一種植物抗逆性相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法

2023-05-24 15:12:06

專利名稱：一種植物抗逆性相關蛋白及其編碼基因與應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種植物抗逆性相關蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術：
鹽漬化土壤在世界上的面積分布很廣，據不完全統計，全世界約有3.8億hm2不同程度的鹽漬化土壤，約佔可耕地面積的10％左右。中隨著人口的增長、工業汙染的加劇、不合理的灌溉、化肥使用不當等原因，次生化鹽漬土壤面積還在擴大，對於糧食產量和種植面積構成新的威脅。
目前，國際上改良和利用大面積的鹽漬化土壤有兩條基本的途徑一是通過農業工程措施改良土壤，降低土壤鹽分，改善土壤環境，緩解作物生長的脅迫條件；其二是走生物學路線，挖掘、培育耐鹽作物品種或開發利用有價值的鹽生植物資源以改良土壤。前者需要花費大量的人力、物力、財力，成本太高，且難以保持持久。在耕地面積日益減少，鹽鹼地逐年增加的形式下，淡水資源嚴重不足的情況下，走生物學路線，培育耐鹽作物品種是改良和利用鹽鹼地資源最經濟、最有效的措施之一，這對鹽鹼地區儘快建立合理的地貌結構，提高作物產量都具有重要的意義，也是長遠而有效地利用鹽鹼化土壤資源的一條根本途徑。
逆境脅迫下，脯氨酸作為滲透保護物質在植株抗逆生理中起著重要的作用，脯氨酸不僅是植物體內的重要能源，作為氮源、碳源，還作為滲透調節物質，在植物抵禦滲透脅迫中起著重要作用。吡咯啉-5-羧酸合成酶( 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)，作為脯氨酸生物合成的穀氨酸途徑的限速酶，其全長cDNA序列已在羽扇豆、擬南芥、碗豆和水稻等植物中克隆，羽扇豆P5CS轉化菸草結果表明，過量表達羽扇豆P5CS基因促進菸草脯氨酸的含量增加，鹽脅迫下與對照比菸草生物量增加，抗脅迫能力增強。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種植物抗逆性相關蛋白及其編碼基因。本發明所提供的植物抗逆性相關蛋白，名稱為TaP5CS( 1-pyrroline-5-carboxylatesynthetase)，其來源於小麥，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID No2；2)將序列表中SEQ ID No2的胺基酸殘基序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關的蛋白質。
其中，序列表中的序列2由716個胺基酸殘基組成。
所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多於十個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
上述植物抗逆性相關蛋白編碼基因(TaP5CS)也屬於本發明的保護範圍。
上述植物抗逆性相關蛋白的cDNA基因，可具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID No1的DNA序列2)編碼序列表中SEQ ID No2蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID No1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
上述高嚴謹條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交並洗膜。
其中，序列表中的SEQ ID No1由2260個脫氧核苷酸組成，自5′第109位至2259位脫氧核苷酸為編碼序列。
含有本發明基因的表達載體、細胞系及宿主菌均屬於本發明的保護範圍。
本發明的第二個目的是提供一種利用該基因增強植物抗逆性的方法。
本發明所提供的增強植物抗逆性的方法，是將上述植物抗逆性相關蛋白編碼基因插入真核細胞表達載體，得到含有所述植物抗逆性相關蛋白編碼基因的重組表達載體，將該重組表達載體導入目的植物，從表達所述植物抗逆性相關蛋白的植株或所述植物抗逆性相關蛋白表達量增加的植株中篩選得到抗逆性增強的植株。
所述真核細胞表達載體可為Ti類質粒載體和病毒載體，優選為pCAMBIA3301。
所述重組表達載體可為將所述植物抗逆性相關蛋白編碼基因插入去除GUS基因的pCAMBIA3301得到的pCAMBIA3301-TaP5CS。
所述轉化方法可為農桿菌介導轉化法、基因槍介導轉化法或花粉管通道法，優選為農桿菌介導轉化法。
植物中的上述植物抗逆性相關蛋白編碼基因的表達。
本發明的TaP5CS基因可通過現有的方法構建到真核細胞表達載體，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強啟動子或誘導型啟動子。為了便於對轉基因植物細胞或植物進行鑑定及篩選，可對所使用的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(BAR基因、GUS基因、螢光素酶基因等)或具有抗性的抗生素標記物(慶大黴素，卡那黴素等)。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草或苜宿等。攜帶有本發明的TaP5CS基因或其反義核酸的表達載體可通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，並將轉化的植物經組織培育成植株。
TaP5CS基因有兩個表達高峰，TaP5CS基因是受鹽脅迫誘導表達的，Northern blot和半定量RT-PCR分析表明，在鹽脅迫2個小時，表達量即增強，隨後減弱，鹽脅迫12小時，表達量又上升到一個高峰，以後表達量稍有下降。TaP5CS基因在小麥根和葉片表達也是不同的，儘管根是先接觸鹽脅迫的部位，但是在鹽脅迫後2個小時TaP5CS在根中的表達量並未明顯增強，而在葉中脅迫2個小時達到高峰，而後下降，在脅迫12小時又達到高峰，根在12小時達到高峰後表達量有下降，24小時和葉片水平相當，96、168小時的表達高於葉片。伴隨P5CS基因的表達脯氨酸含量增加，耐鹽的小麥茶澱紅的葉片在鹽脅迫後24小時，脯氨酸有明顯的增加，以後脯氨酸大量積累，到脅迫後156小時達到5mg/gFW。小麥脯氨酸的積累落後於TaP5CS基因的表達，這和其它植物如擬南芥、水稻是一樣的(Savoure A，JaouaS，Hua X J.Isolation，characterization，and chromosomal location of a geneencodingthe P5CS in Arabidopsis thaliana，FEBS Letters，1995，37213-19；Igwrashi.Charaterization of the gene for pyrroline carboxlate synthetase and correctionbetween the expression of the gene and salt tolerance in oryza satioa L.Plant Mol.Biol.，1997，33(5)857-865)。說明TaP5CS基因是受鹽脅迫誘導表達的基因。通過Southernbot分析表明，TaP5CS基因是2個拷貝的基因，這和人類、番茄、擬南芥的結果是一致的，TaP5CS基因是能夠促進脯氨酸的合成積累。
小麥TaP5CS基因在擬南芥中的Northern blot的結果表明，在正常情況下，小麥TaP5CS基因在擬南芥中高效表達，鹽、PEG和ABA脅迫進一步加強小麥TaP5CS基因轉錄本的積累，也促進了脯氨酸的積累。儘管小麥為單子葉植物，擬南芥為雙子葉植物，小麥TaP5CS基因在擬南芥中的異源表達不僅是高效表達，而且確實增加了擬南芥的耐鹽性。根長的實驗結果表明，在50mM的NaCl脅迫下，表達小麥TaP5CS基因的擬南芥轉基因植株根的伸長几乎不受影響，而對照的生長被抑制了20-25％，在100mM的NaCl脅迫下表達的轉基因植株生長被抑制了30％，而對照抑制了50％。表達的轉基因植株不僅根的長度長於對照，而且根的生物量增加，側根增多，這些結果和羽扇豆VuP5CS基因在菸草的過量表達結果一致。
擬南芥苗期耐鹽性的鑑定結果表明鹽逆境下，表達小麥TaP5CS基因可促進植株的生長，生物量增加，株高和乾重均高於野生型對照和空載體對照。可溶性蛋白和葉綠素是評價植物耐鹽性的重要生理指標，結果表明在鹽脅迫下，在擬南芥中表達TaP5CS基因，在50和100mMNaCl脅迫下，促進了擬南芥可溶性蛋白的合成，在200mM NaCl的高濃度鹽脅迫下穩定蛋白的合成。在擬南芥中表達TaP5CS基因，在50和100mM NaCl脅迫下，葉綠素含量均為上升趨勢，在200mM NaCl的高鹽脅迫下，葉綠素含量降低，而空載體對照在低鹽脅迫下，葉綠素含量下降，在高鹽脅迫下，下降幅度更大。說明在擬南芥幼苗早期和苗期表達TaP5CS基因均能增加擬南芥的抗鹽性，表達不僅增加了擬南芥的抗鹽性，對擬南芥的開花期也有影響，無論鹽脅迫還是正常生長情況下，表達小麥TaP5CS基因的使得擬南芥苗期延長，蓮座葉增大，但是葉片葉色淡，而空載體和野生型葉片小，葉色綠，葉綠素含量高。
為了驗證小麥TaP5CS基因的功能又進行了反義表達的實驗。反義表達的長片段P5CS-2151包含整個ORF，和擬南芥的AtP5CSA的核苷酸有63.3％的一致性，和AtP5CSB的核苷酸有40％的序列一致性。短片段位置P5CS-262從+1396bp到+1658bp，屬於穀氨酸-半醛脫氫酶的保守域。P5CS-262的核苷酸序列和AtP5CSA有62％一致性，和AtP5CSB有58％的一致性，但是它包含133bp的一段區域和AtP5CSA和AtP5CSB分別有79％和81％的一致性。反義表達的結果表明，在T1代長片段P5CS-2151的反義表達沒有短片段P5CS-262的反義表達症狀明顯。反義表達的T1代轉基因植株在株型和植株大小上與野生型沒有明顯的區別，但反義表達的轉基因株系莖幹變細，後期變為紅色，果莢變小，每莢的種子數變少，但種子變大，果莢顏色暗紅，而對照果莢皮色為乳白色，果莢大，莢內種子數多，T1代的實驗結果說明反義表達抑制了內源AtP5CS表達，由於小麥TaP5CS基因和擬南芥的AtP5CS在穀氨酸激酶和穀氨酸-半醛脫氫酶兩個保守域胺基酸序列並不太一致，所以反義表達並沒有完全抑制內源AtP5CS基因的表達。反義表達能夠部分抑制AtP5CS基因的活力，使轉基因植株抗鹽能力降低，根長的實驗結果表明，鹽脅迫下反義表達的轉基因株系根長生長被抑制，而且反義表達的P5CS-262比反義表達的P5CS-2151被抑制的作用更大。鹽脅迫下脯氨酸的測定結果表明，反義表達抑制了脯氨酸的合成。無論在正常情況下還是鹽脅迫條件下，反義表達的P5CS-262轉基因株系脯氨酸含量都比對照低，但在低鹽脅迫下，反義表達的P5CS-2151比對照含量高，可能是鹽脅迫誘導了鳥氨酸合成途徑或對內源AtP5CS基因的活力只是部分抑制。本發明通過遺傳轉化在模式植物擬南芥中進行表達功能驗證，表明該基因在擬南芥中的表達能夠促進脯氨酸的合成積累，可溶性蛋白的合成，從而提高植物的耐鹽性。
本發明的植物抗逆性相關蛋白及其編碼基因可增強植物抗逆性，特別是增強植物對鹽脅迫的抗性。


圖1為TaP5CS基因cDNA的RT-PCR電泳分析。
圖2為不同植物P5CS基因的進化樹。
圖3為小麥TaP5CS基因推測的胺基酸序列與水稻擬南芥P5CS基因序列的比較分析圖。
圖4為小麥TaP5CS基因的Sourthern blot分析圖。
圖5為用中國春小麥的缺四體和端體對小麥TaP5CS基因的Sourthern blot定位分析圖。
圖6為小麥TaP5CS基因的Northern blot分析圖。
圖7為小麥TaP5CS基因的半定量RT-PCR分析圖。
圖8為鹽脅迫促進小麥葉片脯氨酸的積累點線9為pCAMBIA3301載體部分酶切圖。
圖10為小麥TaP5CS基因表達載體pCAMBIA3301-TaP5CS。
圖11為表達載體pCAMBIA3301-TaP5CS的酶切圖。
圖12為轉化的植株在含7mg/L PPT的MS培養基平板上篩選圖。
圖13為轉基因植株的PCR驗證圖。
圖14為轉基因植株的Southern blot驗證圖。
圖15小麥TaP5CS基因促進擬南芥蓮座葉的生長圖。
圖16為轉基因植株的Northern blot雜交分析圖。
圖17為過量表達小麥TaP5CS基因增加逆境脅迫下，轉基因擬南芥葉片的脯氨酸含量分析圖。
圖18為不同鹽脅迫對轉基因苗根伸長的影響圖。
圖19為鹽脅迫16天的轉基因植株的生長情況圖。
圖20為鹽脅迫對可溶性蛋白含量的影響。
圖21為鹽脅迫對葉綠素含量的影響。
圖22為pCAMBIA3301-P5CS-2151和pCAMBIA3301-P5CS-262的擴增。
圖23為pCAMBIA3301-P5CS-2151的酶切鑑定圖譜。
圖24為pCAMBIA3301-P5CS-262的酶切及PCR鑑定圖譜。
圖25為轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株的PCR驗證圖。
圖26為轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株的PCR驗證圖。
圖27為T1代反義表達植株的生長狀況圖。
圖28為鹽脅迫處理18天對轉pCAMBIA3301-P5CS-2151和pCAMBIA3301-P5CS-262苗根長的影響圖。
圖29為鹽脅迫對轉pCAMBIA3301-P5CS-2151和pCAMBIA3301-P5CS-262葉片脯氨酸含量的影響點線圖。
具體實施例方式
下述實施例中的實驗方法如無特別說明，均為常規方法。
T0表示由擬南芥農桿菌蘸花侵染得到的轉基因植株，T1表示T0代自交產生的種子及由它所長成的植株，T2表示T1代自交產生的種子及由它所長成的植株。
下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質量百分含量。
實施例1、TaP5CS及其編碼基因的獲得以100-200mg中國地方小麥茶澱紅葉片為材料，用Trizol方法提取總RNA，經1％瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。ss cDNA的合成按照SuperScriptTMII RNase H-ReverseTranscriptase的方法，合成單鏈(ss)cDNA。通過NCBI資料庫檢索到水稻的OsP5CS基因的全長序列(登陸號為AY574031)，以水稻的OsP5CS基因序列為探針，Blast小麥的EST資料庫，設計了一對引物，正向引物P5CSF為5′CTGCGGCGACGAGGAAAATACACT3′，反向引物P5CSR為5′TCATTGCAAAGGAAGGCTCT3′。以反轉錄得到的cDNA為模板，通過RT-PCR擴增小麥的P5CS基因，PCR反應條件如下先94℃ 5分鐘；然後按照如下條件進行30個循環94℃ 30秒，64℃ 4分鐘；最後72℃延伸15分，4℃保溫。擴增完的PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳結果如圖1所示，結果表明擴增到了2kb左右的條帶。圖1中，中間泳道為PCR產物，兩側的泳道為DNA分子量標準(200bp)。電泳完畢在紫外燈下切下目的條帶，用瓊脂糖凝膠試劑盒純化後與pGEM-T Easy載體連接，將連接產物進行熱激轉化大腸桿菌TOP10，含50μg/ml羧苄青黴素的LB平板上，37℃培養9-12小時，挑取單菌落大量培養，提質粒並用EcoR I酶切鑑定。挑選酶切正確的14個質粒，用BigDyeTM Dye Terminator Cycle Sequencing ReadyReaction Kit方法測序，因為克隆得到的基因大約為2.1Kb，為了使核酸序列準確可靠，在用T7(5′TAA TAC GAC TCA CTA TAG GG3′)和SP6(5′ATT TAG GTG ACA CTA TAG AA3′)測序後，根據得到的序列，又設計合成了2對測序引物如下P5CS1F5′TGGGCTGATGGCACTCTATGAC3′和P5CS1R5′TCAGCATGGCCAAGAACAGGAATC3′；P5CS2F5′GAGACAAGTCCCGTGTTGGT3′和P5CS2R5′ATGCGCAACAGGCCCACAATAAAG3′。測序所用儀器為XL3730 DNA analyzer(ABI)。測序結果表明，該片段大小是2260bp。它具有序列表中序列1的DNA序列，自5′第109位至2259位脫氧核苷酸為編碼序列，編碼具有序列表中序列2的胺基酸殘基序列的TaP5CS。
用TaP5CS的基因序列和其它植物P5CS的基因序列進行blast比對，結果表明TaP5CS基因和水稻OsP5CS，擬南芥AtP5CSA、AtP5CSB，獼猴桃AdP5CS，大豆GmP5CS，羽扇豆VuP5CS基因分別有84％，69％，69％，72％，70％，44％的序列一致性。系統發育分析發現，TaP5CS基因和水稻的OsP5CS基因關係最近，和羽扇豆的VuP5CS基因關係最遠(圖2)。用TaP5CS的胺基酸序列在NCBI資料庫進行保守域比對，TaP5CS有完整的哺乳動物和植物P5CS基因的保守域γ-GK激酶結構域和γ-GSA脫氫酶區域。和擬南芥、水稻比較，在穀氨酸激酶域(γ-Glu-5-kinase domain)和擬南芥AtP5CSA比有7個胺基酸的變異，和AtP5CSB比有6個胺基酸的變異，而且部分變異位點在AtP5CSA和AtP5CSB間是不同的。和水稻OsP5CS比較，在穀氨酸激酶域有5個變異位點。在穀氨酸-半醛脫氫酶(γ-GSA-DH domain)區域和AtP5CSA比，有6個胺基酸位點的變異，和AtP5CSB也有6個位點的變異，其中有5個位點的變異在兩個擬南芥基因間是相同的。小麥TaP5CS基因和水稻OsP5CS有兩個胺基酸的變異位點。穀氨酸激酶和穀氨酸-半醛脫氫酶保守域比較說明這兩個保守域在擬南芥、水稻和小麥之間是不保守的，P5CS擬南芥和小麥之間的一致性小於小麥和水稻之間的一致性。此外，小麥TaP5CS基因有假定的亮氨酸保守域，這個部位P5CS在擬南芥、水稻和小麥之間的胺基酸序列一致性也很差。圖3表明TaP5CS在γ-GK激酶和GSA脫氫酶區域2個保守域內胺基酸變化較大。圖3中I為ATP結合位點(自序列2的氨基端第59位至第66位胺基酸殘基)；II為Glu-5-kinase domain(自序列2的氨基端第232位至第255位胺基酸殘基)；III為NADPH-bindingdomain(自序列2的氨基端第428位至第467位胺基酸殘基)；IV為putativeleu domain(自序列2的氨基端第558位至第586位胺基酸殘基)；V為conserbved GSA-DH domain(自序列2的氨基端第648位至第684位胺基酸殘基)。
TaP5CS和擬南芥、水稻、獼猴桃、松葉菊等植物的P5CS比，在自序列2的氨基端第125位和128位分別有保守的天冬氨酸(Asp，D)和苯丙氨酸(Phe，F)這兩個位點是脯氨酸反饋抑制作用位點，通過胺基酸序列比對，已克隆到的所有植物的P5CS在該位點均為天冬氨酸(Asp，D)和苯丙氨酸(Phe，F)，說明脯氨酸反饋抑制位點在不同植物中是很保守的(Hong ZL，Lakkineni K，Zhang Z H，et al.Removal of feedback inhibition of％1-pyrroline-5-carboxylate synthetase results in increased proline accumulation and protectionof plants fromosmotic stress.Plant Physiol.，2000，1221129-1136)，而這兩個位點和E.coil及酵母不同，說明植物和微生物的差異。通過胺基酸序列比較發現所有的植物P5CS均是ATP和NADPH依賴的有共同的ATP和NADPH結合位點。小麥和擬南芥基因結構的分析說明儘管P5CS基因是脯氨酸生物合成途徑的基因，雙功能酶，都有完整的保守域，但是保守域內部在不同植物間胺基酸有變異，胺基酸的變異可能引起基因功能的差異。
實施例2、Southern blot分析及基因的定位分析分別提取六倍體小麥中國春(Chinese spring)、2倍體烏拉爾圖小麥(T.urartu)A基因組、擬斯卑爾脫(Ae.speltoides ssp speltoide)S基因組、粗山羊草(Ae.squarrosa sspstrangulate)D基因組的DNA，用HindIII、EcoRI、EcoRV酶切，酶切的DNA低壓電泳(1V/cm)10小時，電泳結束後，以小麥TaP5CS的cDNA為探針進行Sourthern blot分析。結果如圖4所示，表明用EcoRI酶切，六倍體小麥為3條帶，A、B、D基因組均為2條帶；EcoRV酶切中國春為4條帶，A基因組為2條帶，S和D基因組為2條帶，HindIII酶切均為2條帶，由此推斷小麥TaP5CS基因可能是兩個拷貝。圖4中，1為六倍體小麥中國春(Chinese spring)、2為二倍體烏拉爾圖小麥(T.urartu)A基因組、3為二倍體擬斯卑爾脫(Ae.speltoides sspspeltoide)S基因組、4為二倍體粗山羊草(Ae.squarrosa ssp strangulate)D基因組。以小麥TaP5CS基因的cDNA作為探針，與中國春小麥的缺四體DNA膜進行同位素雜交，對基因進行定位分析，結果如圖5所示，表明小麥TaP5CS基因是定位在2B染色體上。圖5中N表示缺失的染色體，T表示補上的染色體。
實施例3、TaP5CS基因的表達分析(1)Northern blot分析將生長一葉一心的小麥茶澱紅幼苗的根系置於250mM的NaCl脅迫處理0、2、8、12、24、96小時後提取葉片的總RNA，按照Sambrook的方法進行Nornthern雜交。其中，探針為TaP5CS的全長cDNA基因，用32P-dCTP進行標記。結果如圖6所示，表明小麥的TaP5CS基因是受鹽脅迫誘導的，在正常生長情況下，小麥的TaP5CS基因表達量很低，在鹽脅迫後2小時表達量增強，8小時下降，但表達量高於對照(未經鹽脅迫處理的生長30天的小麥茶澱紅幼苗)，12小時表達量增強，24小時表達量又達到高峰，96小時表達量仍高於對照。
(2)半定量RT-PCR將生長一葉一心的小麥茶澱紅幼苗的根系置於250mM的NaCl溶液分別處理0、2、4、8、12、24、96、168小時後，分別提取根和葉的總RNA，用SuperScriptTM Rnase H Reverase IIITranscriptase(Invitrogen)直接反轉錄為cDNA。首先用組成型表達的Tubulin的特異引物擴增，以調cDNA的濃度一致。Tubulin正向引物5′AGAACAGTGTTGTAAGGCTCAAC3′，反向引物為5′GAGCTTTACTGCCTCGAACATGG3′；反應條件為先94℃ 5min；再25個循環(94℃ 30sec；55℃ 30sec；72℃ 1min)；然後72℃延伸15min，15℃保溫。將不同樣品的起始cDNA濃度調節一致後，以P5CS特異的引物對P5CSF和P5CSR擴增全長cDNA。程序為先94℃ 5min；然後22個循環(94℃ 30sec；64℃ 4min)；再72℃延伸15min，15℃保溫。結果如圖7所示，表明鹽脅迫下小麥葉片TaP5CS基因在2小時表達量增強，4小時，8小時表達量又下降但稍高於對照，鹽脅迫處理12小時表達量增加到最大量，而後表達量下降，但是都高於對照。鹽脅迫下小麥根P5CS基因表達量在2小時沒有明顯增加，在4、8小時表達量有所下降，鹽處理12小時表達量增強，24、96小時根的表達量仍然很高，168小時稍有下降。
實施例4、脯氨酸含量的測定將生長至一葉一心的小麥茶澱紅幼苗的根系置於250mM的NaCl溶液分別處理0、4、8、12、24、72、156小時後，採用茚三酮法測小麥葉片脯氨酸的含量。小麥葉片中脯氨酸含量的變化如圖8所示，表明正常情況下，小麥葉片脯氨酸含量很低；隨鹽脅迫處理時間的延長，葉片脯氨酸含量增加，但在脅迫24小時之前增加的速度緩慢；脅迫24小時後，脯氨酸含量直線增加，到72小時增加到2.0mg/g乾重；脅迫6.5天增加到4.8mg/g乾重。這表明小麥葉片脯氨酸含量受鹽脅迫的誘導而積累。
實施例5、TaP5CS基因在擬南芥中的表達1、表達載體的構建小麥TaP5CS基因在編碼序列的起始密碼前有Nco I位點，所以設計修飾引物時僅在反向引物P5CSNR加Nhe I識別序列，正向引物為P5CSF，反向引物為P5CSNR，序列如下P5CSF5』CTGCGGCGACGAGGAAAATACACT3』，P5CSNR5』ATGCTAGCTCATTGCAAAGGAAGG3』(帶下劃線的序列為Nhe I識別序列)。以中國地方小麥茶澱紅葉片為材料，用Trizol方法提取總RNA，經1％瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性。ss cDNA的合成按照SuperScriptTMII RNase H-ReverseTranscriptase的方法，合成單鏈(ss)cDNA。以反轉錄得到的cDNA為模板，利用P5CSF和P5CSNR通過RT-PCR擴增小麥的TaP5CS基因。其中，PCR反應程序為先94℃ 5分鐘；30個循環(94℃ 30秒，64℃ 4分鐘，)；再72℃延伸15分，15℃保溫。擴增完的PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳。電泳完畢在紫外燈下切下目的條帶，用瓊脂糖凝膠試劑盒純化(購自天為時代)後與pGEM-T Easy連接，將連接產物進行熱激轉化大腸桿菌TOP10，含50μg/ml羧苄青黴素的LB平板上，37℃培養9-12小時，挑取單菌落大量培養，提質粒並用Nco I和NheI雙酶切質粒進行鑑定，挑選酶切得到2260bp片段的質粒用BigDye Dye Terminator方法測序。將含有2260bp的TaP5CS基因的pGEM-T Easy命名為pGEM-T-TaP5CS。
載體pCAMBIA3301(CAMBIA，Australia)(有兩個Nhe I識別位點)先用Nco I完全酶切，再用Nhe I部分酶切，載體的部分酶切見圖9，泳道M是DNA標準分子量(1Kb)，泳道1是線性化的pCAMBIA3301，泳道2和3是pCAMBIA3301的部分酶切。回收去GUS基因的載體條帶，得到去GUS基因的9293bp的載體片段。用Nco I和Nhe I雙酶切含有TaP5CS基因cDNA序列的質粒pGEM-T-TaP5CS，得到起始密碼子前帶有Nco I酶切位點和終止密碼子後帶有Nhe I酶切位點的小麥TaP5CS基因全長片段，將該片段連接到經部分酶切去除GUS基因的9293bp的pCAMBIA3301載體上(流程如圖10)，構建的載體轉化大腸桿菌TOP10(購自北京天為時代科技有限公司)和根癌農桿菌GV3101。分別提取轉化的大腸桿菌TOP10和根癌農桿菌GV3101中的質粒，均用Nco I和Nhe I，Bgl II和Nco I分別酶切鑑定。構建正確的載體用Nco I和Nhe I酶切後為3條帶，分子量分別為5847bp，3421bp，2151bp；因小麥TaP5CS基因在+1768bp處有Bgl II的酶切位點，所以構建正確的載體用Bgl II和Nco I酶切後應為2條帶，分別為9676bp和1768bp的片段。圖11中，1，3，5泳道為Bgl II和Nco I酶切，有1768bp和9676bp2條帶；2，4，6泳道為Nco I和Nhe I酶切的質粒，有5847bp，3421bp，2151bp 3條帶。將得到的構建正確的表達載體命名為pCAMBIA3301-TaP5CS。
2、轉pCAMBIA3301-TaP5CS擬南芥的獲得(1)轉化含有pCAMBIA3301-TaP5CS的根癌農桿菌GV3101通過蘸花侵染的方法轉化擬南芥。由於pCAMBIA3301-TaP5CS帶有抗除草劑的Bar基因，它在轉化時能隨目的基因一起轉入植物體，所以可以用含有PPT的培養基平板對轉化的植株進行篩選。
(2)平板篩選T1代種子經0.5％的次氯酸鈉消毒後，無菌水衝洗3遍，播種在含有0.7％的PPT除草劑的MS平板上，4℃春化3天，正常生長4天，結果如圖12所示，轉化後得到的T1代種子，轉基因苗含有抗除草劑的Bar基因，在含有PPT的培養基上能旺盛生長；非轉化苗在含PPT的培養基上不能正常生長、枯萎。圖12中，其中圖片A是B的放大照片，箭頭示轉基因苗。轉基因苗移栽到營養土中後能正常生長。轉基因苗轉接到MS平板上復壯3天後，移栽到土中。通過除草劑篩選，得到了45株抗除草劑的轉基因植株，在T1代，轉基因植株(陽性植株)和野生型對照及空載體對照植株(轉pCAMBIA3301的擬南芥植株)在植株形態和開花時間上沒有差異，只是轉基因植株的葉片比對照植株更綠。
(3)PCR篩選提取平板篩選獲得的轉基因植株的基因組DNA，用TaP5CS基因的修飾引物(P5CSNR和P5CSF)和Bar基因的引物分別進行PCR擴增，反應條件如下小麥TaP5CS基因的擴增用TaKaRa LA-Taq酶進行目的基因的擴增。10μl反應體系如下基因組DNA1.6μl(20μg/ul)，2×PCR緩衝液5.0μl，dNTP(25mM)0.16μl，P5CSNR和P5CSF各2μl(2μM)，LA-Taq酶0.1μl，ddH2O 1.14μl共10μl。反應程序為先94℃，5min；再30個循環(94℃ 1min，64℃ 4min)；然後72℃，20min；15℃保溫。
抗除草劑基因(Bar)的擴增用上海promega公司提供的Taq酶，20μl的反應體系10×PCR緩衝液2.0μl，dNTP(25mM)0.16μl，Mg2+(25mM)1.44μl，Bar基因的引物各3.2μl(2.0mM)，基因組DNA 4μl(20μg/ul)，ddH2O 5.8μl共20μl。反應程序為先94℃，5min；再22個循環(94℃ 30sec，68℃ 2min，)；然後72℃ 20min；15℃保溫。
陽性植株因為轉入了表達載體，所以應能夠擴增出2200bp和400bp的目的條帶，而未轉化植株則無PCR產物。轉pCAMBIA3301的植株只能擴增出400bp的Bar基因條帶，擴增產物的電泳圖如圖13所示，圖中A為小麥TaP5CS基因的擴增；B為除草劑Bar基因的擴增，泳道1，2，3，4，7，8，9，10，11，12為轉小麥TaP5CS基因的植株；6，13，14為野生型對照；5為轉空載體對照(轉pCAMBIA3301的植株)；M為200bp的marker。表明陽性植物中轉入了表達載體。
(4)轉化植株進行Southern blot檢測。
為了進一步證實PCR鑑定的準確性，對PCR檢測陽性的植株進行了Southern blot檢測分析，用TaP5CS的cDNA全長作探針。不同的轉化株系用EcoRI完全酶切，16小時，電泳轉膜雜交。Southern blot的結果如圖14所示，表明不同的株系轉化基因的拷貝數不同，轉基因株系12，14，16均為3個拷貝，株系18和株系40為1個拷貝，株系17為2個拷貝，株系19為多個拷貝。圖中泳道1和10是野生型對照，泳道2和11是轉空載體對照(轉pCAMBIA3301的植株)，其它泳道為轉pCAMBIA3301-TaP5CS株系，其中泳道3為(35STaP5CS-12)，泳道4為(35STaP5CS-18)；泳道5為(35STaP5CS-14)；泳道6為(35STaP5CS-16)；泳道7為(35STaP5CS-17)；泳道8為(35STaP5CS-19)；泳道9為(35STaP5CS-40)。
(5)T2代轉基因植株的篩選T2代轉基因種子播在含有7mg/L PPT的MS培養基上4℃春化3天，22℃條件下光照培養4天。結果表明T1代幼苗自交後產生的T2代種子在含有PPT的MS培養基上生長，帶有外源基因TaP5CS和除草劑Bar基因的植株能夠成活，統計結果表明有2/3的幼苗成活。
成活的T2代轉基因植株和空載體對照(轉pCAMBIA3301的T2代植株)相比，T2代轉基因植株蓮座葉片肥大，而轉pCAMBIA3301的T2代植株蓮座葉片小，T2代轉基因植株整個生育期長於空載體對照。此外，T2代轉基因植株分枝能力強，植株生長茂盛，如圖15所示，其中A圖是B圖蓮座葉片的放大；35STaP5CS為成活的T2代轉基因植株，p3301(CK)為轉pCAMBIA3301的T2代植株。
(6)Northern blot分析為了進一步證實小麥TaP5CS基因在擬南芥中是否表達及表達後是否和逆境脅迫相關，進行了Northern blot雜交分析。方法如下T2代轉TaP5CS基因的植株和轉pCAMBIA3301的植株(p3301)，播種在含7mg/L PPT的MS培養基上，4℃處理3天，光照培養4天，將能夠成活的幼苗轉移到不含PPT的MS培養基上，正常生長6天。野生型的種子直接播種到MS培養基上生長10天。分別將野生型，轉pCAMBIA3301的植株和TaP5CS轉基因植株的根系置於250mM的NaCl，50mM的ABA和8％的PEG 6000脅迫處理14小時，同時以未經脅迫處理的植株作為對照(Control)。用Trizol試劑提取擬南芥的葉片總RNA，進行Northern blot分析。其中，探針為TaP5CS的全長cDNA基因，用32P-dCTP進行標記。結果如圖16所示，圖中A為轉空載體對照(轉pCAMBIA3301的植株，p3301)；B為野生型(WT)；C為轉基因株系14(35STaP5CS-14)；D為轉基因株系16(35STaP5CS-16)，從圖中可以看出，在正常生長情況下，P5CS在轉TaP5CS擬南芥中就表達很強，只是不同的株系表達量不同，轉基因株系14(35STaP5CS-14)表達量強於轉基因株系16(35STaP5CS-16)，而野生型(WT)和轉pCAMBIA3301的植株沒有表達。在250mM的NaCl脅迫14小時後，轉基因35STaP5CS-14和35STaP5CS-16的P5CS表達量大大增強，而空載體和野生型對照內源擬南芥P5CS基因只有微量的表達。在50mM ABA脅迫下，轉基因株系的35STaP5CS-14和35STaP5CS-16的轉錄水平高於非脅迫處理，野生型對照和轉pCAMBIA3301的植株內源擬南芥P5CS基因僅有微量的表達。在PEG6000脅迫條件，35STaP5CS-16的P5CS轉錄水平大大增強，35STaP5CS-14雜交信號強度和非脅迫處理相當，35STaP5CS-14的初始RNA量遠遠低於p3301，所以儘管35STaP5CS-14雜交信號和轉pCAMBIA3301的植株雜交信號相當，但是35STaP5CS-14的表達水平高於轉pCAMBIA3301的植株和野生型的內源擬南芥P5CS基因的表達量。在50mM ABA脅迫條件下，轉錄水平高於對照但低於鹽脅迫。小麥TaP5CS在擬南芥中的表達分析表明，在35S強啟動子的作用下，小麥TaP5CS在擬南芥中高效表達，而且小麥TaP5CS基因的轉錄在鹽、ABA、PEG6000脅迫下有較高水平的積累。
實施例6、轉TaP5CS基因擬南芥的抗逆性鑑定1、脯氨酸含量的分析為了驗證表達小麥TaP5CS基因是否增加脯氨酸的合成，進行了不同脅迫處理條件下的脯氨酸含量的測定。T2代轉TaP5CS基因的植株和轉pCAMBIA3301植株，野生型，按照實施例5中步驟2的(6)的方法分別用250mM的NaCl，50mM的ABA和8％的PEG6000進行脅迫處理14小時，進行脯氨酸含量的測定。脯氨酸含量的測定採用茚三酮法(Bates L S.Rapiddetermination of free proline for water stress studies.Plant Soil，1973，39205-207)。結果如圖17所示，表明表達TaP5CS的擬南芥植株，無論在鹽、PEG、ABA的脅迫下均促進脯氨酸的積累，而轉pCAMBIA3301植株(p3301)和野生型(WT)對照無論在鹽脅迫還是PEG、ABA脅迫下脯氨酸積累量都很小。表達TaP5CS的擬南芥株系，在PEG脅迫下脯氨酸積累量大於鹽脅迫，鹽脅迫大於ABA脅迫下脯氨酸的積累。在不同的脅迫條件下轉TaP5CS基因植株脯氨酸含量均高於野生型對照(WT)和轉pCAMBIA3301植株。
2、耐鹽性鑑定及生理指標的測定1)鹽脅迫對幼苗早期根長的影響在含7mg/L PPT的MS培養基上生長4天的T2代轉TaP5CS基因幼苗和轉pCAMBIA3301植株以及在不含PPT的MS培養基上生長4天的野生型擬南芥幼苗，同時轉移到不同濃度的NaCl培養基上(0，5，100，200mM)，生長10天拍照，測定根長。鹽脅迫抑制擬南芥根的伸長如圖18所示，圖中B從A中選擇的代表性植株；1，2，3分別為野生型(WT)，轉TaP5CS基因株系16(35STaP5CS-16)和轉pCAMBIA3301植株(空載體對照)。鹽脅迫處理10天，在50mMNaCl的脅迫下，野生型和空載體對照根的伸長速率約為正常條件下的75％和80％，而轉TaP5CS基因植株的根仍保持非脅迫處理條件下的生長速率(表1)；在100mM的中鹽脅迫下野生型和空載體轉基因植株根的伸長為對照的50％，而轉基因35STaP5CS-16為對照的67％；在200mM的NaCl脅迫下，轉TaP5CS基因植株和對照根的伸長速率均被嚴重的抑制，葉片變紅，甚至白化，轉轉TaP5CS基因植株基因植株和野生型及空載體對照比，根的伸長速率仍有明顯的差異。而且對照植株有更多的白化苗。
表1 鹽脅迫對根長的影響

注小寫字母不同的表示差異顯著2)鹽脅迫對株高的影響在MS培養基上生長10天的T2代轉TaP5CS基因幼苗和轉pCAMBIA3301(p3301)植株以及在不含PPT的MS培養基上生長10天的野生型擬南芥幼苗，移栽到7cm的方形營養缽中，培養條件為長日照16小時光照/8小時黑暗。移栽12天，進行鹽處理，處理濃度為50，100，200mM NaCl，處理16天，選擇代表性的植株測量株高后，地上部在105℃殺青10分鐘，70℃烘至恆重，稱乾重。並採用張憲政(張憲政.作物生理研究法.北京農業出版社，1992，148-192)的方法測蓮座葉葉綠素含量，採用Bradford的方法(F.奧斯伯等.精編分子生物學實驗指南.科學出版社.2001，332-333)測定葉片可溶性蛋白含量，以牛血清蛋白(BSA)為標準蛋白。
株高測量結果如圖19所示，在正常情況下，表達小麥TaP5CS基因對擬南芥植株的高度沒有顯著的影響；在鹽脅迫條件下，株高受到影響，在不同的鹽濃度脅迫下，差異均達顯著水平，而且隨鹽脅迫程度的加重，植株高度受抑制的程度加重。圖19中，圖中A為0mM NaCl脅迫，B為50mM NaCl脅迫，C為100mM NaCl脅迫，D為200mM NaCl脅迫；1為轉基因株系16(35STaP5CS-16)，2為野生型(WT)，3為轉pCAMBIA3301植株。由表2的數據得知，在50mM NaCl的低鹽脅迫下，野生型和轉pCAMBIA3301植株株高分別被抑制達9.3％和18.9％，而轉基因35STaP5CS-14僅降低4.4％，35STaP5CS-16增加1.2％，在200mM NaCl的高鹽脅迫下，野生型和空載體對照(轉pCAMBIA3301植株)株高分別降低33％和29.2％，而轉基因株系35STaP5CS-14和35STaP5CS-16降低18.3％和15.1％，顯著高於轉空載體和野生型的對照。
表2 鹽脅迫對擬南芥轉基因植株高度(cm)的影響

注小寫字母不同的表示差異顯著乾重測量結果如表3所示，表達小麥TaP5CS基因增加了擬南芥植株的乾重，在正常生長條件下，轉TaP5CS的轉基因植株的乾重和野生型及空載體植株有顯著的差異，在不同濃度的鹽脅迫下，差異仍達顯著水平。在50mM的NaCl脅迫下，和非鹽脅迫下比，野生型和空載體對照乾重分別下降了21％和14％，而轉基因株系35STaP5CS-14和5STaP5CS-16分別增加了6.0％和5.5％；在中度鹽(100mM)脅迫下，野生型和空載體對照分別下降了39.8和41.5％，而轉基因株系35STaP5CS-14僅下降了12.3％，35STaP5CS-16沒有下降；在200mM的高鹽脅迫下，野生型下降了50.8％的乾重生物量空載體對照下降了47.4％的乾重生物量，而轉基因轉基因株系35STaP5CS-14僅下降了23.6％，35STaP5CS-16縮減了32.3％。
表3 鹽脅迫對擬南芥轉基因植株乾重的影響

注小寫字母不同的表示差異顯著可溶性蛋白含量的測定結果如圖20所示，在正常情況下，TaP5CS轉基因擬南芥葉片可溶性蛋白含量低於轉空載體pCAMBIA3301(p3301)對照和野生型(WT)，野生型和空載體可溶性蛋白分別為9.5mg/g乾重和7.1mg/g乾重，轉基因株系14(35STaP5CS-14)和轉基因株系16(35STaP5CS-16)分別為6.9和5.64mg/g乾重。在50mM的低鹽脅迫下，轉基因植株可溶性蛋白含量高於對照，和對照比轉基因株系14(35STaP5CS-14)和轉基因株系16(35STaP5CS-16)分別提高了45.36％和27.14％，而野生型和空載體對照降低了16.94％和5.71％。在100mM NaCl脅迫下，轉TaP5CS基因植株可溶性蛋白含量繼續增加，而空載體和野生型對照繼續下降。在200mM的高鹽脅迫下，野生型和空載體對照分別下降了39.28％和15.45％，而轉基因株系14(35STaP5CS-14)恢復到對照水平，而株系16(35STaP5CS-16)仍高於對照。
葉綠素含量測定的結果如圖21所示，正常情況下，轉TaP5CS基因植株葉綠素含量低於轉空載體的對照和野生型對照(WT)，在50mM的低鹽脅迫下，轉基因和非轉基因植株葉綠素含量均升高，野生型葉綠素上升幅度大於轉TaP5CS基因植株，空載體對照上升幅度小於轉基因株系14(35STaP5CS-14)和16(35STaP5CS-16)。在100mM的NaCl脅迫下，野生型和空載體葉綠素含量分別下降了26.65％和21.83％，而轉基因株系14(35STaP5CS-14)和16(35STaP5CS-16)葉綠素含量繼續上升，和對照比分別增加了11.74％和17.56％。在200mM的NaCl脅迫下，野生型和空載體葉綠素含量大幅度下降，和對照比分別下降了48.97％和53.93％，轉基因株系14(35STaP5CS-14)則下降了26.00％，株系16(35STaP5CS-16)保持對照水平。
實施例7、小麥TaP5CS基因在擬南芥中的反義表達(1)反義TaP5CS表達載體的構建TaP5CS基因反義表達長片段P5CS-2151含有TaP5CS完整的ORFcDNA全長序列。正向引物含有Nhe I酶切位點，反向引物含有Nco I酶切位點。正向引物anti-P5CS1F為5′ATGCTAGCATGGCCGGCGCCGACCCCAAC3′，反向引物anti-P5CS1R為5′TACCATGGTCATTGCAAAGGAAGGCTCT3′。PCR反應體系為先94℃ 5min；然後28個循環(94℃ 30sec，60℃ 1min，70℃ 4min)；再72℃延伸15min，15℃保溫。TaP5CS反義表達基因P5CS-262含有小麥TaP5CS基因的γ-穀氨酸磷酸還原酶(Gamma-glutamyl phosphatereductase)的保守域，位置從+1396bp到+1658bp，正向引物含有Pml I酶切位點，反向引物含有Bgl II酶切位點。正向引物anti-P5CS2F為5』CTCACGTGGCCTTATTACAACTAGAGAT3』(自序列1的5′端第1397到1416位核苷酸)，反向引物anti-P5CS2R為5』ATAAGATCTTTATGAACAAGCAACG3』(自序列1的5′端第1643到1658位核苷酸)；PCR反應體系為先94℃ 5分min；28個循環(94℃ 30sec，57℃ 1min，70℃ 2min)；再72℃延伸15min，15℃保溫。擴增得到的PCR產物在1％的瓊脂糖凝膠上電泳，結果如圖22所示，其中A為P5CS-2151的擴增結果；B為P5CS-262的擴增結果。TaP5CS基因反義表達長片段P5CS-2151和短片斷P5CS-262經PCR擴增分別獲得帶有Nco I和Nhe I酶切位點2151bp及帶有Pml I和Bgl II酶切位點262bp的片段。電泳完畢在紫外燈下切下目的條帶，用瓊脂糖凝膠試劑盒純化(購自天為時代)。純化後連到pGEM-T Easy載體上，分別用Vco I和Nhe I及PmlI和Bgl II雙酶切鑑定，分別對Nco I和Nhe I酶切得到2151bp、Pml I和Bgl II酶切得到262bp的質粒進一步用XL3730 NDA測序儀測序鑑定，將含有序列正確的P5CS-2151的質粒命名為pGEM-T-P5CS-2151，含有序列正確的P5CS-262的質粒命名為pGEM-T-P5CS-262。
載體pCAMBIA3301先用Nco I完全酶切，再用Nhe I部分酶切。回收去除GUS基因的載體條帶，得到去GUS基因的9293bp的載體片段，與用Nco I和Nhe I雙酶切pGEM-T-P5CS-2151得到的2151bp片段連接，將得到的連接產物，轉化大腸桿菌TOP10，提質粒，分別利用Nco I和NheI雙酶切和Pml I和Bgl II雙酶切鑑定，結構正確的質粒用Nco I和Nhe I會得到2kb，5kb和6kb 3種條帶，因Bgl II在基因內部+1768部位有切點，所以用Pml I和Bgl II雙酶切出1.7K和9K的條帶。雙酶切鑑定結果如圖23所示，其中1，2，3，4為含有長片段P5CS-2151的不同質粒，A為Bgl II和Pml I雙酶切，B為Nco I和Nhe I雙酶切，M為200bp。將酶切鑑定正確的質粒，利用引物對anti-P5CS1F和anti-P5CS1R進行PCR鑑定，得到結構正確的質粒(PCR產物大小為2151bp)，命名為pCAMBIA3301-P5CS-2151。
載體pCAMBIA3301用Pml I和Bgl II雙酶切得到去除GUS基因的載體片段。去除GUS基因的載體片段經回收純化，與用Pml I和Bgl II雙酶切pGEM-T-P5CS-262得到的262bp片段連接，將得到的連接產物，轉化大腸桿菌TOP10，提質粒，質粒用Bgl II和Pml I進行雙酶切，結構正確的質粒獲得262bp和9kb兩個條帶，因兩個片段大小差距太大，所以儘管兩個片段濃度相同，但清晰度差距很大，9kb的載體條帶很亮，而262bp的條帶很弱，為了進一步驗證，利用引物anti-P5CS2F和anti-P5CS2R對酶切鑑定正確的質粒進行PCR檢測。酶切及PCR檢測的結果如圖24所示，表明得到結構正確的質粒(PCR產物大小為262bp)，命名為pCAMBIA3301-P5CS-262。圖中A為質粒酶切(1，2，3，4，5，6，7，8，9，10為Bgl II和Pml I雙酶切)；B為質粒PCR(11，12，14，為帶有短片斷P5CS-262的質粒，13為pCAMBIA3301，15為水對照)；M為1kb的Marker。
(2)擬南芥的轉化將pCAMBIA3301-P5CS-2151和pCAMBIA3301-P5CS-262轉入農桿菌GV3101，用蘸花侵染(floral dipping)的方法轉化擬南芥。陽性植株的篩選同實施例5的步驟2。轉pCAMBIA3301-P5CS-2151的T1代植株共收到14960粒種子，通過0.05％的PPT篩選，共得到70株轉基因植株，轉化效率為4.7‰；轉pCAMBIA3301-P5CS-262的T1代植株共收到11435粒種子，通過0.05％的PPT篩選，共得到45株轉基因植株，轉化效率為3.9‰。提取經PPT篩選陽性植株的DNA，分別用引物對基因的特異引物引物對anti-P5CS1F和anti-P5CS1R、引物對anti-P5CS2F和anti-P5CS2R和除草劑Bar的引物分別進行PCR擴增，結果表明轉pCAMBIA3301-P5CS-262的PPT陽性植株中能擴增出2151bp和470bp的條帶，部分PPT陽性植株的擴增結果如圖25所示，圖中1、2、3、4、7、8、9、10、11、12、13、16、17、18、20、21、23、24、26、29、30、31、32、33為PCR檢測陽性植株；5、6、19、22為野生型；p為空載體對照(轉pCAMBIA3301的植株)，M為標準分子量200bpMarker。
轉pCAMBIA3301-P5CS-262的PPT陽性植株中能擴增出262bp和470bp的條帶，而未轉化植株無PCR產物。轉空載體的植株(轉pCAMBIA3301的植株)只能擴增出470bp的Bar基因條帶。部分植株的PCR檢測結果如圖26所示。圖26中1、2、3、4、6、7、8、9、14、15、18、19、20、21、22、23、25、26、27、32為轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株；22、24、29為野生型；13為空載體對照(轉pCAMBIA3301的植株)，M為標準分子量200bp的Marker。
實施例8、TaP5CS基因在擬南芥中的反義表達及反義表達轉基因植株的功能1、鑑定T1代轉化植株生長狀況轉pCAMBIA3301-P5CS-2151和轉pCAMBIA3301-P5CS-262的T1代植株，在株型和植株大小和空載體對照(轉pCAMBIA3301的植株)相比，轉pCAMBIA3301-P5CS-2151和轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株的分枝能力減弱，植株莖幹變細，顏色暗紅，開花、結莢期提前，果莢顏色暗紅，莢果變的短小，許多果莢不能正常結實，一些果莢能結實，但果莢中的種子數減少。上述症狀轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株比轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株明顯(圖27)。圖27中，A為空載體對照(轉pCAMBIA3301的植株)；B為轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株；C為轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株。
(2)根長的測定將在含7mg/L PPT的MS培養基上生長4天的轉pCAMBIA3301-P5CS-2151和轉pCAMBIA3301-P5CS-262的T1代幼苗，轉移到含有不同濃度NaCl(0，5，100，200mM)的MS培養基上，生長18天拍照，測定根長。結果如圖28和表4所示，表明在正常生長情況下，正義表達的轉pCAMBIA3301-TaP5CS株系12(35STaP5CS-12)根長長於空載體對照(轉pCAMBIA3301的植株)和反義表達的轉基因株系(轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株)，在50mM的NaCl脅迫下，所有株系的根長都大大縮短，但35STaP5CS-12根長長於轉pCAMBIA3301的植株和反義表達的轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株，35STaP5CS-12和轉pCAMBIA3301的植株及轉pCAMBIA3301-P5CS-262的植株根長有極顯著的差異；轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株又長於轉pCAMBIA3301-P5CS-262的植株，兩者之間有顯著的差異。在100mM的NaCl脅迫下，35STaP5CS12根長長於轉pCAMBIA3301植株及轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株，且差異顯著，轉pCAMBIA3301植株和轉pCAMBIA3301-P5CS-2151和轉pCAMBIA3301-P5CS-262的各株系間沒有明顯的差異。在高鹽脅迫下，35STaP5CS-12和轉pCAMBIA3301植株沒有明顯的差異，但是和轉pCAMBIA3301-P5CS-2151和轉pCAMBIA3301-P5CS-262的各株系間有明顯的差異。根長的實驗結果表明，表達小麥的TaP5CS增加了擬南芥的抗鹽性，小麥TaP5CS在擬南芥反義表達抑制了擬南芥內源AtP5CS的表達，抗鹽能力降低，特別是反義短片段P5CS-262對擬南芥根長的抑制作用大於反義長片段P5CS-2151。圖28中A為35STaP5CS12；B為轉pCAMBIA3301的植株；C為轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株；D為轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株。
表4 鹽脅迫對擬南芥轉基因植株根長的影響

注大寫字母不同表示表示差異極顯著，小寫字母不同表示差異顯著。
(3)脯氨酸含量的測定T2代轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株和轉pCAMBIA3301的植株(空載體對照)，播種在含7mg/LPPT的MS培養基上，4℃春化3天，光照培養4天，將能夠成活的幼苗轉移到不含PPT的MS培養基上，生長6天。野生型的種子直接播種到MS培養基上生長10天。用200mM的NaCl，50mM的ABA和8％的PEG6000進行脅迫處理16小時，用茚三酮法測定葉片脯氨酸含量，結果如圖29所示，表明在正常情況下，轉pCAMBIA3301-TaP5CS株系12(35STaP5CS-12)脯氨酸含量高於空載體對照(p3301)，空載體對照又高於轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株(P5CS-2151-2)和轉pCAMBIA3301-P5CS-262(P5CS-262-50)植株的各個株系，轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株的各個株系間沒有明顯的差異；在200mM NaCl脅迫下，和正常條件比，空載體對照脯氨酸含量增加了3倍，35STaP5CS-12增加了4.8倍，而轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株增加了3.8倍，轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株沒有變化。在8％的PEG脅迫下，過量表達的轉基因植株脯氨酸含量增加了10.3倍，空載體對照僅增加了5.2倍，而轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株分別增加了4倍和3倍；在50mM的ABA脅迫下，空載體對照和轉pCAMBIA3301-P5CS-2151植株和轉pCAMBIA3301-P5CS-262植株脯氨酸含量沒有增加，而35STaP5CS-12增加了7倍。表明小麥的TaP5CS基因在鹽、PEG和ABA脅迫下，轉錄本進一步積累，而內源擬南芥AtP5CS在短期鹽脅迫下表達量低，脯氨酸合成積累少。小麥TaP5CS在擬南芥中反義表達，可能干擾了擬南芥AtP5CS的表達，從而影響到脯氨酸的合成積累。
序列表160221012112260212DNA213小麥(Triticum aestivum L.)4001tctgcggcga cgaggaaaat acactgcaga taagagagag ggaggggcga gcgagcgaga 60cagggagagg cggcgcgccg agccagccag cccacaccgc ccgcggccat ggccggcgcc 120gaccccaacc ggagcttcat gaaggacgtg aagcgcatca tcatcaaggt gggcactgca 180gttatcacca gaaatgatgg aagactggct ttgggcagga ttggagccct gtgcgagcag 240gtcaaggatc ttaatgctca aggatatgag gtgattatgg tcacctcggg cgctgtcggt 300gtggggcgac agcggctcag gtaccggaag cttgtcaata gcagctttgc tgatctgcaa 360aagccacaga tggagctgga tggaaaggcg tgcgctgctg ttggtcagag tgggctgatg 420gcactctatg acatgttgtt tacccaactt gatgtgtcat catcacaact tcttgtgaca 480gatagtgact tcgacaattc aaatttccgg gagcgactcc gcgaaactgt cgagtcatta 540ttagagctta gagttattcc aatatttaat gaaaatgatg ccatcagtac gaggaaggct 600ccatacgagg attcatctgg tatattctgg gataatgaca gtttggcagg tctactggca 660ttggaactga aagctgatct ccttgttctg cttagtgatg tggatggcct ctacagcggt 720ccaccaagtg aaccttcatc aaagttaata catacttata tcaaggaaaa acattatcat 780gaaattactt ttggagacaa gtcccgtgtt ggtagaggtg gcatgacagc taaagtccaa 840gctgctgtgt gggcttcaac gggtggtgta cctgttgtta ttacaagtgg atgtgcatct 900cagagccttg ttaaagttct ccgtggggaa aaaattggta ctctttttca taaaaatgca 960agtttgtggg aaccatccaa ggagaccagt gtccgtgaaa tggctgttgc tgcacgggat1020tgttcaaggc gtctacagaa tttgtcatca gaggagcgca agaaaatatt gttagatgtt1080gcggatgctt tagaggcaaa tgaggattta attagatccg agaatgaagc agatttagca1140gcagcacatg aggctgggta tgagagtgct ttggtttcta gattgactct gaaaccagga1200aagatagcaa gccttgccaa atctgttcgc actcttgcga atatggaaga ccctattaac1260gagatactga aaaggacaga ggttgctgat ggtttagttc ttgagaaaac atcttgccct1320ttgggtgttc tattgattat ttttgagtcc cgacctgatg ccttagtcca gattgcgtct1380ttagccattc gaagtggtaa tggtcttctc ctaaaaggtg gaaaagaagc aatgagatca1440aacgcaatat tgcataaggt tataaccaat gctattcctg acaatgttgg cgaaaaattg1500attggcctta ttacaactag agatgaaatt gcggatttgc taaagcatga tgatgtcatt1560gatcttgtca ttccaagagg gagtaataag cttgttgctc aaatcaaatc atcaacaaag1620attcctgttc ttggccatgc tgatggtgtt tgtcatgtat atattgacaa atcagcagac1680atggatatgg caaaacgtat tgtgatggat gcaaaaattg attacccagc tgcctgcaac1740gcaatggaga cgttgcttgt tcataaagat cttatgaaga ctccagaact caatgacata1800ctagtagcac tcaagacagc aggagttaat ctttattgtg ggcctgttgc gcataaagta1860ttgggctacc caaaagcaga ttcattacat ctggagtaca gttctatggc ttgcacagtt1920gagatagttg atgatgtaca atcagcaatt gaccatatac atcgctatgg aagtgcacat1980acagactgtg tggtcactac agatgataaa gtagcagaga cctttctacg tcaagttgat2040agtgctgccg tattatacaa cgcgagtaca agattctccg atggtgctcg ttttggactc2100ggtgctgagg ttggcataag tacaggccgt atacatgcac gtggacctgt gggtgttgaa2160ggtcttttaa ctacacgatg gctcttacga gggaaagggc aagtggtgaa tggtgacaag2220gatgttgagt acacccataa gagccttcct ttgcaatgag 22602102
211716212PRT213小麥(Triticum aestivum L.)4002Met Ala Gly Ala Asp Pro Asn Arg Ser Phe Met Lys Asp Val Lys Arg1 5 10 15Ile Ile Ile Lys Val Gly Thr Ala Val Ile Thr Arg Asn Asp Gly Arg20 25 30Leu Ala Leu Gly Arg Ile Gly Ala Leu Cys Glu Gln Val Lys Asp Leu35 40 45Asn Ala Gln Gly Tyr Glu Val Ile Met Val Thr Ser Gly Ala Val Gly50 55 60Val Gly Arg Gln Arg Leu Arg Tyr Arg Lys Leu Val Asn Ser Ser Phe65 70 75 80Ala Asp Leu Gln Lys Pro Gln Met Glu Leu Asp Gly Lys Ala Cys Ala85 90 95Ala Val Gly Gln Ser Gly Leu Met Ala Leu Tyr Asp Met Leu Phe Thr100 105 110Gln Leu Asp Val Ser Ser Ser Gln Leu Leu Val Thr Asp Ser Asp Phe115 120 125Asp Asn Ser Asn Phe Arg Glu Arg Leu Arg Glu Thr Val Glu Ser Leu130 135 140Leu Glu Leu Arg Val Ile Pro Ile Phe Asn Glu Asn Asp Ala Ile Ser145 150 155 160Thr Arg Lys Ala Pro Tyr Glu Asp Ser Ser Gly Ile Phe Trp Asp Asn165 170 175Asp Ser Leu Ala Gly Leu Leu Ala Leu Glu Leu Lys Ala Asp Leu Leu180 185 190Val Leu Leu Ser Asp Val Asp Gly Leu Tyr Ser Gly Pro Pro Ser Glu195 200 205Pro Ser Ser Lys Leu Ile His Thr Tyr Ile Lys Glu Lys His Tyr His210 215 220Glu Ile Thr Phe Gly Asp Lys Ser Arg Val Gly Arg Gly Gly Met Thr225 230 235 240Ala Lys Val Gln Ala Ala Val Trp Ala Ser Thr Gly Gly Val Pro Val245 250 255Val Ile Thr Ser Gly Cys Ala Ser Gln Ser Leu Val Lys Val Leu Arg260 265 270Gly Glu Lys Ile Gly Thr Leu Phe His Lys Asn Ala Ser Leu Trp Glu275 280 285Pro Ser Lys Glu Thr Ser Val Arg Glu Met Ala Val Ala Ala Arg Asp290 295 300Cys Ser Arg Arg Leu Gln Asn Leu Ser Ser Glu Glu Arg Lys Lys Ile305 310 315 320Leu Leu Asp Val Ala Asp Ala Leu Glu Ala Asn Glu Asp Leu Ile Arg325 330 335Ser Glu Asn Glu Ala Asp Leu Ala Ala Ala His Glu Ala Gly Tyr Glu340 345 350Ser Ala Leu Val Ser Arg Leu Thr Leu Lys Pro Gly Lys Ile Ala Ser
355 360 365Leu Ala Lys Ser Val Arg Thr Leu Ala Asn Met Glu Asp Pro Ile Asn370 375 380Glu Ile Leu Lys Arg Thr Glu Val Ala Asp Gly Leu Val Leu Glu Lys385 390 395 400Thr Ser Cys Pro Leu Gly Val Leu Leu Ile Ile Phe Glu Ser Arg Pro405 410 415Asp Ala Leu Val Gln Ile Ala Ser Leu Ala Ile Arg Ser Gly Asn Gly420 425 430Leu Leu Leu Lys Gly Gly Lys Glu Ala Met Arg Ser Asn Ala Ile Leu435 440 445His Lys Val Ile Thr Asn Ala Ile Pro Asp Asn Val Gly Glu Lys Leu450 455 460Ile Gly Leu Ile Thr Thr Arg Asp Glu Ile Ala Asp Leu Leu Lys His465 470 475 480Asp Asp Val Ile Asp Leu Val Ile Pro Arg Gly Ser Asn Lys Leu Val485 490 495Ala Gln Ile Lys Ser Ser Thr Lys Ile Pro Val Leu Gly His Ala Asp500 505 510Gly Val Cys His Val Tyr Ile Asp Lys Ser Ala Asp Met Asp Met Ala515 520 525Lys Arg Ile Val Met Asp Ala Lys Ile Asp Tyr Pro Ala Ala Cys Asn530 535 540Ala Met Glu Thr Leu Leu Val His Lys Asp Leu Met Lys Thr Pro Glu545 550 555 560Leu Asn Asp Ile Leu Val Ala Leu Lys Thr Ala Gly Val Asn Leu Tyr565 570 575Cys Gly Pro Val Ala His Lys Val Leu Gly Tyr Pro Lys Ala Asp Ser580 585 590Leu His Leu Glu Tyr Ser Ser Met Ala Cys Thr Val Glu Ile Val Asp595 600 605Asp Val Gln Ser Ala Ile Asp His Ile His Arg Tyr Gly Ser Ala His610 615 620Thr Asp Cys Val Val Thr Thr Asp Asp Lys Val Ala Glu Thr Phe Leu625 630 635 640Arg Gln Val Asp Ser Ala Ala Val Leu Tyr Asn Ala Ser Thr Arg Phe645 650 655Ser Asp Gly Ala Arg Phe Gly Leu Gly Ala Glu Val Gly Ile Ser Thr660 665 670Gly Arg Ile His Ala Arg Gly Pro Val Gly Val Glu Gly Leu Leu Thr675 680 685Thr Arg Trp Leu Leu Arg Gly Lys Gly Gln Val Val Asn Gly Asp Lys690 695 700Asp Val Glu Tyr Thr His Lys Ser Leu Pro Leu Gln705 710 71權利要求
1.植物抗逆性相關蛋白，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2；2)將序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列經過一或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關的蛋白質。
2.根據權利要求1所述的蛋白，其特徵在於所述植物抗逆性相關蛋白是具有序列表中的SEQ ID №2的胺基酸殘基序列的蛋白質。
3.權利要求1或2所述植物抗逆性相關蛋白的編碼基因。
4.根據權利要求2所述的基因，其特徵在於所述植物抗逆性相關蛋白的編碼基因，具有下述核苷酸序列之一1)序列表中SEQ ID №1的DNA序列；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質序列的多核苷酸；3)在高嚴謹條件下可與序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列雜交的核苷酸序列。
5.含有權利要求3或4所述植物抗逆性相關蛋白的編碼基因的表達載體。
6.含有權利要求3或4所述植物抗逆性相關蛋白的編碼基因的細胞系。
7.含有權利要求3或4所述植物抗逆性相關蛋白的編碼基因的宿主菌。
8.一種利用權利要求3或4所述植物抗逆性相關蛋白的編碼基因增強植物抗逆性的方法，是將所述植物抗逆性相關蛋白編碼基因插入真核細胞表達載體，得到含有所述植物抗逆性相關蛋白編碼基因的重組表達載體，將該重組表達載體導入目的植物，從表達所述植物抗逆性相關蛋白的植株或所述植物抗逆性相關蛋白表達量增加的植株中篩選得到抗逆性增強的植株。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於所述重組表達載體為將所述植物抗逆性相關蛋白編碼基因插入去除GUS基因的pCAMBIA3301得到的pCAMBIA3301-TaP5CS。
全文摘要
本發明公開了一種植物抗逆性相關蛋白及其編碼基因與應用。本發明所提供的植物逆性相關蛋白，是具有下述胺基酸殘基序列之一的蛋白質1)序列表中的SEQ ID №2的序列；2)將序列表中SEQ ID №2的胺基酸殘基序列經過一或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗逆性相關的蛋白質。本發明的植物抗逆性相關蛋白及其編碼基因可增強植物抗逆性，特別是增強植物對鹽脅迫的抗性。
文檔編號C12N15/29GK1740191SQ20051010291
公開日2006年3月1日 申請日期2005年9月13日 優先權日2005年9月13日
發明者賈繼增, 馬麗清, 高麗鋒 申請人:中國農業科學院作物科學研究所