一種高山美利奴羊AMH基因CNV標記輔助檢測羊毛性狀的方法及應用

2024-04-16 08:52:05

一種高山美利奴羊amh基因cnv標記輔助檢測羊毛性狀的方法及應用
技術領域
1.本發明屬於分子生物學檢測技術領域，具體涉及一種高山美利奴羊amh基因cnv標記輔助檢測羊毛性狀的方法及應用。


背景技術：

2.羊毛是指覆蓋在羊體表面的一層具有紡織價值的纖維，是皮膚的衍生物。羊毛是毛紡工業的主要原料，約佔毛紡原料的97％，主要用來加工服裝面料、毛線、毛毯等產品。在羊毛生產和育種實踐中，羊毛性狀是重要的經濟性狀，主要包括毛長、產毛量、平均纖維直徑、彎曲度、斷裂強度、伸度、淨毛率等多個指標，與織造產品和經濟效益密切相關。由於人口增長，羊毛的需求已經超過了供給。隨著市場需求的變化，生產優質羊毛已成為山羊育種的主要目標。
3.高山美利奴羊是以甘肅高山細毛羊為母本，澳洲美利奴羊為父本，綜合利用現代先進生物技術和育種技術，經過20年育成的世界首例適應海拔2400～4070m高山寒旱生態區，羊毛纖維直徑主體為19.0～21.5μm的美利奴羊新品種。羊毛形狀也是決定其經濟價值的一項重要指標，並且羊毛形狀的客觀檢驗在羊毛銷售中越來越受到重視，它與紡織性能、育種和生產三者間結合的越來越緊密。
4.與傳統育種方法相比，分子標記輔助選擇方法具有許多優勢，例如可以明顯縮短世代間隔，提高選擇準確性，提前選擇時間，同時對它低遺傳力性狀、早期未表現的性狀、活體難以度量或者度量難度較大、成本較高的性狀，有良好的選擇效果。拷貝數變異(copy number variations，cnvs)，作為一種新發現的基因組亞顯微水平結構變異類型，是指基因組dna中較大片段的缺失或重複現象，涉及的片段大小在50bp到數mb之間，包括拷貝數增加(copy number gain)和拷貝數減少(copy number loss)。
5.cnv常用的檢測方法主要分為在全基因組範圍內檢測未知cnv和用於定點檢測或驗證已知cnv兩類。基因組未知cnv常用的檢測方法有晶片法和測序法，但是，這兩種方法受檢測平臺的局限，而且價格昂貴；對於已確定的cnv的檢測，通常是採用基於pcr技術和雜交技術的一些方法。其中，實時螢光定量pcr(qpcr)最為常用。qpcr通過對目的基因(具有拷貝數變異)及參考基因(無拷貝數變異)進行相對定量，根據2-δδct
方法統計檢測樣本候選基因的拷貝數。該方法操作簡單，普適度高，速度快，受認同程度高。
6.抗苗勒氏管激素(anti-mullerian hormone，amh)是由雄性睪丸支持細胞和雌性卵巢顆粒細胞分泌的一種僅在性腺中表達的糖蛋白，是tgfβ超家族(transforming growth factor beta superfamily，tgfβ超家族)的一員，具有調節細胞分化和發育，促進苗勒氏管退化等作用。同時amh還可以作為反芻動物超數排卵的預測指標，在反芻動物育種中起到了良好的作用，但目前尚未見有關amh基因cnv與綿羊羊毛性狀的關聯性研究的文獻報導。


技術實現要素：

7.本發明提供了一種檢測高山美利奴羊amh基因cnv標記的方法及應用，尤其涉及一種基於qpcr技術檢測高山美利奴羊amh基因cnv標記的方法及其應用。具體包括以下內容：
8.第一方面，本發明提供了一種與高山美利奴羊羊毛淨毛率性狀相關的cnv標記，所述cnv標記位於高山美利奴羊amh基因外顯子區域chr5：18901101-18905300。
9.第二方面，本發明提供了檢測上述第一方面所述高山美利奴羊羊毛淨毛率性狀相關的cnv標記的試劑在檢測高山美利奴羊羊毛淨毛率中的應用；所述試劑擴增權利要求1所述cnv標記和內參基因ankrd1。
10.優選地，所述擴增結果根據2
×
2-δδct
法定義拷貝數變異類型：2
×
2-δδct
＝2為正常型，2
×
2-δδct
》2為插入型，2
×
2-δδct
《2為缺失型；所述正常型和缺失型的羊毛淨毛率顯著高於插入型，同時所述正常型的羊毛淨毛率顯著高於缺失型。
11.優選地，所述試劑包括權利要求1所述cnv標記的擴增引物對p1：
12.上遊引物f1：5'-aagccagcacctccctactcc-3'；
13.下遊引物r1：5'-ccagcctcactatgcagaaccac-3'；
14.和內參基因ankrd1的擴增引物對p2：
15.上遊引物f2：5'-tcttgtaccgattcagcc-3'；
16.下遊引物r2：5'-ttcactcgtttattgggat-3'。
17.第三方面，本發明提供了檢測上述第一方面所述高山美利奴羊羊毛淨毛率性狀相關的cnv標記的試劑在高山美利奴羊早期育種中的應用；所述試劑擴增權利要求1所述cnv標記和內參基因ankrd1。
18.優選地，所述擴增結果根據2
×
2-δδct
法定義拷貝數變異類型：2
×
2-δδct
＝2為正常型，2
×
2-δδct
》2為插入型，2
×
2-δδct
《2為缺失型；所述正常型和缺失型的羊毛淨毛率顯著高於插入型，同時所述正常型的羊毛淨毛率顯著高於缺失型。
19.優選地，所述試劑包括權利要求1所述cnv標記的擴增引物對p1：
20.上遊引物f1：5'-aagccagcacctccctactcc-3'；
21.下遊引物r1：5'-ccagcctcactatgcagaaccac-3'；
22.和內參基因ankrd1的擴增引物對p2：
23.上遊引物f2：5'-tcttgtaccgattcagcc-3'；
24.下遊引物r2：5'-ttcactcgtttattgggat-3'。
25.第四方面，本發明提供了一種用於檢測與高山美利奴羊羊毛淨毛率性狀相關的cnv標記的引物對，所述引物對包括上述第一方面所述cnv標記的擴增引物對p1：
26.上遊引物f1：5'-aagccagcacctccctactcc-3'；
27.下遊引物r1：5'-ccagcctcactatgcagaaccac-3'；
28.和內參基因ankrd1的擴增引物對p2：
29.上遊引物f2：5'-tcttgtaccgattcagcc-3'；
30.下遊引物r2：5'-ttcactcgtttattgggat-3'。
31.第五方面，本發明提供了一種用於qpcr檢測權利要求1所述cnv標記的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒含有上述第四方面所述的引物對。
32.優選地，所述試劑盒還包括top green qpcr supermix、去離子水、對
照樣本中的一種或幾種。
33.第六方面，本發明提供了一種與高山美利奴羊羊毛淨毛率性狀相關的cnv標記的檢測方法，所述方法包括以下步驟：
34.以高山美利奴羊的基因組dna為模板，通過qpcr分別擴增上述第一方面所述cnv標記和參照基因ankrd1；
35.根據2
×
2-δδct
法定量結果將所述拷貝數變異分為三類：2
×
2-δδct
＝2為正常型，2
×
2-δδct
》2為插入型，2
×
2-δδct
《2為缺失型；所述正常型和缺失型的羊毛淨毛率顯著高於插入型，同時所述正常型的羊毛淨毛率顯著高於缺失型。
36.優選地，所述cnv標記的擴增引物對p1為：
37.上遊引物f1：5'-aagccagcacctccctactcc-3'；
38.下遊引物r1：5'-ccagcctcactatgcagaaccac-3'；
39.所述內參基因ankrd1的擴增引物對p2為：
40.上遊引物f2：5'-tcttgtaccgattcagcc-3'；
41.下遊引物r2：5'-ttcactcgtttattgggat-3'。
42.優選地，所述qpcr擴增體系包括：top green qpcr supermix 10μl，上、下遊引物各0.4μl，基因組dna 1μl，nuclease-free water 8.2μl。
43.優選地，所述qpcr所用的反應程序為：
44.(1)預變性：94℃，30s；
45.(2)擴增反應：94℃，5s；之後58℃，15s；72℃，10s；45個循環；
46.(3)繪製熔解曲線：95℃，5s，之後從65℃到95℃，+0.5℃，5s。
47.結合上述的所有技術方案，本發明所具備的優點及積極效果為：
48.本發明提供了一種高山美利奴羊羊毛淨毛率性狀相關的cnv標記，所述cnv標記位於高山美利奴羊amh基因外顯子區域chr5：18901101-18905300；
49.本發明提供了檢測cnv標記的方法，以高山美利奴羊的血液全基因組dna為模板，通過實時螢光定量pcr方法分別擴增高山美利奴羊amh基因cnv區域，並將ankrd1基因作為參照，2
×
2-δδct
法定量結果將所述拷貝數變異分為三類：2
×
2-δδct
＝2為正常型，2
×
2-δδct
》2為插入型，2
×
2-δδct
《2為缺失型；所述正常型和缺失型的羊毛淨毛率更高，所述正常型和缺失型的羊毛淨毛率顯著高於插入型，同時所述正常型的羊毛淨毛率顯著高於缺失型；本發明在dna水平上檢測與高山美利奴羊羊毛淨毛率性狀密切相關的cnv標記，可作為高山美利奴羊羊毛淨毛率性狀的標記輔助選擇的重要候選分子標記；
50.本發明以高山美利奴羊amh基因的cnv為候選位點，通過實時螢光定量pcr技術檢測該位點在高山美利奴羊群體中的拷貝數變異情況，並與羊毛淨毛率等重要經濟性狀進行關聯分析；如果檢測amh基因候選位點的拷貝數變異類型為正常型和缺失型，則具有更高的羊毛淨毛率，尤其是正常型羊毛淨毛率最高；研究該基因cnv並將其與高山美利奴羊重要經濟性狀關聯分析至關重要，可以為我國高山美利奴羊分子育種提供理論依據，便於高山美利奴羊羊毛淨毛率性狀的標記輔助選擇，快速建立遺傳資源優良的高山美利奴羊種群。
51.本發明提供的高山美利奴羊基因的拷貝數變異檢測方法，可用於高山美利奴羊的早期選育；檢測amh基因拷貝數變異的方法準確可靠、操作簡便；amh基因拷貝數變異位點的檢出，為高山美利奴羊的分子標記輔助選擇提供科學依據。
附圖說明
52.為了更清楚地說明本發明實施例的技術方案，下面將對本發明實施例中所需要使用的附圖做簡單的介紹，顯而易見地，下面所描述的附圖僅僅是本發明的一些實施例，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
53.圖1高山美利奴羊amh基因的擴增曲線；
54.圖2高山美利奴羊amh基因的溶解曲線；
55.圖3內參基因ankrd1的溶解曲線。
具體實施方式
56.為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。
57.實施例1檢測高山美利奴羊amh基因cnv標記
58.1.樣品採集
59.高山美利奴羊樣品來自甘肅省綿羊繁育技術推廣站，採集具有生產性能記錄的152隻高山美利奴羊血樣，每隻羊靜脈採血5ml於加入edta-k2抗凝劑的採血管中，血樣採集完畢後迅速混勻，放入含有冰袋的採樣箱中暫存，運回實驗室後於-20℃冰箱冷凍保存，用以dna的提取。每隻羊羊毛性狀(體側毛長、羊毛纖維直徑、剪毛量、淨毛率)記錄由甘肅省綿羊繁育技術推廣站提供。
60.2.主要試劑及儀器
61.edta-k2真空採血管購自江蘇宇力醫療器械有限公司；血液基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；nanodrop2000分光光度計美國thermo fisher scientific公司；top green qpcr supermix購自北京全式金生物技術股份有限公司；實時定量螢光pcr儀器儀購自roche公司。
62.3.血液基因組dna的提取
63.採用天根生化科技(北京)有限公司的血液基因組提取試劑盒，從血樣中提取基因組dna，將提取出的dna置於紫外分光光度計下檢測濃度與純度，濃度＞20ng/μl、od260/od280在1.7-1.9之間即滿足實驗需要，存放於-20℃保存備用。
64.4.引物設計
65.參考國際綿羊基因組oar_v4.0版本第5號染色體(genbank登錄號：nc_019462.2)amh基因序列為參考序列，利用primer premier5.0軟體在cnv區域(chr5：18901101-18905300)設計一對特異性引物，同時採用相同的方法設計擴增內參基因ankrd1的部分片段，引物序列信息如表1所示，引物由北京擎科生物科技有限公司合成。
66.表1qpcr引物信息表
[0067][0068]
5.實時定量pcr擴增
[0069]
qpcr擴增體系20μl：top green qpcr supermix 10μl，上、下遊引物各0.4μl，基因組dna 1μl，nuclease-free water 8.2μl。
[0070]
pcr擴增程序：預變性94℃30s；擴增反應94℃5s，58℃15s，72℃10s，45個循環；繪製熔解曲線95℃5s，從65℃到95℃，+0.5℃5s。
[0071]
通過繪製擴增曲線、溶解曲線確定引物適用於螢光定量pcr分析。其中擴增曲線平滑，表明螢光定量pcr擴增體系和條件合適(結果見圖1)；目的基因和內參基因各樣本溶解曲線在橫坐標相同位置均具有明顯的單一峰值，表明擴增產物單一(結果分別見圖2和圖3)。
[0072]
6.拷貝數變異的計算
[0073]
每個個體分別用目的基因和內參基因的引物進行擴增，並且每個個體設置3個技術重複。根據2
×
2-δδct
方法進行拷貝數的分析。其中δδct＝(ct目的基因-ct內參基因)
實驗組-(ct目的基因-ct內參基因)
對照組
；實驗組為待檢測有無拷貝數變異的個體樣本；對照組即為已知無拷貝數變異的個體樣本，可以採用重測序試驗中所選擇的參照個體。2-δδct
表示的是實驗組目的基因的拷貝數相對於對照組的倍數，根據2
×
2-δδct
將結果分成三類：2
×
2-δδct
＝2為正常型，2
×
2-δδct
》2為插入型，2
×
2-δδct
《2為缺失型。
[0074]
7.amh基因cnv與羊毛性狀的關聯分析
[0075]
採用ibm spss statistics 22軟體中一般線性模型分析高山美利奴羊amh基因拷貝數變異位點與羊毛性狀的關聯性，各組數據間存在的差異利用lsd多重比較來進行檢驗，結果以「平均值
±
標準誤」表示。數據處理結果見表2，高山美利奴羊amh基因拷貝數變異位點與羊毛淨毛率具有顯著的相關性(p《0.05)，其中正常型的羊毛淨毛率顯著高於插入型。
[0076]
表2高山美利奴羊amh基因拷貝數變異與生長性狀的關聯性分析
[0077][0078]
註：同一行數據間標不同小寫字母表示差異顯著(p＜0.05)，n表示具有相同拷貝數的個體數。
[0079]
總之，以上結果表明amh基因的拷貝數變異影響高山美利奴羊的羊毛性狀，將cnv
檢測用於開展高山美利奴羊羊毛淨毛率的早期選擇，縮短培育周期、加快培育進程，降低育種成本，具有很高的應用價值。
[0080]
以上所述，僅為本發明的具體實施方式，但本發明的保護範圍並不局限於此，任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術範圍內，凡在本發明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，都應涵蓋在本發明的保護範圍之內。