辨識甘氨酸氮甲基轉移酵素的單克隆抗體及其使用方法的應用的製作方法

2023-12-09 11:41:46 2

專利名稱：辨識甘氨酸氮甲基轉移酵素的單克隆抗體及其使用方法的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及單克隆抗體及其使用方法的應用，尤其涉及可辨識甘氨酸氮甲基轉移酵素(GNMT)的單克隆抗體以及應用此抗體偵測、監控因甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白表達量低或不正常形成的腫瘤惡性趨向的方法。
背景技術：
肝癌是世界上嚴重的惡性腫瘤之一，每年約有一百萬人死於肝癌。肝癌流行於亞洲、非洲和地中海。在B和C型肝炎盛行的地區，肝癌也有較高的發生率。80％以上肝癌患者的肝臟有硬化現象。一旦被病毒傳染，大約10年會發展成慢性肝炎患者，約20年變成肝硬化患者，到30年時發展成肝癌病人。在非洲和亞洲的國家中黃麴黴素是最重要的汙染源，由於不完善存儲造成黃麴黴素產生菌(Aspergillus flavus)汙染農作物，是肝癌發展的一個重要危險因素，其機制很可能通過p53抑制基因的突變造成。
對於肝硬化的病患，當在肝臟功能惡化，發生急性症狀(有腹水、腦病、便血、黃膽)，或者上腹部疼痛和發燒時應該被懷疑診斷為肝癌。腹部超音波可用來確定多數腫瘤，硬化的肝臟之內有散布大小顆粒的存在、胚肝蛋白超過500納克/毫升是確定診斷的方法。活組織檢查是不必要的，應該避免以減少腫瘤擴散的危險，而外科切除是能夠提供治癒的唯一處理方法。然而，對於現存的腫瘤和之前的肝硬化，這樣的處理在不到20％病人中是切實可行的。平均手術後死亡率在肝硬化的病人中是12％，並且能夠生存五年的大約是15％。對肝硬化和小腫瘤(小於5cm)的患者應該進行肝臟移植。打入酒精或者電刀燒除對移植合適的小腫瘤的病人，可改善存活率。對更大腫瘤的患者，使用細胞毒殺的藥物(cisplatin或者doxorubicin)及動脈栓塞可以在一些病人中引起腫瘤壞死。
並沒有診斷或者評價腫瘤惡性程度的絕對方法。然而，在各種方法中間，組織的顯微鏡檢查仍然是用於常規使用的最可靠的方法。在病理的研究方面，能夠由逆分化程度的近似評估肝細胞回復較原始形態的現象，由此檢查部分為基礎以組織學和細胞學的標準分類腫瘤。從一方面來看，一些細胞也許失去他們的專門架構特性，但是仍然保留分化的生物化學特性，當其它細胞仍然在架構中出現分化，卻失去了許多正常的功能。另一方面，可能有一個腫瘤含等級不同的種類在同一範圍，因此發展的腫瘤可能在架構，成長潛力，有不一致的細胞混合成，可抵抗藥物或X光殺傷力而且有轉移的危險。這兩個限制降低了以組織學方法檢查的合適性，另一方面，用抽樣檢體方法對大規模檢查並不合適。
長期以來，有許多試圖尋找惡性腫瘤標示方法，如試圖確定腫瘤專一或者腫瘤相關的蛋白，直接測量或者用此蛋白質發展專一抗體。不僅提供診斷而且提供破壞癌細胞的策略，看來是有前途的方法。對某些癌症的報導已經揭示許多物質在活體中與癌症有相關性，如胚原蛋白胚肝蛋白，血清蛋白質，例如鐵蛋白，代謝酵素，多胺體(polyamines)，異構的荷爾蒙，細胞表面標誌，腫瘤相關病毒抗原等。然而，傳統癌症診斷的組織學分析方法仍是最可信賴的，只是這種方法仍不適合大量篩選。
最近研究癌化相關現象時發現，其與若干正常生長基因變異及癌腫瘤抑制基因不活化與活化相關。若進一步使用基因的差異表現法能在細胞中反映核糖核酸水準信息，則可以顯示腫瘤和正常細胞之間的差異(Liang等，Cancer Research 52，6966-6968，1992)。

發明內容
本發明令人驚訝地發現在正常和腫瘤細胞之間的GNMT基因表達有極大的差異性，本發明的目的是要提供一種由GNMT的基因表達相對水準來探查細胞癌化的方法。
在本發明中，採用單克隆抗體來偵測GNMT表現量，使用一個敏感方法在血清、血漿或組織找出肝癌形成的致病機轉中GNMT之間的相互關係。以免血抗體做捕獲抗體來捕獲血清或者血漿中的人類GNMT，進一步，以單克隆抗體GRL1表達抗體來分析，可以分析出在肝癌不同病程中，GNMT蛋白的表達量與病程發展有極顯著的相關性(p＜0.01或0.05)。
上述單克隆抗體優選選自包含可與人類GNMT蛋白的胺基酸序列第10到15(參見SEQ ID NO2)或第272到278(參見SEQ ID NO1)作用的單克隆抗體。優選的是，該單克隆抗體為GRL1及GRL7。產生特殊抗體GRL7的相關生物材料已於2003年5月14日寄存於美國典型培養物保藏中心(American Type Culture Collection(ATCC)，P.O.Box1549 Manassas，VA20108)，且已取得保藏號碼為PTA-5195。產生特殊抗體GRL1的相關生物材料已於2003年7月14日寄存於ATCC，且取得保藏號碼為PTA-5319。
本發明所提供的偵測因甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白表現量不同的方法，其步驟如下a)提供生物的檢體；b)採用由(GRL1)PTA-5319及GRL7(PTA-5195)融合瘤產生的單克隆抗體GRL1或GRL7或是這兩種抗體的混合，c)將檢體與所宣稱抗體接觸；d)偵測因所宣稱的抗體與所宣稱的檢體接觸後，而得到所謂的甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白數量狀況。
根據本發明的具體實施方案，上述方法中所述的生物的檢體包括全血、血漿、血清、身體組織。而這些生物的檢體來源可包括因肝癌、設護腺癌、乳癌、腎癌、膽管癌、胰臟癌及胃癌取得的檢體。
優選地，本發明所提供的方法其步驟還可包含a)檢體與單克隆抗體的接觸；b)由接觸的程度來決定甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白的濃度。
另一方面，本發明還提供了所述單克隆抗體在偵測甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白的表達量中的應用，以及產生所述單克隆抗體的融合瘤PTA-5319及PTA-5195的應用。


圖1A和圖1B分別顯示兩個構築表達質粒pGEX-GNMT(圖1A)和pGNMT-His(圖1B)。
圖2A-圖2D為用單克隆抗體GRL1和GRL7顯示GNMT的重組和原生的形式的識別圖。SDS-PAGE的凝膠體含有的圖版圖2A輝煌藍R250染色從大腸桿菌溶解液[JM109]含有pGEX-GNMT，或者[BL21]含有pGNMT-His以IPTG誘導以前(第1、6行)和以後(第2、7行)。這個非結合(第3、9行)和對以組氨酸純化管柱純化及麩氨基硫洋菜膠(glutathione agarose)管柱純化洗提液(第4、8行)在這個行4和行8也被分析了。圖2B對具有GST-GNMT和GNMT蛋白條以單克隆抗體做蛋白質印跡(western blot)。蛋白條有一個免疫前的兔子血清(第1行)，注射GST-GNMT的兔子血清R4(第2行)，單克隆抗體GRL1(第4行)和單克隆抗體GRL7(第5行)。這些條使用間接方法，和表現出受質3-3′聯苯氨顏色。圖2C蛋白質印跡在有細胞轉染溶解液蛋白條，用pCMV-GNMT的質體DNA從293T細胞轉染溶解液。圖2D用GST和GNMT蛋白條上的蛋白質印跡化驗。抗體用於圖版1C和D蛋白行，免疫前的兔子血清；第2行，R4；第3行，正常的老鼠血清；第4行，單克隆抗體GRL7；和第5行，單克隆抗體GRL1。每一個圖版的左邊標明分子重量標誌。
圖3A和圖3B為GNMT的結合反應條件測試及結合反應圖。圖3A顯示結合GNMT反應管醋酸鈉鹽緩衝液pH條件的測驗，其中，1為pH4，2為pH4.5，3及5為pH5.0，4及6為pH5.5，7為pH6。圖3B顯示GNMT的結合反應，其中，階段1為PBST基本線，2為增加EDC/NHS 200微升3次6分鐘，3為PBST洗滌3次，4為pH5.0鈉醋酸鹽緩衝液200微升，5為50微升GNMT(9微克)+150微升pH5.05分鐘的鈉醋酸鹽pH緩衝液，6為加入1M ethanolamin pH8.5 200微升5分鐘停止結合反應及200微升10mM HCl和PBST洗滌3次進行兩個周期的再生反應。
圖4為GRL7和GRL1單克隆抗體對重組GNMT結合反應管反應圖。向反應管中添加2 00微升培養液，以PBST做二倍的稀釋，並且由3.01IAsys控制軟體版本測量這個應答。由FAST fit計算這兩個單克隆抗體的分解常數。GRL1的免疫蛋白G濃度(1)4×10-11，(2)8×10-11，(3)1.6×10-10，(4)3.2×10-10，(5)6.3×10-10，(6)1.3×10-9，(7)2.5×10-9，(8)5.1×10-9，(9)1.0×10-8M；GRL7的免疫蛋白G濃度(1)4.7×10-11，(2)9.4×10-11，(3)1.9×10-10，(4)3.8×10-10，(5)7.5×10-10，(6)1.5×10-9，(7)3×10-9，(8)6×10-9，(9)1.2×10-8M。
圖5A和圖5B為在人類肝臟、老鼠肝臟、肝胚葉腫瘤(HepG2和Huh6)和肝的癌細胞中顯示GNMT存在的蛋白質印跡分析(PLC/PRF/5、Huh7、HA22T、Hep3B和Sk-Hep1)，此時有單克隆抗體GRL1(圖5A)或者GRL7(圖5B)。其中，1為肝癌病人非腫瘤組織；2為C57/BL老鼠的肝臟；3為HepG2；4為PLC/PRF/5；5為Huh6；6為Huh7；7為HA22T；8為Hep3B；9為Sk-Hep1。下行的圖版是乙型肌動蛋白對照抗體的作用在相同蛋白電泳行列內，在每一個圖版的左邊際標明有分子量標誌。
圖6為單克隆抗體GRL7或者GRL1用於兩個肝癌病人的石蠟固定的肝臟組織部分GNMT表現的免疫化學分析。使部分暴露在1∶25稀釋(圖版A、B)或者1∶100稀釋的單克隆抗體GRL1和單克隆抗體GRL7(圖版C、D)由鏈球菌蛋白素-H的方法顯示。圖版A、B為來自肝癌病人H126的非腫瘤組織及腫瘤(放大100倍)。圖版C、D為來自另一個肝癌病人H146的非腫瘤和腫瘤組織(放大400倍)。
圖7為從GNMT定量酵素免疫分析結果的分析顯示平均圖和盒子分布圖。由臺灣臺北仁愛醫院90個慢性肝炎病人、20個確認的肝硬化病人和22個肝癌病人、413健檢健康血清，總計545個血清樣品。在這些病人血清GNMT濃度和正常人的標準偏差的初步估計，對慢性肝炎、肝硬化、肝癌病人分別是11.04±16.24、7.19±9.25、3.14±3.38、2.19±2.54納克/毫升(ng/ml)。
具體實施例方式
本發明提供了探查減少GNMT水準的細胞變形的單克隆抗體。為了從肝癌病人評價GNMT在細胞株和組織方面的表達，本發明提供了兩個單克隆抗體(mAbs)GRL7和GRL1，使用兩個重組GNMT蛋白質質粒(圖1A-圖1B、圖2A-圖2D)。以M13噬菌體展示法顯示單克隆抗體GRL7和GRL1的反應抗原決定位分別是在人類GNMT胺基酸序列第272-278及第10-15的位置，如表1A、表1B所示。
表1A、表1B以M13噬菌體展示法決定單克隆抗體GRL1(表1A)、GRL7(表1B)，其中，保守不變的胺基酸以橫線「-」表示，以「X」表示沒有特定喜歡的胺基酸。
表1A.GRL1

表1B.GRL7

以生物傳感器的反應管結合人類重組GNMT蛋白，測試出最佳結合條件(圖3A)，並加以結合在反應管表面(圖3B)，以此測得在GNMT和mAbs之間的解離常數mAb GRL7(圖4A)的為1.7×10-8M，GRL1(圖4B)的為1.8×10-9M。
使用單克隆抗體GRL1及GRL7的蛋白質印跡法分析發現在正常的老鼠和人類的肝臟組織中確定GNMT的存在。也顯示在2個肝胚葉腫瘤及5個肝癌細胞株沒有GNMT表達(圖5A、圖5B)。
用上述兩個單克隆抗體GRL1及GRL7作免疫化學分析如表2A、2B所示，同一病患非腫瘤的肝臟組織和肝癌組織的比較(同時參見圖6A、圖6B)，有96％(24/25)及50％(13/26)沒有表達GNMT，如表2A、表2B。由此可知在人類肝癌中，GNMT的蛋白表現，被向下調節了。
表2A、表2B以免疫化學染色法用GRL1(表2A)及GRL7(表2B)來鑑定肝癌病人中正常組織(N)及肝癌組織(T)。
表2A

a.單克隆抗體GRL1及GRL7(腹水)稀釋濃度分為1∶100及1∶25。
表2B

b.N+/T+在正常組織(N)及肝癌組織(T)都染到GNMT；N+/T-在正常組織(N)染到GNMT及肝癌組織(T)沒染到GNMT；依此類推。
序列表110晶研生化科技股份有限公司120辨識甘氨酸氮甲基轉移酵素的單克隆抗體及其使用方法的應用130F0311186G1602170PatentIn version 3.121012117212PRT213智人4001Asp Phe Lys Pro Tyr Lys Pro1 521022116212PRT213智人4002Ser Leu Gly Val Ala Ala1 權利要求
1.偵測甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白表現量的方法，其步驟如下a)提供生物的檢體；b)採用由GRL1(PTA-5319)及GRL7(PTA-5195)融合瘤產生的單克隆抗體GRL1或GRL7或是這兩種抗體的混合，c)將檢體與所宣稱抗體接觸；d)偵測因所宣稱的抗體與所宣稱的檢體接觸後，而得到所謂的甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白數量狀況。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物的檢體包括全血、血漿、血清、身體組織。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述生物的檢體來源包括因肝癌、設護腺癌、乳癌、腎癌、膽管癌、胰臟癌及胃癌取得的檢體。
4.根據權利要求1-3任一項所述的方法，其包含a)檢體與單克隆抗體的接觸；b)由接觸的程度來決定甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白的濃度。
5.甘氨氮甲基轉移酵素蛋白的單克隆抗體GRL1及GRL7。
6.權利要求5所述的單克隆抗體所辨識的抗原決定位的胺基酸序列。
7.利用甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白序列為10到15及272到278位置的單克隆抗體。
8.權利要求5或7所述的單克隆抗體在偵測甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白的表達量中的應用。
9.產生權利要求5所述單克隆抗體的融合瘤PTA-5319及PTA-5195。
10.權利要求9所述的融合瘤的應用。
全文摘要
本發明提供了可用以辨識甘氨酸氮甲基轉移酵素的單克隆抗體，尤其是通過融合瘤PTA－5319及PTA－5195產生的兩株單克隆抗體。本發明的單克隆抗體可用以辨識甘氨酸氮甲基轉移酵素(GNMT)的蛋白表達，該結果可用於偵測、監控、診斷因甘氨酸氮甲基轉移酵素蛋白表達量低或不正常形成的腫瘤惡性趨向，本發明還提供了這樣的使用方法的應用。
文檔編號G01N33/574GK1627076SQ20031011854
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月12日 優先權日2003年12月12日
發明者陳宜民 申請人:晶研生化科技股份有限公司