一種雙歧桿菌新菌株及其發酵製備方法與應用的製作方法

2023-05-08 23:12:21

專利名稱：：一種雙歧桿菌新菌株及其發酵製備方法與應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及微生物
技術領域：
，具體地說是一株新的、可產細菌素或抑菌物質的雙歧桿菌亞種菌株，本發明還涉及該菌株的發酵製備方法以及和應用。
背景技術：
：近年來，由於食品安全的需要，微生態製劑的研究和開發得以較快發展，但目前使用的菌種大都為乳酸桿菌、酵母菌和芽胞桿菌，卻很少使用雙歧桿菌。原因在於通常雙歧桿菌營養要求非常高，生長條件須嚴格厭氧，高昂的培養成本和嚴格的生產條件使目前大部分雙歧桿菌不能符合研發乃至實際生產的要求。但雙歧桿菌在微生態製劑的研究方面仍備受親睞，除了它具有常見益生菌的生理功能如促進營養物質吸收利用、生物屏障和生物拮抗作用、免疫調節作用外，還具有一般益生菌所沒有的優良特性。國內外有研究表明雙歧桿菌能產生結合膽酸水解酶、抑制內毒素產生(解毒)、產生細菌素和廣譜抗菌作用；雙歧桿菌具有提高機體抗體水平，促進巨嗜細胞的吞噬能力和消化能力，提高機體抗感染力和預防、殺傷腫瘤細胞的作用；雙歧桿菌能通過降低腸道pH值或通過雙歧桿菌對有害菌在空間、營養上的屏蔽竟爭作用，抑制其在腸道的定植和生長；促進各種礦物質如Ca、Fe、Mg、Zn的吸收利用，降低血清膽固醇和甘油三酯的水平；雙歧桿菌還具有消除自由基、羥自由基、過氧脂質以及腐敗細菌產生的吲哚、胺、酚類，降低腸道氣味等作用，進而可顯著改善伺養環境；雙歧桿菌能合成維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12、煙酸和葉酸等多種維生素，補充營養，並能控制內毒素血症；還可以降低亞硝酸鹽等有害物質的形成進而改善動物產品品質。以上種種優良特性使其在替代和減少抗生素使用、減少動物疫病的發病率和死亡率、保證畜產品安全綠色和公共健康等方面具有獨特的優勢。在益生菌的選育方面，國內外眾多學者均指出，益生菌必需具備耐酸、耐膽鹽及對腸上皮細胞具有粘附性等特點，且菌株最好來源於本種動物，這樣更有利於其在腸道中的定植。目前，大多數研究者熱衷於動物源的益生菌菌種的篩選工作，但是很少有系統研究已得菌株抗逆性(耐酸、耐膽鹽等)、生物學特性(抑菌活性、粘附特性等)、發酵特性和後加工工藝(即製劑)。在畜禽生產中，應用微生物飼料添加劑已有很多研究，也有很好的應用效果，但目前使用菌種主要是乳酸桿菌、芽胞桿菌和酵母等微生物。如張曰俊等(2005)給16周齡肉仔雞日糧添加乳酸桿菌、芽胞桿菌和酵母組成的複合微生物飼料添加劑可顯著降低雞空腸和直腸中大腸桿菌數量(p<0.05),能顯著提高日增重和飼料轉化效率b<0.05)。國內對雙歧桿菌製劑的研究起步較晚，在動物上的應用較少，僅見到一些試驗研究報告，特別是在動物科學領域中關於其抗逆性、發酵特性、產品製劑的應用效果以及對畜產品品質的影響報導較少。
發明內容本發明的第一個目的在於提供一株短雙歧桿菌新菌株BB2。本發明的第二個目的在於提供短雙歧桿菌BB2的發酵方法。本發明的第三個目的在於提供短雙歧桿菌凍幹製劑在畜禽生產上的用途。為實現上述目的，本發明首先提供一株短雙歧桿菌新菌株BB2，其具有對逆環境耐受性強、粘附性強、生長快、發酵液酸度高、生物量大、抑菌活性好等優點。本發明從雞腸道中分離、經定向初篩和復篩得到一株雙歧桿菌。其細胞形狀呈短棒狀，在改良PTYG培養基上，菌落為針尖大小淺乳白色圓形凸起，革蘭氏染色陽性；不生孢子，無鞭毛，不運動；兼性厭氧；不需要營養極其豐富的培養基；發酵分解糖代謝，乙酸、乳酸物質的量之比近3:2;接觸酶陰性，生長溫度25-39。C。菌株BB2通過法國生物梅裡埃公司API20A微生物鑑定系統鑑定97.1%(該系統中，待鑑定的菌種特徵與某已知菌種的符合率〉95%時為高鑑別準確率)為短雙歧桿菌A)^o^cten'wm萬wve2。BB2生化特徵和形態特徵以及API20A鑑定結果分別見表1和表2。表lBB2生化特徵及形態特徵tableseeoriginaldocumentpage5利用改良PTYG液體培養基(具體配方見後部分的發酵方法)，用通用常規方法對雞源短雙歧桿菌BB2進行了耐酸、耐膽汁酸鹽、耐胃蛋白酶試驗、發酵試驗和抑菌活性測定[1，2，3，4]。BB2對不同酸度耐受存活率及多重比較結果見表3，BB2耐膽酸鹽、耐胃蛋白酶及其生長曲線和發酵特性分別見圖1~4。_表3BB2對不同酸度耐受存活率、活菌數及多重比較_tableseeoriginaldocumentpage560min3.8X1084.8x1085.1x1085.3x108處理56.89±3.25Jj82.22±2.67EFGfg85.33±2.51DEFGdef90.67±2.51BCDbed90min3.2x1084.6x1084.8x1085.1xIO8處理42.22±3.94Kk78.67±4.20GHgh80.89±3.08FGHfg86.67±2.24CDEFdef120min2.4x1084.4x1084.6x1084.9x108注數據右側含有不同小寫字母(a,b,c，d，e,f)的表示差異顯著(p0.05)，含有不同大寫字母(A,B,C，D，E，F)的數據表示差異極顯著(p<0.01)從表3可見，酸度越低，BB2活菌數下降越大。在pH2.5pH3.5環境下，處理120min,存活率在80%左右(處理前活菌數5.65x108CFU/mL),表明BB2具有良好的耐酸性。該結果好於王建業等(2000)[5]pH3.5條件下保溫2h其存活率在40%以上的結果。即使在pH1.5條件下，處理120min，BB2的存活率降低到42.22%,其活菌數仍高達2.4x108CFU/mL(處理前活菌數5.65x108CFU/mL)，因而仍然能夠保證有足夠多的BB2活菌通過胃部進入腸道。膽酸鹽耐受試驗中，接種後培養基中的初始活菌數是6.8x106CFU/mL。從圖1可見，培養基中的活菌數隨著膽酸鹽濃度的增加而逐漸降低。當牛膽酸鹽濃度在02.0mg/mL時，BB2活菌數較初始值均有不同程度的增加，lmg/mL時的活菌數增加了12倍多。可見，BB2具有良好的耐膽鹽特性。耐胃蛋白酶試驗結果如圖2。在含胃蛋白酶2.5，5,7.5mg/mL的改良PTYG液體培養基中作用2h後，存活率分別為81.82%,72.12%和43.64%;當濃度為10mg/mL時，驟降至3.03%,但是各試驗組活菌數均在107CFU/mL(處理前活菌數4.13x108CFU/mL)以上，5mg/mL胃蛋白酶作用2h後，BB2的活菌數仍高達2.975xl08CFU/mL，說明BB2具有良好的耐胃蛋白酶特性。圖3為BB2的生長曲線圖。550nm和600nm波長下的吸光值(該指標反映了BB2發酵時的生物量或總菌量)以及活菌數是雙歧桿菌生長情況常用檢測指標。由圖3可見，BB2生長沒有明顯的遲滯期，從接種開始便有一定幅度的增長，從2h即進入對數生長期，直到4h達到最大生長量，然後進入平臺期，最大活菌數達到5xlSCFU/mL(對數值為8.7)，與其他種屬雙歧桿菌相比表現出生長快和生物量大的優點。在改良PTYG液體培養基中發酵015h的pH、葡萄糖消耗量、乳酸產量和對白痢沙門抑菌活性的變化規律見圖4。可見，發酵液pH在2h後迅速下降，在6h末已由初始的6.76下降為4.09，之後略有下降，9h後穩定在3.63.7之間；乳酸的產量從2h10h有較大幅度增加，之後穩定在18.6mmol/L，因此具有發酵液酸度高的優點；BB2對雞白痢沙門耐藥菌株的抑菌效果05h略有增加，5h後迅速增加直到9h末，之後進入平穩期，其最大抑菌圈直徑為15.9mm，具有強抑菌能力。抑菌特性研究表明，BB2的抑菌活性與菌體生物量成正相關，相關係數W為0.6635,乳酸產量和抑菌活性存在很強的相關性(相關係數f為0.9505)。使用150^1的發酵上清液(乳酸含量為18.64mmol/L)以及150|ilpH3.5的乳酸(生理鹽水稀釋)進行抑菌實驗，指示菌為白痢沙門氏菌[(S.戶〃oramCVCC79301)G-，中國獸醫藥品監察所菌種保藏中心]。結果如圖5和圖6所示，BB2的上清液能產生(15.90士0.36mm)的抑菌圈，而乳酸僅能產生較小而模糊的抑菌圈。這表明，BB2抑菌活性主要是抗菌活性物質作用的結果，而不是乳酸。BB2對於常見病原菌及動物腸道常見菌的抑菌範圍測試結果見表4，結果顯示，BB2對革蘭氏陰性菌和部分革蘭氏陽性菌等有抑菌表現，是一具有廣譜抑菌活性的優秀菌株。表4BB2的抑菌譜指示菌金黃色葡萄球菌(iS鄉/z盧COCCUSaw"wssi/fo/.1.801)金黃色葡萄球菌0Sa//^foawrew5sw力平1.879)金黃色葡萄球菌(&a//yfococcusCICC10001)金黃色葡萄球菌(5"鄉/zy/ococcusflwrezw^4wrew5CVCC1885)銅綠假單胞菌am/g/waaCICC20236)革蘭氏染原發酵上清色特性液(mtn)G+12.57±0.37G+13.11±0.42G+13.07±0.25G+12.20士0.42G_13.43±0.15中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)中國普通微生物菌種保藏中心(CGMCC)中國工業微生物菌種保藏中心(CICC)中國獸醫微生物菌種保藏中心(cvcc)中國工業微生物菌種保藏中心(CICC)tableseeoriginaldocumentpage8由上述可見，本發明短雙歧桿菌BB2具有對逆環境耐受性強、生長快、發酵液酸度高、生物量大、有良好的抑菌活性等眾多優點。BB2的粘附特性是通過以下途徑實現的取間歇攪拌培養10-15h的短雙歧桿菌發酵液分別作稀釋或濃縮等不同處理，以植物乳桿菌、糞腸球菌和乳酸乳球菌為對照進行培養和粘附試驗。細胞培養釆用人結腸癌細胞Caco-2細胞(人結腸腺癌細胞系Caco-2細胞株，ATCCHTB-37,美國ATCC全球生物資源中心)，Caco-2細胞具有與小腸上皮細胞相同的微絨毛結構和緊密連接。使用DMEM高糖細胞培養液(商用培養基)，在37°C、5%032~95%空氣的二氧化碳細胞培養箱中恆溫孵育，待細胞生長至鋪滿板面約80%用0.25。/。Trypsin/EDTA消化液消化，以10VmL傳代，每2d更換培養液。在6孔細胞培養板(coming)中放入洗淨無菌的蓋玻片，每孔接入lmL調整好濃度的細胞懸液，每24d更換培養液，以無菌PBS洗滌3次，每孔加入12mL的BB2各種處理液與12mL的DMEM細胞培養液(商用培養基)的混合液，37~40"€,5%(:02~95%空氣中孵育30180min。取出蓋玻片用無菌PBS洗滌三次，再用甲醇固定813min，革蘭氏染色，顯微鏡下隨機挑選20個視野，計數50個細胞上粘附的細菌數，每個處理作3個重複。BB2疏水性及時間、濃度對BB2粘附的影響見表5-表5不同菌株疏水性測定結果的比較-7。tableseeoriginaldocumentpage9注數字右側標不同字母(a、b)表示差異顯著(P〈0.05)表5說明，BB2和植物乳桿菌的疏水性顯著好於糞腸球菌和乳酸乳球菌。表6BB與Caco-2細胞作用不同時間的粘附性tableseeoriginaldocumentpage9注數字右側標不同字母(A、B、C)表示差異極顯著(P〈0.01)表6說明，BB2菌的隨著與Caco-2細胞作用時間的增加，其粘附性極顯著增加，表明其具有極好的粘附性。表7不同濃度BB2發酵液對Caco-2細胞粘附的影響tableseeoriginaldocumentpage9注數字右側標不同字母(A、B、C、D)表示差異極顯著(P〈0.01)表7說明，隨著BB2菌濃度的增加，BB2菌對Caco-2細胞的粘附性極顯著增加，表明其具有極好的粘附性，且與濃度相關。疏水性是決定細菌非特異性粘附到各種生物和非生物表面及界面的最重要動力之一。一般而言，疏水性強的菌株對腸上皮細胞有著較強的粘附力。從表5可看出，BB2與植物乳桿菌的疏水性較高且無顯著差異，而顯著高於糞腸球菌和乳酸乳球菌，表明BB2的粘附力最強，其次為植物乳桿菌。從表6和表7可看出，BB2的粘附特性對孵育時間和菌液濃度有依賴性。傳統觀點認為只有活菌才有粘附能力，但BB2菌於IOO'C水洛10min後粘附數與不處理組相比沒有顯著差異，而65'C水浴30min後粘附數與IO(TC水洛10min在統計學上也沒有顯著差異，這說明IO(TC滅活的BB2雖無活性，但菌體上的粘附位點活性仍然存在。BB2經紫外線照射30min後對Caco-2細胞的粘附數與未照射相比無顯著差異，說明紫外線照射滅活對BB2的粘附性能無明顯影響，也說明在其發酵液中可能存在著一種粘附物質。由此可見，BB2具有很強的腸道粘附特性，並且這種粘附性能不受高溫和紫外線影響。BB2的安全性是通過以下途徑實現的用小鼠和AA肉雞作為模型動物，來試驗BB2的安全性。準備18~22g小鼠40隻，公母各半，隨機分為四個處理組，每組10隻，馴養7天後，釆用腹腔注射的方式進行攻毒試驗，試驗期21天。試驗分為4個處理組，對照組注射生理鹽水lml，B組注射BB2發酵液(lSCFU/mL)lmL，C組注射大腸桿菌(107/mL)lmL,D組注射0.5mL的BB2的發酵液和0.5mL的大腸桿菌。灌服後觀察其中毒症狀，看是否出現呼吸困難、抽搐、肢體麻痺等。準備80隻AA肉雞，隨機分為四組，每組20隻，育雛一周後在甸料中拌入BB2發酵液和/或大腸桿菌發酵液，濃度和各組處理同上。小鼠和肉雞安全性試驗結果見表8和表9。_表8BB2對小鼠的安全性試驗結果_小鼠馴養A組B組C組D組天數(生理鹽水)(BB2發酵(大腸桿菌組)(BBZ發酵液和大腸杆液)菌)8健活健活健活健活9健活健活健活健活12健活健活精神萎靡食欲不振健活15健活健活死亡1隻健活18健活健活死亡1隻食欲不振21健活健活健活精神萎靡未死亡表9BB2對肉雞的安全性試驗結果肉雞飼養A組B組C組D組天數(生理鹽水)(BB2發酵(大腸桿菌組)(BB2發酵液和大腸杆液)菌)7健活健活死亡1隻精神萎靡食欲不振10健活健活死亡1隻死亡1隻14健活健活精神萎靡食欲不振死亡1隻21健活健活死亡1隻食欲不振28健活健活精神萎靡未死亡精神萎靡未死亡35健活健活食欲不振健活42健活健活健活健活從表8和表9可明顯看出，BB2對於小鼠和肉雞是安全的，所有受試小鼠和肉雞均健活；D組的情況總體好於C組。從各組隨機選取5隻小鼠、5隻肉雞進行解剖，B組與對照組相比，各臟器未見異樣，D組臟器病變明顯弱於C組。由此可見BB2能緩解大腸桿菌給小鼠和肉雞帶來的不良影響，一定程度上減少了死亡率。綜上所述，一系列試驗證明BB2具有對逆性環境(不良生存環境)耐受性強、粘附性強、生長快、發酵液酸度高、生物量大、抑菌活性好等眾多優點，並且對小鼠、肉雞等無任何毒害作用，有極高的應用價值。該雞源短雙歧桿菌BB2已於2009年7月22日保藏於《中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心》(地址北京巿朝陽區大屯路甲3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101),其建議分類命名為雙歧桿菌(5折fifo6a"ehwww.)，保藏號為CGMCCNo.3200。本發明還提供短雙歧桿菌BB2的發酵方法。發酵培養基配製為葡萄糖0.72.1%、大豆蛋白腖0.21.0%、胰蛋白腖0.2~1.0%、大豆肽0.3~1.0%、玉米渣0.5~1.5%、檸檬酸銨0.3~1.2%、混合鹽溶液0.4%(無水CaCl20.2g，KH2PO41.0g,K2HPO41.0g，MgSO4.7H2O0.48g，NaHCO310.0g,NaCl2.0g，蒸餾水1000mL。)、消泡劑M0.05~0.1%，pH為6.2~7.4。經121。C高溫蒸汽消毒2030min，降溫至2540。C時，向其中接種菌齡1530h的種子液1.5~3.5%(v/v，種子液含菌量為108CFU/mL)，在254(TC溫度下，每間隔23h進行100~130rpm攪拌，持續510min。接種1015h為發酵終點，可放罐。將BB2發酵液，經離心收集菌泥加入冷凍乾燥保護劑，再經冷凍乾燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑。將本發明短雙歧桿菌BB2應用於肉雞蛋雞生產，結果表明，其能明顯促進和刺激胃腸道中有益菌的生長；並能顯著抑制大腸桿菌和其他一些好氧菌(如沙門氏菌)的生長繁殖，極顯著降低了腹瀉率、同時它的使用顯著提高了動物生產性能、改善了畜舍環境和水產動物水質，提高了動物免疫力或抗病力。因此可將本發明菌株或其發酵液製成菌劑用於家禽、牲畜以及水產的飼養，例如單獨或與適當的其它成分製成飼料添加劑，或者是直接添加到飼料中製成含有該成分的詢料，來提高生產能力。也可以將本發明菌株或其發酵液製成生物獸藥部分代替抗生素提高動物的抗病力。因此本發明具有很高的社會效益、經濟效益和生態效益。本申請中涉及到的百分號"％"，若未特別說明，是指質量百分比；溶液的百分比，除另有規定外，是指溶液100mL中含有溶質若干克；液體之間的百分比，是指在20'C(常溫)時容量的比例。本發明提供的短雙歧桿菌BB2，具有對逆環境耐受性強、生長快、發酵液酸度高、生物量大、有抑菌活性等優點。本發明提供的發酵方法適合BB2的大規模培養。本發明短雙歧桿菌製劑可以部分替代抗生素，消除藥物殘留，提高畜禽產品品質；可以提高動物生產性能、提高免疫力或抗病力、降低動物死淘率、減少腹瀉率；還可以淨化畜舍環境。本發明具有很高的社會效益、經濟效益和生態效益。說明書附圖圖1顯示的是不同濃度膽鹽對BB2的影響；圖2顯示的是不同濃度胃蛋白酶對BB2的影響；圖3顯示的是BB2生長曲線；圖4顯示的是BB2015h發酵特性變化曲線；圖5顯示的是BB2發酵液上清液對雞白痢沙門氏菌的抑菌作用；圖6顯示的pH乳酸對雞白痢沙門氏菌的抑菌作用。具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例l發酵方法A1用葡萄糖0.7%、大豆蛋白腖0.6%、胰蛋白腖0.4%、大豆肽0.3%、玉米渣1.2%、杼檬酸銨0.5%(以上均為質量體積比m/V)、混合鹽溶液0.4%(V/V)、消泡劑M0.05%(V/V)(北京化工集團，型號2118)按比例配製成發酵培養劑。經12rC高溫蒸汽消毒20min，降溫至37'C時，向其中接種菌齡15h的種子液1.5%,在35。C溫度下，每間隔23h進行100rpm攪拌，持續10min。接種15h為發酵終點，可放罐，得到短雙歧桿菌BB2活菌數為4.76x108CFU/mL。經離心收集菌泥加入冷凍乾燥保護劑(水蘇糖1.8%、穀氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%)，再經冷凍乾燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑，活菌數約為125億/g。其中，所述的混合鹽溶液的成分為CaCl20.2g，MgS04'7H200.48g,K2HPO41.0g,KH2PO41.0g,NaHCO310.0g，NaC12.0g，加蒸餾水定容至1000mL，混勻。實施例2發酵方法A2用葡萄糖1.2%、大豆蛋白腖0.3%、胰蛋白腖0.7%、大豆肽0.5%、玉米渣1.0%、檸檬酸銨0.6%(以上均為質量體積比m/V)、加入實施例1所用的混合鹽溶液0.5%(V/V)、消泡劑M0.05。/。(V/V)按比例配製成發酵培養劑。經12rC高溫蒸汽消毒20min，降溫至37。C時，向其中接種菌齡25h的種子液2.5%，在35。C溫度下，每間隔23h進行1OOrpm攪拌，持續10min。接種15h為發酵終點，可放罐，得到短雙歧桿菌BB2活菌數為5.19x108CFU/mL。經離心收集菌泥加入冷凍乾燥保護劑(水蘇糖1.8%、穀氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%),再經冷凍乾燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑，活菌數約為131億/g。實施例3發酵方法A3用葡萄糖1.5%、大豆蛋白腖0.5%、胰蛋白腖0.7%、大豆肽0.4%、玉米渣0.6%、檸檬酸銨0.8%(以上均為質量體積比m/V)、加入實施例1所用的混合鹽溶液0.3%(V/V)、消泡劑M0.05。/。(V/V)按比例配製成發酵培養劑。經121'C高溫蒸汽消毒20min,降溫至37'C時，向其中接種菌齡12h的種子液2.0°/。，在35。C溫度下，每間隔2~3h進行120rpm攪拌，持續10min。接種l化為發酵終點，可放罐，得到短雙歧桿菌BB2活菌數為6.47x108CFU/mL。經離心收集菌泥加入冷凍乾燥保護劑(水蘇糖1.8%、穀氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%),再經冷凍乾燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑，活菌數約為150億/g。實施例4發酵方法A4用葡萄糖2.1%、大豆蛋白腖0.2%、胰蛋白腖1.0%、大豆肽1.0%、玉米渣0.5%、梓檬酸銨0.3%(以上均為質量體積比m/V)、加入實施例1所用的混合鹽溶液0.45%(V/V)、消泡劑M0.05。/。(V/V)按比例配製成發酵培養劑。經12rC高溫蒸汽消毒20min，降溫至37'C時，向其中接種菌齡12h的種子液2.0。/。，在35。C溫度下，每間隔23h進行130rpm攪拌，持續5min。接種14h為發酵終點，可放罐，得到短雙歧桿菌BB2活菌數為6.23x108CFU/mL。經離心收集菌泥加入冷凍乾燥保護劑(水蘇糖1.8%、穀氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%),再經冷凍乾燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑，活菌數約為146億/g。實施例5發酵方法A5用葡萄糖1.8%、大豆蛋白腖1.0%、胰蛋白腖0.2%、大豆肽0.5%、玉米渣1.5%、檸檬酸銨1.2%(以上均為質量體積比m/V)、加入實施例1所用的混合鹽溶液0.35%(V/V)、消泡劑M0.05。/。(V/V)按比例配製成發酵培養劑。經12rC高溫蒸汽消毒20min,降溫至37。C時，向其中接種菌齡12h的種子液2.0。/。，在35。C溫度下，每間隔23h進行llOrpm攪拌，持續10min。接種14h為發酵終點，可放罐，得到短雙歧桿菌BB2活菌數為5.81x108CFU/mL。經離心收集菌泥加入冷凍乾燥保護劑(水蘇糖1.8%、穀氨酸鈉0.3%、半乳糖0.6%、脫脂奶粉12%)，再經冷凍乾燥即得短雙歧桿菌BB2菌劑，活菌數約為139億/g。實施例6雙歧桿菌製劑在蛋雞生產中的應用選用349~377日齡的海蘭灰蛋雞600羽，分為兩個處理組空白對照組不添加任何成分；試驗組添加0.1%的本發明實施例2短雙歧桿菌BB2製劑。每個處理6個重複，每個重複50隻雞。飼養後屠宰，觀察分析蛋雞腸道不同腸段雙歧桿菌和乳酸菌總量、大腸桿菌和總好氧菌的變化情況。試驗結果列於表12。表12蛋雞腸道菌群分離計數結果[logK)(菌數CFU/g內容物)]tableseeoriginaldocumentpage16注同行樣品間凡標有不同大寫字母者為差異極顯著(pO.01);同行樣品間凡標有不同小寫字母者為差異達顯著水平(/K0.05)。從表12可以看出添加0.1%活性雙歧桿菌製劑，嗉囊中的雙歧和乳酸數量總和比空白對照組增加了IO倍以上，其他部位的雙歧桿菌和乳酸菌數量總和也顯著高於空白對照組，大腸桿菌和總好氧菌數量也顯著下降而得到抑制。實施例7雙歧桿菌製劑在肉雞生產中的應用選用128日齡公母混養的AA肉雞300隻，隨機分成3個處理，即空白對照組、抗生素對照組(金黴素100g/t)和0.15%本發明實施例3雙歧桿菌製劑，每個處理100隻。育雛l周后，每個處理分成5個重複，每個重複20隻。飼養後屠宰，觀察分析肉雞腸道內不同腸段雙歧、乳酸總和、大腸桿菌、沙門氏菌和好氧菌總數的變化情況(即菌相變化)。試驗結果列於表13。_表13肉雞腸道菌群分離計數結果[logK)(菌數CFU/g內容物)]_組別測定微生物迴腸l腸——結直腸..............舉壁，大腸桿菌8.539士0,221Ab12.817士0.257Aa10,201士0.312Aa空白對照組沙門氏菌8.764±0.038Aa12.091±0.300Aa10.065±0.209Aa14.45士0.15A雙歧、乳酸總和8.438士0.203Cc9.051士0.219Cd9.102土0.245Cc抗生素對照組0.15%BB2製劑好氧菌總數大腸桿菌沙門氏菌雙歧、乳酸總和好氧菌總數大腸桿菌沙門氏菌雙歧、乳酸總和好氧菌總數10.629土0.115Bb8.604±0.239Ab8.749±0.223Aa8.476土O.匿c10.989士0.170Aa7.563±0.118Bc7.448士0,202Bc0.311土0,208Aa9.609土0.333Cc12.779±0.104Aa11.353±0.056Cc11.673土0.118Bb9.206土0.059Cc11.557土0.107Bb11.239土0.209Cd10.633士O.匿d10.322土0.115Aa10.377土0,211Cd11.112±0.243Aa9.834±0.242Bb9.433土0.165Cc9.569±0.187Bc10.809±0.198Bb7.551土O.跳d8.329±0.207Cd10.447±0.230Aa8.009土0.302Cc5.99土0.21B2.29土0.16C注同行樣品間凡標有不同大寫字母者為差異極顯著(pO.01);同行樣品間凡標有不同小寫字母者為差異達顯著水平(p0.05)。從表13可以看出，添加本發明的雙歧桿菌製劑可以使迴腸中雙歧桿菌和乳酸桿菌的數量比空白對照組增加IO倍以上，並降低了大腸桿菌和沙門氏菌的濃度IO倍以上，其他部位也有類似結果。同時，添加0.15%雙歧桿菌製劑組的腹瀉率極顯著低於空白對照組和抗生素對照組(pO.Ol)。試驗結果表明，本發明提供的雙歧桿菌製劑應用於肉雞蛋雞生產時能明顯促進和刺激胃腸道中有益菌的生長；並能顯著抑制大腸桿菌和其他一些好氧菌(如沙門氏菌)的生長繁殖，調節腸道菌群平衡，提高肉雞抗病力，腹瀉率極顯著下降。實施例8雙歧桿菌製劑對蛋雞生產性能、蛋品質、死淘率和抗體水平的影響用日齡相同的產蛋後期海蘭蛋雞9000隻，分三組，每幢一組3000隻，分3個重複，每個重複1000隻。分組情況如下A組，空白對照組，伺餵蛋雞基礎日糧；B組，在蛋雞基礎日糧中添加抗生素，80g/t;C組，在蛋雞基礎日糧中添加雙歧桿菌製劑0.18%。前7天為預試期，後28天為試驗期，並按上述分組重複試驗3次，測定雞舍內NH3、H2S濃度、雞蛋破損率、哈夫單位、產蛋率、蛋重、死淘率、蛋殼光潔度、抗體水平等指標。結果列於表14。表14對蛋雞生產性能、蛋品質、死淘率的影響ABC空白對照組抗生素對照組雙歧桿菌製劑組氨氣(ppm)16.712.710.3硫化氫(ppm)8.436.785.89雞蛋破損率(％)5.64.94.8後期產蛋率(％)80.283.582.9哈夫單位78.182.282.6蛋重(g)64.365.865.7蛋殼光潔度++++++++死淘率(％)3.91.91.7雞瘟病毒抗體(ELISA,OD值)0.770.751.23注蛋殼光潔度用+的多少表示，越多代表光潔度越好。從表14可以看出，雖然添加了雙歧桿菌製劑一組的蛋重、產蛋率等指標不如抗生素組好，但卻顯著降低了雞舍的氨氣、硫化氫等有害氣體、降低死淘率、抗體水平也得到了較大的提高，有著良好的經濟效益和生態效益，同時解決了藥物殘留問題，提高了食品的安全性。實施例9雙歧桿菌製劑在仔豬、肉仔雞和草魚養殖中的應用效果使用實施例4中的菌劑，分別應用於仔豬、肉仔雞以及草魚的養殖，均設為空白對照組、抗生素組和BB2實驗組，每組3個重複。其中，空白對照組飼餵基礎日糧；抗生素組在基礎日糧中添加金黴素(80g/t);BB2實驗組添加實施例4的菌劑，具體添加量如表15所示。表15雙歧桿菌製劑在仔豬、肉仔雞和草魚養殖中的應用效果處理(組別)試驗方式試驗規模試驗結果A、空白對照(陰性對照)B、抗生素組(陽性對照)C、BB2製劑0.20%A、空白對照B、抗生素組每組30頭仔豬雙歧桿菌組較空白對照組和抗生3個重複90頭素組日採食量提高2.9-3.6%,曰增重提高3.2-4.1%,飼料轉化率改善4.5-5.2%,腹瀉率降低49-54%每組300隻肉仔雞雙歧桿菌組較抗生素雞體內蛋白3個重複卯O只質沉積明顯增加(p0.05),明顯降18C、BB2製劑0.16%低腸道pH(pO.05),顯著抑制大腸桿菌繁殖和減少禽舍中氨氣濃度(p<0.05)A、空白對照B、抗生素組C、BB2製劑0.11%每組2000尾育成期草魚雙歧桿菌組飼料係數比抗生素對3個重複6000尾照組提高4.87%,日增重比對照組提髙8.3%,成活率提高14.5%,且整齊度高，抗病力強。同時，很好地控制了水質。從表15可以看出，在仔豬，肉仔雞和育成期草魚日糧中添加本發明的雙歧桿菌製劑，各項指標均明顯好於抗生素對照組和空白對照組。說明本發明提供的雙歧桿菌製劑能有效防治畜禽和水產動物疾病、顯著提高生產性能、改善畜舍環境和水產動物水質，說明其具有良好的經濟效益和生態效益。實施例10雙歧桿菌製劑對肉仔雞免疫力(包括細胞免疫和體液免疫)的影響試驗選用AA肉雞1日齡300羽，分3組，每組100隻肉雞，分5個重複，每個重複20隻雞，餵以3種不同的日糧，即A組為空白對照組，B組為抗生素組，C組為添加雙歧桿菌製劑0.15%組。分別在7曰齡和14日齡注射牛血清白蛋白抗原，以備檢測免疫學指標。試驗期7周，3周齡時檢測淋巴細胞增殖活力、牛血清白蛋白抗體水平，結果見表16和表17。表16雙歧桿菌製劑對雞血淋巴細胞增殖活力(細胞免疫)的影響添加物空白對照(不添加)抗生素對照雙歧桿菌製劑0.15%T細胞活力(OD值)1.5621.2122.481表17雙歧桿菌製劑對雞血牛血清白蛋白抗體滴度(體液免疫)的影響添加物空白對照(不添加)抗生素對照雙歧桿菌製劑0.15%抗體滴度(OD值)1.3141.0352.018從表16、表17可以看出，本發明提供的雙歧桿菌製劑添加到甸料中可以明顯增強T細胞活力，也可以明顯增強抗體滴度水平。說明本發明提供的雙歧桿菌製劑可明顯提高動物的細胞免疫功能和體液免疫功能。參考文獻1.Gilliland，S.E.，Staley，T,E.andBush,L.J.，ImportanceofbiletoleranceofLactobacillusacidophilususedasadietaryadjunct,JDairySci，1984，67(12):3045-3051.2.Overdahl,B.J.andZottola，E.A.，RelationshipbetweenbiletoleranceandthepresenceofarutheniumredstaininglayeronstrainsofLactobacillusacidophilus,JDairySci，1991，74(4):1196-1200,3.Prasad,J,，Gill,H.,Smart,J.andGopal，R.K.,SelectionofcharacterisationofLactobacillusandBifidobacteriumstrainsforuseasprobiotics，IntDairyJournal,1998，8(12):993-1002.4.Erkkila，S.andPetaja,E.，ScreeningofcommercialmeatstarterculturesatlowpHandinthepresenceofbilesaltsforpotentialprobioticuse,MeatScience,2000，55:297-300.5.王建業，王永坤，朱國強等，豬源雙歧桿菌篩選及生物特性參數測定，揚州大學學報(自然科學版)，2000,3:23-27.6.張日俊，潘淑媛等，綠色高效微生物飼料添加劑一益生康對肉仔雞營養代謝與免疫功能的調控機理，中國農業大學學報，2005.10(3):40-4權利要求1、雙歧桿菌(Bifidobacteriumsp.)BB2，保藏號為CGMCCNo.3200。2、權利要求1所述雙歧桿菌BB2的發酵培養方法，其特徵在於，按1.5~3.5%的接種量向發酵培養基中接入1530h菌齡的所述雙歧桿菌種子液，發酵條件為溫度25~40°C，每間隔2~3h攪拌510min，轉速為100130rpm，培養10~15h;所述發酵培養基的配置為葡萄糖0.7~2.1%、大豆蛋白腖0.2~1.0%、胰蛋白腖0.21.0%、大豆肽0.3~1.0%、玉米渣0.5~1.5%、梓檬酸銨0.3~1.2%、混合鹽溶液0.4°/。、消泡劑M0.05~0.1%,pH為6.27.4。3、含有權利要求1所述雙歧桿菌BB2的菌劑。4、如權利要求3所述的菌劑，其特徵在於，該菌劑通過如下方法製得按照權利要求2所述的方法對雙歧桿菌BB2進行發酵培養得到發酵菌液，離心收集菌泥，加入保護劑凍幹得菌劑。5、含有權利要求1所述雙歧桿菌BB2的飼料添加劑。6、含有權利要求1所述雙歧桿菌BB2的飼料。7、含有權利要求1所述雙歧桿菌BB2的生物獸藥。8、權利要求1所述雙歧桿菌BB2、權利要求3所述菌劑、權利要求5所述的飼料添加劑或權利要求6所述的伺料在家禽、牲畜和水產詞養中的應用。全文摘要本發明涉及一種分離自健康肉仔雞消化道的、可產細菌素或抑菌物質的雙歧桿菌BB2，保藏號為CGMCCNo.3200。該菌株具有抗逆性強、生長快、發酵液酸度高、生物量大、有抑菌或抗菌活性等優點。本發明還涉及該菌株的大規模發酵培養方法，將發酵液離心回收菌泥，加入保護劑凍幹後能夠得到活菌數為120～150億/g的菌劑。本發明的雙歧桿菌亞種BB2製劑可以部分替代抗生素，消除藥物殘留，提高畜禽產品品質；可以提高動物生產性能、提高免疫力或抗病力、降低動物死淘率、減少腹瀉率；還可以淨化畜舍環境。本發明具有很高的社會效益、經濟效益和生態效益。文檔編號C12N1/20GK101671638SQ200910093779公開日2010年3月17日申請日期2009年9月28日優先權日2009年9月28日發明者張日俊,李桂霞,梁曉明,燕黃申請人:中國農業大學