增強對單純皰疹病毒疫苗的免疫應答的方法

2023-05-25 16:22:26

專利名稱：增強對單純皰疹病毒疫苗的免疫應答的方法
技術領域：
本發明一般涉及疫苗領域，更具體地說涉及一種誘導抗單純皰疹病毒免疫的疫苗方案，該方案既使用核酸疫苗，也使用蛋白疫苗，以及使用選定的佐劑。
已知的疫苗製劑使用了各種各樣的傳遞載體，用於將如gD基因的抗原提呈至哺乳動物免疫系統，以便激發針對所述病原體的保護性免疫應答。這種「傳遞載體」包括作為疫苗組分的熱滅活或化學滅活完整病毒、完整病毒的蛋白顆粒、病毒載體(如腺病毒或痘苗病毒等)以及基於DNA的載體或質粒。後一類型的HSV#160;gD基因製劑的實例描述於1998年4月30日公開的國際專利申請WO98/17820號和美國專利第5,958,895號。另一方面，其它傳遞載體可以是例如質粒型載體的附加物，該附加物有助於將抗原傳遞或提呈至免疫系統。參見例如1998年11月5日公開的國際專利申請WO98/48780號。
針對眾多病原體的疫苗的其它變化包括含其它載體的組合物和製劑，所述載體用於傳遞需要針對其的免疫反應的抗原。這些其它載體可以為通過其自身生物活性增加或增強抗所述抗原的免疫應答的類型。例如，已經發現某些細胞因子和白介素是疫苗組合物的理想「佐劑」。在這些佐劑中最令人感興趣的是IL-12。參見例如美國專利第5,723,127號和5,571,515號。
作為再一個獲得針對任何數量的抗病原體疫苗的合適保護性免疫應答的方法，已經提出了各種疫苗接種方案。例如，先前的研究已經證實，質粒型疫苗可用於激發免疫系統，用另一種形式的相同抗原(諸如蛋白質或重組病毒)進行第二次免疫[S.W.Barnett等，Vaccine，15(80)869-873(1997)；N.L.Letvin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，949378-9383(1997)；R.A.Gramzinski等，Molecular#160;Med.，4109-118(1998)；J.Schneider等，Nature#160;Med.，4397(1998)；和M.Sedeguh等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，957648(1998)]。
儘管有大量關於疫苗和疫苗製劑的信息，但仍舊需要有效的疫苗，特別是在人類誘導或產生足夠的抗HSV保護性免疫的有效疫苗。
在用此DNA疫苗免疫哺乳動物至少一次之後，該方法還包括用有效量的第二種疫苗組合物免疫哺乳動物至少一次，所述第二種疫苗組合物在合適藥用載體中包含蛋白、特別是1型或2型HSV#160;gD蛋白和IL-12異二聚體蛋白。在選擇實施方案中，第一種疫苗以含有一定量局部麻醉劑的製劑給予，局部麻醉劑可與第一種疫苗中的核酸分子形成一種或多種複合物。
再一方面，本發明包括HSV疫苗藥盒，該藥盒含有以上疫苗方法中詳細列舉的各種組分，以及說明書和適於混合和給予所述疫苗組分的任選裝置。
本發明的其它方面和優勢在以下的其優選實施方案的詳述中進一步描述。
發明詳述本發明提供一種有效預防或治療哺乳動物感染單純皰疹病毒的疫苗接種方案。此疫苗接種方法包括初免-加強免疫，在哺乳動物誘導針對1型或2型單純皰疹病毒病原體的保護性和/或治療性免疫。本發明證實，初免-加強疫苗接種方案增強了據認為是對治療至關重要的細胞介導免疫，在所述接種方案中，HSV#160;gD在DNA初免階段、任選DNA加強階段和使用與gD相同形式的IL-12的蛋白加強階段給予。該方案證實的廣譜免疫還增強抗HSV感染的保護性和/或治療性免疫。因此，本發明提供了一種用於預防和治療HSV感染的方法，例如用於HSV接觸前和接觸後的個體。I.定義術語「哺乳動物」包含其一般的含義。儘管本發明最理想的是指對人的效力，但其它靈長類動物以及馴養哺乳動物物種，包括但不限於狗、貓、母牛、馬、豬、綿羊、山羊、小鼠、兔和大鼠等，也包含在此定義內。
作為術語在本文可交互使用的「免疫應答」或「免疫性」是指誘導體液(即B細胞)和/或細胞(即T細胞)應答。相應地通過檢測將HSV#160;gD抗原引至宿主中而免疫的動物血清中存在的抗原特異性抗體評價體液免疫應答。在以下的一個典型實施方案中，通過酶聯免疫吸附測定免疫動物血清或如以下的實施例2所述通過微量中和測定免疫動物血清評價免疫應答。還可如下文所述用CTL測定檢測分離自免疫動物脾的淋巴細胞的T細胞應答。
術語「初免」和「加強」具有其在本領域的通常含義。「初免」是指用第一種組合物免疫接種，其在隨後用相同的或另一種組合物免疫(「加強」)時誘導的針對抗原的免疫應答水平高於用單一疫苗組合物(例如單獨的初免組合物或單獨的加強組合物)免疫獲得的免疫應答。
本文使用的術語「同源」是指兩個聚合分子的序列相似性，例如兩個核酸分子(如兩個DNA分子或兩個RNA分子)或兩個多肽分子之間的序列相似性。當兩個分子上的核苷酸或胺基酸位置都由相同的單體核苷酸或胺基酸佔據時，例如兩個DNA分子中每一個分子的某個位置都是腺嘌呤，那麼它們在該位置同源。兩個序列之間的同源性是匹配或同源位置數的正函數，例如如果兩個化合物序列的一半位置(例如10個亞單位長度的聚合物中的5個位置)同源，那麼兩個序列50％同源，如果90％的位置(例如10個位置中的9個)匹配或同源，則兩個序列具有90％同源性。舉例來說，DNA序列3′ATTGCC5′和3′TATGCG5′具有50％同源性。本文使用的術語「大致同源」是指與目標核酸約50％同源的DNA或RNA，更優選約70％同源，甚至更優選約80％同源，最優選約90％同源。
本文論述的HSV#160;gD或IL-12蛋白和/或DNA序列由其與鑑定序列的同源性或同一性百分比限定，用於計算同源性或同一性百分比的算法包括Smith-Waterman算法[J.F.Collins等，1988，Comput.Appl.Biosci.，467-72；J.F.Collins等，Molecular#160;Sequence#160;Comparison#160;andAlignment，(M.J.Bishop等主編)，載於Practical#160;Approach#160;SeriesNucleic#160;Acid#160;and#160;Protein#160;Sequence#160;Analysis#160;XVIII，IRL#160;PressOxford，England，UK(1987)第417頁]，以及BLAST和FASTA程序[E.G.Shpaer等，1996，Genomics，38179-191]。這些參考文獻通過引用結合到本文中。II.用gD和IL-12#160;DNA初免按照本發明，所述方法的第一步或初免步驟包括用有效量的第一種「初免」疫苗免疫接種哺乳動物，所述「初免」疫苗包含含1型和2型HSV#160;gD蛋白DNA編碼序列的第一種核酸分子和含IL-12異二聚體每個亞單位的DNA編碼序列的第二種核酸分子。此第二種核酸序列可包含兩個單獨核酸分子的組合物，其中每個核酸分子都編碼不同的IL-12異二聚體，或者可以是含兩個異二聚體亞單位的雙順反子或者為IL-12亞單位或其生物活性片段融合在一起成為單個分子的單一序列。gD1和gD2蛋白的編碼序列是已知的(參見例如GenBank登錄號K01408和以上背景技術中提及的文獻)，還已知IL-12異二聚體的編碼序列(參見例如美國專利第5,457,038號)。
天然HSV#160;gD1或gD2序列優選用於初免疫苗；但是，本發明考慮使用修飾的gD1和gD2序列，在本發明中，這樣的核酸序列修飾增強了gD基因的體內免疫原性、穩定性或某些其它藥理特性。已知眾多的核苷酸序列修飾，下文進行概述。在所述修飾中包括截斷或缺失/插入，以縮短或延長天然gD序列。可截斷gD序列的5′末端，以除去信號序列或前導序列。或者，可截斷gD序列的3′末端，以除去其跨膜結構域或其半胱氨酸富集區。另一個選擇是gD分子的5′和3′末端都截斷，以使信號序列和跨膜結構域都被去除。修飾的gD基因的再一個實例是缺失天然前導序列或信號序列而被另一個信號序列取代的序列。例如，可在gD的殘基285或殘基316的胺基酸編碼密碼子處截斷所述序列，以提供可用於本發明的修飾的gD序列。其他修飾可能也有用(參見例如美國專利第5,958,895號描述的片段)。
本發明還包括gD核酸編碼序列，該序列以相同讀框融合至另一個有助於免疫宿主細胞表達和分泌多肽或有助於所述多肽在細胞中的穩定性的多核苷酸序列，例如，起控制細胞中的多肽轉運的分泌序列作用的前導序列。
同樣，幾個哺乳動物物種(包括鼠和人)的IL-12#160;p35和p40異二聚體亞單位序列是本領域已知的。選擇使用的IL-12亞單位序列最好為給予初免疫苗的哺乳動物物種的天然序列或等位基因序列。例如，最優選用於人類個體的是天然人IL-12異二聚體。而且，本發明考慮使用修飾的IL-12#160;p35和IL-12#160;p40序列，在本發明中，所述核酸序列修飾增強了IL-12亞單位基因的體內穩定性或某些其它藥理特性。例如，可設計含有連接在一起的兩個異二聚體或兩個異二聚體的生物相關片段的單個基因。已知眾多的核苷酸序列修飾，在下文概述。
編碼HSV#160;gD或編碼IL-12異二聚體的核苷酸序列也可用於本發明方法的初免疫苗或加強疫苗，所述核苷酸序列具有的序列分別與gD抗原或IL-12細胞因子的胺基酸序列同源，其中所述同源抗原誘導抗HSV的免疫應答或誘導抗IL-12的適當應答。應當將與目標gD編碼序列同源的基因看作包括在本發明中，只要它們編碼的蛋白質或多肽誘導的抗HSV保護性免疫應答與天然或野生型HSV#160;gD引起的免疫應答大致相似。
製備本發明初免疫苗步驟組分的方法在常規書刊(如Burger等，J.Gen.Virol.，72359-367(1991))中有描述，並且是本領域眾所周知的。還參見Sambrook等，1989，Molecular#160;CloningA#160;LaboratoryManual，Cold#160;Spring#160;Harbor#160;Laboratory#160;Press，New#160;York；和Ausubel等，1997，Current#160;Protocols#160;in#160;Molecular#160;Biology，Green#160;amp;#160;Wiley，NewYork。另一方面，可由商業渠道購買含HSV#160;gD核酸序列或IL-12亞單位核酸分子的合適質粒。
編碼gD、IL-12#160;p35或IL-12#160;p40的每種核酸序列優選處於調節序列控制之下，所述調節序列控制哺乳動物細胞的每種核酸序列的複製和產物產生。所述術語「啟動子/調節序列」是指表達與啟動子/調節序列有效連接的核酸需要的DNA序列。在某些情況下，啟動子/調節序列可以組織特異性方式起作用，即所述啟動子/調節序列僅能在特定組織類型的細胞中驅動表達。在某些情況下，啟動子/調節序列可以為核心啟動子序列，而在其它情況下，該序列還可以包括增強子序列和以組織特異性方式表達需要的其它調節元件。
本文使用的描述「有效連接的」兩個DNA是指含有所述兩個DNA中的每一個的單鏈或雙鏈DNA，並且所述兩個DNA在所述單鏈或雙鏈DNA中以以下方式排列至少一個DNA序列能夠對另一個序列施加其特徵性生理效應。當編碼gD或IL-12的核酸還含有啟動子/調節序列時，該啟動子/調節序列最好位於編碼序列的5′末端，使得其驅動細胞中的gD或IL-12表達。
這樣的調節序列包括但不限於啟動子序列、增強子序列、聚腺苷酸序列、剪接供體序列和剪接受體序列。本領域提供大量的所述序列，由這些序列可設計用於本發明的DNA分子。本領域技術人員可容易地在所述已知調節序列中進行選擇，以製備本發明分子，所述調節序列的選擇對本發明無限制作用。例如，用於為初免疫苗組分的質粒或其它DNA分子的啟動子可包括非特異性活性的組成型啟動子。這樣的啟動子包括但不限於反轉錄病毒LTR啟動子、巨細胞病毒(CMV)立即早期啟動子、SV40啟動子、二氫葉酸還原酶啟動子和磷酸甘油激酶(PGK)啟動子。也可以使用由外部施加的藥物調節的誘導型啟動子。誘導型啟動子包括但不限於鋅誘導型綿羊金屬硫蛋白(MT)啟動子和地塞米松(Dex)誘導型小鼠乳瘤病毒(MMTV)啟動子等等。可用於本發明的其它種類誘導型啟動子是那些受特定生理狀態(例如溫度或急性期或僅在可複製細胞時)調節的啟動子。
編碼gD或IL-12異二聚體的核酸序列優選以載體或質粒給予。本文使用的術語「載體」是指各種病毒或細菌來源的DNA分子，這些DNA分子設計用來編碼外源或異源核酸序列。因此，所述術語包括常規的細菌質粒。所述質粒或載體可包括病毒或噬菌體的質粒序列。所述載體包括染色體載體、游離型載體和病毒來源的載體，例如得自細菌質粒、噬菌體、酵母附加體、酵母染色體元件和病毒的載體；得自其組合的載體，如得自質粒和噬菌體遺傳元件、粘粒和噬菌粒的載體。所述術語還包括將基因由一個細胞轉移至另一個細胞的非複製型病毒。所述術語還應包括促進核酸轉移到細胞中的非質粒和非病毒化合物，例如聚賴氨酸化合物等。病毒載體的實例包括但不限於腺病毒載體、痘病毒載體、反轉錄病毒載體等。細菌載體的實例包括但不限於得自卡介苗(BCG)、沙門氏菌、志賀氏菌和李斯特菌等的序列。因此，一個典型載體是單鏈或雙鏈噬菌體載體。另一個典型載體是單鏈或雙鏈RNA或DNA病毒載體。
除了以上提及的調節序列以外，質粒還可含有轉錄起始和終止位點以及轉錄區中用於翻譯的核糖體結合位點。由構建物表達的成熟轉錄物的編碼部分包括開始的翻譯起始密碼子和在所翻譯多肽末端適當位置的終止密碼子。
以上所有的質粒或載體組分都可由本領域已知的物質中選擇，並可由藥廠獲得。不能把對質粒骨架和調節序列的選擇看成對本發明是限制性的。
用於本發明初免疫苗接種步驟的gD基因和每個IL-12亞單位最好都存在於單獨的質粒中。或者，這些核酸序列中的兩個或三個可包含在多順反子轉錄物中，即設計用來表達三種基因產物中的兩種或全部三種基因產物的單個分子。
因此，初免疫苗在合適的藥學或生理學可接受的載體(如等滲生理鹽水或等滲鹽溶液)中含有HSV#160;gD及IL-12異二聚體核酸編碼序列中的一種或多種序列。合適的載體對本領域人員而言是顯而易見的，並且主要取決於給予途徑。另一方面，由多核苷酸分子組成的所述初免疫苗最好含有任選多核苷酸促進劑或「輔助劑(co-agent)」，如局部麻醉劑、肽、脂質(包含陽離子脂質、脂質體或脂質顆粒)、聚陽離子(如聚賴氨酸)、支鏈三維聚陽離子(如樹枝狀晶體(dendrimer)、碳水化合物、陽離子兩性分子、去汙劑、卞銨表面活性劑)或其它促進多核苷酸轉移至細胞的化合物。用於本發明的這種促進劑或輔助劑的非排他性實例描述於美國專利第5,593,972、5,703,055、5,739,118、5,837,533號；1996年4月4日公開的國際專利申請WO96/10038號和1994年8月8日公開的國際專利申請WO94/16737號，這些文獻通過引用結合到本文中。
所述局部麻醉劑最優選以和所述核酸分子形成一種或多種複合物的量存在。當所述局部麻醉劑與DNA質粒混合時，其形成各種各樣的包裝DNA的均一小複合物或顆粒。因此，在本發明初免疫苗組合物的一個實施方案中，所述複合物通過混合局部麻醉劑和1至3種DNA質粒(含兩種IL-12亞單位的質粒，或含gD的質粒和含一種或兩種IL-12亞單位的質粒，或含gD的質粒和含兩種IL-12亞單位的雙順反子質粒，或含gD序列和兩種IL-12亞單位序列的單個多順反子質粒)形成。任何由此混合物產生的單個複合物都可含有各種各樣的不同質粒組合。或者，在本發明初免組合物的另一實施方案中，可將局部麻醉劑分別與每種gD質粒和IL-12亞單位質粒預混合，然後將單獨的混合物組合成單一初免組合物，以保證在單個疫苗組合物中出現理想質粒比率，前提是所有質粒都以單劑大劑量快速給予。或者，局部麻醉劑和每種質粒可分別混合，並分別給予，以獲得目標比率。下文中的術語「複合物」或「一種或多種複合物」用於定義初免疫苗組合物的實施方案，顯然該術語包括一種或多種複合物，每種複合物含有含gD和IL-12亞單位質粒的混合物，或分別形成的複合物的混合物，其中每種複合物僅含有一種類型的質粒，或其中每種複合物都包含多順反子DNA的一種複合物或複合物的混合物。
所述複合物的粒徑最好為約50-約150nm。當使用的促進劑為局部麻醉劑(優選丁哌卡因)時，其量優選為佔多核苷酸組合物總重的約0.1％-約1.0％(重量)。還參見國際專利申請PCT/US98/22841號，該文獻通過引用結合到本文中，該文獻講述將苄銨表面活性劑作為輔助劑加入，優選以約0.001-0.03％(重量)的量給予。按照本發明，局部麻醉劑的量相對於所述核酸分子的存在比率為0.01-2.5％(w/v)與1-10μg/ml核酸。
所述藥用組合物還可以含有適於該組合物的選定給予模式的其它添加劑。本發明的組合物還可以含有凍幹多核苷酸，其可與其它藥學上可接受的賦形劑一起用於開發粉劑、液體劑型或懸浮劑型。參見例如RemingtonThe#160;Science#160;and#160;Practice#160;of#160;Pharmacy，第2卷，第19版(1995)，例如第95章Aerosols；和國際專利申請PCT/US99/05547，其內容通過引用結合到本文中。如果需要的話，這些組合物的給予途徑可以組合或進行調整。
因此，這些初免/加強DNA疫苗可含有適於通過任何常規給予途徑給予的添加劑。在某些優選的實施方案中，製備用於給予哺乳動物個體的本發明初免組合物和任選DNA加強組合物的形式為例如液體、粉末、氣溶膠、片劑、膠囊、腸溶包衣片劑或膠囊、或栓劑。給予途徑包括但不限於胃腸外給予、腹膜內給予、靜脈給予、肌內給予、皮下給予、皮內給予、口服給予、局部給予、鼻內給予、肺內給予、直腸給予、陰道給予等。所有這些途徑都適於給予這些組合物，並可由主治醫師根據治療的患者和病症以及類似因素進行選擇。
一般而言，根據哺乳動物生理狀況選擇本發明初免組合物的合適劑量，最特別地包括免疫哺乳動物的總體健康狀況和體重。這種選擇和有效劑量的上調或下調屬於本領域的技術範圍。
在以下的實施例方法中，初免疫苗的組分同時給予哺乳動物。首先將含gD基因和每種IL-12亞單位的核酸分子混合在合適的藥用載體中，然後以單劑一次給予。
或者，設想每種質粒可單獨序貫給予。作為初免疫苗步驟的描述性實例，以下的實施例顯示給予三種細菌質粒pMVgD2、pMVp35和pMVp40，它們混合併在鹽水中肌內給予。還可考慮其它給予方式。III.任選核酸加強劑本發明方法還設想了一種任選加強疫苗，其含有的組分和製劑與上述「初免疫苗」相同。此核酸加強劑最好在給予初免疫苗後約4周至約32周給予患者。理想的是，所述核酸加強劑以和上述初免疫苗接種步驟相同的途徑和相同的劑量給予。IV.HSV#160;gD和IL-12異二聚體蛋白加強劑本發明方法進一步提供蛋白加強疫苗接種步驟。所述方法的該步驟優選包括在用上述「初免疫苗」或用一種或多種上述任選核酸加強劑免疫後約2周至32周，用有效量的蛋白疫苗組合物免疫哺乳動物，所述蛋白疫苗組合物含有1型或2型HSV#160;gD蛋白或其類似物以及IL-12異二聚體或其類似物。
以上提及的HSV#160;gD#160;1型和2型以及小鼠和人IL-12異二聚體亞單位的DNA序列和蛋白序列是本領域眾所周知的。術語「類似物」當用來指本發明使用的gD或IL-12多肽時，意思是全長多肽或基本保留了與所述多肽相同的生物功能或活性的其片段，即起免疫原作用。gD和/或IL-12異二聚體多肽類似物可以為(i)其中一個或多個胺基酸殘基被保守或非保守胺基酸殘基(優選保守胺基酸殘基)取代的類似物，這種取代的胺基酸殘基可以是或可以不是由遺傳密碼編碼；(ii)其中一個或多個胺基酸殘基包括取代基的類似物；(iii)其中多肽與另一種化合物(如增加所述多肽半衰期的化合物，如聚乙二醇)融合的類似物；或(iv)其中另外的胺基酸與所述多肽融合的類似物，例如前導序列或分泌序列或用於純化所述多肽的序列。這樣的類似物被認為屬於本文論述領域的技術人員的範圍之內。本文描述的HSV#160;gD或IL-12異二聚體類似物在保守胺基酸序列差異或不影響序列的修飾或這兩方面可以不同於天然存在的蛋白或肽。例如，可以獲得保守胺基酸改變，儘管這種胺基酸改變可以改變蛋白或肽的一級序列，但一般不改變其功能。
修飾(一般不改變一級序列)包括多肽的體內或體外化學衍生物，例如乙醯化或羧化。gD或IL-12類似物還包括那些通過糖基化修飾的蛋白，例如在其合成和加工過程中或在進一步加工步驟中改變多肽的糖基化形式獲得的蛋白；例如通過將所述多肽暴露於影響糖基化的酶(例如哺乳動物糖基化酶或去糖基化酶)獲得的蛋白。本發明類似物還包括胺基酸殘基已磷酸化的HSV#160;gD或IL-12序列，例如磷酸酪氨酸、磷酸絲氨酸和磷酸蘇氨酸。類似物還包括已使用普通分子生物學技術修飾的gD或IL-12多肽，以提高對蛋白水解酶降解的抗性或優化溶解性。所述多肽的類似物包括那些含有非天然存在的L-胺基酸的殘基的多肽，例如D-胺基酸或非天然存在的合成胺基酸。其它可存在於本發明多肽中的已知修飾為(不限於)醯化、ADP-核糖基化、醯胺化、共價結合核黃素、共價結合血紅素部分、共價結合核苷酸或核苷酸衍生物、共價結合脂質或脂質衍生物、共價結合磷脂醯肌醇、交聯、環化、形成二硫鍵、脫甲基化、形成共價交聯、形成胱氨酸、形成焦穀氨酸鹽、甲醯化、γ-羧化、形成GPI錨、羥化、碘化、甲基化、肉豆寇醯化、氧化、蛋白水解加工、異戊二烯化、外消旋化、硒化、硫化、t-RNA介導的蛋白胺基酸加成(如精氨醯化蛋白)或遍在蛋白化。
其它修飾(特別是gD蛋白)包括上述缺失gD#160;N端的信號序列或前導序列和/或缺失gD#160;C端的跨膜結構域和/或半胱氨酸富集區或二者均缺失。同樣，修飾可包括用另一個信號或前導序列替代所述信號或前導序列。參見例如美國專利第5,958,895號。
獲得所述修飾的方法對技術人員而言是眾所周知的。參見例如PROTEINS-STRUCTURE#160;AND#160;MOLECULAR#160;PROPERTIES，第2版，T.E.Creighton，W.H.Freeman#160;and#160;Company，New#160;York，1993；Wold，F.，「蛋白翻譯後修飾前景與展望」，1-12頁，載於POSTTRANSLATIONAL#160;COVALENT#160;MODIFICATION#160;OFPROTEINS，B.C.Johnson主編，Academic#160;Press，New#160;York，1983；Seifter等，Meth.Enzymol.，182626-646(1990)，和Rattan等，Ann.N.Y.Acad.Sci.，66348-62(1992)。
除了基本全長多肽以外，用於本發明的gD和/或IL-12蛋白包括這些多肽的免疫活性片段。本文使用的術語「片段」應用於多肽時，通常為至少約6個連續胺基酸長度，典型為至少約15個或約25個連續胺基酸長度，更典型為至少約40個連續胺基酸長度，經常至少約45個連續胺基酸長度，優選為至少約50個連續胺基酸長度。參見例如描述於美國專利第4,709,011號的gD多肽，該文獻通過引用結合到本文中。如果gD蛋白、其類似物或其片段在受試哺乳動物誘導抗1型或2型HSV的保護性免疫應答，則可用於本發明方法。例如，在約殘基285處截斷的gD蛋白是需要的片段。同樣，在約殘基316處截斷的gD蛋白也是需要的片段。可以選擇其它的gD片段。如果IL-12蛋白、其類似物或其片段增強gD蛋白誘導的免疫應答，則可用於本發明方法。
用於本發明蛋白加強疫苗的gD蛋白和IL-12異二聚體不限於本文列舉的任何具體示範性方法的產物。實際上，可通過以上引用書刊中的現存方法或通過以上初免疫苗部分引用書刊的方法製備gD蛋白和IL-12異二聚體蛋白。用於疫苗用途的蛋白組合物的分離和生產屬於本領域技術範疇。或者，gD和IL-12蛋白可由商業渠道購買。
最好將蛋白加強組合物配製成藥用組合物。這樣的製劑包含gD蛋白和IL-12異二聚體和藥學上可接受的載體(如無菌水或無菌等滲生理鹽水)。合適的載體對本領域技術人員而言是顯而易見的，並大部分依賴於給予途徑。製劑包括但不限於懸浮劑、溶液、油性或水性溶媒的乳濁液、糊劑和植入性緩釋製劑或生物降解製劑。所述製劑可進一步包含一種或多種其它成分，包括但不限於懸浮劑、穩定劑或分散劑。在胃腸外給予製劑的一個實施方案中，以乾燥形式(即粉末或顆粒)提供活性成分，以便在胃腸外給予配製的組合物之前用合適載體(例如無菌無熱源水)配製。其它有用的胃腸外給予製劑包括含微晶形式、脂質體製劑或作為生物可降解聚合物系統組分的活性成分的製劑。緩釋或植入組合物可包含藥學上可接受的聚合物或疏水性物質，如乳濁液、離子交換樹脂、微溶聚合物或微溶鹽。
蛋白加強組合物中可存在的其它組分為佐劑、防腐劑、化學穩定劑或其它抗原性蛋白。通常要優化穩定劑、佐劑和防腐劑，以確定對目標人或動物有效的最佳製劑。合適的代表性防腐劑包括氯丁醇、山梨酸鉀、山梨酸、二氧化硫、沒食子酸丙酯、對羥基苯甲酸酯、乙基香蘭素、甘油、苯酚和對氯酚。可使用的合適穩定劑成分包括例如酪蛋白胺基酸、蔗糖、明膠、酚紅、N-Z胺、二磷酸氫鉀、乳糖、乳白蛋白水解物和奶粉。常規佐劑用於吸引白細胞或增強免疫應答。這樣的佐劑特別包括MPLTM(3-O-脫醯單磷醯脂A；RIBIImmunoChem#160;Research，Inc.，Hamilton，MT)、礦物油和水、氫氧化鋁、Amphigen、Avridine、L1#160;21/鯊烯、D-丙交酯-聚丙交酯/糖苷、pluronicplyois、胞壁醯二肽、殺死的博德特氏菌、皂苷如Quil#160;A或StimulonTMQS21(Aquila#160;Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)和霍亂菌毒素(或者為野生型或者為突變型，例如其中按照國際專利申請PCT/US99/22520號用另一個胺基酸(優選組氨酸)取代胺基酸位置29的穀氨酸，該文獻通過引用結合到本文中)。
在某些優選實施方案中，製備的用於給予哺乳動物個體的本發明加強組合物的形式為液體、粉末、氣溶膠、片劑、膠囊、腸溶包衣片劑或膠囊、或栓劑。給予途徑包括但不限於胃腸外給予、腹膜內給予、靜脈給予、肌內給予、皮下給予、皮內給予、口服、局部給予、鼻內給予、肺內給予、直腸給予、陰道給予等。所有這些途徑都適於給予這些組合物，並可由主治醫師根據治療的患者和病症以及類似因素進行選擇。
一般而言，根據哺乳動物生理條件選擇本發明蛋白加強組合物的合適劑量，最特別地包括免疫哺乳動物的總體健康狀況和體重。這種對每個患者合適劑量的選擇在本領域技術範圍內。
在以下的實施例方法中，混合優選的蛋白加強疫苗的組分並以單次注射肌肉給予。還可以將均在合適藥用載體中的gD蛋白和IL-12異二聚體分別給予。V.本發明的藥盒本發明還包括用於誘導增強的HSV保護性和/或治療性免疫應答的藥盒。這樣的藥盒優選包含初免疫苗組分，即一種或多種如上所述的核酸分子，其含有1型或2型HSV#160;gD基因的DNA編碼序列和IL-12#160;p-35和p40亞單位的DNA編碼序列，其中所述gD基因DNA編碼序列和所述IL-12異二聚體DNA編碼序列都處於控制其在哺乳動物細胞中表達的調節序列控制之下。所述藥盒任選含有一定量的局部麻醉劑，所述局部麻醉劑可與這些核酸分子形成一種或多種複合物。所述藥盒任選含有如上所述的DNA加強疫苗組分。所述藥盒還含有蛋白加強疫苗組分，即在上述藥學可接受載體中的1型或2型HSV#160;gD蛋白和IL-12異二聚體。
所述藥盒的其它組分包括給予每種組合物的給藥器(applicator)。所述術語「給藥器」當在本文中使用時，是指眾多廣為人知的藥用組合物給予裝置中的任何一種，包括但不限於皮下注射器、基因槍、噴霧器、點滴器、支氣管鏡、栓劑，用於通過任何合適途徑給予人或獸醫患者DNA疫苗組分和/或蛋白疫苗組分。其它組分包括所述藥盒的使用說明書。
VI.實施例通過以下的實驗實施例進一步詳述本發明。提供這些實施例僅用於闡述本發明，除非另有說明，否則沒有限制作用。不應當將本發明理解為限於使用特定的DNA質粒和質粒組分，如用作初免DNA疫苗的啟動子，也不應當將本發明理解為限於使用本文描述的特定局部麻醉劑。因此，本發明包括任何和所有本文提供內容的顯而易見變化。實施例1HSV疫苗組分A.初免疫苗PMV質粒得自pCMV-β[Clontech，Inc.]，去除了β-半乳糖苷酶位點和SV40聚腺苷酸位點，並用分離自pcDNA3.1[Invitrogen，Inc.]的牛生長激素(bGH)聚腺苷酸代替缺失的序列。PMV質粒的其它特徵包括pUC複製起點、含有SV40剪接供體/受體的內含子和氨苄青黴素抗性基因。如下構建PMVgD質粒由質粒pww65分離1.5kb的含2型HSV(HSV-2)病毒株186的gD基因的HindIII-BstXI片段[Eisenberg等，J.Virol.，648(1990)]。用Klenow片段補平5′突出端，然後克隆入PMV質粒的SmaI位點。獲得的質粒由CMV啟動子表達gD2，並用牛生長激素聚腺苷酸聚腺苷酸化。
包含IL-12異二聚體的質粒是PMVp35和PMVp40，這些質粒如下構建由質粒pEDIL-12p35和質粒pEDIL-12p40[都得自GeneticsInstitute，Inc.，Cambridge，MA；還參見S.A.Wolf等，J.Immunol.，1463074-3081(1991)]分離出為單個SalI-XhoI片段的小鼠IL-12#160;p35cDNA(650bp)和p40#160;cDNA(1.0kb)。如上所述將這些片段克隆入各個PMV質粒的SalI-XhoI位點，產生PMVp35和PMVp40。每個質粒由巨細胞病毒啟動子表達p35或p40#160;IL-12異二聚體，並含有牛生長激素聚腺苷酸。
如以下實施例2和3的方法所闡述，優選的初免疫苗在0.06ml磷酸緩衝鹽水溶液中包含35μg的每種質粒pMVgD、PMVp35和PMVp40。另一方面，在以下實施例的某些實施方案中，所述初免疫苗僅包含pMVgD、IL-12質粒或野生型HSV。含gD的質粒和含IL-12異二聚體的質粒優選以單一組合物肌內(i.m.)給予。然而，或者，所述質粒可序貫共同給予或經不同於以下方法例舉途徑的途徑給予。B.加強疫苗配製的用於以下實驗的優選加強疫苗包含2型HSV#160;186病毒株gD蛋白。以杆狀病毒生產gD蛋白，然後如V.Landolfi等，Vaccine，11407-414(1993)所述進行純化。由Genetics#160;Institute，Inc.，Cambridge，MA獲得重組小鼠IL-12異二聚體蛋白。另一方面，可如美國專利第5,457,038號(通過引用結合到本文中)所述製備IL-12蛋白。優選將合適劑量的gD蛋白和IL-12蛋白混合在一起，並在單個部位進行免疫。或者，gD蛋白和IL-12蛋白可序貫共同給予或經不同於以下實施例2和3的方法例舉的途徑和部位給予。
加強疫苗的一個實施方案包含50μg#160;gD蛋白/ml磷酸緩衝鹽水(3μg/劑)、pH#160;7.4。加強疫苗的另一個實施方案包含50μg#160;gD蛋白/ml磷酸緩衝鹽水(3μg/劑)和200μg磷酸鋁(Wyeth-Lederle#160;Vaccines)/劑。加強疫苗的再一個實施方案包含50μg#160;gD蛋白/ml磷酸緩衝鹽水(3μg/劑)和200μg磷酸鋁/劑以及1μg/劑的小鼠IL-12蛋白[Genetics#160;Institute，Inc.]的磷酸緩衝鹽水溶液pH#160;7.4。實施例2多種疫苗接種方案對比A.接種方案在本實驗中使用14組(n＝5隻/組)7周齡雌性Balb/c小鼠(CharlesRiver#160;Laboratories)。在第0天，用以下的初免製劑給予各組第1-5組在第0天用實施例1描述的pMVgD質粒以25μg劑量和用以上實施例1描述的兩種IL-12質粒以35μg/質粒的劑量肌內(i.m.)免疫。
第6-10組和第12組在第0天未接受免疫。
第11組僅在第0天肌內接受35μg/質粒劑量的以上實施例1描述的兩種IL-12質粒。
第13組接受1×105pfu活體感染性野生型HSV1病毒NS株(得自費城兒童醫院的H.Friedman醫生)，在第0天以0.03ml體積經爪墊注射。
第14組接受2×103pfu活體感染性野生型HSV2病毒186株(美國典型培養物保藏中心)，在第0天以0.03ml體積經爪墊注射給予。
4周後，各組動物接受以下的「加強免疫」第1組和第6組接受第二次給予(相同劑量和途徑)的含gD和IL-12的質粒。
第2組和第7組接受第二次給予(相同劑量和途徑)的僅含gD2的質粒。
但是，第3組和第8組接受第二種疫苗組分。以3μg劑量肌內給予如實施例1所述產生和分離自杆狀病毒的全長gD2蛋白，並以1μg/二聚體的劑量肌內給予重組小鼠IL-12(rmIL-12)異二聚體蛋白的PBS溶液。第4組和第9組僅接受以3μg劑量肌內給予的全長gD2蛋白的PBS溶液。
第5、10、13和14組未接受第二次給予。
第11組僅接受IL-12異二聚體質粒的第二次給予，給予途徑和劑量和第一次給予相同；而第12組僅接受rmIL-12，給予途徑和劑量與以上相同。
在最後免疫後4周由所述動物取血並去除脾，如York等，Vaccine，131706-1712(1995)所述進行ELISA和淋巴增殖測定。如York等所述(同上)進行CTL測定，該測定進行如下的改變用HSV2病毒(M.O.I.4#160;pfu/細胞)於37℃、5％#160;CO2中感染A20細胞4小時，並用UV燈滅活。這些細胞以1∶20比率(HSV感染和UV滅活的A20細胞∶脾細胞)用作刺激細胞。
另外，使用市售ELVISTM#160;HSV細胞系[Biowhittaker，Inc.]進行HSV-1和HSV2的比色血清微量中和測定。簡而言之，該測定包括於37℃、5％#160;CO2下有或沒有豚鼠補體的情況下溫育預先確定量的所述病毒和各種稀釋度的熱滅活血清樣品或僅僅培養基對照(病毒對照)1小時，接著平板接種在融合單層ELVIS#160;HSV細胞上。在相同的條件下溫育後，用ELVIS替換培養基再培養所述單層細胞，並再溫育18個小時。去除培養基並加入1.5％NP40-MEM(0.05ml/孔)，每個微孔平板放置於-70℃至少4小時。於37℃融化裂解物之後加入等體積的β-半乳糖苷酶底物，並將所述平板於37℃溫育40分鐘。測定570nm的OD。中和滴度定義為使病毒對照OD下降50％的血清稀釋度。
基本按照具有如下改變的She等，Intern』l.Immunol.，110845-957(1999)所述進行胞內細胞因子染色。將脾細胞與熱滅活(56℃/30分鐘)的HSV2(106pfu/2×106脾細胞)於37℃、5％#160;CO2中溫育3天。參比抗原為淋巴細胞標誌(CD3、CD4或CD8)、活化抗原CD25和細胞因子(IFN-γ或IL-10)。B.測定結果下表1以IgG1、IgG2的幾何平均滴度(GMT)和Neut#160;GMT(血清中和活性的幾何平均滴度)描述了ELISA和中和測定滴度獲得的體液應答。這是測試血清體外中和病毒感染能力的對數轉化表達。「上下95％CI」是檢測變異性的統計學表述，包括平均限定範圍左右的間隔，95％的觀測結果都落在該範圍內。
簡而言之，在gD和IL-12質粒初免和無佐劑gD亞單位加強的小鼠血清中獲得最大IgG1滴度。在接受gD和IL-12蛋白加強的小鼠中也發現IgG1滴度升高。接受gD亞單位蛋白和IL-12蛋白加強的gD質粒和IL-12質粒初免小鼠表現出極高的IgG2a抗體滴度。還在單獨的gD亞單位加強小鼠中觀測到高滴度的IgG2a。該觀察結果提示，在用亞單位加強時保持和增強了質粒激發的Th1為主的抗體應答。血清中和滴度與在亞單位加強或亞單位gD和IL-12蛋白加強的質粒免疫小鼠觀察到的很高滴度的ELISA相似。
在接受無佐劑gD亞單位(即傳統製劑)的小鼠組中，如上所述給予的gD亞單位激發高滴度的IgG1#160;ELISA抗體和中至高水平血清中和抗體。傳統配製的亞單位一貫不能誘導IgG2a#160;ELISA抗體或細胞介導(CMI)應答。相比之下，在本發明的實施方案中，與IL-12的聯合製劑擴大了包括IgG2a和CMI的應答。DNA初免和亞單位加強使這種應答模式(稱為1型應答模式)最大化。參見對比的實施例3的結果。
血清學數據的統計學(ANOVA)分析表明，gD#160;DNA和IL-12#160;DNA初免和gD/IL12亞單位加強組(第3組)顯然是實施例2中的最佳應答組。該組還包括第二高的IgG1抗-gD血清滴度，在這方面，除了gDDNA和IL-12#160;DNA初免和gD亞單位加強的第4組之外，在統計學上優於所有其它的組。根據血清抗-HSV中和滴度和IgG2a抗-gD滴度，gD#160;DNA和IL-12#160;DNA初免和gD亞單位加強的第4組是第二佳應答組。第4組和最佳應答的第3組之間的唯一區別是在免疫方案的亞單位加強部分中沒有IL-12，這導致IgG2a抗-gD抗體滴度和血清抗-HSV中和滴度較低。所有中和滴度及其對應的IgG1或IgG2a抗-gD抗體滴度的統計學分析表明，IgG2a抗-gD抗體滴度和抗-HSV中和活性之間存在正相關(P＝0.0001)，而在IgG1滴度和中和滴度之間未觀察到相關性。
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在表2中顯示了淋巴增殖測定的細胞應答結果。該測定列舉了免疫細胞的抗原特異性母細胞化，並用作細胞應答的一級近似值。該測定包括存在測試抗原時再刺激脾(或淋巴結)細胞約5天。然後用氚化胸苷脈衝所述細胞，接著收穫細胞並測定同位素攝取，同位素攝取與DNA合成和細胞分裂相關。該測定的計量單位是每分鐘的脈衝數(CPM)，CPM與同位素攝取直接相關。對照培養基的CPM包括在表2中，以顯示在給定的細胞群中觀察到的任何非特異性活性(即HSV1群具有相對高的背景活性水平，這可能影響對測試抗原的表觀應答程度)。
結果以刺激指數表示，刺激指數即為用測試抗原再刺激的給予特定免疫原的小鼠的脾細胞活性除以用對照再刺激的「相同」細胞群的活性，所述對照包括培養基、Vero細胞培養上清液(sup.)或不相關病毒(A/Tx-一種流感病毒株)。Vero#160;sup.的意義在於所有結果應當為約1.0，對照細胞上清液和培養基再刺激之間沒有差異。特別令人感興趣的列是用gD、HSV1或HSV2(特異性抗原)再刺激的細胞的列。與體液應答相一致，在接受gD和IL-12質粒初免疫苗以及gD和IL-12蛋白加強的小鼠觀察到最大增殖活性。
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圖1以及下表3和表4報告了CTL測定和胞內細胞因子染色測定的結果。未對這些數據進行統計學分析，因為使用了未重複檢測的合併樣品。然而，本領域技術人員應當發現，在大範圍的效應細胞∶靶比值內表現出的應答程度和活性水平相對提高，預示了積極的結果(如下文論述)。
圖1以圖解形式顯示了第1組(gDpl12pl/(2))、第2組(gDpl12pl/gDpl)、第3組(gDpl12pl/gDpr12pr)、第4組(gDpl12pl/gDpr)、第13組(活體HSV1)和第14組(活體HSV2)的CTL活性。這些組相比於其它組都產生了可觀測的CTL活性。然而，用gD和IL-12質粒初免然後用gD亞單位和IL-12蛋白加強產生高水平的CTL活性，與在病毒對照動物於致死的較高效應物∶靶比值觀察到的CTL活性相當。
表3和4顯示了γ-幹擾素和IL-4的胞內細胞因子染色。胞內細胞因子數據與同時攜帶特異性表型標誌(CD3＝全T細胞；CD4＝輔助T細胞；CD8＝細胞毒性T細胞)、細胞活化標誌(CD25)和γ-幹擾素(IFN-γ與1型應答相關)或IL-4(與2型應答相關)的胞內表達標誌的細胞相對頻率相關。進行這些測定，以更好地界定可歸因於免疫方案的細胞因子分泌性細胞的活性狀態和表型，並用作圖1的CTL結果的確證數據。抗原列(Ag)的參比是熱滅活HSV2病毒(HSV2)和HSV感染的A20細胞(A20)。胞內IFN-γ、CD4或CD共受體和CD24#160;T細胞活化標誌的協同染色提示，用gD#160;DNA和IL-12#160;DNA免疫然後用gD亞單位和IL-12蛋白加強導致IFN-γ生產細胞的水平提高。這些觀測結果水平與病毒對照相當，並符合特徵為CD4+表型分布的相似模式。任何處理組都未檢測到IL-4活性，即便有也非常少。一般來說，細胞頻率相對於對照增加約2倍提示發生了生物相關性變化。
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實施例3疫苗接種方案比較A.接種方案在本實驗中使用15組(n＝5隻/組)Balb/C小鼠。第1-5組在第0天用實施例1描述的pMVgD質粒以25μg劑量肌內(i.m.)免疫和用以上實施例1描述的兩種IL-12質粒以35μg/質粒的劑量肌內免疫。第6-7組在第0天僅肌內接受35μg/質粒劑量的以上實施例1描述的兩種IL-12質粒。第8-15組在第0天未接受免疫。
4周後，各組動物接受以下的「加強免疫」第1-5組使用相同劑量和途徑重複給予gD2和IL-12質粒。第6-7組還接受重複劑量的其初免組合物。第8組接受1×105pfu活體感染性野生型HSV1病毒NS株，在第0天以0.03ml/體積經爪墊注射給予。第9組接受2×103pfu活體感染性野生型HSV2病毒186株，在第0天以0.03ml/體積經爪墊注射給予。第10組在第4周未接受給予。第11組接受以3μg劑量肌內給予的全長gD2蛋白。第12組肌內給予全長gD2蛋白(3μg劑量)，佐劑為200μg/劑的磷酸鋁。第13組肌內接受全長gD2蛋白(3μg劑量)和以1μg/二聚體劑量和PBS混合在一起的rmIL-12異二聚體蛋白。第14組肌內接受以磷酸鋁為佐劑的gD2蛋白(0.3μg/劑)和與PBS混合在一起的mIL-12蛋白異二聚體蛋白(1.0μg/劑)。第15組僅接受1μg/二聚體肌內給予的mIL-12蛋白。
在第8周的時間點，對相同組的實驗動物進行如下處理第1組和第8-10組未接受給予。第2組接受第三劑gD2/IL-12質粒(第一劑和第二劑包含gD2/IL-12質粒)。第3組僅接受另一劑gD質粒。第4和13組肌內接受3μg劑量的全長gD2蛋白和以1μg/二聚體劑量和PBS混合在一起的rmIL-12異二聚體蛋白。第5和11組僅接受全長gD2亞單位。第6組僅接受IL-12質粒。第7組僅接受IL-12蛋白。第12組接受第二劑鋁佐劑化gD亞單位。第14組接受第二劑鋁佐劑的gD亞單位和mIL-12異二聚體蛋白。第15組僅接受第二劑mIL-12異二聚體蛋白。
在第12周由所述動物取血並如以上的實施例2所述進行ELISA、中和測定和淋巴增殖測定。B.測定結果下表5顯示了本實驗中各組的ELISA和中和測定滴度。本實驗的結果與以上實施例2的結果相反。接受gD和IL-12質粒兩次免疫然後用無佐劑的gD亞單位加強的組(第3組)的反差最引人注目。由兩劑無蛋白加強的gD質粒和IL-12質粒誘導的ELISA和中和滴度無顯著差異。先前用gD和IL-12質粒重複免疫已觀察到這種類型的觀測結果。相反，用gD和IL-12質粒兩次免疫然後用gD和IL-12蛋白加強(第4組)產生極高的IgG2a#160;ELISA和中和滴度，甚至在與用IL-12蛋白配製的磷酸鋁佐劑亞單位gD兩次接種(第14組)相比時也如此。參見表1後的討論。
血清學數據的統計學(ANOVA)分析表明，接受gD#160;DNA和IL-12DNA兩次免疫並用gD/IL-12蛋白加強的第4組，在最高血清抗-HSV中和滴度和IgG2a抗-gD滴度方面遠優於所有其它組。
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在表6中顯示了上述各組的淋巴增殖測定結果。這些反應與實施例2中各組的反應相似。然而，在再次免疫之後，所有接受3次gD疫苗免疫的第2、3、4和5組都證實淋巴增殖反應高於第14組的刺激指數。與傳統亞單位/AlPO4免疫方案相比，該結果與混合方案初免/加強的作用有關。
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表7顯示了這些組的CTL活性。列舉的這些實驗組的CTL活性包括完整細胞群分析以及選擇性缺失的CD4+或CD8+細胞。表7表明，在得自gD和IL-12質粒兩次免疫並用gD亞單位和IL-12蛋白加強的小鼠的細胞觀察到峰值活性。缺失分析表明，所有組的細胞溶解幾乎都完全歸因於CD4+群，只有觀察到混合表型的HSV2對照例外。縮寫「nd」表示未進行。
這些數據的生物意義在於和傳統治療相比，活性相對提高見於混合方案初免-加強免疫動物。而且，在Balb/C小鼠模型中實際上所有CTL活性都與CD4+細胞群無關的事實與上述胞內細胞因子數據密切相關。因此，初免-加強方案的治療在於CD4/CD25/IFNγ細胞率增加。
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以上實施例2和3描述的結果表明了HSV疫苗程序的初免-加強方案的優勢，其中表達gD2基因和IL-12細胞因子的質粒用於激發免疫應答，然後用由gD2亞單位和IL-12蛋白組成的加強制劑加強。該方案似乎激發Th1為主的應答模式，該應答模式被蛋白加強制劑顯著增強。此外，還增強了該類方案對體液應答和細胞應答作用的數量和質量。
HSV#160;gD亞單位疫苗和IL-12的製劑的引人注目之處在於該細胞因子調節通常與亞單位疫苗相關的應答模式由2型主要應答(特徵為出現IL-4、IL-5、IL-10和主要誘導體液應答)向1型主要模式(具有高水平的IL-2和IFN-γ，與細胞應答以及補體結合IgG亞型有關)轉變的能力。1型應答模式與對許多細胞內病原體的保護性免疫密切相關，據認為是HSV感染的治療性標誌中的重要元素。本發明利用了DNA(HSV#160;gD抗原+IL-12)有效激發免疫系統的能力，然後通過給予蛋白HSV#160;gD糖蛋白和IL-12顯著加強免疫系統。
本文援引的每個專利、專利申請和出版物的公開內容都通過應用整體結合到本文中。儘管已通過具體的實施方案公開了本發明，但顯然本領域其他技術人員可在不偏離本發明的真正精神和範圍的情況下，設計出本發明的其它實施方案和改變。應當將所附的權利要求書理解為包括所有這些實施方案和等同變化。
權利要求
1.一種誘導哺乳動物抗單純皰疹病毒病原體的保護性免疫的方法，該方法包括以下步驟(a)用有效量的DNA疫苗組合物進行至少一次免疫，所述DNA疫苗組合物包括(i)#160;含有編碼1型或2型HSV#160;gD蛋白的DNA序列的第一種核酸分子，和(ii)含有編碼IL-12異二聚體兩種亞單位的DNA序列的第二種核酸分子；以及(b)然後用有效量的蛋白疫苗組合物進行至少一次免疫，所述蛋白疫苗組合物包括(i)1型或2型HSV#160;gD蛋白；和(ii)IL-12異二聚體。
2.按照權利要求1的方法，其中用步驟(a)的DNA疫苗組合物進行兩次免疫。
3.按照權利要求1的方法，其中所述DNA疫苗組合物還包含可與所述核酸分子(i)和(ii)形成複合物的一定量的局部麻醉劑。
4.按照權利要求1的方法，其中在步驟(a)(i)中編碼HSV#160;gD蛋白的所述DNA序列為編碼2型HSV#160;gD蛋白的DNA序列，而且其中在步驟(b)(i)中的所述HSV#160;gD蛋白為2型HSV#160;gD蛋白。
5.按照權利要求1的方法，其中在步驟(a)(i)中編碼HSV#160;gD蛋白的所述DNA序列為編碼1型HSV#160;gD蛋白的DNA序列，而且其中在步驟(b)(i)中的所述HSV#160;gD蛋白為1型HSV#160;gD蛋白。
6.按照權利要求1的方法，其中所述第二種核酸分子包括含IL-12#160;p35序列的DNA編碼序列的第一種質粒和含IL-12#160;p40序列的DNA編碼序列的第二種質粒，其中所述IL-12#160;p35序列的DNA編碼序列與在哺乳動物細胞中控制所述p35蛋白表達的合適啟動子有效連接，所述IL-12#160;p40序列的DNA編碼序列與在哺乳動物細胞中控制所述p40蛋白表達的合適啟動子有效連接。
7.按照權利要求1的方法，其中所述第一種核酸分子包含與在哺乳動物中控制所述gD蛋白表達的合適啟動子有效連接的所述編碼gD的DNA序列。
8.按照權利要求3的方法，其中所述複合物的直徑在約50nm至約150nm之間。
9.按照權利要求3的方法，其中所述局部麻醉劑為丁哌卡因。
10.按照權利要求3的方法，其中所述DNA疫苗組合物還包含一種或多種選自以下的化合物陽離子脂質、中性脂質、陰離子脂質、陽離子表面活性劑、中性表面活性劑、陰離子表面活性劑、陽離子去汙劑、中性去汙劑和陰離子去汙劑。
11.按照權利要求1的方法，其中所述IL-12異二聚體亞單位包含p35亞單位和p40亞單位。
12.按照權利要求1的方法，其中給予所述DNA疫苗後2-32周給予所述蛋白疫苗。
13.一種HSV疫苗藥盒，其包含(a)一種DNA疫苗組合物，其包含(i)含有編碼1型或2型HSV#160;gD蛋白的DNA序列的第一種核酸分子，和(ii)含有編碼IL-12異二聚體兩種亞單位的DNA序列的第二種核酸分子；以及(b)一種蛋白疫苗組合物，其包含(i)1型或2型HSV#160;gD蛋白；和(ii)IL-12異二聚體。
14.按照權利要求13的藥盒，其中所述DNA疫苗組合物還包含可與所述核酸分子(i)和(ii)形成複合物的一定量的局部麻醉劑。
全文摘要
一種誘導和增強哺乳動物抗HSV的保護性和/或治療性免疫的方法，該方法包括以下步驟用有效量DNA疫苗組合物進行至少一次免疫，所述DNA疫苗組合物包含含有編碼1型或2型HSV gD蛋白的DNA序列的第一種核酸分子和含有編碼IL－12異二聚體兩種亞單位的DNA序列的第二種核酸分子。該方法還包括用有效量的蛋白疫苗組合物進行至少一次後續免疫，所述蛋白疫苗組合物包含1型或2型HSV gD蛋白以及IL－12異二聚體。在DNA疫苗組合物中可包括一定量的局部麻醉劑，所述局部麻醉劑可與所述核酸分子形成一種或多種複合物。當將用於本方法的疫苗組合物按照本方案以合適有效劑量提供給哺乳動物時，其在免疫的哺乳動物中產生超乎想像好的保護性和/或治療性抗HSV免疫應答。
文檔編號A61P31/00GK1434864SQ00818918
公開日2003年8月6日 申請日期2000年12月7日 優先權日1999年12月17日
發明者E·M·米斯金, R·J·納圖克, M·W·普裡德, M·K·西德胡 申請人:美國氰胺公司