逆型膠體金免疫層析試劑條及其應用的製作方法

2023-12-09 06:36:51

專利名稱：逆型膠體金免疫層析試劑條及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及免疫層析試劑條，具體指加樣點位於固相膠體金標記結合物前沿的逆型膠體金免疫層析試劑條。
本發明還涉及上述試劑條的應用。
背景技術：
金標免疫檢測技術屬於固相膜免疫測定技術。金標免疫檢測技術包括金標免疫滲濾法(滴金免疫測定法)和金標免疫層析法。金標免疫滲濾法建立於20世紀90年代初，是以硝基纖維素膜為載體，利用微孔濾膜的可濾過性，使抗原抗體反應和洗滌在一特殊的滲濾裝置上以液體滲濾過膜的方式迅速完成。金標免疫層析法是繼金標免疫滲濾法之後發展起來的另一種膜固相免疫測定方法，目前已被廣泛應用，其原理是以微孔濾膜(如硝基纖維素膜)為固相載體，並利用微孔濾膜的毛細管作用，使加於膜條一端的液體樣品向另一端滲移，猶如層析一般。移動過程中被分析物與固定於膜上某一區域的受體(抗原或抗體)結合而被固相化，無關物則越過該區域而被分離，然後通過標記物(膠體金)的顯色來判定檢測結構。金標免疫層析法的特點是快速、簡便，利用膠體金免疫層析試劑條可使抗體抗原「三明治」夾心反應於5-30分鐘內快速進行。全部反應在一個試劑條上完成，將樣品膜(玻璃纖維紙或其它纖維紙)、固相膠體金標記物(Conj)、硝基纖維素膜和吸水紙裝配於帶有雙面粘膠的塑料薄板上。硝基纖維素膜上有兩個反應區域，測試區(T區)固相一條特異抗原/抗體，對照區(C區)，固相一條對照帶。固相膠體金標記物是為與T區相對應的另一特異「抗原/抗體-金標記物」的乾燥顆粒。經典試劑條的測試流程為滴入尿液、血清、血漿、血液、唾液等待測液或樣品提取液或它們的稀釋液於樣品膜(S)上面。有的檢測項目需隨後再於同一位置滴入「緩衝液」以達到更好的效果。如果樣品中含有待測成分，該待測成份分子的一端將與膠體金標記物中特異抗原/抗體形成複合物，該複合物按毛細管原理上行於纖維膜上。在測試區(T)，待測成分分子的另一端將於固相化的另一特異抗原/抗體起反應，並在T處被「固定」。由於膠體金顆粒是玫瑰色，於是在T區出現了一條玫瑰色線。該處顏色深淺與待測樣品濃度高低成正比例。金標免疫層析檢測技術目前已得到廣泛的應用，如進行人絨毛促性腺激素(HCG)、促黃體生成激素(LH)、促卵泡成熟激素(FSH)、促甲狀腺激素(TSH)等激素的測定；衣原體(Chlamydia)、人類免疫缺陷病毒(HIV)、梅毒(Syphilis)、B肝病毒(HBV)、幽門螺旋桿菌(Hpy)等感染原的檢測；嗎啡、古柯鹼、鴉片等毒品的檢測；以及心肌梗塞指標(如肌鈣蛋白Tni、異激動酶CKMB、肌紅蛋白Myoglubin)和腫瘤指標(如前列腺特異抗原PSA、胚癌蛋白CEA、甲胎蛋白a-FP)的檢測等。
利用金標免疫層析法測定抗體時，一般採用膠體金標記抗人IgG/IgM，在硝基纖維素膜上固相一條特異性抗原。在檢測中，按上述反應流程因樣品中的特異性和非特異性IgG/IgM先與膠體金標記抗人IgG/IgM競爭結合，大大降低了檢測的敏感度，因此上述流程的膠體金免疫層析試劑條並不能用於某些檢測項目，尤其無法對TORCH抗體進行檢測。將弓形體(Toxoplasmagondii)、巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、風疹病毒(Rubella)、單純皰疹(Hepes Smplex virus III)這幾種抗原按第一字母組合，簡稱為TORCH，應用上述經典的膠體金免疫層析試劑條對TORCH抗體進行檢測時，在T區見不到色帶，即使在高濃度抗體的存在下，也極難見到T色帶。

發明內容
本發明的目的在於提供一種逆型膠體金免疫層析試劑條，改換經典金標免疫檢測的反應步驟，以獲得高靈敏度的檢測效果，從而拓寬經典膠體金免疫層析試劑條的應用範圍。
本發明的另一目的在於提供上述逆型膠體金免疫層析試劑條的用途。
本發明提出的逆型膠體金免疫層析試劑條，將樣品加入點由經典試劑條(組成結構見附圖1)的樣品膜(S)處移至固相膠體金標記結合物的前沿，樣品膜處僅用於滴加緩衝液。本發明試劑條的底板可採用雙面膠塑料片，塑料片兩端粘貼有吸水材料，其中一端為緩衝液加入區(B)，可採用材料包括玻璃纖維紙或其它纖維紙，另一端為吸水紙區(A)，材料以吸水性強的濾紙為佳。緊鄰B區為乾燥固相膠體金標記結合物(Conj)，加樣點位於Conj的前沿。Conj與A的中間粘貼吸附有受體(抗原或抗體)的硝基纖維素膜，受體以直線的形式包被在膜上，自Conj向A方向，硝基纖維素膜上有兩個反應區域，測試區(T區)固相一條特異抗原/抗體，對照區(C區)，固相一條對照帶。本發明試劑條的反應特點在於首先將待測樣品加於固相膠體金標記結合物之前使之向測試區層析移動，隨後用一定的緩衝液溶解固相膠體金標記結合物，使之在硝基纖維素膜上向測試區發生移動，這樣待測成分分子首先與固相於測試區的特異抗原/抗體形成複合物並被固定，然後再與膠體金所標記的特異抗原/抗體結合，形成最終的顯色複合物(試劑條組成結構見附圖2)。這樣對經典試劑條的反應順序(即待測成分分子首先與膠體金所標記的特異抗原/抗體結合形成顯色複合物，然後再與固相於測試區的特異抗原/抗體形成最終複合物並被固定)進行了逆向改變，從而在利用試劑條檢測抗體時，大大降低了樣品中大量非特異性IgG/IgM的幹擾，從而避免了樣品中特異性和非特異性IgG/IgM與膠體金標記抗人IgG/IgM的先行競爭結合，提高了試劑條的檢測靈敏度。本發明拓寬了經典試劑條的檢測範圍，尤其可以有效地用於TORCH抗體檢測。根據實際需要，本發明逆型膠體金免疫層析試劑條可製成測定單一指標的試劑條或同時測定多項指標的試劑條。本發明逆型試劑條可用於抗原或抗體的檢測，應用本發明逆行試劑條，可根據其測試區所固相的抗體或抗原，檢測相對應的抗原或抗體。以有色乳膠顆粒、螢光或其它發光物質等代替膠體金作為標記物，可將本發明試劑條製成相應的逆型免疫層析試劑條。
下面以抗體抗原「三明治」夾心法測定TORCH抗體為例，說明逆型膠體金免疫層析試劑條的操作步驟和原理首先加入待測液血清、血漿於膠體金標記結合物Conj的前沿，隨後立即於B處滴入2滴緩衝液，該緩衝液在溶解固相膠體金標記抗人IgG/IgM抗體的同時「衝向」硝基纖維素膜，將待測液成份先帶入T區。如樣品中含有待測成分，即TORCH抗體，該抗體將被在T區的固相TORCH抗原所捕獲並形成抗原抗體複合物。而樣品中所含的大量非特異性人免疫球蛋白IgG/IgM，將通過T區繼續前進而被排除。在T區形成的足夠量「抗原抗體」複合物與隨之而來的膠體金標記抗人IgG/IgM抗體形「TORCH抗原-人體TORCH抗體-抗人IgG/IgM抗體-膠體金顆粒」複合物。因而在T區產生玫瑰色色帶，其顏色深淺與TORCH抗體含量成正比例。如樣品中不含有待測成分，或TORCH抗體的含量低於檢測靈敏度。則在T區不形成可見的玫瑰色帶，即為陰性結果。如需檢測IgG型TORCH抗體，則使用抗人IgG抗體膠體金標記物。如需檢測IgM型TORCH抗體，則用抗人IgM抗體膠體金標記物。T區可固相化一種或多種TORCH抗原，膠體金標記結合物可採用膠體金標記的羊或兔或其它動物品種抗人的免疫球蛋白IgG/IgM。


圖1為經典型膠體金免疫層析試劑條的組成結構圖，其中S指樣品膜；Conj指固相膠體金標記結合物；T指測試區；C指對照區；Abs指吸水紙區圖2為本發明逆型膠體金免疫層析試劑條的組成結構圖，其中B指緩衝液加入區；S指樣品加入點；Conj指固相膠體金標記結合物；T指測試區；C指對照區；Abs指吸水紙區圖3五合一逆型膠體金免疫層析板檢測盒的結構圖，其中I指用於檢測Toxo抗體的試劑條；II指用於檢測CMV抗體的試劑條；III指用於檢測Rubella抗體的試劑條；IV指用於檢測HSV-I抗體的試劑條；V指用於檢測HSV-II抗體的試劑條；B指緩衝液加入區；Conj指固相膠體金標記結合物；S指樣品加入點；T指測試區；C指對照區。
圖4為四合一逆型膠體金免疫層析板檢測盒的結構圖，其中B指緩衝液加入區；Conj指固相膠體金標記結合物；S指樣品加入點；Toxo指固相化Toxo抗原；CMV指固相化CMV抗原；Rubella指固相化Rubella抗原；HSV-I/II指固相化HSV-I/II抗原；C指對照區。
有益效果1、本發明提供了一種新穎的逆型膠體金免疫層析試劑條，逆向改變了經典金標免疫檢測的反應步驟，大大降低了樣品中大量非特異性IgG/IgM的幹擾，從而大大降低了樣品中特異性和非特異性IgG/IgM與膠體金標記抗人IgG/IgM的競爭結合，提高了試劑條的檢測靈敏度。
2、本發明拓寬了膠體金免疫層析試劑條的應用範圍，利用本發明逆型膠體金免疫層析試劑條可有效地進行TORCH抗體的檢測。
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明作進一步闡述，但不限制本發明。
實施例1 五合一逆型膠體金免疫層析板檢測盒如圖3所示，本檢測盒由檢測單項TORCH抗體的逆型膠體金免疫層析試劑條組合而成，該檢測盒由5個試劑條組合而成，其中試劑條I用於檢測人抗弓形體(Toxo)抗體；試劑條II用於檢測人抗巨細胞病毒(CMV)抗體；試劑條III用於檢測人抗風疹病毒(Rubella)抗體；試劑條IV用於檢測人抗單純皰疹I(HSV-I)抗體；試劑條V用於檢測人抗單純皰疹II(HSV-II)抗體。每個試劑條均包括緩衝液加入區(B)、固相膠體金標記結合物(Conj)、樣品加入點(S)、測試區(T)、對照區(C)和吸水紙區(Abs)。其中各試劑條的T區分別包被固定有相應的TORCH抗原。
製備本檢測盒所需的材料如下1、美國司泰普公司(STAPLES，SAN DIEGO，CA)生產的10mil PVC塑料板，塗以雙面粘膠2、美國渥特明公司(WHATMAN，FAIRFIELD，NJ)生產的硝基纖維素膜
3、美國渥特明公司(WHATMAN，FAIRFIELD，NJ)生產的吸水紙片4、美國泊樂-吉樂明公司(PALL-GELMAN，ANN ARBOR，MI)生產的玻璃纖維紙5、美國西格瑪公司(SIGMA，ST.LOUIS，MO)生產的金膠6、購自美國羅斯南方實驗室(ROSS SOUTHERN LAB，UT)的TORCH抗原7、美國百敖柏西非克公司(Biopacific，CA)生產的羊抗人IgG/IgM抗體及鼠抗羊抗人IgG/IgM抗體本檢測盒的製備方法為用ISOFLOW噴霧機(IMAGINE公司產品)將五種TORCH抗原分別以2mg/ml的濃度噴塗在25mm*300mm的硝基纖維素膜上製成測試區。同時將濃度為2mg/ml的相應鼠抗羊抗人IgG/IgM抗體噴塗在硝基纖維素膜上製成對照區。以25μg羊抗人IgG(或IgM)抗體，標記10ml金膠，在12,000rpm速度下對金膠溶液進行離心，以分離金膠顆粒，用磷酸緩衝液溶解沉澱物(膠體金-羊抗人IgG/IgM抗體複合物)，浸入玻璃纖維紙，真空乾燥後切成6*60mm的小條。(膠體金標記羊抗人IgG/IgM抗體的方法及純化方法參見中國專利98122892.5)按圖2所示的結構，將玻璃纖維紙、標記有羊抗人IgG/IgM抗體的金標紙、包被有TORCH抗原及鼠抗羊抗人IgG/IgM抗體的硝基纖維素膜、吸水紙組裝成檢測板。再將各試劑條裝置於塑料盒中即製成本檢測盒。
實施例2 四合一逆型膠體金免疫層析板檢測盒如圖4所示，該檢測盒可同時測定樣品中的人抗弓形體(Toxo)抗體、人抗巨細胞病毒(CMV)抗體、人抗風疹病毒(Rubella)抗體和人抗單純皰疹I/II(HSV-I/II)抗體。試劑條包括緩衝液加入區(B)、固相膠體金標記結合物(Conj)、樣品加入點(S)、測試區(T)、對照區(C)和吸水區(Abs)。其中T區依次包被固定有Toxo抗原、CMV抗原、Rubella抗原和HSV-I/II抗原。
製備該檢測盒的所需的材料和基本方法與實施例1相同，只是在同一條硝基纖維素膜上依次噴塗不同抗原溶液。依金標部位向上，分別噴塗Toxo抗原、CMV抗原、Rubella抗原、HSV-I/II抗原(1∶1混合物)，各抗原的噴塗濃度皆為2mg/ml。
實施例3酶聯免疫試劑盒、逆型膠體金免疫層析檢測盒及經典膠體金免疫層析檢測盒測定TORCH抗體的效果比較實驗本實驗採集臨床病人的血清作為實驗樣品，其中用於Toxo抗體檢測的血清樣品72例(38例檢測IgG抗體，34例檢測IgM抗體)；用於CMV抗體檢測的血清樣品81例(42例檢測IgG抗體，39例檢測IgM抗體)；用於Rubella抗體檢測的血清樣品68例(36例檢測IgG抗體，32例檢測IgM抗體)；用於HSV-1抗體檢測的血清樣品120例(64例檢測IgG抗體，56例檢測IgM抗體)；用於HSV-2抗體檢測的血清樣品123例(70例檢測IgG抗體，53例檢測IgM抗體)。每例血清樣品用市售酶聯免疫試劑盒測定以確定陽性樣品和陰性樣品，然後分別用逆型膠體金免疫層析檢測盒和經典膠體金免疫層析檢測盒對陽性樣品和陰性樣品進行測定。
實驗方法按實施例1所述方法製備用於檢測TORCH抗體的逆型膠體金免疫層析檢測盒。其中試劑條的組成結構如圖2所示，測定時在樣品加入點(S)加入5微升血清，然後在緩衝液加入區(B)處加2滴緩衝液，測試時間為15分鐘，若測試區(T)呈玫瑰色，則樣品為陽性，否則為陰性。TORCH經典膠體金免疫層析檢測盒採用類似的製備方法，其中試劑條的組成結構如圖1所示，測定時在樣品膜(S)處加入5微升血清，並在同樣部位加2滴緩衝液，測試時間為15分鐘，若測試區(T)呈玫瑰色，則樣品為陽性，否則為陰性。TORCH酶聯藥盒購自EE LABS，CA，按常規酶聯法檢測血清樣品(具體操作參照試劑盒說明書)，若OD＜0.25，則認定為陰性樣品；若OD＞0.6，則認定為陽性樣品。
如表1所示雖然逆型膠體金免疫層析試劑條及經典膠體金免疫層析試劑條的測試區所固化的TORCH抗原的濃度相同，均為2mg/ml，但逆型試劑條對陽性樣品的測定結果與酶免的測定結果基本一致，相關性達到94％以上，而經典試劑條對陽性樣品的測定結果全部為陰性，由此可以看出，逆型試劑條對TORCH抗體的檢測與酶免測定結果相當，可有效地檢測TORCH抗體。而經典試劑條無法測定TORCH抗體。表1 酶聯免疫試劑盒、逆型膠體金免疫層析檢測盒及經典膠體金免疫層析檢測盒測定TORCH抗體的效果比較項目 酶聯免疫試逆型檢測 經典檢測 酶聯法與逆劑盒檢測例盒檢測例 盒檢測例 型法相關性TOXOIgG陰性 14 1414100％陽性 24 230 96％IgM陰性 16 1616100％陽性 18 170 94％CMVIgG陰性 18 1818100％陽性 24 230 96％IgM陰性 22 2222100％陽性 17 160 94％RubellaIgG陰性 12 1212100％陽性 24 230 96％IgM陰性 11 1111100％陽性 21 200 95％
HSV-1IgG陰性 1818 18 100％陽性 4645 098％IgM陰性 2121 21 100％陽性 3534 097％HSV-2IgG陰性 1616 16 100％陽性 5453 098％IgM陰性 1919 19 100％陽性 3433 097％
權利要求
1.一種逆型膠體金免疫層析試劑條，包括緩衝液加入區、固相膠體金標記結合物、測試區、對照區、吸水紙區等組成部分，其持徵在於待測樣品的加樣點位於固相膠體金標記結合物的前沿。
2.根據權利要求1所述的逆型膠體金免疫層析試劑條，其特徵在於該試劑條上的反應順序為首先將待測樣品加於固相膠體金標記結合物前沿的加樣點使之向測試區層析移動，隨後滴加一定的緩衝液溶解固相膠體金標記結合物，使之在硝基纖維素膜上向測試區發生移動，這樣待測成分分子首先與固相於測試區的特異抗原/抗體形成複合物並被固定，然後再與膠體金所標記的特異抗原/抗體結合，形成最終的顯色複合物。
3.根據權利要求1所述的逆型膠體金免疫層析試劑條，其特徵在於起固相載體作用的微孔濾膜為硝基纖維素膜或尼龍膜等。
4.權利要求1所述的逆型膠體金免疫層析試劑條用於TORCH抗體的檢測。
5.權利要求1所述的逆型膠體金免疫層析試劑條用於單一指標的檢測或用於多項指標的同時測定。
6.權利要求1所述的逆型膠體金免疫層析試劑條用於除TORCH以外的其它抗體的檢測。
7.權利要求1所述的逆型膠體金免疫層析試劑條用於檢測抗原。
8.根據權利要求1所述的逆型膠體金免疫層析試劑條，其特徵在於以有色乳膠顆粒、螢光或其它發光物質等標記物替代膠體金作為標記物，可製成相應的逆型免疫層析試劑條。
全文摘要
本發明涉及一種逆型膠體金免疫層析試劑條，其特點是待測樣品的加樣點位於固相膠體金標記結合物的前沿，從而改變了傳統金標免疫檢測的反應步驟，大大降低了樣品中非特異性IgG/IgM的幹擾，提高了試劑條的檢測靈敏度。該試劑條可有效地進行TORCH抗體的檢測。
文檔編號G01N33/558GK1553193SQ03142460
公開日2004年12月8日 申請日期2003年6月6日 優先權日2003年6月6日
發明者盧惟釗 申請人:盧氏實驗公司