莫海維芽胞桿菌的應用及其降解鄰苯二甲酸2‑乙基己酯的方法與流程
2024-02-29 23:20:15
本發明涉及莫海維芽胞桿菌的應用及其降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法，屬於環境微生物應用領域。
背景技術：
：鄰苯二甲酸2-乙基己酯(Bison(2-ethylhexyl)ortho-phthalate)，簡稱DEHP，是一類重要的環境激素類有機合成化合物，在工業生產中主要用作聚氯乙烯(PVC)塑料增塑劑，提高塑料的可塑性和易彎曲性。塑料中，DEHP與塑料分子以氫鍵或範德華力連接，很容易通過淋洗、遷移或蒸發等方式進入食物、空氣、飲用水及其它物質中；DEHP也可以在塑料生產或燃燒過程中通過煙塵沉降釋放到環境中。許多動物實驗研究結果顯示DEHP具有生殖發育毒性、免疫毒性、胚胎毒性、肝臟毒性及致癌性等多種毒性，並具有引起甲狀腺素代謝改變的類雌激素活性。美國環保局(EPA)、歐盟以及中國國家環境監測中心均已將其列入優先控制汙染物黑名單。環境中DEHP的分解、轉化方法及技術探索已成為環境汙染治理的重要研究方向。但是DEHP在自然環境中的水解、光解速度非常緩慢，屬於難降解物質。有研究表明，DEHP的水解半衰期達2000年，光解半衰期也需要105年。與水解及光解等物理降解相比，基於微生物代謝的生物降解過程具有功能微生物多樣性、過程簡單、成本低、環境友好等特點，使得微生物降解被認為是自然環境中DEHP完全礦化的最有效途徑。因此，篩選高效分解DEHP的微生物並闡明其分解代謝途徑，對於深化有關消除DEHP環境危害的研究及應用具有現實意義。近年來，DEHP的微生物降解已經得到廣泛的研究，大量能高效降解DEHP的菌株已經從各類環境中分離得到，包括紅樹林、土壤、海洋、河流與廢水處理廠的活性汙泥等，微生物類別包括大量細菌以及部分真菌。研究表明，不同來源以及不同類型的微生物在DEHP降解途徑方面具有較大差異性，所呈現的降解機制也不盡相同。所述降解機制包括發揮降解作用的關鍵酶及酶系、降解途徑中的關鍵節點及關鍵影響因素、微生物自身代謝與降解效果之間的關係、微生物降解廣譜性與特異性及其與DEHP結構的關係等。莫海維芽胞桿菌(Bacillusmojavensis)主要應用在脂肪酶的發酵，目前未見有關利用莫海維芽胞桿菌降解DEHP的報導。技術實現要素：本發明的目的在於提供一種能夠降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的新菌株；及該菌株的應用和採用該菌株降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法。技術方案本發明從土壤中篩選並分離出了一株新的菌株；屬於杆狀的革蘭氏陰性菌，能形成芽孢；經鑑定，該菌株是一種莫海維芽胞桿菌(Bacillusmojavensis)；命名為莫海維芽胞桿菌B1811；保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)；保藏編號為CGMCCNo.12805；保藏時間為2016年7月21日。本發明的莫海維芽胞桿菌B1811能夠降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯；莫海維芽胞桿菌B1811對鄰苯二甲酸2-乙基己酯的降解率可高達99.1％。採用本發明的莫海維芽胞桿菌B1811降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的其中一種方法為：在酵母提取物存在的條件下，莫海維芽胞桿菌B1811與DEHP接觸。其中，酵母提取物的量會影響降解率。所以，上述方法，優選的，在改良BSM基礎鹽液體培養基存在的條件下，莫海維芽胞桿菌B1811與DEHP接觸；所述改良BSM基礎鹽液體培養基，每1L中含有以下成分：酵母提取物2-10g，硫酸銨0.5g，氯化鈉4.0g，三水合磷酸鉀0.5g，七水合硫酸鎂0.4g，蒸餾水餘量；pH7.0。具體的，是將DEHP加入改良BSM基礎鹽液體培養基；將莫海維芽胞桿菌B1811種子液接種於改良BSM基礎鹽液體培養基，在150-200rpm、30-35℃的條件下恆溫震蕩培養。上述方法，優選的，改良BSM基礎鹽液體培養基中酵母提取物的含量為6或7g/L。上述方法，優選的，培養條件為轉速175rpm，溫度30℃；其他條件相同情況下，此培養條件下鄰苯二甲酸2-乙基己酯的降解率最高。上述方法，莫海維芽胞桿菌B1811種子液相對於改良BSM基礎鹽液體培養基的接種量的變化，對單位時間內的DEHP降解率有明顯影響；通常情況下，接種量越多，單位時間內降解率越高；但是對最終降解率(發酵液中DEHP含量達到穩定時的降解率)沒有明顯影響。上述方法，所述莫海維芽胞桿菌B1811種子液是由莫海維芽胞桿菌B1811培養獲得的。在獲得莫海維芽胞桿菌B1811的條件下，本領域技術人員通過常規操作即可以獲得莫海維芽胞桿菌B1811種子液。本發明中，對於某個成分的含量的百分比，如果沒有特別說明，均指重量百分比(w/w)。本發明所用專業術語說明：rpm是轉速單位，1rpm是指每分鐘旋轉一轉。有益效果：(1)首次分離培養出能夠降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的莫海維芽胞桿菌B1811；(2)莫海維芽胞桿菌B1811對鄰苯二甲酸2-乙基己酯的降解率超過99.1％；(3)本發明降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法，與本發明之前細菌、真菌降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法相比，在菌種來源上具有新意，降解率高，降解周期短，操作簡單。保藏信息：保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址：北京市朝陽區北辰西路1號院中國科學院微生物研究所保藏日期：2016年7月21日保藏編號：CGMCCNo.12805分類命名：莫海維芽胞桿菌(Bacillusmojavensis)。附圖說明圖1為本發明中所述莫海維芽胞桿菌B1811的顯微鏡下形態特徵；圖1中，莫海維芽胞桿菌B1811為杆狀的革蘭氏陰性菌，能形成芽孢；圖2為莫海威芽孢桿菌B1811與相關種的16SrDNA序列系統發育分析；圖3為莫海威芽孢桿菌B1811與相關種的recA序列系統發育分析。具體實施方式下述實施例中，如無特殊說明，均為本領域常用方法。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可以通過市購獲得的常規產品。實施例1菌株B1811的鑑定菌株B1811分離自土壤，其形態如圖1所示，屬於杆狀的革蘭氏陰性菌，能形成芽孢。提取其基因組DNA，並利用16srDNA和BCR1引物對於該基因組DNA進行聚合酶鏈反應(PolymeraseChainReaction，PCR)以增殖特定之DNA序列，並利用美國國家生物技術信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation,簡稱NCBI)資料庫進行菌株比對。(1)16SrDNA序列分析：16srDNA正向引物27F：5』-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』,如SEQIDNO.1所示；16srDNA反向引物1541R：5′-AAGGAGGTGATCCAGCC-3′，如SEQIDNO.2所示；擴增所得16SrDNA序列如SEQIDNO：3所示，序列全長為1461bp。將該擴增所得16SrDNA序列與GenBank資料庫中的相關菌株的基因序列進行比較，用MEGA4.1軟體進行序列比對，採用臨位連接法構建系統發育樹，經1000次隨機抽樣，計算Bootstrap值，所構建的系統發育樹如圖2。圖中發育樹節點只顯示Bootstrap值大於50％數值，上標的「T」表示模式菌株。從NCBI上可以查出菌株「B1811」與模式菌株BacillusmojavensisRO-H-1T/JH600280同源性達99.8％。(2)gyrB基因序列分析gyrB-34F基因正向引物：5'-ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg-3'，如SEQIDNO.4所示；gyrB-977R基因反向引物：5'-CCSgCAgARTCACCCTCTACg-3'，如SEQIDNO.5所示；擴增所得gyrB基因序列如SEQIDNO：6所示，序列全長為887bp。將該擴增所得gyrB基因序列與GenBank資料庫中的相關菌株的基因序列進行比較，用用MEGA4.1軟體進行序列比對，採用臨位連接法構建系統發育樹，經1000次隨機抽樣，計算Bootstrap值，所構建的系統發育樹如圖3。圖中發育樹節點只顯示Bootstrap值大於50％數值，上標的「T」表示模式菌株。從NCBI上可以查出菌株「B1811」與模式菌株B.malacitensisCECT5687(DQ903179)同源性達99.5％。因此可以判定B1811為一種全新的莫海威芽孢桿菌。經過鑑定確認其所屬菌種後，莫海威芽孢桿菌B1811於2016年7月21日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；保藏編號為CGMCCNo.12805；此生物材料已經存活試驗測試並通過該試驗。實施例2莫海維芽胞桿菌B1811液體搖瓶培養液製備(1)斜面培養：莫海維芽胞桿菌B1811接種於斜面培養基上，在40℃下培養48小時，得斜面菌株。所用斜面培養基，每1L中含有的成分為：葡萄糖2.0g、蛋白腖1.0g、酵母提取物0.5g、瓊脂1.8g、蒸餾水餘量，pH為中性，115℃滅菌20min。(2)取斜面菌株接種到已滅菌的種子培養基中，在175rpm、30℃的條件下恆溫震蕩培養24h，得到種子培養液。所述種子培養基，每1L中含有的成分為：硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、瓊脂粉15g、酵母提取物5g、蒸餾水餘量，pH7.0，121℃滅菌25min。(3)將10μL的DEHP(工業純)以無菌操作加入含有50mL的改良BSM基礎鹽液體培養基的搖瓶中，將莫海維芽胞桿菌B1811的種子培養液以1mL的接種量接種到搖瓶中，在175r/min、30℃的條件下恆溫震蕩培養72h；得發酵液。所述改良BSM基礎鹽液體培養基，每1L中含有的成分為：酵母提取物5.0g、硫酸銨0.5g、氯化鈉4.0g、三水合磷酸鉀0.5g、七水合硫酸鎂0.4g、蒸餾水餘量，pH7.0，121℃滅菌15min。實施例3DEHP標準曲線制定與含量測定(1)高效液相色譜法(HPLC)製作標準曲線：取600μLDEHP以甲醇為溶劑，製備成1mg/mL的DEHP溶液，稀釋十倍後分別取0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL定容至2mL離心管中，即濃度梯度(μg/mL)為10、20、30、40、50、60、70分別用0.45μm有機濾膜過濾後置於液相小瓶中待測。本實施例3中的高效液相檢測條件為：色譜柱為SepaxGp-C18柱(150mm*4.6mm，5.0μm)；流動相為乙腈-水(83：17，V/V)；進樣量10μL；流速1.0mL/min；柱溫25C°；紫外檢測器波長210nm。以DEHP的峰面積為橫坐標，以DEHP的濃度為縱坐標，製作標準曲線；進而獲得峰面積-濃度方程。實施例4高效液相法檢測DEHP的降解率(1)向實施例2獲得的發酵液中加入與發酵液等量的乙腈對DEHP進行提取，超聲(40KHZ，300W)輔助提取30min後取其中2mL用乙腈定容至10mL，混合均勻後離心(12000rpm,10min)，將離心後的上清液用有機濾膜(0.45μm)進行過濾，棄去初濾液，取續濾液置於液相小瓶中，以實施例3步驟(1)的檢測條件，採用高效液相色譜儀(HPLC)進行分析。運行時間為20分鐘，讀取保留時間在8.5min左右的峰面積值。根據實施例3的峰面積-濃度方程，得續濾液中DEHP的濃度，進而計算出發酵液中DEHP的殘留濃度。(2)降解率的計算公式：降解率％＝(C0-C)/C0*100％，C0為用莫海維芽胞桿菌B1811降解之前DEHP的總質量濃度(μg/mL)(即實施例2步驟(3)發酵之前搖瓶中混合液的DEHP質量濃度：0.1713μg/mL)，C為發酵液中的DEHP的殘留濃度(μg/mL)。經計算，實施例2的降解率為98.9％實施例5莫海維芽胞桿菌B1811降解DEHP的優化將實施例2步驟(3)中的種子液接種量依次改為2、3、4、5、6mL，其他操作同實施例2。按照實施例4的步驟測定發酵液的DEHP濃度，進而計算DEHP的降解率。在不同接種量條件下，DEHP降解率如表1所示。實施例6將實施例2步驟(3)中所用改良BSM基礎鹽液體培養基的酵母提取物的含量依次修改為1、2、3、4、5、6、7、8、10g/L；其他操作同實施例2。按照實施例4的步驟測定發酵液的DEHP濃度，進而計算DEHP的降解率。在不同酵母提取物的含量條件下，DEHP降解率如表2所示。表1種子液接種量(mL)DEHP降解率(％)00198.9298.1398.9499.1599.0699.1表2北京工商大學莫海維芽胞桿菌的應用及其降解鄰苯二甲酸2-乙基己酯的方法6120DNA人工合成1AGAGTTTGATCCTGGCTCAG20217DNA人工合成2AAGGAGGTGATCCAGCC1731461DNA人工合成3ATACATGCAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTG60AGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATA120CCGGATGCTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTAC180AGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCAACGATGC240GTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTAC300GGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGT360GAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCG420AATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAG480CCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAG540GCGGTTCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACT600GGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA660GATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGC720GAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGT780GCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCC840TGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT900GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTG960ACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTC1020GTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTA1080GTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTG1140GGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGAC1200AGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCG1260GATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCAT1320GCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGT1380AACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGA1440TTGGGGTGAAGTCGTAACAAG1461422DNA人工合成4ggTgTWRgKgCNgTCgTAAACg22521DNA人工合成5CCSgCAgARTCACCCTCTACg216887DNA人工合成6AACGCGTTATCAACAGAGCTTGATGTGACTGTTCACCGTGACGGAAAAATCCATCGCCAA60GTCTATAACCGCGGTGTCCCGGTTTCTGATCTTGAGGTTATTGGCGAAACGGATCATACA120GGAACGACTACACACTTTGTTCCAGATCCTGAAATCTTCACGGAAACAACTGAGTATGAA180TATGATTTGCTTGCTAACCGTGTTCGCGAACTAGCCTTTTTGACAAAAGGCGTAAACATC240ACGATTGAAGATAAACGTGAAGGCCAAGAGCGCAAAAATGAGTATCATTACGAAGGCGGA300ATTAAAAGCTATGTAGAGTATTTAAACCGCTCCAAAGAAGTTGTCCATGAAGAGCCGATT360TATATTGAAGGCGAAAAGGACGGCATTACGGTTGAAGTCGCTCTGCAATACAATGACAGC420TACACAAGCAATATTTACTCATTTACAAACAATATCAACACGTACGAAGGCGGTACCCAC480GAAGCCGGTTTTAAAACGGGGCTGACTCGTGTCATCAATGATTACGCCAGAAAAAAAGGA540CTCATAAAAGAAAATGATCCAAACTTAAGCGGAGATGATGTGAGAGAAGGGCTTACCGCG600ATTATCTCGATCAAACACCCGGATCCGCAGTTCGAAGGCCAAACGAAAACAAAACTAGGC660AACTCAGAGGCGCGGACGATCACAGATACGTTATTTTCTGCTGCGTTGGAAACCTTTATG720CTGGAAAATCCAGATGCGGCCAAAAAAATCGTTGACAAAGGCTTAATGGCAGCAAGAGCA780AGAATGGCTGCGAAAAAAGCGCGTGAATTAACGCGCCGCAAAAGTGCTTTGGAGATTTCA840AACCTTCCTGGTAAATTAGCGGACTGCTCTTCGAAAGACCCGAGCAT887當前第1頁1 2 3