一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系的製作方法

2023-05-24 23:58:36 2

一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，屬於動物細胞（組織）工程領域。該大鼠胰島上皮樣幹細胞來源於正常成年大鼠胰島組織，體外培養能克隆性生長，且具有多分化潛能，具體為細胞貼壁培養呈多角形上皮樣，細胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁；細胞克隆性生長，細胞接種第1d生長緩慢，第2～4d進入對數生長期，第5～6d為平臺期，第7d增殖能力下降；是正常的二倍體細胞，染色體數目2n=42；在蛋白水平表達八聚體轉錄因子4、配對基因盒4、配對基因盒6、神經源性因子3和巢蛋白；具有多分化潛能，體外定向誘導，分化形成神經細胞、脂肪細胞和成骨細胞；無致瘤性。
【專利說明】一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系
【技術領域】
[0001]本發明涉及人類和其它哺乳動物胰島幹細胞系及其特徵，特別涉及一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系及其形態、生長、表達和分化等特徵，屬於動物細胞(組織)工程領域。
【背景技術】[0002]糖尿病(Diabetes mellitus, DM)是危害人類健康的重大疾病之一，據統計目前全世界糖尿病患者已達3.46億(Am J Stem Cells.2012，I (3): 196-204.)，而傳統的藥物及胰島素替代療法卻不能從根本上醫治該病。近十年來，隨著移植技術的發展，胰島移植治療糖尿病取得了一定的療效(N Engl J Med 2000，343 (4):230-238.Diabetes.2005, 54(7):2060-2069.Am J Transplant.2008, 8(11):2463-2470.1mmuneNetw.2013, 13(6):235-239.)。但是，由於供體來源短缺，胰島移植治療糖尿病技術的應用受到制約。胰島幹細胞是存在於胰腺內分泌組織胰島中的成體幹細胞，能自我更新並具有多分化潛能。體外分離克隆胰島幹細胞，誘導其分化形成功能性胰島，並移植治療糖尿病是有效解決供體短缺的途徑之一。目前，建立胰島幹細胞系，研究胰島幹細胞分化形成功能性胰島移植治療糖尿病已成為焦點。國外，Zulewski等(Diabetes.2001，50 (3): 521-533.Endocrinology.2002，143(8):3152-3161.StemCells.2004，22(7):1134-1141.)首先報導膠原酶消化大鼠或成人胰腺組織分離獲得單個細胞和胰島，RPMI1640培養液懸浮培養，96h後，挑出懸浮胰島，培養液中再添加20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF貼壁培養，上皮樣胰島幹細胞克隆性生長。其中，大鼠胰島幹細胞8.5個月擴增了 10倍，人胰島幹細胞8個月擴增了 7倍。免疫化學反應顯示胰島幹細胞表達巢蛋白(nestin),不表達insulin、glucagon、somatostatin和CK19。體外定向誘導,胰島幹細胞分化形成胰腺導管細胞,表達CK19 ;分化形成胰島細胞，表達insulin、glucagon等；分化形成肝臟細胞,表達α -甲胎蛋白；分化形成神經細胞，表達神經細胞特異性粘附分子。移植在小鼠肝臟內，人源性胰島幹細胞分化形成人肝臟細胞。Maria-Engler 等(J Endocrinol.2004, 183(3): 455-467.)膠原酶 HI灌注消化成人胰腺主胰管，分離獲得細胞和細胞團，密度梯度離心，雙硫腙(dithizon，DTZ)活性染色檢測，篩選出直徑大於150 μ m胰島，CMRL1066+10%FCS培養。共聚焦螢光顯微觀察和RT-PCR檢測，培養24h，胰島細胞團中僅有少量細胞表達nestin ;培養60d，nestin+表達量顯著增多。採用含10%FBS培養液培養nestin+細胞30d，表達insulin ;而採用含1%FBS 培養液培養 nestin+ 細胞 30d,則表達 insulin、glucagon 和 somatostatin。因此，作者認為體外長期培養，人胰島中的nestin+細胞具有幹細胞特性。Humphrey等(Diabetes.2003，52(10):2519-2525.)膠原酶消化人胎兒早期胰腺組織獲得胰島細胞團，貼壁培養，上皮樣細胞擴增形成單層。構建nestin-GFP質粒,腺病毒轉染,418篩選,純化出nestin+細胞。RT-PCR檢測nestin+細胞共表達波形蛋白。採用煙醯胺、HGF等體外定向誘導，nestin+細胞卻不能分化形成表達Pdxl、insulin的β細胞，移植在無胸腺小鼠體內也不能分化形成功能性β細胞,分泌insulin。這表明nestin不是β細胞祖細胞的特異性標記物。Sugiyama 等(Proc Natl Acad Sci USA.2007, 104 (I): 175-180.)膜蛋白酶消化小鼠胎兒胰腺組織，分離獲得單個細胞。流式細胞術分選，獲得共表達Ngn3、⑶133和⑶45f的胰島幹細胞。體外定向誘導，胰島幹細胞分化形成β細胞,分泌insulin。Ta等(StemCells.2006, 24(7): 1738-1749.)的研究表明在培養液中添加成纖維細胞生長因子(basicfibroblast growth facter, bFGF)、白細胞抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)和骨形態發生蛋白4 (bone morphogenetic protein-4, BMP4),均能促進成年小鼠胰島幹細胞擴增。Jin 等(Proc Natl Acad Sci USA.2013, 110(10):3907- 3912.)膠原酶B+DNase消化液消化成年小鼠胰腺組織獲得單個細胞，CD 133標記，流式細胞術分選，條件培養基培養，3w後，細胞克隆形成細胞團，RT-PCR檢測克隆細胞表達CD133。培養液中添加RSP01定向誘導，⑶133+細胞分化形成表達Ngn3的胰島幹細胞和腺泡細胞。流式細胞術進一步分選出Ngn3+胰島幹細胞，體外定向誘導，分化形成β細胞。葡萄糖刺激，分泌insulin。國內，效梅等(中國科學C輯:生命科學.2008，38 (8): 699-707.Science inChina Series C:Life Science.2008，51 (9):779-788.分子細胞生物學報.2008.41 (6):450-457.分子細胞生物學報.2008, 41 (6): 457-464.解剖學報.2009, 40 (2): 55-58.中國獸醫學報.2009, 29 (2): 191-195.)報導IV型膠原酶消化人胎兒胰腺組織，收集單個細胞和細胞團，低糖DMEM培養液培養。當原代上皮樣胰腺幹細胞長出後，0.25%胰蛋白酶消化液消化，傳代。克隆環篩選出單複製人胰腺幹細胞，培養液中添加10ng/mLEGF擴增培養，建立人胎兒胰腺幹細胞系。免疫化學反應和RT-PCR檢測該幹細胞表達Pdxl、glucagon、nestin及CK19蛋白，不表達insulin、CD34、CD44及CD45。β -巰基乙醇誘導，分化形成神經細胞，表達NF蛋白。煙醯胺誘導，分化形成DTZ染色陽性，分泌insulin和C肽的功能性類胰島。將誘導類胰島移植在STZ製備的糖尿病大鼠腎囊內，能降低糖尿病大鼠血糖水平，延長壽命。閻志風等(中國組織工程研究與臨床.2008，12(3): 485-489.)無菌取人胎兒胰腺組織，V型膠原酶消化，分離得到胰島樣細胞團。挑出懸浮胰島樣細胞團貼壁培養，上皮樣幹細胞克隆性生長至單層， 傳代。生長曲線顯示人胎兒胰島上皮樣幹細胞傳代第3d進入對數生長期，第6d進入平臺期，細胞生長曲線呈」 S」形。螢光免疫反應檢測原代上皮樣幹細胞表達PCNA、Pdxl、nestin、CK19、insulin、glucagon和Q)29,傳代後，幹細胞則不表達insulin、glucagon和CD29。白日星等(中國普通外科雜誌.2004，13(10):746-749)膠原酶消化新生大鼠胰腺組織，組織碎片採用無血清RPMI1640培養液培養。培養36h，nestin+細胞貼壁生長。添加bFGF、EGF、N2, nestin+細胞快速增長。培養18~24d，nestin+細胞分化形成類胰島樣細胞團，胰島素釋放實驗檢測，分泌insulin。馮若鵬等(中國農業科學.2007, (3).582-587.農業生物技術學報，2011.19(1): 9-17.)膠原酶消化胎豬胰腺組織分離獲得胰島，貼壁培養，胰島幹細胞快速增殖，傳18代，建系。免疫化學反應顯示胰島幹細胞表達CK19和a-actin,不表達nestin。無血清誘導，2w後,胰島幹細胞分化形成DTZ染色陽性的胰島樣細胞團，表達insulin和Glut2等胰島素分泌細胞功能相關的蛋白。葡萄糖刺激，分泌insulin和C-肽。將誘導細胞移植到糖尿病裸鼠腹腔內，可緩解其高血糖狀況。目前，國內尚無建立大鼠胰島上皮樣幹細胞系的報導。本發明一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系及其特徵，將為研究人類和其它哺乳動物胰島幹細胞提供依據，這對於進一步研究人類和其它哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。
【發明內容】

[0003]本發明的目的是提供一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系及其特徵，為研究人類和其它哺乳動物胰島幹細胞系提供依據，這對於進一步研究人類和其它哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。
[0004]為了解決上述問題，本發明所採用的技術方案是:
一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，保藏號為C201460，保藏日期2014年4月2日，保藏單位:中國典型培養物保藏中心，地址:武漢大學中國典型培養物保藏中心。
[0005]包括如下特徵:
1.大鼠胰島上皮樣幹細胞形態特徵 H.E染色，大鼠胰島上皮樣幹細胞完全貼壁後，呈多角形上皮樣(圖1) ；Giemsa染色，細胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁(圖2)；
2.大鼠胰島上皮樣幹細胞生長特性
大鼠胰島上皮樣幹細胞克隆性生長；生長曲線表明細胞接種第Id生長緩慢，第2~4d進入對數生長期，第5~6d為平臺期，第7d增殖能力下降(圖3)；
3.大鼠胰島上皮樣幹細胞染色體數目
染色體標本顯示大鼠胰島上皮樣幹細胞是正常的二倍體細胞，染色體數目2n=42 (圖
4)；
4.大鼠胰島上皮樣幹細胞表達特徵
流式細胞術檢測和螢光免疫化學反應顯示大鼠胰島上皮樣幹細胞在蛋白水平表達八聚體轉錄因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,圖 5)、配對基因盒 4 (Paired box 4, Pax4,圖 6)、配對基因盒 6 (Paired box 6, Pax6,圖 7)、神經源性因子 3 (Neurogenin 3, Ngn3,圖 9)和巢蛋白(nestin,圖 10),不表達 Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin ;圖8是流式細胞術檢測陰性對照，圖11是突光免疫化學反應小鼠胎兒成纖維細胞陰性對照；
5.大鼠胰島上皮樣幹細胞分化潛能
大鼠胰島上皮樣幹細胞具有多分化潛能，體外定向誘導，分化形成神經細胞、脂肪細胞和成骨細胞；
5.1分化形成神經細胞:採用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液體外定向誘導，誘導6d，約有50%大鼠胰島多角形上皮樣幹細胞分化形成有突觸的神經細胞(圖12)，螢光免疫化學反應表達神經元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(圖13);
5.2分化形成脂肪細胞:採用DMEM+10%NBS+lumol/L地塞米松+lug/Linsulin+
0.5mmol/LIBMX誘導液體外定向誘導，誘導7d，大鼠胰島多角形上皮樣幹細胞內出現小而少的脂滴；14d，細胞內脂滴增多，大小均勻；21d，約80%多角形上皮樣幹細胞變為圓形細胞，細胞內脂滴繼續增多，大小不一；27d，圓形細胞內脂滴明顯增多、增大，油紅O染色陽性(圖 14)；
5.3分化形成成骨細胞:採用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+10mmol/L β -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導液體外定向誘導，誘導7d，約30%大鼠胰島多角形上皮樣幹細胞出現皺縮；14d，皺縮細胞增至50%，部分細胞死亡；21d，細胞分泌增多，開始出現礦化結節；28d，礦化結節茜素紅染色陽性(圖15)，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色(圖16)；
6.大鼠胰島上皮樣幹細胞致瘤性
大鼠胰島上皮樣幹細胞無致瘤性；大鼠胰島上皮樣幹細胞接種在裸鼠背部皮下30d，剖解，眼觀未見瘤狀物。
[0006]7.大鼠胰島上皮樣幹細胞傳代培養
大鼠胰島上皮樣幹細胞按I X IO6個/mL細胞密度培養，幹細胞生長至80%融合時，
0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化傳代，收集的細胞接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養液擴增培養；該例大鼠胰島上皮樣幹細胞系已傳50代；
8.大鼠胰島上皮樣幹細胞冷凍保存
冷凍:80%DMEM+10%DMS0+10%NBS細胞冷凍液稀釋大鼠胰島上皮樣幹細胞至I X IO6個/mL，分裝於冷凍管；4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長期冷凍保存；
解凍:從液氮罐中取出大鼠胰島上皮樣幹細胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養液貼壁培養；臺盼藍染色檢測，大鼠胰島上皮樣幹細胞解凍成活率約為93%。
本發明的有益效果 是:提供一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系及其特徵，將為研究人類和其它哺乳動物胰島幹細胞提供依據，這對於進一步研究人類和其它哺乳動物胰腺發育、糖尿病的產生以及再造胰島微小器官治療糖尿病具有重要的意義。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]本說明書共有16幅附圖，其中:
圖1大鼠胰島上皮樣幹細胞H.E染色形態特徵(X 200);
圖2大鼠胰島上皮樣幹細胞Giemsa染色形態特徵(X 400)；
圖3大鼠胰島上皮樣幹細胞生長曲線；
圖4大鼠胰島上皮樣幹細胞染色體數目2n=42 ；
圖5流式細胞術檢測，大鼠胰島上皮樣幹細胞表達0ct4 ；
圖6流式細胞術檢測，大鼠胰島上皮樣幹細胞表達Pax4 ；
圖7流式細胞術檢測，大鼠胰島上皮樣幹細胞表達Pax6 ；
圖8流式細胞術檢測陰性對照；
圖9螢光免疫化學反應，大鼠胰島上皮樣幹細胞表達Ngn3 (X400)；
圖10螢光免疫化學反應，大鼠胰島上皮樣幹細胞表達nestin (X400)；
圖11螢光免疫化學反應小鼠胎兒成纖維細胞陰性對照(X200)；
圖12體外定向誘導，大鼠胰島上皮樣幹細胞分化形成有突觸的神經細胞(X200)；
圖13螢光免疫化學反應，大鼠胰島上皮樣幹細胞分化形成的神經細胞表達NSE(X200)；
圖14體外定向誘導，大鼠胰島上皮樣幹細胞分化形成脂肪細胞，油紅O染色陽性(X200)；
圖15體外定向誘導，大鼠胰島上皮樣幹細胞分化形成成骨細胞，茜素紅染色陽性(X100)；圖16大鼠胰島上皮樣幹細胞分化形成成骨細胞，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色(X100)。
【具體實施方式】
[0008]下面通過實例對本發明做進一步詳細說明，這些實例僅用來說明本發明，並不限制本發明的範圍。
[0009]實施例1
1.大鼠胰島上皮樣幹細胞形態特徵
Η.Ε染色:大鼠胰島上皮樣幹細胞完全貼壁後，呈多角形上皮樣(圖1)。染色方法參照司徒鎮強，吳軍正.細胞培養[Μ].世界圖書出版公司.2007.略；
Giemsa染色:大鼠胰島上皮樣幹細胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁(圖2)。染色方法參照R.1.弗雷謝尼.動物細胞培養一基本技術指南[Μ].科學出版社.2008.略；
2.大鼠胰島上皮樣幹細胞生長特性
大鼠胰島上皮樣幹細胞克隆性生長；生長曲線表明細胞接種第Id生長緩慢，第2~4d進入對數生長期，第5~6d為平臺期，第7d增殖能力下降(圖3)。
[0010]生長曲線測定方法 :解凍復活第20、30、40代大鼠胰島上皮樣幹細胞，RPMI1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養液分別稀釋細胞至I X IO4個/mL。取96孔板7個，每個板上分別接種3種不同代數的細胞，每代設6個孔，每孔加100 μ L細胞懸液，並設陰性對照(基礎培養液，無細胞)，置於37°C、5%C02、飽和溼度培養箱中培養。此時記為0d。每24h取出一塊培養板，採用CCK-8法測定細胞吸光度值(0D值)，共測7d。測定時，每孔加10 μ LCCK-8後，置於37°C、5%C02、飽和溼度培養箱中作用2h，在酶標儀上測定450nm處OD值。以時間(d)為橫坐標，吸光度值(OD)為縱坐標，繪製大鼠胰島上皮樣幹細胞生長曲線圖。
[0011]3.大鼠胰島上皮樣幹細胞染色體數目
染色體標本顯示大鼠胰島上皮樣幹細胞是正常的二倍體細胞，染色體數目2n=42 (圖4)。
[0012]大鼠胰島上皮樣幹細胞按I父105個/ HiL細胞密度接種於鋪有0.1%明膠的培養皿中，貼壁培養。擴增至80%融合時，加入終濃度為0.1 μ g/mL秋水仙素，繼續培養5h，使多數細胞染色體停於中期分裂相。0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液室溫消化3min，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化，離心。棄上清，加入0.4%KC1，並置於37°C水域中，低滲30min，離心。棄上清，加甲醇-冰醋酸固定液(甲醇:冰醋酸=3:1，現用現配)，混勻，靜置固定20min，離心。如此反覆固定2~3次。棄上清，加0.5mL固定液，混勻，製成染色體懸液。取冰凍載玻片，於約80cm高度滴片,火焰乾燥。滴加Giemsa染色液,染色lOmin。普通生物學顯微鏡下觀察染色體標本，照相。
[0013]4.大鼠胰島上皮樣幹細胞表達特徵
流式細胞術檢測和螢光免疫化學反應顯示大鼠胰島上皮樣幹細胞在蛋白水平表達八聚體轉錄因子 4 (Octamer-binding transcription factor 4, 0ct4,圖 5)、配對基因盒 4 (Paired box 4, Pax4,圖 6)、配對基因盒 6 (Paired box 6, Pax6,圖 7)、神經源性因子 3 (Neurogenin 3, Ngn3,圖 9)和巢蛋白(nestin,圖 10),不表達 Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin和secretin。圖8是流式細胞術檢測陰性對照，圖11是突光免疫化學反應小鼠胎兒成纖維細胞陰性對照。
[0014]4.1流式細胞術檢測
根據所購特異性抗體是否帶螢光標記，採用直接免疫螢光標記法或間接免疫螢光標記法檢測。
[0015]4.1.1直接免疫螢光標記法
直接免疫螢光標記法檢測大鼠胰島上皮樣幹細胞不表達MafA、PCNA、⑶117、⑶15、⑶34和 CD45。
[0016]PBS(-)洗滌大鼠胰島上皮樣幹細胞2次，稀釋細胞至I X IO6個/mL。取EP管7個，分別加入ImL細胞懸液，離心(1000rpm, 5min)。棄上清，分別加入200uL含1%BSA的PBS(-)稀釋的螢光素標記抗體(0.25ug/100uL稀釋的金黃地鼠抗小鼠MafA螢光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人PCNA螢光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人CD117螢光抗體、5uL/100uL稀釋的小鼠抗人CD 15螢光抗體、5uL/IOOuL稀釋的小鼠抗人CD34螢光抗體或5uL/IOOuL稀釋的小鼠抗人⑶45突光抗體,均購自eBioscience公司)，陰性對照加PBS(-),混勻，4°C孵育30min,離心(1000rpm, 5min)。棄上清，PBS (-)洗漆細胞 2 次,離心(1000rpm, 5min),以除去未結合的多餘抗體。每管分別加0.5mLPBS (-)重懸細胞，流式細胞儀(Accuri C6，BD，美國)檢測陽性細胞比例。實驗重複3次。
[0017]4.1.2間接免疫螢光標記法
間接免疫螢光標記法檢測大鼠胰島上皮樣幹細胞表達八聚體轉錄因子4 (0ct4)、配對基因盒 4 (Paired box 4, Pax4)和配對基因盒 6 (Paired box 6, Pax6)。
[0018]PBS (_)洗滌大鼠胰島上皮樣幹細胞2次，稀釋細胞至I X IO6個/mL。取EP管4個，分別加入ImL細胞懸液,離心(1000rpm, 5min)。棄上清，分別加入200uL含1%BSA的PBS (_)稀釋的無螢光素標記的一抗(1:100稀釋的兔抗人0ct4或1:500稀釋的兔抗大鼠Pax6,購自Epitomics公司；1:50兔抗人Pax4,購自Abgent公司)，陰性對照加PBS(-),混勻，4°C孵育30min，離心(1000rpm，5min)。棄上清，PBS (-)洗滌細胞2次，離心(lOOOrpm，5min)，以除去未結合的多餘抗體。棄上清，加入200uL含I %BSA的PBS (_)稀釋的螢光素標記二抗(1:100稀釋的羊抗兔突光二抗,購自Epitomics公司)，陰性對照加PBS (-),混勻，4°C孵育30min，離心(lOOOrpm，5min)。棄上清，PBS (-)洗滌細胞2次，離心(lOOOrpm，5min),以除去未結合的多餘抗體。每管分別加0.5mLPBS(_)重懸細胞,流式細胞儀(AccuriC6，BD，美國)檢測陽性細胞比例。實驗重複3次。
[0019]4.2突光免疫化學反應
對於購買不到流式細胞術檢測的抗體，則購買螢光免疫化學反應抗體檢測。
[0020]螢光免疫化學反應顯示大鼠胰島上皮樣幹細胞表達神經源性因子3 (Neurogenin
3,Ngn3)和巢蛋白(nestin),不表達 Pdxl、Ptfla、CK19、Nanog、NeuroD2、Sox2、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 及 secretin。
[0021]在鋪有0.1 %明膠的培養皿中放入蓋玻片，大鼠胰島上皮樣幹細胞按I父105個/mL細胞密度接種在放有蓋玻片的培養皿中。當細胞生長至80%融合，4%多聚甲醛室溫固定細胞爬片15min。PBS (-)洗滌細胞爬片2次後，l%Triton_X100穿孔30min，1%BSA封閉45min。洗掉多餘封閉液，加含1%BSA的PBS (_)稀釋的一抗(1:100稀釋的小鼠抗人Ngn3、3 μ g/mL稀釋的小鼠抗人Ptfla、5 μ g/mL稀釋的小鼠抗人ghrelin或1:100稀釋的兔抗人secretin,均購自Abcam公司；1:300稀釋的小鼠抗大鼠nestin,購自Novus公司；20yg/mL稀釋的小鼠抗人Pdxl或20 μ g/mL稀釋的小鼠抗人CK19,購自eBioscience公司；1:100稀釋的兔抗人Nanog、1:300稀釋的兔抗大鼠NeuroD2、1:100稀釋的兔抗人Sox2或1:100稀釋的兔抗人somatostatin,均購自Epitomics公司；1:500稀釋的小鼠抗大鼠insulin或1:500稀釋的兔抗大鼠glucagon，購自Boster公司；)，陰性對照加PBS(-)，4°C過夜。PBS(_)洗滌3次，每次3min。加含1%BSA的PBS (_)稀釋的螢光二抗(1:1000稀釋的羊抗小鼠突光二抗，購自Novu公司或1:100稀釋的羊抗兔突光二抗,購自Epitomics公司)，陰性對照加PBS(-)，37°C孵育lh。PBS (_)洗滌3次，每次3min，甘油封片。螢光顯微鏡下觀察，照相。陰性對照細胞為小鼠胎兒成纖維細胞。
[0022]5.大鼠胰島上皮樣幹細胞分化潛能
大鼠胰島上皮樣幹細胞具有多分化潛能，體外定向誘導，分化形成神經細胞、脂肪細胞和成骨細胞。[0023]5.1分化形成神經細胞
分化形成神經細胞:採用DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液體外定向誘導，誘導6d，約有50%大鼠胰島多角形上皮樣幹細胞分化形成有突觸的神經細胞(圖12)，螢光免疫化學反應表達神經元特異性烯醇化酶(Neuron specific enolase, NSE)(圖13)。
[0024]大鼠胰島上皮樣幹細胞按I X IO5個/ mL細胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培養液擴增培養。當細胞生長至80%融合時，換DMEM+10%NBS+5mg/mL大鼠腦組織提取液定向誘導培養，隔天換液。誘導6d，約有50%大鼠胰島多角形上皮樣幹細胞分化形成有突觸的神經細胞，螢光免疫化學反應表達NSE。
[0025]5.2分化形成脂肪細胞
分化形成脂肪細胞:採用 DMEM+10%NBS+lumol/L 地塞米松 +lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX誘導液體外定向誘導，誘導7d，大鼠胰島多角形上皮樣幹細胞內出現小而少的脂滴；14d，細胞內脂滴增多，大小均勻；21d，約80%多角形上皮樣幹細胞變為圓形細胞，細胞內脂滴繼續增多，大小不一；27d，圓形細胞內脂滴明顯增多、增大，油紅O染色陽性(圖14)。
[0026]大鼠胰島上皮樣幹細胞按I X IO5個/ mL細胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培養液擴增培養。當細胞生長至80%融合時，換DMEM+10%NBS+lumol/L地塞米松+lug/Linsulin+0.5mmol/LIBMX誘導液定向誘導培養，隔天換液。誘導7d,大鼠胰島多角形上皮樣幹細胞內出現小而少的脂滴；14d，細胞內脂滴增多，大小均勻；21d，約80%多角形上皮樣幹細胞變為圓形細胞，細胞內脂滴繼續增多，大小不一 ；27d，圓形細胞內脂滴明顯增多、增大,油紅O染色陽性。
[0027]5.3分化形成成骨細胞
分化形成成骨細胞:採用RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導液體外定向誘導，誘導7d，約30%大鼠胰島多角形上皮樣幹細胞出現皺縮；14d，皺縮細胞增至50%，部分細胞死亡；21d，細胞分泌增多，開始出現礦化結節；28d，礦化結節茜素紅染色陽性(圖15)，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色(圖16)。
[0028]大鼠胰島上皮樣幹細胞按I X IO5個/ mL細胞密度接種，RPMI1640+10%NBS+10ng/mL bFGF培養液擴增培養。當細胞生長至80%融合時，換RPMI1640+10%NBS+0.lumol/L地塞米松+lOmmol/L0 -磷酸甘油+50ug/mL抗壞血酸鹽誘導液定向誘導培養，隔天換液。誘導7d，約30%大鼠胰島多角形上皮樣幹細胞出現明顯的皺縮；14d，皺縮細胞增至50%，部分細胞死亡；21d，細胞分泌增多，開始出現礦化結節；28d，礦化結節茜素紅染色陽性，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色。
[0029]6.大鼠胰島上皮樣幹細胞致瘤性
大鼠胰島上皮樣幹細胞無致瘤性。大鼠胰島上皮樣幹細胞接種在裸鼠背部皮下30d，解剖，眼觀未見瘤狀物。
[0030]在6隻裸鼠背部皮下分別注射大鼠胰島上皮樣幹細胞，劑量為I X IO6個/0.2mL/site, 3隻裸鼠背部皮下注射0.2mL細胞培養液RPMI1640作為對照，正常飼養管理30d。結果，6隻實驗裸鼠和3隻對照裸鼠均存活至實驗結束，解剖觀察，均未見瘤狀物。
[0031]7.大鼠胰島上皮樣幹細胞傳代培養
當大鼠胰島上皮樣幹細胞生長至80%融合時，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化3min, RPMI1640+10%NBS培養液終止消化，離心(lOOOrpm，5min)。收集的細胞按I X IO6個/mL細胞密度接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養液擴增培養。該例大鼠胰島上皮樣幹細胞系已傳50代。
[0032]8.大鼠胰島上皮樣幹細胞冷凍保存
冷凍:大鼠胰島上皮樣幹細胞生長至80%融合時，PBS (_)清洗，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化，RPMI1640+10%NBS培養液終止消化，離心(lOOOrpm, 5min)。80%RPMI1640+10%DMS0+10%NBS冷凍液稀釋細胞至I X IO6個/mL，分裝於冷凍管。4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長期冷凍保存。
[0033]解凍:從液氮罐中取出大鼠胰島上皮樣幹細胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI1640+10%NBS培養液清洗解凍細胞2~3遍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養液貼壁培養。取少量細胞，臺盼藍染色檢測，細胞解凍成活率約為93%。
[0034]採用該冷凍保存方法，已冷凍保存該例大鼠胰島上皮樣幹細胞50管，約0.5 X IO8個細胞。
【權利要求】
1.一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，其特徵在於:大鼠胰島上皮樣幹細胞來源於正常成年大鼠胰島組織，體外培養能克隆性生長，且具有多分化潛能，保藏號為C201460，保藏日期2014年4月2日，保藏單位:中國典型培養物保藏中心。
2.根據權利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，其特徵在於:大鼠胰島上皮樣幹細胞形態特徵為:大鼠胰島上皮樣幹細胞完全貼壁後，呈多角形上皮樣，細胞核為橢圓形，核仁多為單核仁或雙核仁。
3.根據權利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，其特徵在於:大鼠胰島上皮樣幹細胞生長特性為:大鼠胰島上皮樣幹細胞克隆性生長；細胞接種第Id生長緩慢，第2~4d進入對數生長期，第5~6d為平臺期，第7d增殖能力下降。
4.根據權利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，其特徵在於:大鼠胰島上皮樣幹細胞染色體數目為:大鼠胰島上皮樣幹細胞是正常的二倍體細胞，染色體數目2n=42。
5.根據權利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，其特徵在於:大鼠胰島上皮樣幹細胞表達特徵為:大鼠胰島上皮樣幹細胞在蛋白水平表達八聚體轉錄因子4(Octamer-binding transcription factor 4,0ct4)、配對基因盒 4(Paired box 4,Pax4)、配對基因盒6 (Paired box 6, Pax6)、神經源性因子3 (Neurogenin 3, Ngn3)和巢蛋白(nestin)，不表達 Pdxl、MafA、Ptfla、CK19、NeuroD2、PCNA、Nanog、Sox2、CD117、CD15、CD34、CD45、insulin、glucagon、ghrelin、somatostatin 和 secretin。
6.根據權利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，其特徵在於:大鼠胰島上皮樣幹細胞分化潛能為:大鼠胰島上皮樣幹細胞具有多分化潛能，體外定向誘導，大鼠胰島上皮樣幹細胞分化形成有突觸的神經細胞，表達NSE ;分化形成含有脂滴的脂肪細胞，油紅O染色陽性；分化形成成骨細胞，產生礦化結節，茜素紅染色陽性，Vonkossa染色礦化結節呈現黑色。
7.根據權利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，其特徵在於:大鼠胰島上皮樣幹細胞致瘤性:大鼠胰島上皮樣幹細胞無致瘤性。
8.根據權利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，其特徵在於:大鼠胰島上皮樣幹細胞傳代培養:當大鼠胰島上皮樣幹細胞生長至80%融合時，0.25%胰蛋白酶+0.04%EDTA消化液消化傳代，收集的細胞按I X IO6個/mL細胞密度接種在鋪有0.1%明膠的培養皿中，RPMI1640+ 10%NBS+10ng/mLbFGF培養液擴增培養；該幹細胞系已傳50代。
9.根據權利要求1所述的一例大鼠胰島上皮樣幹細胞系，其特徵在於:大鼠胰島上皮樣幹細胞冷凍保存: 冷凍:80%DMEM+10%DMS0+10%NBS細胞冷凍液稀釋大鼠胰島上皮樣幹細胞至I X IO6個/mL，分裝於冷凍管；4°C平衡30min，液氮面上懸浮2h，投入液氮長期冷凍保存； 解凍:從液氮罐中取出大鼠胰島上皮樣幹細胞冷凍管，迅速投入37°C水域中解凍，RPMI 1640+10%NBS+10ng/mLbFGF培養液貼壁培養；臺盼藍染色檢測，大鼠胰島上皮樣幹細胞解凍成活率約為93%。
【文檔編號】C12R1/91GK103881961SQ201410138844
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年4月9日 優先權日:2014年4月9日
【發明者】安立龍, 效梅 申請人:廣東海洋大學