利用基因工程生產限制性內切酶的方法
2023-05-05 09:26:16 2
專利名稱：利用基因工程生產限制性內切酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種利用基因工程生產限制性內切酶的方法。
背景技術：
限制性內切酶是特異性識別DNA序列並在特定點將其切斷的工具酶， 它們來源於不同的微生物，是細菌防禦外來病毒入侵的武器。在20世紀60 年代中期，科學家推測細菌中有限制-修飾系統(restriction-modification system, R-M system)。該系統中有作用於同一 DNA序列的兩種酶，即，消化 DNA的限制酶和改變DNA鹼基結構使其免遭限制酶分解的修飾酶，並且這 兩種酶作用於同一DNA的相同部位。 一般說來，不同的細菌或不同的細菌菌 抹具有不同的限制酶和修飾酶組成的限制-修飾系統。
這些酶自七十年代後期在基因工程、分子生物學上被廣泛應用，已有30 年歷史。目前商品化的酶有230多種，常用酶有50多種。隨著基因克隆技術 的應用，大大簡化了限制性內切酶的生產過程，酶的純度也更好。與一般基 因工程工具酶不同，限制性內切酶可將自身DNA切斷而導致菌體不能存活。 所以要在大腸桿菌內工程化生產這種酶，必須先將這種酶的修飾酶基因導入 菌體並預先表達，或通過這種酶的限制-修飾調控序列來精確調控兩種酶的表 達順序。現有的克隆技術以及限制-修飾系統理論研究的限制使得工程菌抹很 難實現基因可誘導性表達。現有技術中生產限制性內切酶的方法主要是將限 制-修飾及調控基因以鳥槍法克隆入質粒，靠質粒的高拷貝數實現目的蛋白高 表達。這種生產方法的產量低、純度差並且生產成本高，所以需要開發一種 產量高、純度好並且生產成本低的生產限制性內切酶的方法。
發明內容
本發明提供了一種生產限制性內切酶的方法，利用該方法生產酶的產量 高、酶的純度好並且成本低。
根據本發明的生產限制性內切酶的方法包括以下步驟將與所述限制性內切酶相對的修飾酶基因克隆到載體的上遊；在修飾酶的保護下，將限制性 內切酶基因克隆至同 一載體強啟動子下遊的多克隆位點中；轉化表達宿主菌； 篩選穩定、可誘導、高表達的限制性內切酶的菌抹。
本發明上述方法中的修飾酶基因可選自曱基化酶基因，例如BHIM曱基 化酶基因。
本發明方法中採用的載體可以是適合原核宿主的任何載體，優選地為 pEEB載體。
本發明方法中釆用的宿主菌可以是任何原核宿主細胞。優選地為大腸桿菌。
本發明的方法可以應用到生產以下限制性內切酶AatII、 Accl、 Acil、 Acll、 Afel、 AflII、 AflIII、 Agel、 Alul、 Alwl、 Apal、 ApaLI、 ApeKI、 Apol、 Ascl、 Asel、 AsiSI、 Aval、 Avail、 BamHI、 Banl、 BanII、 BbvCI、 Bbvl、 Bccl、 Bcll、 Bfal、 BfuCI、 Bgll、 BglII、 Blpl、 BmgBI、 Bmrl、 Bmtl、 BpulOI、 BsaBI、 BsaHI、 Bsal、 BsaJI、 BsaWI、 BseYI、 Bs正I、 BsiHKAI、 BsiWI、 BsmFI、 Bsml、 BsoBI、 Bspl2861、 BspDI、 BspEI、 BspHI、 BspMI、 BsrBI、 BsrDI、 BsrFI、 BsrGI、 Bsrl、 BssHII、 BssKI、 BssSI、 BstAPI、 BstBI、 BstEII、 BstNI、 BstUI、 BstXI、 BstYI、 BstZ171、 Bsu361、 Btgl、 BtgZI、 BtsCI、 Btsl、 AvrII、 Cac81、 Clal、 CspCI、 CviAII、 CviKI-l、 CviQI、 Ddel、 Dpnl、 DpnII、 Dral、 DraIII、 Drdl、 Eael、 Eagl、 Earl、 Ecil、 EcoNI、 EcoRI、 EcoRV、 Fatl、 Faul、 F皿4HI、 Fokl、 Fsel、 Fspl、 HaeII、 HaeIII、 Hgal、 Hhal、 HincII、 HindIII、 Hinfl、 HinPlI、 Hpal、 HpaII、 Hphl、 HpyAV、 Kasl、 Kpnl、 Mbol、 MboII、 Mfel、 Mlul、 Mlyl、 Mmel、 Mnll、 Mscl、 Msel、 Msll、 MspAlI、 Mspl、 Mwol、 Nael、 Narl、 Ncil、 Ncol、 Ndel、 NgoMIV、 Nhel、 N固、脂V、 NmeAIII、 Notl、 Nml、 Nsil、 Nspl、 Pacl、 PaeR71、 Pcil、 PflFI、 PflMI、 Phol、 Plel、 Pmel、 Pmll、 PpuMI、 PshAI、 Psil、 PspGI、 PspOMI、 PspXI、 Pstl、 Pvul、 PvuII、 Rsal、 RsrII、 Sacl、 SacII、 Sall、 Sapl、 Sau3AI、 Sau961、 Sbfl、 Scal、 ScrFI、 SexAI、 SfaNI、 Sfcl、 Sfil、 Sfol、 SgrAI、 Smal、 Smll、 SnaBI、 Spel、 Sphl、 Sspl、 Stul、 StyD41、 Styl、 Swal、 Taqal、 Tfil、 Tlil、 Tsel、 Tsp451、 Tsp5091、 TspMI、 TspRI、 Tthllll、 Xbal、 Xcml、 Xhol、 Xmal、 Xmnl、 Zral,優選地為限制性內切酶BamHI。
根據本發明的示例性實施例，生產限制性內切酶的方法可以用於生產限 制性內切酶BamHI，採用的修飾酶是BHIM曱基化酶基因，採用的載體是pEEB載體。
圖1是根據本發明的生產限制性內切酶的方法的流程圖； 圖2是示出根據本發明實施例的BHIM曱基化酶基因的PCR擴增結果的 電泳測試圖3是示出根據本發明實施例的BamHI限制酶基因的PCR擴增結果的 電泳測試圖4是示出根據本發明實施例的克隆BHIM曱基化酶基因的結果的電泳 測試圖5是示出採用限制性內切酶BglII和Sph I對克隆後的BHIM曱基化 酶基因進行酶切的結果的電泳測試圖6是示出根據本發明實施例的將BHIM甲基化酶基因克隆到pEEB載 體上之後，挑取轉化子作PCR擴增試驗結果的電泳測試圖7是示出根據本發明實施例的將BHIM曱基化酶基因克隆到pEEB載 體上之後，挑取轉化子作Bgl II酶切試驗結果的電泳測試圖8是示出PCR鑑定BamHI插入片段的結果的電泳測試圖9是採用Nde I和Sac I對pEEB-BHIM中的BamHI插入基因進行酶 切的結果的電泳測試圖IO是採用SDS-PAGE檢測根據本發明實施例製備的BamHI表達的測
試圖ll是用western-blot檢測根據本發明實施例製備的BamHI表達的測試圖。
具體實施例方式
本發明提供了 一種生產限制性內切酶的方法，根據本發明實施例的生產 限制性內切酶的方法包括以下步驟將修飾酶基因克隆到載體的上遊；在修 飾酶的保護下，將內切酶基因克隆到同 一載體的強啟動子下遊的多克隆位點 中；轉換表達宿主菌；篩選穩定、可誘導和高表達的限制酶的菌抹。
在下文中，將以限制性內切酶BamHl和pEEB載體(由金普諾安蛋白質 工程技術有限公司生產)為例來描述根據本發明實施例的生產限制性內切酶的方法。具體地講，根據本發明示例性實施例的生產限制性內切酶的方法包括以下步驟從基因資料庫中找到編碼酶的DNA序列；從菌體或基因組DNA中 PCR ( polymerase chain reaction,聚合酶鏈反應)擴增目的基因；擴增目的基 因的純化、酶切；將基因片斷插入pEEB質粒載體；將載體轉化導入大腸杆 菌(修飾酶先於限制酶)；DNA測序確證基因序列正確；正確質粒轉化表達 宿主菌並篩選工程菌；蛋白質的誘導表達和檢測PAGE及免疫印記；大量發 酵培養工程菌；收集工程菌、破菌、分離、純化蛋白質；酶活性試驗；質量 控制試驗，包括非特異性內切酶、外切酶、核酸酶監測、再連接及藍白斑試 驗；凍幹或分裝成為成品酶。BHIM基因和BamHI基因的PCR擴增結果 BHIM是與限制性內切酶BamHI相對的修飾酶，稱作曱基化酶。 根據設計的兩對引物，PCR擴增BHIM基因和BamHI基因。待擴增目 的基因大小分別為1654bp和660bp，其中，BHIM基因包含有編碼基因自身相吻合，且目的片斷擴增特異性高，陰性對照正常。 克隆曱基化酶基因(BHIM)BHIM的PCR產物經純化後與pGEM-T載體連接，然後轉化大腸桿菌 DH5oc感受態細胞，次日挑取轉化子，提取質粒進行PCR和酶切圖譜鑑定， 如圖4和圖5所示。由圖4可知，四個轉化子中有一個轉化子PCR擴增程陽性。利用質粒小 提試劑盒對此轉化子進行質粒抽提，並用限制性內切酶BglII和Sphl分別酶 切來進一步驗證陽性轉化子的正確性，酶切驗證結果如圖5所示。由圖5可 知，提取質粒經BglII消化後能正確釋放出1600bp左右的條帶，Sphl單酶 切後線性質粒大小為4000bp左右，以上結果均符合預期片斷大小。由此可知， 篩選的轉化子為含有目的基因的陽性克隆子並命名為pGEM-BHIM。將BHIM克隆到pEEB載體上遊pGEM-BHIM用Bgl II消化後回收甲基化酶BHIM基因，與同樣經Bgl II 消化並去磷酸化的線性載體pEEB連接轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞。挑 取轉化子做菌液PCR擴增和Bgl II酶切驗證，如圖6和圖7所示。由圖6和 圖7可以看出，在1600bp左右出現條帶，由此可知曱基化酶BHIM基因正確克隆入pEEB載體中。BamHI表達質淨立的構建PCR擴增Bamffl基因並用酶Nde I和Sac I對其進^"消化，回收目的片 段與同樣經Nde I和Sac I消化的線性質粒載體pEEB-BHIM連4妄過夜，轉化 大腸桿菌DH5a感受態細胞。挑取轉化子做菌液PCR擴增和Nde I、 Sac I雙 酶切驗證，結果如圖8和圖9所示。由圖8和圖9的電泳圖可知，轉化子PCR 擴增和NdeI、 Sacl酶切結果均出現一條大小為660bp左右的片斷，由此證 明該轉化子中攜帶有內切酶Bamffl基因。目的蛋白誘導表達及SDS-PAGE電泳檢測和Western Blot分析經驗證正確的表達質粒轉化大腸桿菌，挑取新鮮克隆於LB培養基中培 養過夜，次日按1%接種量接種於大量液體LB培養基中，200rpm, 37。C培養， 加入IPTG誘導表達BamHI,進行SDS-PAGE電泳;險測和Western Blot分析， 結果如圖IO和圖11所示。菌抹經IPTG誘導後，其總蛋白中明顯呈現一條誘 導蛋白，大小為24kD左右，與內切酶BamHI目的蛋白大小吻合。同時，Western Blot分析也證明菌體中存在目的蛋白。酶的純化對親和純化酶蛋白進行純化，純度可達卯％以上。 酶活性檢測限制性內切酶的一個活性單位是指在50(il的反應體系裡，採用隨酶提 供的緩衝液，用l個小時的時間，徹底消化1嗎底物DNA所需要的酶量。酶 切反應應在帶蓋的Eppendorf管中進行，濃縮的酶稀釋成大約1,000單位/ml。 根據檢測結果可知，根據本發明的示例性方法生產的BamHI活性穩定，識別 序列正確，比活性好。連接DNA片段的再酶切實驗DNA片段通過用每一種限制性內切酶過量消化底物DNA而獲得(20-50 倍)。用T4DNA連接酶連接(5'末端濃度為0.1-1.0 ^M)。連接的片段然後用 同一種限制性內切酶重切。僅當3'和5'末端都保留完整，連接反應才會發生； 而且只有那些識別位點完全恢復的分子才能被重切。根據再酶切試驗結果可 知，切割後正常的帶型說明3'和5'末端都是完整的，並且根據本發明實施例 的方法生產的酶樣品中檢測不到核酸外切酶和磷酸酶。核酸酶汙染的過夜鑑定所有的限制性內切酶與lfig底物DNA在50pl反應體系中，採用提供的緩衝液溫育過夜。比較酶切1小時的特徵帶型和過夜酶切的帶型。通過比較 可知，在兩種情況下帶型均明顯且沒有改變，說明測試的酶中不存在非特異性的DNA酶，由此可知根據本發明實施例生產的酶合格。 核酸外切酶汙染鑑定所有的限制性內切酶與l(ig單雙《連混合的、3H標記的E.coli DNA (200,000 cpm/iig)在50(il反應體系中，採用隨酶提供的緩衝液，在推薦的溫度 下溫育4小時。通過可溶解的TCA著色，可以計算出反應體系中被標記的 DAN的百分比，進而可以顯示出核酸外切酶的汙染。根據本發明實施例生產 的限制性內切酶酶未檢出外切酶活性。藍白斑篩選鑑定用於克隆的酶還須通過額外的質量鑑定，即，藍白斑篩選鑑定，以確定 經酶過量消化後DNA末端的完整性。該種鑑定方法為用酶10倍過量消化 適當的載體上lacZ基因中單一的酶切位點、連接、轉化、並塗XGal/IPTG/Amp 平板。成功地切割、連接和表達半乳糖苷酶(b-galactosidase )可以說明克隆 後基因是完整的， 一個完整的基因產生藍斑， 一個不完整的基因(例如，降解 的DNA末端)產生白斑。在進行藍白斑鑑定中，根據本發明實施例生產的限 制性內切酶產生的白斑數量未超過3 % ,該結果合格。以上以限制性內切酶BamHI和pEEB載體為例示出了根據本發明實施例 的生產限制性內切酶的方法，但是根據本發明實施例的生產內切酶的方法可 以應用到生產其它限制性內切酶上。例如，可以應用到生產以下限制性內切 酶AatII、 Accl、 Acil、 Adl、 Afel、 AflII、 AflIII、 Agel、 Alul、 Alwl、 Apal、 ApaLI、 ApeKI、 Apol、 Ascl、 Asel、 AsiSI、 Aval、 Avail、 BamHI、 Banl、 BanII、 BbvCI、 Bbvl、 Bccl、 Bcll、 Bfal、 BfuCI、 Bgll、 BglII、 Blpl、 BmgBI、 Bmrl、 Bmtl、 BpulOI、 BsaBI、 BsaHI、 Bsal、 BsaJI、 BsaWI、 BseYI、 BsiEI、 BsiHKAI、 BsiWI、 BsmFI、 Bsml、 BsoBI、 Bspl2861、 BspDI、 BspEI、 BspHI、 BspMI、 BsrBI、 BsrDI、 BsrFI、 BsrGI、 Bsrl、 BssHII、 BssKI、 BssSI、 BstAPI、 BstBl、 BstEII、 BstNI、 BstUI、 BstXI、 BstYI、 BstZ171、 Bsu361、 Btgl、 BtgZI、 BtsCI、 Btsl、 AvrII、 Cac81、 Clal、 CspCI、 CviAII、 CviKI-l、 CviQI、 Ddel、 Dpnl、 DpnII、 Dral、 DraIII、 Drdl、 Eael、 Eagl、 Earl、 Ecil、 EcoNI、 EcoRI、 EcoRV、 Fatl、 Faul、 Fnu頓、Fokl、 Fsel、 Fspl、 HaeII、 HaeIII、 Hgal、 Hhal、 HincII、HindIII、 Hinfl、 HinPlI、 Hpal、 HpaII、 Hphl、 HpyAV、 Kasl、 Kpnl、 Mbol、 MboII、 Mfel、 Mlul、 Mlyl、 Mmel、 Mnll、 Mscl、 Msel、 Msll、 MspAlI、 Mspl、 Mwol、 Nael、 Narl、 Ncil、 Ncol、 Ndel、 NgoMIV、 Nhel、 NlaIII、 NlaIV、 NmeAIII、 Notl、 Nrul、 Nsil、 Nspl、 Pacl、 PaeR71、 Pcil、 PflFI、 PflMI、 Phol、 Plel、 Pmel、 Pmll、 PpuMI、 PshAI、 Psil、 PspGI、 PspOMI、 PspXI、 Pstl、 Pvul、 PvuII、 Rsal、 RsrII、 Sacl、 SacII、 Sall、 Sapl、 Sau3AI、 Sau961、 Sbfl、 Scal、 ScrFI、 SexAI、 SfaNI、 Sfcl、 Sfil、 Sfol、 SgrAI、 Smal、 Smll、 SnaBI、 Spel、 Sphl、 Sspl、 SM、 StyD41、 Styl、 Swal、 Taqal、 Tfil、 Tlil、 Tsel、 Tsp451、 Tsp5091、 TspMI、 TspRI、 Tthllll、 Xbal、 Xcml、 Xhol、 Xmal、 Xmnl、 Zral。另外，根據本發明實施例的生產限制性內切酶的方法也可以採用現有技 術中的其它載體，而不限於上述的pEEB載體。從以上描述可知，根據本發明實施例的生產內切酶的方法分別克隆限制 酶和曱基化酶及調控基因，順序插入載體，在曱基化酶保護下，實現限制酶 基因的可誘導高表達。根據本發明實施例的生產限制性內切酶的方法通過利用PCR擴增從原始 菌中分別擴增限制修飾系統的曱基化酶基因和內切酶基因，其中，甲基化酶 帶自身調控序列便於基因自身調控。因此，根據本發明實施例的生產限制性內切酶的方法可以提高蛋白質表 達量，易於純化和生產，並且能夠降低限制性內切酶的生產成本。
權利要求
1、一種生產限制性內切酶的方法，所述方法包括以下步驟將與所述限制性內切酶相對的修飾酶基因克隆到載體的上遊；在修飾酶的保護下，將限制性內切酶基因克隆至同一載體強啟動子下遊的多克隆位點中；轉化表達宿主菌；篩選穩定、可誘導、高表達的限制性內切酶的菌株。
2、 權利要求l所述的方法，其中，所述修飾酶基因是曱基化酶基因。
3、 權利要求2所述的方法，其中，所述修飾酶基因是BHIM曱基化酶 基因。
4、 權利要求1所述的方法，其中，所述載體是適合原核宿主的任何載體。
5、 權利要求4所述的方法，其中，所述載體是pEEB載體。
6、 權利要求l所述的方法，其中，所述宿主是任何原核宿主細胞。
7、 權利要求6所述的方法，其中，所述宿主是大腸桿菌宿主細胞。
8、 權利要求1所述的方法，其中，所述限制性內切酶選自AatII、 Accl、 Acil、 Acll、 Afel、 AflII、 AflIII、 Agel、 Alul、 Alwl、 Apal、 ApaLI、 ApeKI、 Apol、 Ascl、 Asel、 AsiSI、 Aval、 Avail、 BamHI、 Banl、 BanII、 BbvCI、 Bbvl、 Bccl、 Bcll、 Bfal、 BfuCI、 Bgll、 BglII、 Blpl、 BmgBI、 Bmrl、 Bmtl、 BpulOI、 BsaBI、 BsaHI、 Bsal、 BsaJI、 BsaWI、 BseYI、 Bs正I、 BsiHKAI、 BsiWI、 BsmFI、 Bsml、 BsoBI、 Bsp 12861、 BspDI、 BspEI、 BspHI、 BspMI、 BsrBI、 BsrDI、 BsrFI、 BsrGI、 Bsrl、 BssHII、 BssKI、 BssSI、 BstAPI、 BstBI、 BstEII、 BstNI、 BstUI、 BstXI、 BstYI、 BstZ171、 Bsu361、 Btgl、 BtgZI、 BtsCI、 Btsl、 AvrII、 Cac81、 Clal、 CspCI、 CviAII、 CviKI-l、 CviQI、 Ddel、 Dpnl、 DpnII、 Dral、 DraIII 、 Drdl、 Eael、 Eagl、 Earl、 Ecil、 EcoNI、 EcoRI、 EcoRV、 Fa仏Faul、 Fnu4HI、 Fokl、 Fsel、 Fspl、 HaeII、 HaeIII、 Hgal、 Hhal、 HincII、 HindIII、 Hinfl、 HinPlI、 Hpal、 HpaII、 Hphl、 HpyAV、 Kasl、 Kpnl、 Mbol、 MboII、 Mfel、 Mlul、 Mlyl、 Mmel、 Mnll、 Mscl、 Msel、 Msll、 MspAlI、 Mspl、 Mwol、 Nael、 Narl、 Ncil、 Ncol、 Ndel、 NgoMIV、 Nhel、 NlaIII、謹V、 NmeAIII、 Notl、 Nml、 Nsil、 Nspl、 Pacl、 PaeR71、 Pcil、 PflFI、 PflMI、 Phol、 Piel、 Pmel、 Pmll、 PpuMI、 PshAI、 Psil、 PspGI、 PspOMI、 PspXI、 Pstl、 Pvul、PvuII、 Rsal、 RsrII、 Sacl、 SacII、 Sall、 Sapl、 Sau3AI、 Sau961、 Sbfl、 Scal、 ScrFI、 SexAI、 SfaNI、 Sfcl、 Sfil、 Sfol、 SgrAI、 Smal、 Smll、 SnaBI、 Spel、 Sphl、 Sspl、 Stul、 StyD41、 Styl、 Swal、 Taqal、 Tfil、 Tlil、 Tsel、 Tsp451、 Tsp5091、 TspMI、 TspRI、 Tthllll、 Xbal、 Xcml、 Xhol、 Xmal、 Xmnl、 Zral。
9、 權利要求8所述的方法，其中，所述限制性內切酶是BamHI。
10、 權利要求1-9中的任一項所述的方法，其特徵在於所述限制性內切 酶是BamHI,所述修飾酶是BHIM曱基化酶基因，採用的載體是pEEB載體。
全文摘要
本發明公開了一種生產限制性內切酶的方法，所述方法包括以下步驟將與所述限制性內切酶相對的修飾酶基因克隆到載體的上遊；在修飾酶的保護下，將限制性內切酶基因克隆至同一載體強啟動子下遊的多克隆位點中；轉化表達宿主菌；篩選穩定、可誘導、高表達的限制性內切酶的菌株。
文檔編號C12N15/55GK101225396SQ200810057659
公開日2008年7月23日 申請日期2008年2月4日 優先權日2008年2月4日
發明者波 冉, 安海謙, 輝 柳, 梅小偉, 魯剛偉 申請人:金普諾安蛋白質工程技術(北京)有限公司