家蠶鈉鉀atp酶及其基因和應用的製作方法
2023-12-11 22:53:22 1
家蠶鈉鉀atp酶及其基因和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種家蠶鈉鉀ATP酶及其基因和應用，家蠶鈉鉀ATP酶的胺基酸序列如SEQ ID NO.8所示或SEQ ID NO.8所示胺基酸序列經取代、缺失或添加至少一個胺基酸且來源於家蠶的具有鈉鉀ATP酶功能的酶，該酶具有四個鈉、鉀離子及ATP結合的保守的胺基酸位點，屬於典型的P-type鈉鉀ATP酶，編碼該酶的基因在家蠶五齡第3天的各個組織中均有表達，但鈉鉀ATP酶只在家蠶五齡三天的頭部和表皮中有表達，經體外真核表達後發現鈉鉀ATP酶具有水解ATP酶活性，由於家蠶絲腺腔內金屬離子交換是影響家蠶絲蛋白構象轉換的重要影響因素，因此家蠶鈉鉀ATP酶功能研究對今後改良家蠶絲纖維具有重要的意義。
【專利說明】家蠶鈉鉀ATP酶及其基因和應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬於生物【技術領域】，具體涉及家蠶鈉鉀ATP酶，還涉及編碼家蠶鈉鉀ATP酶 的基因和應用。
【背景技術】
[0002] 鈉鉀ATP酶（NKA)又叫鈉鉀泵，是由丹麥科學家J. C. Skou在1957年首次發現的 P-type ATP酶，它存在於大多數真核生物細胞中。細胞內外的鈉離子濃度梯度可以維持細 胞的體積，而且可以通過Na+/H+和Na+/Ca 2+交換體維持細胞內的氫和鈣離子濃度。此外，細 胞內鈉離子梯度產生的靜電勢是很多細胞膜轉運過程（例如葡萄糖，胺基酸和其他營養物 質向細胞內的轉運）的驅動力，而NKA的主要功能就是維持細胞內的高鉀和低鈉的離子濃 度梯度。
[0003] 迄今為止，在脊椎動物細胞中共發現四個NKA的同位體，除了具有離子轉運的功 能外，脊椎動物的NKA的a 1亞單位可與Src相互作用形成內源激素哇巴因（ouabain)的 受體，進而介導細胞下遊信號通路來調控細胞的生長速度，特別是在胚胎發育，神經導向， 中樞神經系統發育等生理學過程中，發揮了重要作用。近年來許多非脊椎動物如果蠅、暗 蚊、線蟲和水蛭等的鈉鉀ATP酶基因相繼被克隆出來，經過同源比對發現它們與脊椎動物 的NKA同源性非常高，但對非脊椎動物NKA是否也可以與Src相互作用形成受體複合物的 研究未見報導。作為鱗翅目昆蟲模式生物，家蠶的神經組織中存在NKA，但NKA基因在家蠶 體內是以何種形式存在及該基因表達酶的活性包括對家蠶生長發育等過程的影響均未被 研究，因此，對家蠶鈉鉀ATP酶（BmNKA)的全長基因進行克隆、表達和相關功能的研究將有 利於闡明NKA在參與無脊椎動物發育、信號傳導等過程中所起的具體功能。
【發明內容】
[0004] 有鑑於此，本發明的目的之一在於提供家蠶鈉鉀ATP酶，本發明的目的之二在於 提供編碼家香納鍾ATP酶的基因，本發明的目的之二在於提供含有上述基因的表達載體； 本發明的目的之四在於提供家蠶鈉鉀ATP酶的應用。
[0005] 為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案：
[0006] 1、家蠶鈉鉀ATP酶，所述家蠶鈉鉀ATP酶的胺基酸序列如SEQ ID NO. 8所示或SEQ ID NO. 8所示胺基酸序列經取代、缺失或添加至少一個胺基酸且來源於家蠶的具有鈉鉀ATP 酶功能的酶。
[0007] 2、編碼權利要求1所述家蠶鈉鉀ATP酶的基因，其特徵在於：所述基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 7第172-3021位所示或SEQ ID NO. 7第172-3021位經取代、缺失或添加 至少一個鹼基且來源於家蠶的編碼具有鈉鉀ATP酶功能的核苷酸序列。
[0008] 優選的，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示。
[0009] 3、含有所述基因的表達載體。
[0010] 優選的，所述表達載體由SEQ ID NO. 7第172-3201位所示核苷酸序列連入 pEYFP-Cl載體的BspEI和BamHI酶切位點處。
[0011] 4、權利要求1所述家蠶鈉鉀ATP酶在改良蠶絲纖維性能中的應用。
[0012] 本發明的有益效果在於：本發明公開了家蠶鈉鉀ATP酶和編碼家蠶鈉鉀ATP酶 的基因，家蠶鈉鉀ATP酶具有四個鈉、鉀離子及ATP結合的保守的胺基酸位點，屬於典型的 P-type鈉鉀ATP酶，組織表達譜分析發現家蠶鈉鉀ATP酶基因在五齡第3天的各個組織中 均有表達，而在蛋白水平鈉鉀ATP酶只在家蠶五齡三天的頭部和表皮中有表達，將編碼家 蠶鈉鉀ATP酶的基因構建重組表達載體在體外真核表達後具有水解ATP酶活性，建立單克 隆細胞系是後續鈉鉀ATP酶在信號傳導功能研究良好的細胞模型，這為闡明家蠶鈉鉀ATP 酶參與家蠶發育、信號傳導等過程具有重要意義，也為獲得一種絲纖維性能改良的新型家 蠶品種具有重要意義。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0013] 為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖：
[0014] 圖1為BmNKA基因的結構注釋圖。
[0015] 圖2為BmNKA基因和BmNKA蛋白在5齡第3天家蠶雌雄幼蟲中的組織表達特徵 (A :BmNKA基因組織表達譜；B :BmNKA蛋白Western檢測結果）。
[0016] 圖3為建立的表達YFP-rata 1和YFP-Silkworma兩個單克隆細胞系中外源大鼠 與家蠶鈉鉀ATP酶和內源鈉鉀ATP酶的Western定量檢測結果（A和C表示外源鈉鉀ATP 酶表達結果；B和D表示內源鈉鉀ATP酶表達結果）。
[0017] 圖4為穩定表達YFP-ratNKAa 1和YFP-SilkwormNKAa的兩個單克隆細胞系中外 源鈉鉀ATP酶的細胞定位檢測結果（A :穩定表達YFP-ratNKAa 1的單克隆細胞系；B :穩定 表達YFP-SilkwormNKA a的單克隆細胞系）。
[0018] 圖5為家蠶和大鼠的鈉鉀ATP酶分別在PY17細胞系中瞬時轉染表達後的酶活性 測定及Western定量檢測。
[0019] 圖6為轉基因家蠶獲得的結果圖（A為構建過表達BmNKA基因的轉基因載體示意 圖，B為綠色波長的激發光下篩選轉基因陽性個體，轉基因陽性個體的蛹和蛾的眼分別在下 發出綠色螢光；C為以EGFP為探針的Southern blot雜交結果，泳道1是轉家蠶鈉鉀ATP酶 基因的實驗組，泳道2與3分別為陽性與陰性對照）。
[0020] 圖7為利用紅外光譜儀對轉基因蠶與非轉基因蠶的再生絲蛋白溶液蛋白二級結 構觀察結果。
【具體實施方式】
[0021] 下面將結合附圖，對本發明的優選實施例進行詳細的描述。實施例中未註明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如分子克隆實驗指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
[0022] 以下實施例中使用的家蠶品種為大造，由中國西南大學家蠶基因資源庫提供。
[0023] 實施例1、家蠶鈉鉀ATP酶基因（BmNKA)mRNA全長序列的克隆
[0024] 從NCBI中（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/)下載果蠅典型的鈉鉀ATP酶全長氨 基酸序列，將該序列在家蠶9倍基因組預測的蛋白質資料庫（http://silkworm. swu. edu. cn/silksoft/blast2_simple· html)中進行同源比對，發現基因編號為BGIBMGA005058的 基因與果蠅的鈉鉀ATP酶具有最高的同源性，由於家蠶的鈉鉀ATP酶（BGIBMGA005058)基 因具有8條EST序列，利用軟體DNAStar Lasergene對這8條EST序列進行拼接得到該基因 的部分正確的mRNA序列後，設計合成5'RACE的基因特異引物和巢氏基因特異引物。5'RACE 引物序列如下：
[0025] 5058-pl :5'-ttcgataatacggatgtcggcggga-3'（SEQ ID NO. 1);
[0026] 5058_p2 :5,-gaagataccagtaacgatcacgacg-3，（SEQ ID NO. 2);
[0027] 5058_p3 :5'-acggatgacggtggcgaattggggg-3'（SEQ ID NO. 3)。
[0028] 然後按照GeneRacerTM試劑盒（Invitrogen公司）說明書，擴增得到該基因 5'端 的非翻譯區序列（SEQ ID NO. 4)，根據獲得的5'端的非翻譯區序列與拼接的EST序列設計 BmNKA基因的全長序列擴增引物，具體引物如下：上遊引物序列為：（5' -cgtccggaatgggcga gacgcgcagaaaacctcccgc_3，）（SEQ ID N0.5);下遊引物序列為：（5，_gcggatccttaataataag tctcttgttcgagcc-3'）（SEQ ID NO. 6)。
[0029] 以家蠶（大造）五齡3天的頭部cDNA為模板，利用SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6 所示的引物進行PCR擴增，PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒（上海華 舜生物技術有限公司）切膠回收純化目的片段，再將所得目的片段克隆到載體PEasy-Tl simple (Transgen公司），並委託上海生工生物工程有限公司進行測序，結果SEQ ID NO. 7 所示。結果顯示，BmNKA基因 mRNA全長共計3030個核苷酸，開放閱讀框（ORF)為3030個 核苷酸，編碼長為1009個胺基酸的BmNKA蛋白（SEQ ID NO. 8)，經信號肽預測發現在BmNKA 蛋白N端包含一個由22個胺基酸組成的信號肽序列，將獲得的全長序列同家蠶基因組數據 庫比對分析，發現BmNKA基因含15個外顯子和14個內含子，如圖1所示。
[0030] 將BmNKA基因開放閱讀框（ORF)序列及預測的胺基酸序列在NCBI上進行BLAST 比對，根據比對結果分析BmNKA基因進化樹。結果顯示昆蟲、鳥類和哺乳動物等典型的NKA 蛋白序列均具有很高的同源性，而且不同物種的鈉鉀ATP酶亞單位的α 1，α 2, α 3, α 4分 別聚為一支。但作為NKA酶家族進化的早期形式的昆蟲和蟲類的鈉鉀ATP酶僅具有一種亞 單位形式。然後根據比對BmNKA，果蠅NKA α，線蟲NKA α，人NKA α 1，鼠 NKA α 1，鼠 NKA α 2 和鼠 NKA α 3的胺基酸序列。結果顯示，BmNKA基因含有NKA基因的典型結構，表明BmNKA基 因屬於典型的P-type鈉鉀ATP酶。
[0031] 實施例2、BmNKA基因組織表達譜
[0032] 根據BmNKA基因全長序列設計特異引物，具體如下：上遊引物序 列（FP) :5' -gacaggaatggacctaccg-3'（SEQ ID N0·9);下遊引物序列（RP): 5'-gcctgatctcgtcgtagat_3'（SEQ ID N0.10)。同時設計內參基因家蠶肌動蛋白基因 Actin3 的特異引物，具體如下：上遊引物為（A3-F:5'-aacaccccgtcctgctcactg_3'）（SEQ ID N0·ll)，下遊引物為：（A3-R:5'-gggcgagacgtgtgatttcct-3'）（SEQIDN0·12)。分別取家 蠶5齡第3天雌雄幼蟲的各組織（1.生殖腺；2.頭；3.表皮；4.中腸；5.脂肪體；6.馬氏 管；7.血細胞；8.前部絲腺；9.中部絲腺；10.後部絲腺；11.陰性對照）材料，取一部分 組織材料分別採用TRIzol試劑（Invitrogen公司）提取總RNA，利用M-MLV反轉錄試劑盒 (Invitrogen 公司）合成 cDNA 第一鏈，再用 SEQ ID NO. 8 和 SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 10 和 SEQ ID NO. 11所示的引物對進行PCR，PCR擴增條件為：95°C預變性10分鐘，95°C變性40 秒、55°C退火30秒、72°C延伸90秒，共25個循環，最後72°C終延伸10分鐘，將PCR產物用 瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果如圖2 (A)所示。結果顯示，在mRNA水平，5齡第3天的家蠶 各個組織都有BmNKA基因的表達。然後將各組織的剩餘材料用於Western雜交以在蛋白水 平檢測BmNKA酶在各組織的表達情況（與家蠶鈉鉀ATP酶雜交的LEAVE抗體由美國德克薩 斯大學醫學院生理學與細胞生物學實驗室饋贈），結果如圖2 (B)所示。結果顯示，在蛋白水 平BmNKA酶只在家蠶五齡三天的頭部和表皮中有表達。
[0033] 實施例3、單克隆細胞系的建立過程如下
[0034] 根據BmNKA基因 mRNA全長序列設計擴增BmNKA基因開放閱讀框（ORF)的引物， 具體如下：上遊引物序列（FW) ：5' -cgtcc￡gaatgggcgagacgcgcagaaaacctcccgc-3' (SEQ ID NO. 13)，下劃線為 BspEI 酶切位點；下遊引物序列（RW) :5' -gcggatccttaataataagtctcttg ttcgagcc-3'（SEQ ID NO. 14)，下劃線為BamHI酶切位點；然後以家蠶五齡3天的頭部cDNA 為模板進行PCR擴增，經BspEI和BamHI酶切後連入pEYFP-Cl載體的（pEYFP-Cl載體同樣 也經過BspEI和BamHI進行雙酶切），獲得重組表達質粒，命名為BmNKA-pEYFP。
[0035] 同時克隆大鼠的鈉鉀ATP酶基因（基因編號GI :55771)，將其連接入pEYFP-Cl載 體，獲得含有大鼠鈉鉀ATP酶的pEYFP-Cl載體RatNKA-pEYFP，作為陽性對照。
[0036] 將LLC-PKl (豬腎表皮細胞系）細胞在6孔板進行培養，待細胞生長到80%左右分 別用重組表達質粒BmNKA-pEYFP和RatNKA-pEYFP轉染，細胞轉染過程參照invitrogen公 司的Lipofectamine2000轉染試劑盒說明；之後給細胞換成不含FBS和抗生素的培養基，24 小時後換成含FBS和抗生素 G418 (500 μ g/mL)的培養基培養5天，篩選僅表達家蠶和大鼠 NKA酶的細胞群落，繼續在含有抗生素 G418 (500 μ g/mL)的培養基中擴大培養3-5天，再將 擴大培養的混合的細胞群落用胰酶消化下來後轉移到含有新的培養基的24孔板繼續擴大 培養一周，最後把這些細胞消化下來後移種入96孔板，確保每個孔內僅含有一個細胞，擴 大培養後篩選兩個單克隆細胞系（YFP-rat a 1和YFP-Silkworma )進行Western雜交分別 檢測家蠶和大鼠 NKA蛋白（一抗購自FISHER公司，CAT#05369MI)在單克隆細胞系表達的 正確性。利用YFP抗體檢測外源大鼠與家蠶鈉鉀ATP酶基因在豬腎表皮細胞系（LLC-PKl) 中的表達，Western雜交結果如圖3 (A與C)所示。結果顯示，兩個外源鈉鉀ATP酶基因 BmNKA-pEYFP和RatNKA-pEYFP質粒都能夠在LLC-PKl細胞中特異表達，但大鼠比家蠶的鈉 鉀ATP酶基因表達量要高的多。同時以轉染E-YFP質粒的LLC-PKl細胞係為陰性對照，利 用YFP抗體未檢測到外源大鼠和家蠶鈉鉀ATP酶基因在轉染E-YFP質粒在LLC-PKl細胞系 中表達量。
[0037] 為檢測新建立的YFP-rat a 1和YFP-Silkworma兩個單克隆細胞系中內源性豬鈉 鉀ATP酶（GI: 164381)的表達量，利用通用的商品化哺乳動物的鈉鉀ATP酶抗體a 6F與兩 個單克隆細胞系進行雜交，Western雜交結果如圖3的B與D所示。結果顯示，在YFP-rat a 1 單克隆細胞系中大鼠與豬的鈉鉀ATP酶基因均可以在大鼠的單克隆細胞系中表達，而在 YFP-Silkworma單克隆細胞系中內源性piga 1表達量比YFP-rat a 1細胞系中ATP酶表達 量要高得多。
[0038] 四.BmNKA的細胞定位與酶活性測定
[0039] I、BmNKA細胞定位流程
[0040] 將滅菌後的玻璃切片輕放於6孔板，將YFP-rat a 1和YFP-Silkworma兩個細胞 系分別培養於玻璃切片上，待貼壁生長至細胞密度達到80%左右後直接利用螢光共聚焦顯 微鏡觀察，如圖4所示。結果顯示，連接有YFP標籤的大鼠鈉鉀ATP酶α?亞單位基本都定 位在細胞膜上，而家蠶鈉鉀ATP酶大部分都在細胞質中，但仍有少部分定位在細胞的膜上。
[0041] 2、BmNKA酶活測定步驟
[0042] (1)製備ΡΥ17細胞系：ΡΥ17細胞系是通過瞬時轉染A4siRNA表達載體 (?5即?^ 8〇1^4以1?嫩）到豬腎表皮細胞系（1^(：-?1(1)24小時後利用濃度11^/1^嘌呤黴 素（puromycin)進行篩選，其中內源性的豬鈉鉀ATP酶基因被設計的SiRNA靶標序列幹涉 掉，最後獲得了僅含有維持細胞生命必需的7. 5 %左右內源性豬鈉鉀ATP酶的PY17細胞 系，PY17細胞系可作為下一步測量鈉鉀ATP酶活性的生物模型（具體方法參見：Man Liang et al. Functional Characterization of Src-interacting Na/K-ATPase Using RNA Interference Assay. JBC. 2006. 281(28)。
[0043] PY17細胞系培養至細胞密度達到80-90 %後，瞬時轉染YFP-rat a I與 YFP-silkworma兩個質粒到PY17細胞系，每類細胞傳代三盤到IOcm的盤中，生長到90% 左右後用 buffer A(BufferA 為 pH7. 4 終濃度為 30mM 組氨酸，250mM 蔗糖，lmMEDTANa2*2H20 的混合溶液）溶液收集；勻楽攪拌15次後超聲處理；800g離心IOmin後收集沉澱；再 在4°C，45000g高速離心45min獲得細胞膜沉澱；接著在IOOg速度條件下離心IOmin,用 buffer A溶解後測定蛋白濃度，並用buffer A稀釋到蛋白濃度為1?2mg/mL，得待測樣品； 每個樣品準備6個管子，其中3個管子加入哇巴因至終濃度為ImM，另3個管子加入等體積 的水，每管加入含5?10μ g蛋白的待測樣品；然後加入丙甲菌素（alamethicin)，加入量 按每10 μ g蛋白加入1 μ L丙甲菌素，然後於室溫下靜置10min。
[0044] 準備如表1所示的反應混合體系：
[0045] 表1、反應混合體系
[0046]
【權利要求】
1. 家蠶鈉鉀ATP酶，其特徵在於：所述家蠶鈉鉀ATP酶的胺基酸序列如SEQ ID NO. 8所 示或SEQ ID NO. 8所示胺基酸序列經取代、缺失或添加至少一個胺基酸且來源於家蠶的具 有鈉鉀ATP酶功能的酶。
2. 編碼權利要求1所述家蠶鈉鉀ATP酶的基因，其特徵在於：所述基因的核苷酸序列 如SEQ ID NO. 7第172-3201位所示或SEQ ID NO. 7第172-3201位經取代、缺失或添加至 少一個鹼基且來源於家蠶的編碼具有鈉鉀ATP酶功能的核苷酸序列。
3. 根據權利要求2所述的基因，其特徵在於：所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所 /Jn〇
4. 含有權利要求2或3所述基因的表達載體。
5. 根據權利要求3所述的表達載體，其特徵在於：所述表達載體由SEQ ID NO. 7第 172-3201位所示核苷酸序列連入pEYFP-Cl載體的BspEI和BamHI酶切位點處。
6. 權利要求1所述家蠶鈉鉀ATP酶在改良蠶絲纖維性能中的應用。
【文檔編號】C12N15/85GK104312993SQ201410555339
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月16日 優先權日:2014年10月16日
【發明者】趙萍, 衣啟營, 王鑫, 夏慶友, 宋倩茹 申請人:西南大學