝膠上可以觀察到僅有一條特異性的DNA片段(407bp)。將IiU RCA反應液進行稀釋，經過測試，稀釋到416倍後還能擴增明顯的DNA條帶，具有極高的靈敏性，如圖1所示，圖1中，泳道1:冬生疫黴菌+水；泳道2-11為逐漸稀釋後的RCA反應液+PHIB，泳道11中RCA反應液稀釋到416倍後還能擴增明顯的DNA條帶。實施例2
本實施例中RCA反應體系的總體積為10 ill。具體檢測方法如下(I)在無菌離心管中依次加入滅菌去離子水5.9iil、10Xphi29 DNA聚合酶緩衝液I yl、濃度為10 y M的正義引物PHIBl體積0.5 yl、濃度為1011|1的反義引物？11182體積0.5111以及濃度為110ng/ul的目標物DNA體積I yl，然後將其混合均勻後離心，將反應液離心至管底；(2)、將離心管用PCR儀在95°C下加熱5min，然後迅速冰浴18min ；(3)、在離心管中依次加入濃度為2. 5mM each的dNTPs混合物0. 5 y1、濃度為1%的BSA 0.1 ill及濃度為10 U/ ill的phi29 DNA聚合酶0. 5 y 1，混合均勻後離心，將反應液離心至管底；(4)、將離心管置於PCR儀中，在30°C的條件下反應15h，反應結束後，將離心管在65°C條件下熱浴lOmin，使phi29 DNA聚合酶失去活性，即可製得RCA反應產物，所製得的RCA反應產物應及時使用或_20°C下低溫保存；(5)、另取ー只無菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水18iU、10XPCR緩衝液2. 5 ii1、濃度為2. 5 mM each的dNTPs混合物I y1、濃度為10 y M的正義引物PHIBl體積I U1、濃度為10 ii M的反義引物PHIB2體積I ill、RCA反應產物I y I以及濃度為5U/U I的TaqDNA聚合酶0. 5 U I，然後將反應液離心至管底；
(6)、將離心管置於PCR儀上進行擴增，擴增程序為94°C下3min，94°C下30S，62°C下30S，72°C下30S，循環36次，最後72°C下補時5min，擴增後得到PCR反應產物；(7)、PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化こ錠溶液染色13min後，在紫外透射儀上觀察PCR反應結果，在瓊脂糖凝膠上可以觀察到僅有一條特異性的DNA片段(407bp)。將IiU RCA反應液進行稀釋，經過測試，稀釋到416倍後還能擴增明顯的DNA條帶，具有極高的靈敏性。
胺基酸序列表
中華人民共和國湖北出入境檢驗檢疫局
:-種高靈敏性撿測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法
2
1 22 DNA
人工序列 1
tcaggtctiia uctagtagtc tt22
2 24 DNA
人工序列 2
cttccacaac caattccatt atgc 2權利要求
1.一種高靈敏性檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法，其特徵在於包括以下步驟 (1)、在無菌離心管中依次加入滅菌去離子水、phi29DNA聚合酶緩衝液、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2以及目標物DNA，然後將其混合均勻後離心，將反應液離心至管底； (2)、將離心管用PCR儀在95°C下加熱3-5min，然後迅速冰浴10_20min； (3)、在離心管中依次加入dNTPs混合物、BSA及phi29DNA聚合酶，混合均勻後離心，將反應液離心至管底； (4)、將離心管置於PCR儀中，在30°C的條件下反應10-15h，反應結束後，將離心管在65°C條件下熱浴lOmin，使phi29 DNA聚合酶失去活性，即可製得RCA反應產物，所製得的RCA反應產物應及時使用或_20°C下低溫保存； (5)、另取ー只無菌離心管，在離心管中依次加入滅菌去離子水、PCR緩衝液、dNTPs混合物、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2、RCA反應產物以及TaqDNA聚合酶，然後將反應液離心至管底； (6)、將離心管置於PCR儀上進行擴增，擴增後得到PCR反應產物； (7)、PCR產物用2%-3%瓊脂糖凝膠電泳分離，經溴化こ錠溶液染色12-20min後，在紫外透射儀上觀察PCR反應結果。
2.根據權利要求1所述的檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法，其特徵在於步驟(I)中所述的phi29 DNA聚合酶緩衝液為10Xphi29 DNA聚合酶緩衝液，所加入的去離子水、phi29 DNA聚合酶緩衝液、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2以及目標物DNA之間的體積比為5.9 :1 :0. 5 :.05 :1，其中正義引物PHIBl和反義引物PHIB2的濃度均為10 y M，目標物DNA的濃度為100-200 ng/u I ;步驟(3)中加入的dNTPs混合物、BSA、phi 29 DNA聚合酶與目標物DNA的體積比為0. 5 :0.1 :0. 5 :1，其中dNTPs混合物的濃度為2. 5mM each, BSA的濃度為1%，Phi 29 DNA聚合酶的濃度為IOU/yl。
3.根據權利要求1所述的檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法，其特徵在於步驟(2)中將離心管用PCR儀在95°C下加熱3min，然後迅速冰浴15min。
4.根據權利要求1所述的檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法，其特徵在於步驟(5)中加入的組分為滅菌去離子水、PCR緩衝液、濃度為2. 5mM each的dNTPs混合物、濃度為IOuM的正義引物PHIBl、濃度為10 ii M的反義引物PHIB2、RCA反應產物以及濃度為5U/ U I的TaqDNA聚合酶，各物質之間的體積比為18 :2. 5 1 1 1 1 :0. 5。
5.根據權利要求1所述的檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法，其特徵在於步驟(6)中擴增的程序為94°C 3min,94°C 30S，62°C 30S，72°C 30S，循環 32-36 次，最後 72°C補時5min。
全文摘要
本發明提供了一種高靈敏性檢測柑橘冬生疫黴褐腐病原菌的方法，包括以下步驟首先在無菌離心管中依次加入滅菌去離子水、phi29 DNA 聚合酶緩衝液、正義引物PHIB1、反義引物PHIB2以及目標物DNA，混合均勻後離心，將反應液離心至管底；將離心管加熱後迅速冰浴；在離心管中依次加入dNTPs混合物、BSA及phi29 DNA 聚合酶，製得RCA反應產物；另取一隻無菌離心管，進行PCR擴增，擴增後得到PCR反應產物；最後檢測PCR產物的結果。該方法能夠快速、靈敏的檢測出柑橘冬生疫黴褐腐病原菌，本發明提供的檢測方法相比於傳統的利用PCR擴增的檢測方法，其靈敏性至少要高出10×49倍。
文檔編號C12Q1/04GK103060448SQ20121058342
公開日2013年4月24日 申請日期2012年12月28日 優先權日2012年12月28日
發明者王振華, 張建坤, 李鳳新, 曾憲東 申請人:中華人民共和國湖北出入境檢驗檢疫局