一種快速高效刪除質粒上基因片段的方法
2023-09-18 04:20:25
專利名稱：一種快速高效刪除質粒上基因片段的方法
技術領域：
一步PCR法快速高效刪除質粒上基因片段的方法，本發明涉及一步PCR法快速高效刪除質粒上任意位置基因片段的方法，屬於微生物基因工程領域。
背景技術：
PCR技術類似於DNA的天然複製過程，其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成①模板DNA的變性模板DNA經加熱至94°C左右一定時間後，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；②模板DNA與引物的退火(復性)模板DNA經加熱變性成單鏈後，溫度降至55°C左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；③引物的延伸DNA模板-引物結合物在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列 為模板，按鹼基配對與半保留複製原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留複製鏈， 重複循環變性-退火-延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」。通過巧妙設計刪除引物，使得在質粒中任意位置刪除基因片段的技術變得簡單有效。設計一對刪除引物(正、反向)，用刪除引物和模板質粒退火後用高保真DNA聚合酶「循環延伸」，(所謂的循環延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈後回到引物5』端終止，再經過反覆加熱褪火延伸的循環，這個反應區別於滾環擴增，不會形成多個串聯拷貝。)正反向引物的延伸產物退火後配對成為帶缺刻的開環質粒。之後用DpnI酶切延伸產物，由於原來的模板質粒來源於常規大腸桿菌，是經dam甲基化修飾的,對DpnI敏感而被切碎(DpnI識別序列為甲基化的GATC，GATC在幾乎各種質粒中都會出現，而且不止一次)，而體外合成的已刪除目標基因片段的質粒由於沒有甲基化而不被切開，因此在隨後的轉化中得以成功轉化，即可得到基因片段已刪除的質粒克隆。
發明內容
本發明的目的是提供一種快速高效刪除質粒上基因片段的方法。本發明的具體步驟如下I)確定刪除序列；2)把與刪除基因兩端相連接的一定長度的序列片拼接在一起，據此設計成一對刪除引物；3) PCR擴增步驟與普通PCR —致，但是延伸溫度的時間設定與該重組質粒的長度有關，一般含7000bp鹼基數的重組質粒延伸時間約為5-8min ；4) PCR擴增步驟與普通PCR —致，但是PCR擴增循環數一般約為15_20次；5) PCR擴增完成後經DpnI酶消化3h後直接轉化感受態細胞。6)選擇陽性克隆測序本發明所述刪除基因片段長度沒有限制，只要能進行正常PCR擴增就行。PCR擴增步驟與普通PCR —致，只是延伸溫度的時間設定要根據重組質粒的長度而定，PCR擴增循環數也要儘量少一些，一般15-20次為宜，儘量減少引入因PCR擴增循環數過多而引起的其它突變。本發明的詳細的步驟為I)確定刪除序列；2)把與刪除基因片段兩端相連接的序列拼接在一起，設計成引物；刪除引物設計的時候要注意，刪除引物5』端離被刪除區域的鹼基數比3』端離被刪除區域的鹼基數要多一些，一般5』端離被刪除區域的鹼基數為25-30bp，而3』端離被刪除區域的鹼基數為20-25bp ；3)設定PCR擴增程序； PCR反應條件
預變性94°C4 min
變性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C5-8 min
最後延伸72°C8inin「變性-退火-延伸」這個過程進行18-20個循環。4) PCR擴增完成後經DpnI酶消化3h後直接轉化感受態細胞；PCR擴增完成後，跑DNA凝膠電泳檢驗一下有一定亮度的條帶就可以了。然後再用DpnI酶消化3h，之後可直接轉化克隆宿主菌或表達宿主菌。5)選擇陽性克隆測序。本發明的有益效果本發明提供了一種快速高效刪除質粒上任意位置基因片段的方法。
圖I. 一步PCR法快速高效刪除質粒上任意位置基因片段的原理
具體實施例方式材料和檢測方法來源於惡臭假單胞菌Pseudomonas putida NRRL-18668腈水合酶基因β亞基全序列；重組質粒模板pET-24a_B。實施例I :I)從NCBI上下載GenBank號為U89363. I的序列並且識別SEQ ID NO. I ；2)引物設計把與刪除基因片段兩端相連接的序列拼接在一起，設計成引物；刪除引物設計的時候要注意，刪除引物5』端離被刪除區域的鹼基數比3』端離被刪除區域的鹼基數要多一些，一般5』端離被刪除區域的鹼基數為25-30bp，而3』端離被刪除區域的鹼基數為20-25bp ；上遊引物Pl如SEQ ID NO. 2所示；下遊引物P2如SEQ ID NO. 3所示。刪除序列位於編碼腈水合酶β亞基的B基因如SEQ ID NO. I中415位與441位鹼基之間。3)設定PCR擴增程序；PCR反應條件
預變性94°C4 min
變性94°CI min
退火59°CI min
延伸72°C8 min
最後延伸72°C8 min「變性-退火-延伸」這個過程進行20個循環。4) PCR擴增完成後經DpnI酶消化3h後直接轉化感受態細胞；PCR擴增完成後，跑DNA凝膠電泳檢驗一下有弱的條帶就可以了。然後再用DpnI酶消化3h，之後直接轉化E. coli BL21 (DE3)表達宿主菌。5)選擇陽性克隆測序。選擇陽性克隆送生工生物工程上海股份有限公司測序，結果顯示成功刪除了目標片段。
權利要求
1.一種一步PCR法刪除質粒上基因片段的方法，是採用兩個特異性引物片段，通過一步PCR實現刪除質粒上任意位置基因片段的方法。
2.如權利要求I所述的方法，其特徵在於兩個特異性引物的設計，將與刪除片段兩端相連接的一定長度的序列拼接在一起，據此設計成為特異性引物。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵在於，兩個引物擴增方向相向。
4.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，一步PCR法擴增得到目的片段已經被刪除的質粒，不需要重疊PCR、酶切、連接等傳統的構建方法。
5.如權利要求4所述的方法，其特徵在於，PCR方法與普通PCR方法一致，但PCR延伸時間為延伸整個重組質粒長度的時間，一般含7000bp鹼基數的重組質粒延伸時間約為5-8min。
6.如權利要求5所述的方法，其特徵在於，PCR方法與普通PCR方法一致，但PCR擴增循環數一般約為15-20次。
7.如權利要求I所述的方法，其特徵在於，PCR擴增完成後經DpnI酶消化3h後直接轉化感受態細胞。
全文摘要
本發明公開了一種快速高效刪除質粒上基因片度的方法，是採用設計兩個特異性引物片段，通過一步PCR獲得目標片段已刪除的重組質粒的方法，屬於基因克隆技術領域。本發明方法操作簡單，具有非常高的效率和成功率。
文檔編號C12N15/09GK102899311SQ20121034524
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月18日 優先權日2012年9月18日
發明者周哲敏, 杜坤, 崔文璟, 周麗, 葛春蕾 申請人:江南大學