鹼性成纖維細胞生長因子及其組合物在製備美容化妝品中的用途的製作方法
2024-01-28 09:29:15
專利名稱：：鹼性成纖維細胞生長因子及其組合物在製備美容化妝品中的用途的製作方法
技術領域：
：本發明提供了鹼性成纖維細胞生長因子的新用途，尤其是公開了鹼性成纖維細胞生長因子及其組合物在製備美容化妝品中的用途，同時還提供了其生產工藝，屬於生物美容製品
技術領域：
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背景技術：
：本發明涉及的鹼性成纖維細胞生長因子(BasicFibroblastGrowthFactor,簡稱bFGF)，是主要由大腦和腦垂體中的星形膠質細胞、垂體濾泡及部分神經細胞所分泌的一種促細胞分裂生長因子。bFGF的基因定位於染色體4q26227,其轉錄產物RNA有多個拼切位點及多個翻譯起始位點,由此產生多種分子量的bFGF,小分子量18Kd的bFGF多由AUG起始翻譯,分泌到胞外的bFGF以這種亞型多見。高分子量21kD、22.5kD、24kD、34kD的bFGF以CUG為翻譯起始點，主要定位於胞核中。不象其他細胞分泌性蛋白,bFGF缺少典型的信號肽,不能通過經典的高爾基2內質網途徑分泌到胞外,但具體機制至今仍不詳。現今研究的bFGF的生物學活性主要是針對18Kd的亞型。bFGF能刺激和調節血管內皮細胞、上皮細胞、成肌細胞、成骨細胞和神經膠質細胞等多種起源於中胚層、神經外胚層的細胞分化增飱，在胚胎發育、組織癒合中起重要作用。目甜bFGF的研究或應用均局限在促進神經損傷的修複方面，尚未見有其在美容方面的研究或應用。本發明涉及的hGM-CSF是人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(Humangranulocytemacrophagecolonystimulatingfactor)的簡稱，是人體內分泌的一種重要的促細胞生長增殖的細胞剌激因子，具有顯著的誘導未成熟的骨髓細胞前體細胞增殖和成熟等功能。它由T細胞、內皮細胞、上皮細胞、成纖維細胞、肥大細胞、B細胞和巨噬細胞等分泌。根據其糖基化程度不同，分為9個以上不同的類型，分子量從14.5-32kd不等。hGM-CSF作為一種強有力的細胞分裂因子，具有很高的生物活性。極微量hGM-CSF即能強烈促進相關細胞的增殖和成熟。目前，hGM-CSF的研究和應用均局限在治療腫瘤放化療後的白細胞減少、骨髓移植和再生障礙性貧血等方面，hGM-CSF還作為疫苗佐劑使用。尚未發現hGM-CSF在美容方面的研究和應用。另外，將hGM-CSF和bFGF組合在一起，應用於人的美容，目前也未見文獻報導。
發明內容本發明公開了一種鹼性成纖維細胞生長因子在製備美容化妝品中的用途。本發明還公開了鹼性成纖維細胞生長因子組合物在製備美容化妝品中的應用。本發明的技術解決方案包括1、以鹼性成纖維細胞生長因子為主要活性成分，採用特殊的真空冷凍乾燥工藝及常規的美容化妝品生產工藝製成化妝品。2、本發明還提供了一種含有bFGF、hGM-CSF為主要活性成分的美容化妝品(重量份數比)bFGF110萬AUhGM-CSF3002000ug活性穩定劑4~8g活性促進劑0.33g蛋白酶抑制劑0.10.6g透皮吸收促進劑0.12g所用的蛋白酶抑制劑為硼酸亮氨酸、硼酸纈氨酸、硼酸丙氮酸、N-乙醯半胱氨酸中的任意一種。所用的透皮吸收促進劑為月桂氮卓酮、丙二醇、巰基乙酸鈣中的任意一種。所用的活性穩定劑為透明質酸、甘露醇、右旋糖苷的任意一種；所用的活性促進進劑為水溶性膠原蛋白。所述的美容化妝品的製備方法，包括以下步驟在bFGF中加入活性穩定劑、活性促進劑、蛋白酶抑制劑及透皮吸收促進劑的任意一種或多種，用純化水配製成水溶液，再採用真空冷凍乾燥工藝製成凍乾粉。也可在上述歩驟中同時加入hGM-CSF，製成美容化妝品。本發明的技術方案中涉及以下成分活性成分bFGF、hGM-CSF;活性穩定劑透明質酸、甘露醇、右旋糖苷；活性促進劑水溶性膠原蛋白；蛋白酶抑制劑硼酸亮氨酸、硼酸纈氨酸、硼酸丙氨酸、N-乙醯半胱氨酸；透皮吸收促進劑佐恩(月桂氮卓酮，Azone)、丙二醇、巰基乙酸鈣。在上述的活性成分中加入活性穩定劑、活性促進劑、蛋白酶抑制劑及透皮吸收促進劑中的任意一種或多種，用低溫純化水配製成水溶液，並置於冰浴中，待分裝。將上述配製而得的水溶液，分裝到西林瓶中，置於真空冷凍乾燥機中進行凍幹後即得。專用溶媒的製造透皮吸收促進劑0.12份蛋白酶抑制劑0.10.6份活性穩定劑4~8份丙三醇2~6份pH5.07.4PBS溶液加至100份按上述比例將透皮吸收促進齊U、蛋白酶抑制劑、活性穩定劑混合，用PBS溶液溶解，加入丙三醇，混勻，分裝，加塞，用流通蒸汽滅菌後即得。凍乾粉的製劑製造按上述比例將活性成分、活性穩定劑、活性促進劑和/或活性穩定劑和/或蛋白酶抑制劑和/或透皮吸收促進劑，用低溫純化水配製成水溶液，並置於冰浴中；將上述配製而得的水溶液，分裝到西林瓶中，將膠塞半加塞，置於真空冷凍乾燥機中進行凍幹。凍幹工藝及條件為開啟真空冷凍乾燥機，對製品進行預冷，將製品溫度降至-60°C，降溫時間為4-5小時。啟動真空泵，將箱內真空度抽至0.3Mbar。加溫，升華，升華時間為14-18小時，升華完畢，壓塞，箱內充入無菌氣體，開箱，取出製品，軋蓋，入庫。產品形式為凍乾粉加專用溶媒，使用時需用專用溶媒作溶解劑。專用溶媒的配方及工藝為將透皮吸收促進劑、蛋白酶抑制劑、活性穩定劑，用pH5.07.4PBS溶液溶解，加入丙三醇，混勻，分裝，加塞，用10(TC流通蒸汽滅菌30分鐘後即得。活性穩定劑可用其中的一種或幾種，但三種活性穩定劑及一種活性促進劑同時使用效果最佳。透皮吸收促進劑及蛋白酶抑制劑在組方中每次一般只用其中的一種，也可幾種合用，其效果類似。以下實驗表明本發明的美容效果1材料活性成分bFGF和hGM-CSF，均為市售品，也可採用基因工程法自行生產。使用前要進行活性測定，bFGF活性測定採用的是細胞增殖/MTT法，hGM-CSF的活性測定採用的是TF-1細胞/MTT比色法，兩種方法的具體操作方法均見中國藥典2005版。活性穩定劑透明質酸、甘露醇、右旋糖苷。市售，化學純。活性促進劑水溶性膠原蛋白，市售，純度大於95%。蛋白酶抑制劑硼酸亮氨酸、硼酸纈氨酸、硼酸丙氨酸、N-乙醯半胱氨酸，市售，化學純。透皮吸收促進劑佐恩(月桂氮卓酮，Azone)、丙二醇、巰基乙酸鈣。市售，化學純。蛋白酶胃蛋白酶、胰蛋白酶，市售，化學純。2方法2.1凍乾粉製劑的製造參見上文2.2專用溶媒的製造參見上文2.3抗蛋白酶降解試驗實驗品將上述製造的含有活性成分的凍乾粉製劑用專用溶媒溶解，製成水溶液，並分別測定其兩種活性成分的活性，以此活性值作為100%。活性測定的方法同上。對照品除不含有蛋白酶抑制劑外，其餘同實驗品。用純化水製成水溶液，並分別測定其兩種活性成分的活性，以此活性值作為100%。蛋白酶溶液將胃蛋白酶及胰蛋白酶，用純化水配成含1%胃蛋白酶及1%的胰蛋白酶的混合水溶液。分別取實驗品及對照品各20ml，分別加入蛋白酶溶液0.5ml，混勻，置37'C水浴中孵育，分別於不同的時間取樣，進行活性測定。2.4穩定性試驗取上述製得的含有兩種活性成分的凍乾粉製劑，分別置於室溫及7'C冰箱中，分別於放置不同的時間後取樣，進行含量及活性測定。2.5美容效果試驗實驗品1:含有bFGF及hGM-CSF的凍幹製劑實驗品2:只含有hGM-CSF的凍幹製劑實驗品3:只含有bFGF的凍幹製劑空白對照品既不含bFGF也不含hGM-CSF的凍幹製劑市售對照品市售某品牌嫩膚美容產品實驗品13及空白對照品，在使用前均用專用溶媒溶解，之後，塗布於面部皮膚，並用特定的方法進行導入。分別進行如下美容效果試驗2.5.1嫩膚、去皺試驗選取4055歲老年人200人，男女各半。隨機分為5組，每組40人，男女各半。每組分別使用上述實驗品或空白對照品，連續2個月，然後分別評價其嫩膚、去皺的美容效果。2,5.2祛斑試驗選取2035歲面部有色斑的女性160人，隨機分為4組，每組40人。每組分別使用上述各實驗品或空白對照品，連續2個月，然後分別評價其祛斑效果。2.5.3祛痘試驗選取1825歲面部有青春痘的人160人，男女各半，隨機分為4組，每組40人，男女各半。每組分別使用上述各實驗品或空白對照品，連續2個月，然後分別評價其祛痘效果。2.5.4安全性試驗在上述嫩膚去皺試驗、祛斑試驗及祛痘試驗中，同時觀察其對皮膚的刺激性、過敏性及其它不良反應。3結果3.1凍乾粉製劑的製造結果經上述工藝製造出來的凍乾粉製劑，外觀呈疏鬆的塊狀或粉狀，呈白色或類白色。加水極易溶解，溶解後呈澄清透明的溶液。經微生物學檢測，未檢出活的微生物，為無菌溶液。超過國家有關化妝品的衛生標準。3.2專用溶媒的製造結果經上述工藝製造出來的專用溶媒，外觀澄清透明。經微生物學檢測，未檢出活的微生物，為無菌溶液。超過國家有關化妝品的衛生標準。3.3抗蛋白酶降解試驗結果表1抗蛋白酶降解試驗結果tableseeoriginaldocumentpage9由上表可以看出，實驗組在37。C溫度下與胃蛋白酶及胰蛋白酶共同作用30分鐘後，其活性基本不下降，作用1小時後，其活性仍降低很少。而對照組在與蛋白酶共同作用IO分鐘後，其活性即只剩原來的四分之一以下。結果說明，本發明之製品具有良好的抗蛋白酶降解作用。而用本品進行美容護膚時，製品在皮膚上的停留並導入的時間不超過20分鐘，故本發明之製品的抗蛋白酶降解作用的時間是足夠的。3.4穩定性試驗結果表2穩定性試驗結果tableseeoriginaldocumentpage9從上表可以看出，本發明之製品，在常溫放置及7。C下放置至36個月時，其含量均未見明顯變化；在常溫下放置至18個月時，其活性未見明顯變化；在7'C下放賈至30個月時，其活性仍未見明顯變化。結果表明，本發明之製品，可在常溫下保存18個月，如置於7"C以下，則保存時間更長，可長達2.5年以上。3.5美容效果試驗結果3.5.1嫩膚、去皺試驗結果表3嫩膚、去皺試驗結果tableseeoriginaldocumentpage9hGM-CSF組4077.517.55.0bFGF組4085.012.52.5空白對照組4000100市售品對照組40047.552.5由上表可以看出，bFGF、hGM-CSF單獨使用即有較好的嫩膚去皺效果；bFGF與hGM-CSF合用，嫩膚去皺的效果最佳；不含有bFGF和hGM-CSF的空白對照組，沒有嫩膚去皺的效果；hGM-CSF與bFGF組、hGM-CSF組及bFGF組的美容效果均顯著優於市售對照品組。3.5.2祛斑試驗結果表4祛斑試驗結果組別例數(人)祛斑效果(％)顯著一般不明顯bFGF及hGM-CSF組4072.520.07.5hGM-CSF組40復035.025.0bFGF組4055.035.010.0空白對照組4000100由上表可以看出，bFGF和hGM-CSF組、hGM-CSF組及bFGF組均具有較好的祛斑效果，其中，hGM-CSF和bFGF組合使用，祛斑效果最佳。3.5.3祛痘試驗結果表5祛痘試驗結果組別例數(人)祛痘效果(％)顯著一般不明顯bFGF及hGM-CSF組3066.720.013.3hGM-CSF組3060.026.613.4bFGF組3043.336.720.0空白對照組3000100由上表可以看出，bFGF和hGM-CSF組、hGM-CSF組及bFGF組均具有較好的祛痘效果，其中，hGM-CSF和bFGF合用，祛痘效果最佳。3.6安全性試驗結果表6安全性試驗結果例數(人)安全性試驗結果(％)皮膚刺激性過敏反應其它不良反應72001.10.7經720人使用後，未發現對皮膚有刺激性，只發現8人面部輕度過敏，有5人局發癢或潮紅。10本發明將bFGF和hGM-CSF應用於美容時，解決了三個嚴重的問題，否則其將無法實際應用。艮P:(1)bFGF及hGM-CSF在常溫下難以保持其生物學活性。在常溫下放置短時間後，其即失去其生物學活性，故其生產、運輸、保存都成為不可逾越的鴻溝，使其實際應用難以實現。另外，其發揮生物學活性需特定的pH值、離子強度及溫度，故製成霜劑等常見化妝品劑型，其將不具有任何生物學活性。(2)bFGF及hGM-CSF易被蛋白酶降解而失去活性。bFGF及hGM-CSF的化學本質為蛋白多肽類，人皮膚表面存在大量的蛋白酶，在bFGF接觸皮膚後，會很快被皮膚表面的蛋白酶降解而失去活性。(3)bFGF及hGM-CSF難以透皮吸收。bFGF及hGM-CSF均是大分子生物活性物質，在正常情況下，其難以透過皮膚進行吸收。本發明成功地解決了上述難題，使bFGF及hGM-CSF應用於美容成為現實。本發明的有益效果在於將bFGF及與hGM-CSF組合用於外用美容，兩種生物活性成分聯合應用，通過補充促進細胞代謝和增殖的生物活性因子，從根本上改善皮膚的生理狀態，促進皮膚組織的修復和代謝；使皮膚異常細嫩年輕；淡化色斑，平復皺紋；減輕R曬對皮膚的損傷；並具有顯著抗衰老作用。故嫩膚美容效果顯著，且安全可靠，無副作用。bFGF及hGM-CSF聯合應用，其組方中各成分可相互協同，較單用bFGF或hGM-CSF，可顯著促進人上皮組織的生成和增殖，美容效果顯著增強。將透皮吸收促進劑應用於bFGF和域hGM-CSF的美容組方中，解決了bFGF及hGM-CSF難以透皮吸收的問題，顯著地提高了其美容效果。將蛋白酶抑制劑應用於bFGF及hGM-CSF的美容組方中，解決了bFGF及hGM-CSF易被蛋白酶降解的問題，保持了bFGF及hGM-CSF的活性，促進了bFGF及hGM-CSF的吸收，顯著地提高了其嫩膚美容的效果。將bFGF及hGM-CSF製成凍乾粉製劑，解決了其在常溫下易失去活性的問題。該配方製成的凍乾粉劑，可在常溫下可保持活性18個月；在07卩冷庫中，可保持活性2.5年以上。故可常溫運輸和保存，如置於冷庫或冰箱中保持，效果更佳。解決了bFGF及hGM-CSF的生產、運輸和保存時無法保持活性的問題，使bFGF及hGM-CSF的實際應用成為現實。其製造工藝合理，適合於工業化大規模生產。具體實施方式通過以下實施例進一歩舉例描述本發明，並不以任何方式限制本發明，在不背離本發明的技術解決方案的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的權利要求範圍之內。主要材料活性成分bFGF及hGM-CSF。可自行製造，也可外購購獲得。其主要工藝過程為將bFGF及hGM-CSF工程菌在發酵罐內發酵，離心取菌體，用PBS液洗滌兩次，置抽提液中抽提。離心取上清，鹽析。離心，取沉澱。將沉澱復溶，用層析法進行純化，收集bFGF及hGM-CSF峰，置-20'C低溫冰櫃中凍存。取樣進行純度及活性測定。活性穩定劑透明質酸、甘露醇、右旋糖苷，市售，化學純。活性促進劑水溶性膠原蛋白，市售，純度大於95%。蛋白酶抑制劑硼酸亮氨酸、硼酸纈氨酸、硼酸丙氨酸、N-乙醯半胱氨酸，化學純。透皮吸收促進劑佐恩(月桂氮卓酮，Azone)、丙二醇、巰基乙酸鈣。化學純。實施例l:量取bFGF24萬AU、hGM-CSF300700ug、透明質酸16g、甘露醇38g、右旋糖苷38g、水溶性膠原蛋白16g、純化水加至100ml;將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例2:量取bFGF4002000ug、透明質酸16g、甘露醇38g、右旋糖苷388g、水溶性膠原蛋白16g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例3-量取hGM-CSF7002000wg、WGF0.12萬AU、甘露醇38g、右旋糖苷38g、水溶性膠原蛋白l6g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例4:量取bFGF410萬AU、hGM-CSF100300yg、甘露醇38g、右旋糖苷38g、透明質酸l6g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例5:量取bFGF58萬AU、hGM-CSF200400wg、右旋糖苷38g、水溶性膠原蛋白16g、透明質酸l6g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例6:量取bFGF24萬AU、hGM-CSF300700ug、甘露醇38g、水溶性膠原蛋白i6g、透明質酸16g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例7:量取bFGF24萬AU、hGM-CSF300700ug、甘露醇38g、透明質酸16g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例8:量取bFGF24萬AU、hGM-CSF300700ug、右旋糖苷38g、水溶性膠原蛋白l6g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例9:量取bFGF24力'AU、甘露醇38g、右旋糖苷38g、水溶性膠原蛋白16g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例10:量取bFGF24萬AU、透明質酸l6g、甘露醇38g、右旋糖苷38g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍千，即得。實施例ll:量取bFGF24萬AU、透明質酸l6g、右旋糖苷38g、水溶性膠原蛋白l6g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例12:量取bFGF24力'AU、透明質酸l6g、甘露醇38g、水溶性膠原蛋白l6g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。實施例13:量取bFGF24萬AU、甘露醇38g、右旋糖苷38g、純化水加至100ml，將上述各成分溶解於低溫純化水中，分裝，凍幹，即得。權利要求1、鹼性成纖維細胞生長因子在美容化妝品中的應用。2、一種含有鹼性成纖維細胞生長因子組合物的美容化妝品，主要活性成分為(重量份數比)鹼性成纖維細胞生長因子3002000yg人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子110萬AU3、根據權利要求1或2所述的美容化妝品，其特徵在於人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子3002000ug鹼性成纖維細胞刺激因子110萬AU活性穩定劑活性促進劑蛋白酶抑制劑透皮吸收促進劑48g0.33g0.10.6g0.12g(4、權利要求2所述的美容化妝品，其特徵在於所用的蛋白酶抑制劑為硼酸亮氨酸、硼酸纈氨酸、硼酸丙氨酸、N-乙醯半胱氨酸中的任意一種。5、權利要求2所述的美容化妝品，其特徵在於所用的透皮吸收促進劑為月桂氮卓酮、丙二醇、巰基乙酸鈣中的任意一種。6、根據權利要求1所述的美容化妝品的製備方法，包括以下步驟在人粒細胞巨噬細胞集落剌激因子、鹼性成纖維細胞生長因子中加入活性穩定劑、活性促進劑、蛋白酶抑制劑、透皮吸收促進劑中的任意一種或多種，用純化水配製成水溶液，再採用真空冷凍乾燥工藝製成凍乾粉；凍幹工藝及條件為對製品進行預冷，使其降至-6(TC，降溫時間為4-5小時；抽真空至0.3Mbar;加溫，升華，升華時間為14-18小時；至製品中的水分升華完畢，壓塞，箱內充入無菌氣體。7、一種與權利要求1、2、3所述美容化妝品其配合使用的溶媒，由以下重量份數比的原料製成透皮吸收促進劑0.12份蛋白酶抑制劑0.10.6份活性穩定劑48份丙三醇2~6份PBS溶液加至100份將透皮吸收促進劑+蛋白酶抑制劑+活性穩定劑，用PBS溶液溶解，加入丙三醇,混勻，分裝，加塞，用流通蒸汽滅菌後即得。全文摘要本發明公開了一種鹼性成纖維細胞生長因子及組合物在製備美容化妝品中的用途，同時還提供了其生產工藝。本發明利用生物技術美容，將鹼性成纖維細胞生長因子用於外用美容，並與人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子組合在一起應用於美容。鹼性成纖維細胞生長因子與人粒細胞巨噬細胞集落刺激因子兩種生物活性成分聯合應用，各成分相互協同，通過補充促進表皮細胞代謝和增殖的生物活性因子，從根本上改善皮膚的生理狀態，促進表皮組織的修復和代謝；可使皮膚異常細嫩年輕，淡化色斑，平復皺紋，減輕日曬對皮膚的損傷，還具有顯著抗衰老作用，嫩膚美容效果顯著，且安全可靠，無副作用。文檔編號A61Q19/00GK101327172SQ20081005101公開日2008年12月24日申請日期2008年7月23日優先權日2008年7月23日發明者馮來坤申請人:馮來坤