抗病毒療法應答的預測的製作方法

2023-05-03 06:28:11 1

專利名稱：抗病毒療法應答的預測的製作方法
抗病毒療法應答的預測本發明涉及改善抗病毒療法的處理並涉及用於確定抗病毒療法是否將有效的方法。病毒性感染代表對健康的嚴重威脅並且已知是動物和人發病率的一個主要原因。 例如，C型肝炎病毒(HCV)感染是世界範圍慢性肝臟疾病的主要原因。C型肝炎的一個重要且顯著的特徵是其慢性傾向。在超過70%的感染個體中，HCV建立超過數十年的可能導致硬化和肝細胞癌的持續感染。HCV生物學中的一個有趣假設提出病毒的NS3-4A蛋白酶不僅加工病毒蛋白，還切割並失活探測病毒性感染和誘導I型幹擾素(IFN)轉錄性激活的胞內傳感途徑的組分。 NS3-4A的靶標之一是TRIF (誘導IFN β的含有IlR結構域的接頭蛋白)，它是一種在內體中 TLR3 (Toll樣受體幻檢測dsDNA與IFNii誘導之間的重要紐帶。最近，視黃酸可誘導的基因-I(RIG-I)和MDA5(heliCard)被鑑定為dsRNA的胞內傳感基因。這兩種傳感基因通過 Cardif (也稱作 IPS-I、MAVS、VISA)發信號以誘導 IFNβ 產生。Cardif 可以被 HCV NS3-4A 切割並失活。被鑑定為dsRNA胞內傳感蛋白的兩種RNA解旋酶RIG-I和MDA5通過Cardif 發揮作用以誘導IFNii產生。I型IFN不僅是先天免疫系統的重要組分，也是當前抗CHC療法的最重要組分。當前標準療法由每周一次皮下注射聚乙二醇化IFNa (pegIFNa)和每日攝入口服抗病毒藥利巴韋林組成。該方案在約55%患者中實現整體的持續病毒學應答(SVR)，該應答在基因型之間存在顯著差異。SVR定義為治療期間喪失可檢測的HCV RNA並且在停止治療後繼續不存在至少6個月。對實現SVR的患者的幾項長期隨訪研究表明這種應答在超過95%的患者中是持久的。SVR的可能性強烈依賴於早期治療應答。不顯示早期病毒學應答(EVR)的患者很可能不出現SVR並且可以在這些患者中停止治療，其中所述的早期病毒學應答定義為治療12周後病毒載量降低至少2 Iog100另一方面，具有EVR的患者具有治癒的良好機會，65%的這些患者實現SVR。具有快速病毒學應答(RVR)的患者的預後甚至更好，其中所述的快速病毒學應答定義為治療4周後檢測不到血清HCV RNA。超過85%的這些患者會實現SVR。不幸地是，少於20%的具有基因型1的患者和約60%的具有基因型2或3的患者顯示RVR。對早期治療應答重要的宿主因素目前是未知的。I型IFN通過調節數百種基因(ISG，幹擾素刺激的基因)實現其強烈的抗病毒作用。ISG的轉錄性激活誘導出通常在靜息細胞中不合成並且在細胞內建立非病毒特異性抗病毒狀態的蛋白質。幹擾素通過激活Jak-STAT途徑(一種被許多細胞因子和生長因子使用的細胞信號傳導範例)誘導這些蛋白質合成。所有I型IFN結合至相同的細胞表面受體(IFNAR)並激活受體相關的Janus激酶家族成員Jakl和Tyk2。所述激酶隨後磷酸化並激活信號轉導物和轉錄激活物I(STATl)和STAT2。激活的STAT轉位至細胞核，在那裡它們結合ISG啟動子中的特異性DNA元件。眾多的ISG具有抗病毒活性，不過其他ISG參與脂類代謝、凋亡、蛋白質降解和炎性細胞反應。如同多種病毒那樣，HCV幹擾IFN系統，可能在多個水平上幹擾。IFN誘導的Jak-STAT信號傳導在表達HCV蛋白的細胞和轉基因小鼠中以及CHC患者的肝臟活組織檢查中被抑制。在體外，HCV蛋白NS5A和E2結合併失活一種重要的非特異性抗病毒蛋白即蛋白激酶RO3KR)。但是，目前未知對應答於CHC患者中治療性施用的IFN而言重要的分子機制。(Sarasin-Filipowicz等人，2008，PNAS，105(19) 7034-7039)。HCV在多個不同水平上幹擾IFN途徑的能力是決定HCV成功建立慢性感染的可能機制(Gale，M.，Jr. ^P Foy, Ε. Μ.，Nature 436，939-945 Q005))。但是，極為矛盾的是，在 HCV 急性或慢性感染的黑猩猩中，數百種ISG在肝臟中被誘導(7 Bigger, C. B.等人，J Virol 78,13779-13792(2004)).但是，儘管激活了內源性IFN系統，然而病毒未從慢性感染動物中清除。用黑猩猩獲得的結果難以外推至人，因為HCV感染的病理生物學在這些物種之間存在一些重大差異。大部分急性感染HCV的黑猩猩自發清除病毒，而人類中的感染大多變成慢性。另一方面，幾乎很少能夠用IFN治癒慢性感染的黑猩猩，而成功地治療了超過半數的CHC患者。ISG的誘導也存在於許多CHC患者的治療前肝臟活組織檢查中，這再次表明HCV感染可能導致內源性IFN系統激活(Chen，L.等人，Gastroenterology 128， 1437-1444(2005))。值得注意的是，與具有低初始ISG表達的患者相比較時，具有預先升高的ISG表達的患者傾向於不良地應答於療法(Chen, L.等人，Gastroenterology 128， 1437-1444(2005))。不了解這種差異性治療應答的原因。本發明基於這樣的研究，其中本發明人研究了用pegIFNa治療之前和治療期間的慢性肝炎患者的肝臟活組織檢查和外周血單核細胞(PBMC)的成對樣品中IFN誘導的信號傳導和ISG誘導。本發明人還將生物化學數據和分子數據與治療應答關聯。他們的工作在後附實施例中更詳細地描述。在之前的研究中，本發明人確定了患有肝臟病毒性感染的一些受試者處於「預激活」狀態，從而IFN信號傳導途徑處於用激活的ISG刺激的狀態(Sarasin-Filipowicz等人，2008，PNAS, 105 (19) =7034-7039)。本發明人已經發現此類個體隨後用IFN和抗病毒藥治療時具有不良的抗病毒治療應答或無抗病毒治療應答。相反，另一組感染的受試者沒有預先的IFN受體刺激作用(並且沒有ISG刺激作用)並且該組受試者良好地應答於抗病毒療法(即他們具有快速的病毒學應答(RVR))。另外，可能根據眾多特定基因的表達水平確定受試者是否是治療的不良應答者或具有RVR，其中所述的特定基因中某些是ISG基因。換句話說，本發明人鑑定了作為預後遺傳標記的一組基因，其中所述基因的表達水平預測受試者是否將應答抗病毒治療。在使用pegIFNd治療之前和治療期間慢性肝炎患者的肝臟活組織檢查和外周血單核細胞(PBMC)的成對樣品的進一步研究中，本發明人研究了所述患者的微RNA(miR)。
微RNA (miRNA)是其終產物為約22nt的功能性RNA分子的一類非編碼性RNA基因。 它們從內源編碼的不完整髮夾前體被加工為單鏈RNA。它們似乎通過與靶mRNA的3』 -非翻譯區(UTR)鹼基配對藉助翻譯抑制作用發揮功能(Griffith-Jones等人，2006，Nucleic Acids Research, Vol. 34，D140—D144)。 微RNA(miRNA)生物發生是一個複雜的多步驟過程。初級miRNA轉錄物由RNA聚合酶11轉錄並且可以在大小上是數百至數千個核苷酸長度範圍內(初級miRNA)。miRNA可以追溯至兩個基因組來源。一些miRNA位於蛋白質編碼基因的內含子區域內部。其他miRNA位於非編碼性RNA的內含子或外顯子內部。有趣地，初級miRNA可以編碼單個miRNA，但是也可以含有成簇的幾個miRNA。初級miRNA隨後由胞核核糖核酸酶III (RNA酶III)內切核酸酶 Drosha加工成約70nt的髮夾(前miRNA)。前miRNA隨後從細胞核由核輸出蛋白5/RanGTP 輸出到胞漿中。在胞漿中，第二種RNA酶III(Dicer)連同其dsRBD蛋白夥伴在髮夾的莖區中切割該前miRNA，因而釋放約21核苷酸的RNA雙鏈體。來自該miRNA雙鏈體的一條鏈進入抑制靶基因表達的蛋白質複合體(RNA誘導的沉默複合體(RISC))，而另一條鏈被降解。鏈的選擇取決於該miRNA雙鏈體的局部熱動力學穩定性。其5』末端較不穩定配對的鏈被載入 RISC複合體。載入RISC複合體的miRNA似乎通過與靶mRNA的3』-非翻譯區(UTR)鹼基配對藉助翻譯抑制作用發揮功能(Du，T.和Zam0re，P.D.等人，微引物微RNA的生物發生和功能(micro-Primer :the biogenesis and function ofmicroRNA). Development(2005) 132, 4645-4652)。目前，462 種人 miRNA 序列保存在 miRBase (http //microrna. sanger. ac. uk) 中並且提出此名單會達到800種。迄今鑑定的龐大數目的miRNA暗示它們可能在生物過程的調節和細緻微調中發揮複雜的作用。實際上，幾種miRNA參與細胞增殖調控(mir-12^和 let-7)、造血性B細胞系命運(mir-181)，B細胞存活(mir-15a和mir-16-l)、腦模式建立 (mir-430)、胰腺細胞胰島素分泌(mir-357)、脂肪細胞發育(mir-375)和肌肉增殖與分化 (miR-1和miR-133)。許多miRNA位於涉及癌症的基因組區域中。例如，含有mir-16-l和 mir-15的簇在大部分B細胞慢性淋巴細胞性白血病中缺失和下調(B-CLL ;Calin，G. Α.等人，微 RNA-癌症聯繫新故事的開女臺(MicroRNA-cancer connection :Thebeginning of a new tale). Cancer Res. (2006)66，7390-7394)。miRNA似乎參與基因調節。一些miRNA (包括lin_4和let_7)通過結合至靶mRNA 的部分互補性3』非翻譯區(3』 UTR)來抑制蛋白質合成。其他miRNA(包括植物中存在的 Scarecrow miRNA)像siRNA那樣發揮功能並且與完全互補性mRNA序列結合以摧毀靶轉錄物(Grishok 等人，2001)。隨著科學家開始認識到這些分子在真核基因表達調節中發揮的廣泛作用，對微 RNA的研究正在增加。兩種最充分理解的miRNA(lin-4和let_7)通過調節一個重要mRNA 家族的翻譯而調節秀麗隱杆線蟲(C. elegans)中的發育時序(Pasquinelli，2002中綜述)。 已經在秀麗隱杆線蟲、果蠅、小鼠和人中鑑定了幾百種miRNA。如會對調節基因表達的分子預期的那樣，已經顯示miRNA水平在組織與發育狀態之間不同。此外，一項研究顯示了兩種 miRNA的減少表達與慢性淋巴細胞性白血病之間的強烈關聯，從而提供miRNA與癌症之間的可能聯繫(Calin，2002)。雖然該領域仍然不成熟，但是存在以下推測miRNA可能在調節高等真核生物中基因表達方面與轉錄因子同樣重要。存在幾個在細胞分化、早期發育和細胞過程如凋亡和脂肪代謝方面發揮關鍵作用的miRNA例子，lin-4和let_7均在秀麗隱杆線蟲發育期間調節從一種幼體狀態轉變至另一種幼體狀態(Ambros，200 。mir-14和bantam是顯然通過調節參與凋亡的基因的表達而調節細胞死亡的果蠅miRNA (Brennecke等人，2003，Xu等人，2003)。Mir_14也參與脂肪代謝(Xu等人，2003)。Lsy-6和miR-273是調節化學感覺神經元不對稱性的秀麗隱杆線蟲 miRNA (Chang等人，2004)。調節細胞分化的另一種動物miRNA是miR-181，它指導造血細胞分化(Chen等人，2004)。這些分子代表全部類型的具有已知功能的動物miRNA。增強對 miRNA功能的理解將毫無疑問地揭示對正常發育、分化、胞內與胞間通訊、細胞周期、血管生成、凋亡和許多其他細胞過程做出貢獻的調節網絡。鑑於它們在生物學功能中的重要作用，miRNA可能會提供用於治療性介入或診斷性分析的重要的點。豐富的肝臟特異性miRNA miR-122對於HCV RNA在穩定表達HCV複製子的培養的人肝癌Huh7 細胞中高效複製是重要的(Jopling CL, Yi M, Lancaster AM, Lemon SM, Sarnow P. Science 2005 ；309 :1577-1581) 這個觀察結果引起關於miR-122在HCV感染中的作用和作為潛在治療靶的大量興趣。如本文中所解釋，現有CHC療法由PEG化INF α (pegIFNa) 聯合利巴韋林組成，但是該療法僅在約55%的患者中實現持續的病毒學應答(Maims MP等人，Lancet 2001 ；358 :958-965 ；Fried MW 等人，N Engl J Med2002 ；347 :975-982)。近來據報導，miR-122和其他幾種miRNA的水平在Huh7肝癌細胞和原代小鼠肝細胞中受IFN 調節，並且miRNA可能介導IFN對HCV RNA體外複製的至少某些效應(Pedersen IM等人， Nature2007 ；449 =919-922)。迄今進行的全部實驗均評估了 miR-122在HCV於培養細胞中複製方面的作用。為確定miR-122在患有慢性C型肝炎(CHC)的患者中的狀態，本發明人比較了 miR-122和其他miRNA在肝臟活組織檢查樣品中的水平，其中所述肝臟活組織檢查樣品從正在用pegIFNa和利巴韋林治療的42位CHC患者收集。使用化學合成的miRNA作為標準品，通過定量PCR(qPCR)進行測量。本發明人發現，被劃分為原發性無應答者(PNR) 的不應答於療法而伴有病毒載量在第12周下降超過2 Iogltl的患者比伴有強烈IFNa應答且在第12周具不可檢測到的HCV RNA (完全的早期病毒學應答；cEVR)的患者具有顯著較低水平的miR-122。PNR和cEVR患者之間的差異與肝纖維樣變性的階段無關，表明miR-122 在PNR患者中的下降不歸因於活組織檢查材料中肝細胞的較低比例。另外，當miR-122水平對肝細胞特異性白蛋白mRNA進行歸一化時，各組之間miR-122表達的差異仍是顯著的， 這進一步支持miR-122水平與治療應答之間的直接關聯。臨床研究已經顯示，具有高HCV病毒載量的患者較差地應答於療法(Marms MP等人，Lancet 2001 ；358 :958-965 ；Fried MW 等人，N Engl J Med2002 ;347 :975-982)。由於miR-122對Huh7肝癌細胞中的HCV複製是重要的，故本發明人在無應答者中發現低量 miR-122是令人吃驚的。本發明人測量了所述患者的肝臟和血清中的HCV RNA。沒有觀察到miR-122水平與HCV病毒載量之間的關聯。這些結果與體外獲得的結果相反並且不支持 miR-122在HCV體內複製中的明顯作用(見例如W0-A-2007/1127M，其提出抑制miR-122 用於治療HCV)。無應答者中降低的miR-122水平提出一種可能性miR_122是一種受負調節的IFN靶基因。實際上，miR-122在CHC患者的活組織檢查樣品中的表達顯示負相關於已知的IFN-刺激基因(ISG)的表達。總而言之，現有令人吃驚的結果顯示(i)不應答於IFN療法的患者通常具有比應答者低幾倍的miR-122水平；(ii)peglFNa的施用未對患者肝臟中的miR-122水平產生明顯影響；和(iii)肝內miR-122水平與HCV RNA水平之間不存在關聯。這是出於意料的，因為基於Huh7細胞中的HCV複製子研究，低水平的miR-122應當降低病毒產量並有益於該療法。然而，miR-122水平在PNR中明顯低於cEVR患者的研究結果使miR-122成為一種便利標記物，該標記物例如連同預激活的ISG (Sarasin-Filipowicz M等人，Proc Natl Acad Sci USA 2008,105(19) :7034-7039 ；Chen L 等人，Gastroenterology 2005 ； 128 :1437-1444 ； Asselah T等人，Gut2008 ；57 =516-524)適用於預測IFN療法在CHC患者中的結果。另外， 本發明結果也令人吃驚地顯示(i)不應答於IFN療法的患者通常具有比應答者高几倍的 miR-296-5p水平。這表明miR496-5p並且更一般地表明miRNA可以用於預測IFN療法在CHC患者中的結果。這導致本發明人認識到可以開發一種基於miRNA的方法以幫助臨床決定針對患有肝臟病毒性感染的受試者的治療方案。來自感染個體的miRNA(例如miR-122或 miR-296-5p)的水平可以與來自對照(即無病毒性感染的受試者)的基因表達比較。(與對照相比)具有較低水平miR-122和/或較高水平miR496-5p的感染受試者將不可能得益於治療方案中的IFN使用(即，預期這些個體不會具有RVR)，而與對照表達相比其miR-122水平和/或miR496-5p水平大多未改變或升高的感染受試者有可能得益於 IFN療法並具有RVR。本發明人驚訝於產生這些關聯，原因是本領域已知的體外結果做出相反預測。儘管先前已研究了 「應答」和「非應答」的肝臟病毒性感染受試者中的基因表達水平，例如Chen等人Q005) (Gastroenterology 128，1437-1444，然而作為本發明的一部分所實施的研究調查了廣泛得多的基因集合以確定哪些基因將充當預後標記物。另外，本發明人也評估了不同的miRNA是否可能用作預後標記物。而且，本發明人也分析了抗病毒治療之前和之後所取的樣品中的基因表達水平和miRNA水平，並使用這種信息來鑑定預後的遺傳標記物，而先前的研究僅試圖將治療結果與治療前所取的樣品中存在的基因表達水平關聯。認為導致鑑定到下文所述預後遺傳標記物的數據集合比先前研究中的數據完整且有力得多。因此在本發明的第一方面，提供了用於確定具有肝臟病毒性感染的受試者會應答於包括刺激幹擾素(IFN)活性的抗病毒療法的可能性的方法，該方法包括對來自該受試者的樣品分析miRNA的表達水平並且比較來自受試者的樣品中所述miRNA的表達水平與對照樣品中所述miRNA的表達水平。在本發明的一些實施方案中，miRNA是miR122並且其中與對照樣品中miR-122的水平相比，來自受試者的樣品中較低的miR-122水平表明該受試者很可能不應答於所述抗
病毒療法。在本發明的一些其他實施方案中，所述實施方案可以與上文所述的那些實施方案聯合，miRNA是miR496-5p並且其中與對照樣品中miR496-5p的水平相比，來自受試者的樣品中較高的miR496-5p水平表明該受試者很可能不應答於所述抗病毒療法。在本發明的一些其他實施方案中，分別與對照樣品中miR-122或miR496-5p的水平相比，來自受試者的樣品中未改變或升高的miR-122水平或未改變或降低的miR496-5p 水平分別可以表示該受試者可能應答於所述抗病毒療法。應當理解本發明的方法不限於僅使用一種miRNA，還包括任意miRNA的表達水平與miR-122和/或miR496-5p的那些表達水平的任意組合，或任意相關的miRNA、尤其具有預測力的任意miRNA的組合，其中所述的預測力針對具有肝臟病毒性感染的受試者會應答於抗病毒療法的可能性。在本發明的方法中，抗病毒療法可以是聚乙二醇化的IFN α (pegIFN α )，其任選地與利巴韋林聯合。而且，在本發明的一些實施方案中，病毒性感染是B型肝炎病毒感染或C型肝炎病毒感染。而且，肝臟組織可以用作本發明方法中的樣品。
有利地，也可以在本發明的方法中分析可能預測受試者應答於療法的基因(例如由一些本發明人在先前研究中所發表基因中的一些基因(Sarasin-Filipowicz等人， 2008，PNAS，105(19) :7034-7039))的表達，目的在於提高預測力，可以通過測量樣品中 mRNA基因轉錄物的量或從所述mRNA衍生的cDNA的量，或通過例如使用特異性結合分子測量樣品中由該基因編碼的肽或多肽的量來確定所述的基因表達。在本發明的一些實施方案中，受試者是哺乳動物，例如人。本發明也包括用於實施本發明方法的試劑盒，所述的試劑盒包含用於對來自受試者的樣品分析miRNA例如miR-122或miR496-5p的表達水平的工具；並且任選地包括用於比較來自該受試者的樣品中所述miRNA例如miR-122或miR496-5p的表達水平與對照樣品中所述miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的工具。該試劑盒可以還包含用於分析可能預測受試者應答於療法的至少一種基因的表達的工具，最終包含一種或多種特異性結合分子，所述的特異性結合分子可靶向代表所述至少一種基因的分子，所述的至少一種基因可預測受試者應答於療法，其中所述的特異性結合分子是寡核苷酸探針、抗體或適體； 並且任選地，用於比較樣品中所述基因的表達與對照樣品中相同基因的表達的工具。將理解本發明的方法會極有益於臨床醫生。IFN是蛋白質生長因子並且含有IFN 的藥物製品造價昂貴。因而對臨床醫生極重要的是確信以適宜和經濟的方式使用IFN。而且，與成本無關的是，往往希望儘可能快地消除肝臟病毒性感染。因此，如果臨床醫生施用 IFN並且隨後發現它沒有有益效果，則這是浪費時間(本可以用來使用備選療法)。本發明的方法因而與臨床醫生極有關係，因為他可以鑑定兩個受試者群體。一個群體與對照相比會顯示較低的miR-122水平和/或較高的miR496-5p水平並且因而可能不會從用IFN治療中得益。與對照相比，具有正常或升高的miR-122水平和/或正常或降低的miR496-5p 表達水平的另一個群體會從用IFN治療中得益。在又一個實施方案中，本發明提供了影響具有肝臟病毒性感染的受試者針對抗病毒療法的應答的方法，該方法包括調節miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平，其中所述抗病毒療法包括刺激幹擾素(IFN)活性。miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平可能通過本領域已知的任何合適方法調節。此類方法的例子可以在例如W0-A-2006/13794U W0-A-2007/021896或 W0-A-2007/090073 中找到。「抗病毒療法」意指用於減少涉及刺激IFN活性的病毒性感染的任意治療方案。這種方案可以涉及使用刺激I型IFN活性和/或誘導IFN刺激的基因(ISG)的化合物。該療法可以涉及用IFN本身或其他IFN受體激動劑治療。例如，該療法可以使用聚乙二醇化
IFNa (pegIFNa )。該療法可以僅涉及刺激IFN活性。但是，本發明人已經發現本發明的方法對預測包括使用聯合療法的抗病毒療法的有效性特別有用，其中所述聯合療法包括與已知抗病毒藥聯合的IFN活性刺激物。多種抗病毒藥是本領域已知的並且本發明的方法可以用來評價眾多的不同聯合療法的有效性。但是，本發明人已經發現本發明的方法對於預測與抗病毒藥利巴韋林聯合使用IFN活性刺激物的療法的有效性具有特別的價值。在一個實施方案中，本發明的方法用來預測pegIFNa和利巴韋林作為抗病毒療法的有用性。
本發明的方法可以用來評價針對眾多不同肝臟病毒性感染的療法的有效性，所述肝臟病毒性感染包括B型肝炎病毒感染和C型肝炎病毒感染。在一個實施方案中，該方法用來評價針對C型肝炎病毒(HCV)感染的療法的有效性。本發明人已經發現本發明的方法對區分預期具有快速病毒學應答(RVR)的受試者和沒有快速病毒學應答(無RVR)的那些受試者特別有用。可以根據本發明使用的代表受試者中miR-122水平的樣品包括可以提供關於該受試者中miR-122水平方面信息的任意樣品。合適樣品的例子包括活組織檢查樣品、外科手術期間切下的樣品、血樣、尿樣、痰樣品、腦脊液樣品和拭子樣品(如唾液拭子樣品)。將理解的是樣品來源將取決於該受試者可能患有哪種類型的病毒性感染。在一個實施方案中，樣品來自肝臟組織。已經發現當所述方法用來評估具有HCV 感染的受試者時，肝臟樣品特別具有指示性。本發明人驚訝地發現RVR能夠通過分析 miR-122的水平與無RVR受試者區分。合適的樣品可以包括組織切片，如組織學切片或冰凍切片。可籍以製備此類切片從而能夠提供信息的方法將是本領域技術人員熟知的並且應當參考研究基因表達時意圖使用的技術加以選擇，其中所述信息代表所述切片所來源的受試者中miRNA例如miR-122 或miR496-5p的表達水平。雖然構思了使用包含受試者的組織的一部分的樣品，不過通常可以優選的是代表 miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的樣品包含從這種組織取得的合適提取物，所述提取物能夠進行研究以提供該受試者中關於所述miRNA例如miR-122或miR496-5p的所述水平方面的信息。用於產生能夠提供關於受試者中基因表達方面信息的組織提取物的合適方案是本領域技術人員熟知的。優選的方案可以參考待研究基因表達的方式選擇。在樣品源自肝臟的情況下，合適的製備步驟在實施例中公開。「對照樣品」意指與來自受試者的樣品等同的樣品，該樣品已經來源於並未患有肝臟病毒性感染的個體。雖然構成對照樣品的等同組織樣品或器官樣品或來自此類樣品的提取物可以直接用作對照樣品中miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的信息來源，將理解並且一般優選應當以參考數據的形式提供關於「理想」對照樣品中miRNA例如miR-122或 miR-296-5p的表達水平的信息。這種參考數據可以用指示所選擇對照組織中miRNA例如 miR-122或miR496-5p水平的表格形式提供。備選地，這種參考數據可以用計算機軟體形式供應，所述的計算機軟體含有指示所選擇對照組織中miRNA例如miR-122或miR496-5p 水平的可獲取信息。該參考數據可以例如以算法的形式提供，其中所述的算法能夠比較受試者中至少miRNA例如miR-122或miR496-5p的表達水平與對照組織樣品中這種miRNA 的表達。在對照樣品中miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平欲通過處理構成對照樣品的組織或器官樣品進行研究的情況下，使用與處理來自該受試者的樣品所用的相同方法實施這種處理是有益的。受試者樣品和對照樣品的這種平行處理允許產生程度更大的可信性，從而這些組織中的基因表達比較將相對於另一方進行歸一化(因為與處理組織和研究基因表達的所選方法相關的任意人為影響將應用於受試者和對照樣品這兩者)。本發明的方法可以涉及分析至少miR-122的水平。改變的miR-122水平可以用於確定抗病毒療法有效性的研究結果是令人驚訝的。就現有技術中公布的結果而言，完全出乎意料的是較低的miR-122水平與針對後續IFN療法的不良應答相關。在先前研究中，本發明人已經鑑定到不同的基因，它們的表達水平可以是抗病毒療法結果的預後標記物。涉及miR-122的本發明可以與所述的基因組合，旨在提供更有力的預測。可以被研究的miRNA例如miR-122或miR496-5p的存在、不存在和/或水平通常將使用合適的探針分子檢測。這種檢測會提供miRNA例如miR-122或miR496-5p的存在、 不存在和/或水平方面的信息並且因而允許在出現於受試者中的miRNA例如miR-122或 miR496-5p和出現於對照樣品中的那些miRNA的水平之間比較。探針通常將能夠直接或間接地與該miRNA例如miR-122或miR496-5p特異性結合。隨後可以評估此類探針的結合作用並使之與該miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平關聯，以允許受試者與對照之間的有效預後性比較。「改變的表達」包括與對照相比時樣品中的基因表達升高或降低，如上文所討論。相反地，「未改變的表達」包括與對照相比時樣品中的基因表達不升高或不降低， 如上文所討論。評估miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平和基因表達是否改變或未改變可以可以使用統計分析的常規方法進行。靶分子可以是肽或多肽。使用特異性結合分子，例如抗體，可以確定肽或多肽的量。在一個優選的例子中，可以參考樣品中靶蛋白的生物學活性評估該樣品中存在的某些靶蛋白的量。以這種方式評估和比較表達在具有酶活性的蛋白質靶的情況下是特別合適的。用於測量樣品中存在的蛋白質靶的量的合適技術包括但不限於基於適配子和抗體的技術，如放射免疫測定法(RIA)、酶聯免疫測定法(ELISA)和蛋白質印跡法。為了本發明的目的，將「核酸」或「核酸分子，，理解為指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。另外，除非上下文另外要求，應當認為這些術語包括天然核苷酸的已知類似物，其中所述的已知類似物可以按照類似於天然存在核苷酸的方式發揮作用。而且，將理解適用於本發明的靶核酸不需要包含「全長核酸」(例如全長基因轉錄物)，而僅需要包含允許探針分子特異性結合的足夠長度。在本發明方法的一個實施方案中，可以通過裂解取自合適樣品的細胞(這可以使用市售的裂解緩衝液如Qiagen有限公司生產的裂解緩衝液實現)，隨後使用市售的核酸分離柱(如Qiagen有限公司生產的RNeasy微量離心柱)離心裂解物的方法處理樣品以分離RNA靶分子。用於RNA提取的其他方法包括Chomczynski，P.和&icchi，N. (1987) AnalyticalBiochemistry 162，156. 「通過酸硫氰酸胍-酚-氯仿提取的單步驟RNA分離方法(Single Step Method of RNA Isolation by Acid GuanidiniumThiocyanate-Pheno I-Chloroform Extraction)，，的酚和異硫氰酸胍方法的變更方式。以這種方式獲得的RNA 可以構成合適的靶分子本身或可以充當模板用於產生代表miR-122的水平的靶分子。在評估所選擇基因的表達旨在獲得更有力預測值的情況下，可以優選來源於受試者或對照樣品的RNA可用作cDNA合成的底物，例如，使用Superscript系統Gnvitrogen Corp.)。所得的cDNA隨後可以使用BioArrayRNA轉錄物標記試劑盒(Enzo Life SciencesInc.)轉變成生物素化cRNA，並且使用RNeasy微量試劑盒Oliagen Ltd)從反應混合物中純化出這種cRNA。可以從來源於受試者或對照樣品的組織中直接測量代表基因表達的mRNA， 無需mRNA提取或純化。例如，目的受試者或對照樣品中存在的並代表基因表達的mRNA可以使用這種組織的恰當固定的切片或活組織檢查樣品進行研究。這種類型樣品的使用可以在可與其開展表達比較的快速性方面提供益處，以及可以用來產生該樣品的相對便宜且簡單的組織處理過程。原位雜交技術代表可以在這種類型的組織樣品中研究和比較基因表達的優選方法。維持受試者或對照樣品中代表基因表達的RNA的可獲得性的目的組織處理技術是本領域技術人員熟知的。但是，可以提取和收集受試者或對照樣品中代表基因表達的 mRNA的技術也是本領域技術人員熟知的，並且本發明人已經發現可以有利地在本發明中使用此類技術。包含來自受試者或對照樣品的提取的mRNA的樣品可以優選用於本發明第三方面的方法中，因為此類提取物傾向於比包含原始組織的樣品更易於研究。例如，允許比較基因表達的合適靶分子可以包含從受試者來源的組織樣品或從對照組織樣品分離的總 RNA。而且，可以容易地擴增提取的RNA以產生放大的mRNA樣品，其中所述放大的mRNA樣品能夠提供關於受試者或對照樣品中基因表達的增多的信息。用於提取和擴增mRNA群體的技術的合適例子是熟知的，並在下文更詳細地考慮。例如，分離和純化核酸以產生本發明適用的核酸靶的方法在P. Ti j sseη編著的 Elsevier, N. Y. (1993)Laboratory Techniques in Biochemistry andMoIecuIar Biology !Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation的第3章中詳細描述。當想要在研究和比較基因表達之前擴增核酸靶的情況下，可以優選使用維持或控制所擴增核酸在來源該樣品的受試者或對照組織中相對頻率的方法。「定量」擴增的合適方法是本領域技術人員熟知的。一個熟知例子即定量PCR涉及同時地共擴增已知其量在對照與受試者樣品之間不改變的對照序列。這提供了可用來校準 PCR反應的內部標準。除上文概述的方法之外，技術人員會知道將擴增基因-轉錄物特異性產物偶聯於信號產生的任何技術也可以適用於定量。一個優選的例子使用針對聚合酶鏈反應的便利改進(US 4683195和468320 ，所述的便利改進通過摻入mRNA的初始逆轉錄至cDNA而使聚合酶鏈反應適於特定mRNA轉錄物的精確定量。其他關鍵性改進能夠隨反應進程而實時測量積累的PCR產物。在許多情況下，可以優選使用能夠指示相關樣品中靶分子存在性的探針分子評估受試者或對照樣品中的基因表達程度。可以參考待研究的基因表達的(直接或間接)產物選擇探針。合適探針的例子包括具有適宜特異性的寡核苷酸探針、抗體、適配子和結合性蛋白質或小分子。寡核苷酸探針可以用作探針。合適寡核苷酸探針的產生是本領域技術人員熟知的(《寡核苷酸合成方法和應用》Piet Herdewijn(編著)(Oligonucleotide synthesis Methods and Applications, HumanaPress (2004)) 寡核苷酸和修飾的寡核苷酸是從眾多公司可商業獲得的。出於本發明的目的，寡核苷酸探針可以認為包含能夠通過一個或多個類型的化學鍵與具有互補序列的核酸靶分子特異性雜交的寡核苷酸。這種結合通常可以藉助互補鹼基CN 102159725 A
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配對並通常藉助氫鍵形成發生。合適的寡核苷酸探針可以包括天然鹼基(即A、G、C或T) 或修飾的鹼基(7-脫氮鳥苷、肌苷等)。此外，除磷酸二酯鍵之外的鍵也可以用來連接寡核苷酸探針中的鹼基，只要這種變異不幹擾該寡核苷酸探針與其靶雜交。因此，適用於本發明方法中的寡核苷酸探針可以是其中組成鹼基由肽鍵而非磷酸二酯鍵連接的肽核酸。如本文中所解釋，微RNA分子(「miRNA」)的長度通常是21至22個核苷酸，儘管已經報導了 17和直至25個核苷酸的長度。多種miRNA各自從較長的前體RNA分子(「前體miRNA」)加工而來。前體miRNA從不編碼蛋白質的基因轉錄而來。前體miRNA具有能夠形成莖環樣或折回樣結構的兩個互補性區域，所述的莖環樣或折回樣結構由動物中稱作 Dicer的酶切開。Dicer是核糖核酸酶III樣核酸酶。加工的miRNA —般是該莖的一部分。經加工的miRNA (也稱作「成熟miRNA」 )變成一個下調特定靶基因的大複合體的部分。動物miRNA的例子包括阻滯翻譯的與靶發生不完全鹼基配對的那些miRNA (Olsen等人，1999 ；Seggerson等人，200 。siRNA分子也由Dicer加工，但是來自長的雙鏈RNA分子。siRNA不天然地存在於動物細胞中，但是它們可以在此類細胞中的RNA誘導的沉默複合體(RISC)內發揮功能以指導mRNA靶的序列特異性切割(Denli等人，2003)。對內源miRNA分子的研究例如在美國專利申請60/575，743中描述。當成熟的單鏈RNA被一個調節與合成性miRNA雜交的mRNA翻譯的蛋白質複合體結合時，該miRNA在細胞中明顯地有活性。導入以與內源表達的miRNA相同的方式影響細胞的外源RNA分子要求序列與內源性成熟miRNA相同的單鏈RNA分子應當被促進翻譯性調控的蛋白質複合體攝取。已經評價了多種RNA分子設計。已經鑑定了使miRNA途徑攝取想要的單鏈miRNA最大化的3種通用設計。將帶有具備所述3種設計至少之一的miRNA序列的RNA分子稱作合成性 miRNA。在一些實施方案中，本發明的合成性miRNA包含兩種RNA分子，其中一種RNA與天然存在的成熟miRNA相同。與成熟miRNA相同的RNA分子稱作活性鏈。稱作互補鏈的第二 RNA分子至少部分地互補於活性鏈。活性鏈和互補鏈雜交以產生與天然存在的miRNA前體相似的稱作合成性miRNA的雙鏈RNA，其中所述的miRNA前體在細胞中的miRNA激活之前即刻被蛋白質複合體結合。最大化合成性miRNA的活性要求在翻譯水平調節基因表達的 miRNA蛋白質複合體對活性鏈的攝取最大化和對互補鏈的攝取最小化。提供最適miRNA活性的分子設計涉及對互補鏈的修飾。兩種設計在互補鏈中摻入化學修飾。第一修飾涉及產生在其5』末端具有除磷酸酯或羥基之外的化學基團的互補性RNA。5』修飾的存在明顯消除了 miRNA蛋白質複合體對互補鏈的攝取並且隨後支持其對活性鏈的攝取。5』修飾可以是包括NH2、NHC0CH3、生物素等在內的多種分子之任一者。顯著減少miRNA途徑攝取互補鏈的第二化學修飾策略是在互補鏈的頭2_6個核苷酸中摻入帶有糖修飾的核苷酸。應當指出符合第二設計策略的糖修飾可以與符合第一設計策略的5』末端修飾聯合以進一步增強合成性miRNA的活性。第三合成性miRNA設計涉及在互補鏈的3』末端摻入不互補於活性鏈的核苷酸。所得活性RNA和互補性RNA的雜交體在活性鏈的3』末端處是極穩定的，但在活性鏈的5』末端處是相對不穩定的。用siRNA的研究表明5』雜交體穩定性是支持RNA幹擾的蛋白質複合體攝取RNA的關鍵指標，其至少與細胞中的miRNA途徑有關。在互補RNA鏈中審慎使用錯配顯著地增強合成性miRNA的活性。如本文中所解釋，術語「miRNA」通常指單鏈分子，但是在具體的實施方案中，本發明中實現的分子還會包含一個區域或一條額外鏈，其部分地(在鏈長度範圍內10%與50% 之間互補)、基本上(在鏈長度範圍內大於50%但小於100%互補)或完全互補於相同單鏈分子的另一個區域或如此互補於另一個核酸。因此，核酸可以包含這樣的分子，其包含了包含某分子的特定序列的一條或多條互補鏈或自我互補鏈或者「互補物」。例如，前體miRNA 可以具有多達100%互補的自我互補區域。合成性miRNA —般包含兩條鏈，與正在研究的成熟miRNA在序列上相同的活性鏈和與該活性鏈至少部分互補的互補鏈。活性鏈是生物學相關分子並且應當優選地被細胞中藉助mRNA降解或翻譯性調控作用調節翻譯的複合體攝取。對活性鏈的優選性攝取產生兩個深遠結果(1)觀察到的合成性miRNA的活性大幅度地增長並且O)因攝取和激活互補鏈所誘導的非預期效應基本上消除。根據本發明，可以使用幾種合成性miRNA設計來確保對活性鏈的優選性攝取。在互補鏈的5』末端導入除磷酸酯或羥基之外的穩定部分損害了互補鏈在miRNA 途徑中的活性。這確保僅使用合成性miRNA的活性鏈來調節細胞中的翻譯。5』修飾包括但不限於NH2、生物素、胺基、低級烷胺基、乙醯基、2 O-Me, DMT0、螢光素、硫氫基或吖啶或具有這種類型官能性的任意其他基團。其他的有義鏈修飾。在合成性miRNA的互補鏈中導入核苷酸修飾如2』 _0Me、NH2、 生物素、胺基、低級烷胺基、乙醯基、DMT0、螢光素、硫氫基或嚇唳或具有這種類型官能性的任意其他基團可以消除互補鏈的活性並增強對該miRNA的活性鏈的攝取。如同siRNA(Schwarz 2003)那樣，合成性miRNA的活性鏈5』和3』末端的相對穩定性顯然決定了 miRNA途徑對該活性鏈的攝取和激活。通過策略性替換合成性miRNA的互補鏈3』末端中的鹼基錯配致合成性miRNA的活性鏈5』末端去穩定化增強了活性鏈的活性並且基本上消除互補鏈的活性。miR-122(也稱作miRNA-1222、22-核苷酸微RNA)從轉錄自基因her的肝臟特異的非編碼性聚腺苷酸化RNA衍生。從哺乳動物物種直至魚類，miR-122的確切序列以及在her mRNA內部的相鄰二級結構是保守的。miR-122在小鼠肝臟中的水平在胚發生的約第17日增加至50%最大值，並且在出生前達到平均每個細胞50，000個拷貝的幾乎最大水平(它佔據70%的全部miRNA) (Chang等人，2004 ；Lagos-Quintana等人，200 。它是據認為對於建立基因表達模式重要的許多組織特異性微RNA之一，其中所述的基因表達模式可能負責維持組織的分化狀態(Lagos-Quintana等人，2002 ；Lim等人，2005)。如本文中所用的短語「特異性雜交至」指寡核苷酸探針偏好地與特定靶核苷酸序列在嚴格條件下結合、形成雙鏈體或雜交，此時所述序列存在於複雜混合物(如總細胞DNA 或RNA)中。在一個實施方案中，探針可以僅與特定靶分子結合、形成雙鏈體或雜交。術語「嚴格條件」指這樣的條件，在所述條件下探針將與其靶的子序列雜交，而最小程度地與其他序列雜交。在一些實施方案中，探針可以在嚴格條件下與除該探針靶之外的序列不雜交。嚴格條件具有序列依賴性並且在不同的環境中會不同。較長的序列在更高的溫度上特異性雜交。通常，可以將嚴格條件選擇為在定義的離子強度和pH上，低於特定序列的熱解鏈溫度(Tm)約5°C。1是(在定義的離子強度、pH和核酸濃度下)與靶核酸互補的50%寡核苷酸探針與該靶核酸平衡雜交的溫度。由於靶核酸一般過量存在，50%的探針在Tm被平衡地佔據。例如，嚴格條件將是這些條件，其中鹽濃度是在PH 7.0至8. 3至少約0.01至1.0M Na+離子濃度(或其他鹽)並且溫度對於短探針(例如10至50個核苷酸)是至少約30°C。 嚴格條件也可以通過添加去穩定劑如甲醯胺來實現。寡核苷酸探針可以用來檢測合適代表性樣品中的互補性核酸序列(即核酸靶)。 這種互補結合作用形成可以使用寡核苷酸來檢測並因而允許比較特定基因表達的大部分技術的基礎。一些合適的技術允許平行地量化多種基因的表達並且包括其中實時地將物質種類擴增與量化偶聯的技術(如定量逆轉錄PCR技術)和其中經擴增的物質種類的量化在擴增後進行的技術，如陣列技術。陣列技術涉及代表受試者或對照樣品的樣品與多種寡核苷酸探針雜交，其中每種探針偏好地與公開的一種基因或多種基因或miRNA雜交。陣列技術提供對特定寡核苷酸序列的獨特鑑定，例如通過其物理位置(例如，如AfTymetrix Inc.商業提供的二維陣列中的網格)或通過與另一個特徵關聯(例如，標記的珠子，如Illumina Inc或Luminex Inc商業提供)進行鑑定。寡核苷酸陣列可以原位地合成(例如通過光定向合成，如Affymetrix Inc商業提供)或通過(如Agilent或Applied Biosystems商業提供的)接觸或噴墨技術預形成和點樣。對於本領域技術人員顯而易見的是完整或部分的cDNA序列也可以充當陣列技術的探針(如商業地由Clontech提供)。寡核苷酸探針可以在印跡技術如DNA印跡或RNA印跡中用來檢測和比較基因表達 (例如通過代表基因表達的cDNA或mRNA靶分子)。適用於DNA印跡或RNA印跡技術中的技術和試劑將是本領域技術人員熟知的。簡而言之，將包含DNA(在DNA印跡的情況下)或 RNA (在RNA印跡的情況下)靶分子的樣品根據它們穿透凝膠材料如丙烯醯胺或瓊脂糖的能力分離。凝膠的穿透可以由毛細管作用或電場活動驅動。一旦已經實現靶分子的分離，將這些分子轉移至薄膜(通常是尼龍或硝化纖維素)，隨後固定在該膜上(例如通過焙烘或通過紫外線照射)。隨後可以通過寡核苷酸探針與結合至該膜的靶分子雜交檢測並比較基因表達。在某些情況下，使用比較基因表達的常規雜交方案可能證明是有問題的。例如，印跡技術可能難以區別分子量大致相同的兩種或多種基因產物或miRNA，因為難以使用凝膠分開大小相似的產物。因此，在這種情況下，可以優選使用備選技術(如下文所述的那些技術)比較基因表達。可以參考合適核酸樣品中的整體轉錄物水平，通過高密度寡核苷酸陣列技術評估代表受試者中基因表達和/或miRNA水平的樣品中的基因表達。此類技術利用了其中寡核苷酸探針(例如通過共價結合作用)束縛至固體支持物的陣列。這些固定於固體支持物上的寡核苷酸探針陣列代表在本發明的方法和試劑盒中待用於基因表達比較的優選組分。可以按照這種方式結合龐大數目的此類探針以提供適於比較大量基因或miRNA的表達的陣列。因此，會認識到此類寡核苷酸陣列可以在想要比較多於一種miRNA和/或基因的表達的實施方案中是特別優選的。可以在比較代表基因表達的核酸靶中使用的其他合適方法學包括但不限於基於核酸序列的擴增(NASBA)或滾環DNA擴增(RCA)。
通常希望將探針標記，旨在可以輕易地檢測到這些探針。可以在標記根據本發明適用的探針或靶標中使用的可檢測部分的例子包括通過光譜學、光化學、生物化學、免疫化學、電學、光學或化學手段可檢測的任意組合物。合適的可檢測部分包括多種酶、輔基、螢光物質、發光物質、生物發光物質、放射活性物質和比色物質。這些可檢測部分適於摻入可以用於本發明方法中的全部類型的探針或靶，除非有相反說明。合適酶的例子包括辣根過氧化物酶、鹼性磷酸酶、β -半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶；合適輔基複合體的例子包括鏈黴抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素； 合適螢光物質的例子包括傘形酮、螢光素、異硫氰酸螢光素、羅丹明、二氯三嗪胺螢光素 (dichlorotriazinylamine fluorescein)、丹磺醯氯、藻紅蛋白、德克薩斯紅、羅丹明、綠色螢光蛋白等；發光物質的例子包括魯米諾；生物發光物質的例子包括螢光素酶、螢光素和水母發光蛋白；合適放射性物質的例子包括125I、131I、35S、3H、14C或32P ；合適比色測定物質的例子包括膠體金或有色玻璃或塑料(例如聚苯乙烯、聚丙烯、乳膠等)珠。檢測此類標記物的手段是技術人員熟知的。例如，可以使用膠片或閃爍計數器檢測放射標記物；可以使用檢測發射光的光探測器檢測螢光標記物。酶標記物一般通過向酶提供底物並檢測因該酶作用於此底物所產生的反應產物檢測，並且比色測定標記物通過簡單地觀察有色標記物檢測。在本發明的一個實施方案中，可以掃描螢光標記的探針或靶並且使用雷射共聚焦掃描儀檢測螢光。在標記的核酸探針或靶的情況下，合適的標記過程可以在雜交之前、期間或之後進行。在一個實施方案中，核酸探針或靶在雜交之前被標記。螢光標記物也是適合的，並且在使用時，通過量化來自雜交的螢光標記核酸的螢光量化核酸探針與其核酸靶的雜交。量化可以源自結合摻入核酸的半抗原的螢光標記試劑實施。在本發明的一個實施方案中，可以使用合適的分析軟體如微陣列分析軟體包 (Affymetrix Inc.)實現雜交分析。可以使用螢光顯微鏡實現有效的量化，其中所述的螢光顯微鏡可以配備有自動載物臺以允許自動掃描陣列，並可以配備有用於自動測量、記錄和後續加工螢光強度信息的數據獲取系統。這種自動化的合適布局是常規的並且是本領域技術人員熟知的。在一個實施方案中，通過檢測連接至雜交的核酸的一種或多種可檢測部分檢測所述核酸。可檢測部分可以通過本領域技術人員熟知的多種方法中任意方法摻入。但是在一個實施方案中，在樣品核酸(探針或靶)製備中的擴增步驟期間同時摻入此類部分。因而例如，使用以可檢測部分標記的引物或核苷酸的聚合酶鏈反應(PCR)將提供用所述部分標記過的擴增產物。在一個備選的實施方案中，使用螢光標記的核苷酸(例如螢光素標記的 UTP和/或CTP)的轉錄擴增將該標記物摻入轉錄的核酸。備選地，可以將合適的可檢測部分直接添加至原始核酸樣品(例如來自目的組織的mRNA、polyA mRNA、cDNA等)或在原始核酸擴增結束後添加至擴增產物。將標記物如螢光標記物連接至核酸的方法是本領域技術人員熟知的並且包括例如切口翻譯或通過激酶處理核酸(例如用標記的RNA)進行末端標記並隨後連接核酸接頭，其中所述核酸接頭將樣品核酸與標記物(如合適的螢光團)連接。儘管本發的方法最合適與人受試者結合使用，然而它也可以用於確定非人動物
15(例如馬、犬、牛、駱駝)中病毒性感染的治療過程。在先前研究中，本發明人確立了內源性IFN系統在眾多感染的患者中被持久地激活。另外，本發明人驚訝於具有預激活的IFN系統的患者與不良的IFN療法應答相關。這個研究結果是違背直覺的，因為人們本來預期活躍的先天免疫系統在IFNa療法期間將幫助消除病毒。本發明人分析了肝臟活組織檢查中的ISG表達並且進一步得出結論存在其中 HCV出人意料地誘導(不阻斷)內源性IFN系統的患者，並且存在其中HCV不誘導(可能通過切割TRIF和/或Cardif所致)內源性IFN系統的患者，不過這種差異不影響HCV維持慢性感染的能力。在IFN系統沒有預激活的患者中，發明人發現pegIFNa 2b在4小時內誘導肝臟中眾多ISG的強烈(次)最大上調。出人意料地，這種高ISG表達水平已經存在於稍後不顯示第4周快速病毒學應答的患者的治療前活組織檢查樣品中。還發現與HCV基因型2或3感染患者相比，內源性IFN系統的預激活更頻繁地存在於HCV基因型1 (和4)感染患者的肝臟活組織檢查樣品中。這是令人好奇的，因為眾所周知與基因型1感染患者低於50%的治癒相比，可以治癒超過80%的基因型2和3感染患者。本發明人的研究結果即內源性IFN系統預激活的頻率和程度依賴於HCV基因型為對 HCV基因型治療的不同易感性提供了解釋。本發明人認識到這些數據確立了 HCV幹擾IFN信號傳導並且因而損害治療應答。 而且，HCV抑制IFNa信號傳導解釋了內源性IFN系統的強烈預激活為何不導致自發消除 HCV。本發明人不希望受任何假設約束，不過相信這意味著IFNa將不會在感染HCV的肝細胞中誘導抗病毒狀態。在眾多患者的肝臟中觀察到的ISG上調隨後僅將出現於非感染的肝細胞中。肝臟活組織檢查中存在的ISG強烈誘導與這種模型一致，因為未感染的肝細胞比感染的肝細胞更多。在沒有成功切割Cardif和/或TRIF的病毒感染的肝細胞中會出現 IFN^產生。因為HCV誘導的Jak-STAT途徑抑制，分泌的IFNii將不在這些感染的肝細胞中而僅在未感染的毗鄰細胞中誘導抗病毒狀態。「減少」意指物質有效減少ISG的刺激，從而ISG的表達水平沒有顯著不同於對照組織中的表達水平。所述物質可以在治療眾多不同的肝臟病毒性感染中使用，所述肝臟病毒性感染包括B型肝炎病毒感染和C型肝炎病毒感染。在一個實施方案中，所述物質用來預防或減少C型肝炎病毒(HCV)感染。可以根據本發明使用的物質的例子包括以下情況，其中該物質可以結合至IFNa 多肽並阻止IFN功能活性，例如抗體和其片段和衍生物(例如結構域抗體或Fab)。備選地， 該物質可以通過充當針對IFNa受體(例如IFNAR1、IFNAR2a、b或c)拮抗劑作為IFN系統的競爭性抑制劑發揮作用。備選地，該物質可以抑制IFN途徑中的酶或其他分子。備選地，該物質可以以如此方式結合至編碼IFN α多肽的mRNA，從而導致減少該mRNA並因而減少IFNa多肽。備選地，該物質可以以如此方式結合至編碼IFNa的核酸序列，從而導致減少所轉錄的編碼IFN α多肽的mRNA的量。例如，該物質可以結合至IFN α基因的編碼區或非編碼區或結合至IFN的DNA的5』或3』並因而減少該蛋白質的表達。存在眾多不同的人幹擾素α多肽序列。共有序列已經確定。該信息可以由技術人員用來開發針對IFNa多肽的結合物質。當所述物質結合至IFNa多肽時，優選該物質結合至由已經正確摺疊成其天然形式的蛋白質所定義的表位。應理解物種之間和基因型之間可以存在一些序列變異。因此， 其他的優選表位包含來自基因變體的等同區域。可以使用以上在本發明第一方面中概述的序列相似性和同一性工具和資料庫搜索方法鑑定來自其他IFN多肽的等同區域。抗體可以通過注射抗原至動物作為多克隆血清產生。例如，可以通過使用本領域已知的技術，以抗原(例如完整IFNa多肽或其片段)接種動物(例如兔)產生多克隆抗體。備選地，抗體可以是單克隆的。常規雜交瘤技術可以用來產生此類抗體。用來產生本發明中使用的單克隆抗體的抗原可以與用來產生多克隆血清的抗原相同。在其最簡單的形式下，抗體或免疫球蛋白是通常用抗體的Y-免疫球蛋白(IgG) 類作為例子的Y形分子。該分子由四條多肽鏈每條分別大約50kD的兩條相同重鏈(H)和每條分別大約25kD的兩條相同輕鏈(L)組成。每條輕鏈通過二硫鍵和非共價鍵與重鏈結合(H-L)。兩個相同的H-L鏈組合通過與兩條H鏈之間相似的非共價鍵和二硫鍵連接以形成基本的四鏈免疫球蛋白結構(H-L)2。輕鏈免疫球蛋白由1個V-結構域(yL)和1個恆定結構域(CJ組成，而重鏈由1 個V-結構域和取決於H鏈同種型的3個或4個C-結構域(CH1、Ch2、Ch3和CH4)組成。在序列上變動巨大的可變(V)結構域位於每條輕鏈或重鏈的氨基端區域並且負責與抗原的特異性結合。抗體對抗原的特異性實際上由V區內部稱作高變環或互補決定區 (⑶R)的胺基酸序列決定。每條H鏈和L鏈的V區具有3個這樣的⑶R，並且正是全部6個 CDR的組合才形成抗體的抗原結合位點。顯示較少變異並支撐高變環的其餘V區胺基酸稱作構架區(FR)。可變結構域之外的區域(C-結構域)在序列上相對恆定。將理解本發明抗體的表徵特性是Vh和\結構域。將進一步理解總體而言Ch和Q結構域的確切本質對本發明是不重要的。實際上，用於本發明中的優選抗體可以具有極不同的C1^nQ結構域。另外，如下文更充分地討論，優選的抗體功能性衍生物可以包含沒有C-結構域的可變結構域(例如 scFV抗體)。在一個物種中產生的抗體並且尤其是mAb已知用來治療一個不同物種時具有幾個嚴重的缺點。例如在人類中使用鼠抗體時，這些抗體總是具有血清中短的循環半壽期並且可以被正在治療的患者的免疫系統識別為外來蛋白。這可以導致不希望的人抗小鼠抗體 (HAMA)應答發生。當需要頻繁施用抗體時，這尤其麻煩，因為該抗體可以增強其清除作用、 阻斷其治療作用並誘導超敏反應。這些因素限制了小鼠單克隆抗體在人療法中的使用並且促進抗體工程技術的發展以產生人源化抗體。因此，在意圖使用能夠降低IFN活性的抗體作為治療劑以在人受試者中治療HCV 感染的情況下，則優選使非人來源的抗體和其片段被人源化。可以通過將V區序列(例如源自非人雜交瘤中產生的單克隆抗體)與來自人抗體的C區(並且理想地是來自V區的F 序列剪接起來實現人源化。所得的「工程化」抗體在人中比衍生所述工程化抗體的非人抗體具有更小的免疫原性並且因而更好地適於臨床用途。
人源化抗體可以是其中使用重組DNA技術將嚙齒類免疫球蛋白恆定區替換為人抗體恆定區的嵌合單克隆抗體。嵌合H鏈和L鏈基因隨後可以克隆到含有合適調節元件的表達載體並導入哺乳動物細胞以產生充分糖基化的抗體。通過為該過程選擇適宜的人H鏈 C區基因，可以預先確定抗體的生物學活性。此類嵌合分子可以根據本發明用來治療或預防癌症。抗體的進一步人源化可以涉及抗體的⑶R移植或重構。通過移植非人抗體的重和輕鏈CDR(其形成抗體的抗原結合位點)至人抗體的相應構架區產生此類抗體。人源化抗體片段代表根據本發明使用的優選物質。可以通過篩選人抗體可變鏈的噬菌體文庫鑑定識別IFNa多肽或IFN受體上表位的人FAb。本領域已知的(例如由 Morphosys或Cambridge Antibody ^Technology開發的)技術可以用來產生可以作為本發明物質使用的Fab。簡而言之，人組合Fab抗體文庫可以通過將源自單鏈Fv文庫的重和輕鏈可變區轉移至Fab展示載體產生。該文庫可以產生2. IXlOici種不同的抗體片段。該肽隨後可以用作「釣餌」從該文庫鑑定具有所需結合特性的抗體片段。結構域抗體(dAb)代表可以根據本發明的這個實施方案使用的另一種優選物質。 dAb是抗體的最小功能性結合單位並且對應於人抗體重或輕鏈的可變區。此類dAb可以具有約13kDa的分子量(對應於完整抗體的約1/10 (或更小)尺寸)。適配子代表本發明第三和第四方面的另一種優選物質。適配子是採取特定的序列依賴性形狀並且基於適配子與配體之間的鎖-鑰匹配而與特定靶配體結合的核酸分子。一般而言，適配子可以包含單鏈或雙鏈DNA分子(ssDNA或dsDNA)或單鏈RNA分子(ssRNA)。 適配子可以用來結合核酸靶和非核酸靶。因此，可以產生識別並因而降低IFNa的活性或表達的適配子。可以從隨機序列匯集物選擇合適的適配子，從所述隨機序列匯集物中可以鑑定以高親和力與所選靶分子結合的特定適配子。用於產生和選擇具有所需特異性的適配子的方法是本領域技術人員熟知的並且包括SELEX(指數富集的配體系統進化)法。簡而言之，產生大的寡核苷酸文庫，從而允許通過反覆的體外選擇過程並隨後通過聚合酶鏈反應擴增來分離龐大數目的功能性核酸。反義分子代表用來治療患者的另一種優選物質。反義分子一般是這樣的單鏈核酸，該單鏈核酸可以與一種基因產生的互補核酸序列特異性結合併使該基因失活，從而有效地「關閉」該基因。如技術人員所理解，該分子稱作「反義」，原因是它互補於稱作「有義」 序列的該基因的mRNA。反義分子一般是15至35鹼基長度的DNA、RNA或化學類似物。反義核酸已經實驗地用來結合於mRNA並阻止特定基因的表達。這已經導致發展「反義療法」 作為治療癌症、糖尿病和炎性疾病的藥物。反義藥物最近已經由美國FDA批准用於人類治療用途。因此，通過設計針對編碼IFN多肽的多核苷酸序列的反義分子，將有可能減少細胞中IFN α多肽的表達並因而降低IFN α活性和減少HCV感染中所見到的預激活。圖8中提供編碼IFNa多肽的多核苷酸序列。小的幹擾性RNA (siRNA)，有時稱做短的幹擾性RNA或沉默性RNA，代表根據本發明第三和第四方面使用的其他優選物質。如上所述，本發明人認識到IFN系統的預激活與抗病毒療法耐受有關。因而顯而易見，可以減少IFNa表達的siRNA分子在製備用於治療HCV 感染的藥物中具有巨大用途。siRNA是一類20-25核苷酸長的參與RNA幹擾途徑(RNAi) 的RNA分子，其中siRNA可以藉助所述RNA幹擾途徑引起特定基因的表達減少，或特異地幹擾這種mRNA的翻譯，因而抑制由該mRNA編碼的蛋白質的表達。siRNA具有充分定義的結構在任意末端具有2個核苷酸3』突出端的短(通常21個核苷酸)RNA雙鏈(dsRNA)。 每條鏈具有一個5』磷酸基團和一個3』羥基(-0H)。在體內，這個結構是Dicer (—種將長 dsRNA或髮夾RNA轉變成siRNA的酶)加工的結果。siRNA也可以通過多種轉染方法外源 (人為)地導入細胞以引起目的基因的特異性敲低。因而基於與適宜定製的siRNA的序列互補性，可以靶向序列已知的基本上任何基因。鑑於基本上敲低任何目的基因的能力，藉助 siRNA的RNAi已經在基礎及應用生物學中激起巨大興趣。設計旨在鑑定多種生物學途徑中重要基因的大規模RNAi篩選的數目日益增加。由於疾病過程也依賴於多個基因的活性，預期在一些情況下用siRNA關閉某基因的活性可能產生治療益處。因而它們的發現已經導致將RNAi用於生物醫學研究和藥物開發的興趣激增。治療性RNAi試驗的最近I期結果表明 siRNA被良好地耐受並具有合適的藥代動力學特性。siRNA和相關RNAi誘導方法因此代表在可見的未來變成一種重要的新類型藥物。針對編碼IFNa多肽的核酸所設計的siRNA分子可以用來減少IFNa的表達並因而導致減少IFN系統的預激活。因此，本發明這個方面的一個實施方案是其中所述物質是與IFNa多核苷酸具有互補序列的siRNA分子。使用如此信息，設計具有與IFNa多核苷酸互補的序列的siRNA分子是簡單明了的並且完全在技術人員的能力範圍內。例如，簡單的網際網路搜索提供了可以用來設計siRNA 分子的多個網址。"siRNA分子」包括20至25個核苷酸長的雙鏈RNA分子，以及組成siRNA分子的兩條RNA單鏈中的每條鏈。例如，使用髮夾RNA(shRNA)形式的siRNA。這種shRNA可以包含由間隔序列(例如約9個核苷酸長)連接的兩個互補siRNA分子。所述互補siRNA分子可以摺疊從而它們
結合在一起。能夠切割編碼IFNa多肽的RNA或DNA的核酶代表本發明第三和第四方面的另一種優選物質。「受試者」可以是脊椎動物、哺乳動物、家畜或人。優選待治療的受試者是人。當情況如此時，可以這樣設計所述物質，從而它們最適合人療法(例如如上文討論的抗體人源化)。但是，也應理解所述物質也可以用來治療有獸醫意義的其他動物(例如馬、駱駝、牛、 犬或貓)。如本文中提及的「可藥用載體」是本領域技術人員已知用於配製藥物組合物的任
意生理學載體。技術人員施行本發明第一方面方法所需要的多種元件可以併入一個試劑盒中。因此，根據本發明的一個方面，提供了用於確定具有肝臟病毒性感染的受試者會應答於抗病毒療法的可能性的試劑盒，所述抗病毒療法包括刺激幹擾素(IFN)活性，該試劑盒包含(i)用於分析來自受試者的樣品中miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的工具；和，任選地，(ii)用於比較該樣品中該miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平與對照樣品中所述miRNA例如miR-122或miR-296_5p的水平的工具。「用於分析來自受試者的樣品中miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的工具」包括特異性結合分子，所述的特異性結合分子可以靶向代表樣品中該miRNA例如miR-122 或miR496-5p水平的分子。在一些實施方案中，該特異性結合分子是上文提及的寡核苷酸探針、抗體、適配子或結合蛋白或小分子。「用於比較該樣品中該miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平與對照樣品中所述miRNA例如miR-122或miR496-5p的水平的工具」包括在本發明的第一方面中上文所提及的對照樣品。也包括本文中提及的對照參考數據。本發明的試劑盒也可以包含(iii)用於分析miRNA例如miR-122或miR496-5p的表達水平的相關緩衝液和試劑。隨試劑盒提供的緩衝液和試劑可以是液體形式並且在一些實施方案中以預量取的等份樣提供。備選地，所述緩衝液和試劑可以是用於稀釋的濃縮(或甚至粉)形式。本文(包括後續任意權利要求、摘要和附圖)中所述的全部特徵和/或披露的任意方法或過程的全部步驟可以與上述方面中任意者以任何組合方式組合，不包括其中此類特徵和/或步驟中至少一些是相互排斥的組合。本發明現在將參考以下實施例和附圖進一步描述，其中

圖1.慢性C型肝炎(CHC)患者的肝臟中的miR-122表達。(A)miR-122水平在針對pegIFN α療法的原發性無應答者(PNR)中顯著地低於具有完全早期病毒學應答(cEVR)的患者。miR-122在42位CHC患者和6位無肝臟疾病的對照患者的肝臟中的量由RT-qPCR測量並表述為拷貝/IOpg總RNA。16位PNR患者和沈位 cEVR患者之間的差異是統計學顯著的(ρ <0.0001)，如雙尾Marm Whitney t_檢驗所確定。 cEVR患者和對照之間不存在顯著差異。(B)RNA酶保護測定法證實miR-122水平在PNR與cEVR患者之間的差異。源自4 位對照患者和8位CHC患者G位PNR和4位cEVR ；患者數目顯示在各分圖的頂部)的RNA 用針對miR-122 (上分圖)和let-7b (中間分圖)特異的探針分析。下部分圖中的柱代表了通過定量性磷成像法對每位患者確定的miR-122與let-7b RNA(來自兩個實驗的平均數相似於上部和下部分圖中所示的那些平均數)之間的相對比率。PNR患者顯示比cEVR患者和對照患者低3-4倍的miR-122水平。(C)血清HCV RNA水平與肝內miR-122表達不相關。血清病毒載量(國際單位/ ml)以對數刻度作圖(y_軸)。相關性不顯著(ρ = 0.35)，相關係數r = 0.15。(D)肝內HCV RNA水平與miR-122表達不相關。肝內HCV RNA (拷貝/ μ g總肝臟 RNA)以對數刻度作圖(y_軸)。相關性不顯著(p = 0. 06，相關係數r = -0. 29)。(E)PegIFNa的施用沒有顯著影響人肝臟中的miR-122水平。通過RT-qPCR測量來自患有CHC的6位cEVR患者和5位PNR患者中的成對人肝臟活組織檢查樣品中的miR-122 水平(拷貝/IOpg總RNA)。首次肝臟活組織檢查在治療啟動之前(-pegIFNa )進行。在首次pegIFNa注射後4小時進行第二次活組織檢查(+pegIFNa )。該圖顯示了每位患者的成對肝臟樣品(由一條線連接)中miR-122的水平。圖2.慢性C型肝炎(CHC)患者的肝臟中的miR496-5p表達。miR496-5p水平在針對pegIFNa療法的原發性無應答者(PNR)中顯著地高於具有完全早期病毒學應答(cEVR)的患者。miR496-5p在42位CHC患者和6位無肝臟疾病的對照患者的肝臟中的量由RT-qPCR測量並表述為拷貝/IOpg總RNA。16位PNR患者和沈位cEVR患者之間的差異是統計學顯著的(ρ < 0.0001)，如雙尾Marm Whitney t_檢驗所確定。
實施例患者樣品和C型肝炎治療從2006年10月至2008年3月，請求稱作巴塞爾大學醫院臨床肝臟外部患者 (outpatient)的CHC患者允許出於研究目的使用他們的診斷性肝臟活組織檢查樣品。用聚乙二醇化 IFNa 2b(pegIFNa ；Peglntron, EssexChemie AG，瑞士)和利巴韋林(Rebetol, Essex Chemie AG，瑞士 ；基於體重給藥 85kg, 1. 2g/d) 治療的42位患者提供了可用於重複RNA提取的足夠肝臟活組織檢查材料。他們全部是白種人。這42患者中11位還同意首次注射pegIFNa後4小時進行第二次肝臟活組織檢查。 該方案由巴塞爾大學醫院倫理委員會批准並從全部患者獲得書面的知情同意書。使用來自 Roche Molecular Systems 的COBASAmpliPr印/COBASTaqman HCV-Test，在治療啟動前和在治療4周和12周時量化血清HCV RNA。在巴塞爾大學醫院病理學研究所根據Metavir 分類系統進行HCV肝臟活組織檢查的組織學評級和分期。從6位患者取得非CHC健康對照組織，其中所述的患者接受超聲波引導肝臟活組織檢查病灶並且為該病灶外部的正常肝臟組織中的活組織檢查出具告知同意書。這些患者具有正常的肝臟值並且組織學地證實全部對照樣品不存在肝臟病變。選擇肝臟組織和Huh7細胞中用於量化的miRNA除miR-122之外，為量化和分析Huh-7細胞和人及小鼠肝臟樣品中的IFN作用所選擇的 miRNA 是 miR-1、miR-196、miR-296, miR-351 和 miR-448，它們均由 Pedersen 等人報導為INF-可誘導的(Pedersen IM等人，Nature 2007;449:919-922)。還報導這些miRNA (miR-1除外)中每一種miRNA的轉染降低了 Huh7細胞中HCV複製子RNA的量 (Pedersen IM 等人，Nature 2007;449:919-922)。據報導導致 HCV 複製子 RNA 產量減少的另一種miRNA是miR-431，但是我們沒有分析這種miRNA，因為用於其量化的測定法從Applied Biosystems不可獲得並且迄今為止，這種miRNA未曾鑑定為在肝臟或肝細胞中表達。同樣，沒有分析miR-30，因為它以多種形式(miR-30a、b、c、d和e)存在，但是 Pedersen等人沒有詳述分析的形式。此外，這種miRNA的過量表達對HCV RNA產量沒有影響(Pedersen IM 等人，Nature 2007;449:919-922)。雖然沒有指出 Pedersen 等人分析的具體miR-196和miR-296形式，我們選擇量化miR_196b (人肝癌細胞中所鑑定的兩個 miR-196 特定克隆代表 miR-196b 並且不代表 miR-196a)和 miR-296_5p (Pedersen 等人也使用的Applied Biosystems Taqman 微RNA測定法可用於miR-296_5p，但不可用於miR496-3p)。除miR_196b之外，沒有從人肝臟或肝癌細胞分離出代表其他分析的 miRNA (miR-1、miR-^6、IiiiR-35I 和 miR-448)的克隆(參考文獻 3)。選擇Let_7b和miR-lfe作為預期在CHC中不受影響或不受IFN治療影響的對照 miRNA水平。小RNA的RNA提取、逆轉錄和實時qPCR量化分別使用Trizol 和 mirVana miRNA 分離試劑盒(Ambion，Austin，TX)，並根據製造商的方案，提取來自Huh7細胞和Huh7. 5細胞的總RNA部分和小RNA部分。通過在Trizol 試劑中均化10-30mg冰凍組織而分離來自人或小鼠肝臟的總RNA。使用NanoDrop分光光度計(NanoDropTechnologies^H )量化 RNA 濃度。為了分析人和小鼠材料中let-7b、miR_15a、miR-122、miR-1、miR_196b、 miRj96-5p、miR-351和miR-448的表達(這些miRNA的序列在小鼠和人中是相同的)，使用了 Applied Biosystem Taqman microRNAAssay System (Applied Biosystems, Foster City, CA)。終體積7. 5μ 1的逆轉錄(RT)反應含有Ix RT緩衝液、5ng RNA、50nM miRNA特異性的 RT 引物、0. 25mM 每種 dNTP、0. 25U/μ 1 RNA 酶抑制劑和 3. 33U/μ IMultiScribe RT, 在16°C孵育30分鐘，在42°C孵育30分鐘，在85°C孵育5分鐘並且隨後保持在4°C。全部逆轉錄反應，包括無模板對照，均一式三份進行。使用Applied Biosystems Prism 7000序列檢測系統開展實時PCR。10 μ 1 PCR包括0. 67 μ 1逆轉錄產物、1 X Taqman通用PCR母混合物和1 μ 1引物和Taqman MicroRNA Assay的探針混合物。所述反應在96孔光學平板中在95°C孵育5分鐘，隨後是40個循環95°C 15秒和60°C 60秒。使用默認閾值設置確定Ct值。將循環閾值(Ct)定義為螢光通過固定閾值的分數循環次數(fractional cycle number) 歸一化和miRNA拷貝數估計對每種樣品確定的Ct值針對所獲得的TORNA的平均Ct歸一化，所述的平均Ct從三次反應計算出來。為確定miRNA拷貝數，使用聚丙烯醯胺凝膠電泳(PAGE)純化的對應於 let-7b、miR-15a、miR-122、miR-1、miR_196b、miR-296_5p、miR-351 和 miR-448 miRNA 的寡核苷酸(Microsynth，瑞士)，產生標準曲線。合成性RNA輸入量是從1. 3aM(等同於每個反應7個拷貝)至13pM(每個反應7X107個拷貝)並且使用如上文所述的Applied Biosystems Prism 7000，通過Taqman 微RNA測定法一式兩份分析所述反應。為進一步驗證用分離的合成性miRNA所進行的標準化，含有來自HeLa細胞或小鼠視網膜的5ng總 RNA的反應用遞增濃度(1.3aM至13pM)的合成性miR-122內標並由Taqman 微RNA測定法分析。如不添加合成性miR-122 RNA的對照反應所確定，HeLa細胞和小鼠視網膜細胞中不表達MiR-122。在「載體」RNA存在或不存在下獲得的多條標準曲線之間未觀察到差異 (數據未顯示)。使用適宜的標準化曲線，從不同反應獲得的Ct值被轉換成每IOpg來自肝臟組織的總RNA或每一單個Huh7細胞的特定miRNA的絕對拷貝數。當指出時，miRNA的回收率進一步對肝細胞特異性白蛋白mRNA的水平歸一化。用於人白蛋白RT-qPCR的引物是 TTGGAAAAATCCCACTGCAT (SEQ ID NO :1)和 CTCCAAGCTGCTCAAAAAGC(SEQ ID NO :2)。使用 SYBR 綠 PCR 母混合物(Applied Biosystems, Foster City, CA)，開展 SYBR-PCR 反應。為確定每個Huh7細胞的各種miRNA的拷貝數，通過3種不同方法計算每個細胞的總RNA回收率。對於頭兩種方法，使用CASYl細胞計數器，根據製造商的方案(Scharfe System，德國)計數細胞並且使用Trizol或mirVana試劑盒從已知數目的細胞提取RNA。在第三種方法中，在顯微鏡下計數細胞並且通過Trizol提取RNA。使用不同數目的用於RNA提取的細胞，一式三份開展全部三種方法。樣品用標記的RNA內標以確定RNA回收率。這三種方法產生每細胞以下量的總 RNA 13. 8+/-3. 5pg、14. 52+/-2. 65pg禾口 13. 98+/-2. 37pg。 平均值14. Ipg/細胞用於其他計算。該值低於Chang等人先前用於計算肝細胞和肝癌細胞
22中miR-122含量的25pg RNA/細胞。但是，它屬於對不同發育期的小鼠T淋巴細胞(0.67 至6.82pg/細胞)或對小鼠ES細胞QOpg/細胞)計算的值範圍。為確定每細胞的小RNA( < 200nt)含量，通過不同方法獲得的總Huh7細胞RNA 經mirVana 試劑盒分級。計算出單個Huh7細胞含有1. 125pg的小RNA (確定範圍從1. 05 至1. 2pg/細胞的平均數)。與Brown等人所確定的值相似的這個值用來相對於miRNA 拷貝/細胞而再計算miRNA拷貝的數目/IOpg小RNA (如Brown等人也使用Applied BiosystemTaqman 測定法所確定的)。我們注意到由 Applied BiosystemTaqman 測定法確定的每細胞中miRNA拷貝的值傾向於比RNA酶保護法所確定的那些值低(我們未發表的結果)。這歸因於以下事實Applied BiosystemTaqman 系統不檢測特定miRNA 的具有相同效力的各個3』端序列變體(未發表的結果)。通過RNA酶保護測定法檢測miRNA使用mirVana miRNA探針構建和檢測試劑盒(Ambion)，根據製造商的說明書進行 RNA酶保護測定法(RPA)。用於製備RPA探針的引物是let_7b，TGAGGTAGTAGGTTGTGTGGTT CCTGTCTC(SEQ ID NO 3)；和 miR-122，TGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTCCTGTCTC(SEQ IDNO :4)。 簡而言之，RPA反應含有5 fmol (100, OOOcpm)的內部標記的且PAGE純化的RPA探針和1 μ g 肝臟總RNA。在42°C過夜實施雜交並且RNA酶A/T1消化在37°C持續20分鐘。受保護的片段通過12% PAGE在變性條件下分析，隨後是磷成像儀(Typhoon，Molecular Dynamics)定
fioISGmRNA水平的確定從人或小鼠肝臟組織提取的總RNA用於量化作為IFN作用的量度的「經典」 ISG mRNA (PKR、OASl、STATl和S0CS1)。該RNA由莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶 (Promega Biosciences, Inc. , Wallisellen,瑞士)在隨機六聚體(Promega)禾口脫氧三磷酸核苷存在下逆轉錄。反應在70°C孵育5分鐘，隨後在37°C孵育1小時，並且通過在95°C加熱5分鐘終止。使用STOR綠PCR母混合物(Applied Biosystems)和跨越外顯子-內含子交界以避免擴增基因組DNA的引物，進行STOR-PCR反應。以下引物用於小鼠(m)基因核糖體蛋白 L-19 (mRPL-19)，ATCCGCAAGCCTGTGACTGT (SEQ ID NO 5)和 TCGGGCCAGGGTGTTTTT(SEQ ID NO 6) ；mPKR, TGATAACGAAAACAAGGTGGATTG(SEQ ID NO 7)和 ACAAGGCCTATGTAGTTACCAACGA(SEQ ID NO 8) ；mOASl,CACCCA GTGAGGGTCTCCAA(SEQ ID N0: 9)和 CCCTTGAGTGTGGTGCCTTT(SEQ ID NO :10) ；mSTATl, CGGCGCAGAGAGATTTGC(SEQ ID N0: 11)和AGCTGAAACGACTGGC TCTCA(SEQ ID NO 12)。針對人(h)基因的引物是甘油醛-3-磷酸脫氫酶(hGAPDH) ；GCTCCTCCTGTTCGACAGTCA (SEQ ID NO 13)和 ACCTTCCCCATGGTGTCTGA (SEQ ID N0:14) ；hPKR, T G A T T A T C T G C G T G C A T T T T G G ( S E Q ID NO 1 5)禾口 GCTGAAAGATCACCAGCCATTT(SEQ ID N0:16) ；hOASl, TGATGCCCTGGGTCAGTTG(SEQ ID NO 17) 和 TCGGTGCACTCCTCGATGA(SEQ ID NO 18) ；hSOCSl, CCCCTTCTGTAGGATGGTAGCA(SEQ ID N0: 19)和 TGCTGTGGAGACTGCATTGTC(SEQ ID NO :20) ；hSTATl,TCCCCAGGCCCTTGTTG(SEQ ID N0: 21)和CAAGCTGCTGAAGTTGGTACCA(SEQ ID NO :22) ；hIP10 ；CGATTCTGATTTGCTGCCTTAT(SEQ ID NO 23)和 GCAGGTACAGCGTACGGTTCT(SEQ ID NO 24) ；hUSP18, CTCAGTCCCGACGTGGAACT(SEQ ID NO 25)和ATCTCTCAAGCGCCATGCA(SEQ ID NO :26) ；hIFI27,CCTCGGGCAGCCTTGTG(SEQ ID NO :27)和AATCCGGAGAGTCCAGTTGCT(SEQ ID NO :28)。通過從目的轉錄物的Ct值中扣除
23充當內部對照的hGAPDH或mRPL-19的Ct值而獲得循環閾值的差(Δ Ct)。使用Applied Biosystems Prism 7000序列檢測系統，一式兩份進行全部反應。使用公式2_Δ"，從Δ Ct 值相對於hGAPDH或mRPL-19計算mRNA的表達水平。根據公式2~(ACt B-I-ACt B_2)，將成對肝臟活組織檢查樣品中的表達變化計算為倍數變化。肝內HCV RNA的定量使用設計用於體外定量全部HCV亞型的病原體特異性RT引物混合物(HCV定量試劑盒，PrimerDesign Ltd，南安普頓，英國)，根據製造商的說明書逆轉錄從42位CHC和 6位對照患者的活組織檢查樣品中分離的IygS RNA。使用病原體特異性引物/探針混合物O^rimerDesign Ltd)和Taqman 通用PCR母混合物(美國新澤西州Roche製造的 AppliedBiosystems)，根據製造商的說明書定量 HCV RNA。通過 AppliedBiosystems 7000 序列檢測系統的FAM通道檢測螢光並且根據標準曲線計算每IygS RNA的HCV RNA拷貝， 其中所述的標準曲線使用病原體陽性對照模板O^rimerDesign Ltd)獲得。
權利要求
1.用於確定具有肝臟病毒性感染的受試者將應答於包括刺激幹擾素(IFN)活性的抗病毒療法的可能性的方法，該方法包括(a)分析來自該受試者的樣品的miRNA表達水平，和(b)比較來自該受試者的樣品中所述miRNA的表達水平與對照樣品中所述miRNA的水平。
2.權利要求1所述的方法，其中miRNA是miR122並且其中與對照樣品中miR-122的水平相比，來自該受試者的樣品中較低的miR-122水平表明該受試者很可能不應答於所述抗病毒療法。
3.權利要求1所述的方法，其中miRNA是miR-296_5p並且其中與對照樣品中 miR-296-5p的水平相比，來自該受試者的樣品中較高的miR-296_5p水平表明該受試者很可能不應答於所述抗病毒療法。
4.前述權利要求任一項所述的方法，其中分別與對照樣品中miR-122和/或 miR-296-5p的水平相比，來自該受試者的樣品中分別未改變或升高的miR-122水平和/或未改變或降低的miR-296-5p水平表示該受試者可能應答於所述抗病毒療法。
5.前述權利要求任一項所述的方法，其中抗病毒療法包括聚乙二醇化的 IFNa (peglFNa)，其任選地與利巴韋林聯合。
6.前述權利要求任一項所述的方法，其中病毒性感染是B型肝炎病毒感染或C型肝炎病毒感染。
7.權利要求4的方法，其中病毒是C型肝炎病毒。
8.前述權利要求任一項所述的方法，其中樣品包含肝臟組織。
9.前述權利要求任一項所述的方法，其中也分析了可預測受試者應答於療法的基因的表達。
10.權利要求9的方法，其中通過測量樣品中mRNA基因轉錄物的量或從所述mRNA衍生的cDNA的量確定基因表達。
11.權利要求9或10所述的方法，其中通過測量樣品中由該基因編碼的肽或多肽的量確定基因表達。
12.權利要求11的方法，其中使用特異性結合分子確定肽或多肽的量。
13.前述權利要求任一項所述的方法，其中受試者是人。
14.用於實施權利要求1至13中任一項的方法的試劑盒，包含⑴用於分析來自受試者的樣品中miRNA例如miR-122或miR-296-5p的表達水平的工具；和，任選地，(ii)用於比較來自受試者的樣品中所述miRNA例如miR-122或miR-296-5p的水平與對照樣品中所述miRNA例如miR-122或miR-296_5p的水平的工具。
15.權利要求14所述的試劑盒，還包含用於分析可預測受試者應答於療法的至少一種基因的表達的工具，最終包含一種或多種特異性結合分子，所述的特異性結合分子能靶向代表所述至少一種基因的分子，所述的至少一種基因可預測受試者應答於療法，其中所述的特異性結合分子是寡核苷酸探針、抗體或適體；和任選地，用於比較樣品中所述基因的表達與對照樣品中相同基因的表達的工具。
全文摘要
本申請涉及用於確定抗病毒療法是否會有效的方法。特別地，本申請提供了使用miRNA例如miR-122或miR-296-5p，用於確定具有肝臟病毒性感染的受試者會應答於抗病毒療法的可能性的方法，所述抗病毒療法包括刺激幹擾素(IFN)活性，並且提供了用於實施所述確定的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK102159725SQ200980133061
公開日2011年8月17日 申請日期2009年6月26日 優先權日2008年6月27日
發明者I·馬爾基維茨, J·科洛爾, M·海姆, M·薩拉森-菲利波維奇, W·菲利波維奇 申請人:巴塞爾大學醫院, 諾瓦提斯研究基金會弗裡德裡克·米謝爾生物醫學研究所