一種利用甘蔗渣發酵產丁醇的預處理方法
2023-05-28 23:15:26
一種利用甘蔗渣發酵產丁醇的預處理方法
【專利摘要】本發明公布了一種利用甘蔗渣發酵產丁醇的預處理方法，該方法包括機械粉碎、液態熱水處理、微波處理、微生物分解、氨處理和酶解處理步驟，經過上述步驟後，可合併各步驟的分解產物進行分步糖化發酵和同步糖化發酵。該預處理方法可將主要抑制劑呋喃甲醛和羥甲基糠醛的含量控制在不影響發酵菌生長的濃度以下，並且基本不產生葡糖醛酸、對香豆酸、丁香酸和阿魏酸等其它抑制劑。該方法無需對預處理分解產物進行脫毒純化處理，便可直接進行生物發酵產丁醇，具有可控制抑制劑產生、成本低、產量高和環境友好的優點。
【專利說明】一種利用甘蔗渣發酵產丁醇的預處理方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物質預處理領域，具體涉及一種利用甘蔗渣發酵產丁醇的預處理方 法。
【背景技術】
[0002] 目前，已有多種成熟的針對於纖維材料和半纖維材料的預處理方法以水解得到糖 分，所得的糖分可以用於發酵生產生物燃料。
[0003] 最近，這些方法在工業生物【技術領域】得了一些進展，為能經濟有效的利用農業產 業廢料提供了潛在的機會。例如，甘蔗渣是一種綜合性材料，為甘蔗產業中的主要副產物， 也是主要農業廢料之一,每年都富產於中國南方。甘蔗渣含有大約50%的纖維素、25%的半 纖維素和25%的木質素，用其生產生物丁醇是一種生產生物燃料的理想方法，因為丁醇相 比於傳統的乙醇，具有更高的熱值和更低的吸溼性。
[0004] 然而，利用甘蔗渣生產丁醇是否可行，取決包括預處理和脫毒純化等多種因素。而 傳統的預處理方法，如酸解，常產生嚴重抑制梭菌生長的毒性物質。
[0005] 許多研究報導了多種可用於富有纖維素和半纖維素的穀物殘渣的預處理方法，包 括蒸汽爆破法或稀酸預處理法。酸解法是一種常用且有效的預處理方法，特別常用的是稀 硫酸。該方法不僅簡單，而且成本低廉。然而，在酸解時，常產生一類微生物抑制劑，該抑制 劑可在發酵時抑制微生物的生長。呋喃甲醛和羥甲基糠醛是在生物發酵時產生的主要抑制 齊IJ。因此，在進行生物丁醇發酵前，水解產物必須首先進行脫毒純化，以除去抑制劑。
[0006] 然而，預處理後的脫毒純化是一個複雜的過程，儘管多種脫毒純化方法已經得到 了研究，如石灰處理、蒸發法、離子交換柱層析法、活性炭和生物處理法，然而這些方法要麼 脫毒純化效果不好，要麼成本太高。目前，主要通行的方法是利用化學法去除抑制劑，因為 化學法較為簡單，成本也較低。然而，利用化學法時，由於抑制劑的化學結構的差異性，導致 該法無法對所有抑制劑進行清除。另外，化學法還會產生許多鹽類，導致在發酵液中含有高 濃度的鹽，而高濃度鹽會對微生物發酵產生嚴重的抑制效果，從而導致生物丁醇產量的減 少。
[0007] 因此，選擇合適的預處理方法就顯得十分重要。選擇預處理方法時，需考慮如下兩 點：1、能最有效的破壞纖維結構，以產生充足的糖，並防止對糖的損耗，同時還能避免或減 少抑制劑的產生；2、預處理方法需成本低廉，簡單易行。
[0008] 在現有技術中，還未有可避免或減少所有主要抑制劑產生的預處理方法。因此，亟 待開發一種既經濟可行，又能控制所有主要抑制劑含量，以便對甘蔗渣進行發酵產丁醇的 預處理方法。
【發明內容】
[0009] 本發明的目的在於提供一種利用甘蔗渣發酵產丁醇的預處理方法，該預處理方法 可以控制抑制微生物生長的毒素的產生。通過控制毒素的產生，使得經預處理後的甘蔗渣 無需後續的純化脫毒處理，便能進行發酵生產丁醇，大大降低了生產成本。
[0010] 該預處理方法包括如下步驟： 1) 機械粉碎：對甘蔗進行切段至長度為5-l〇Cm，在65±2°C下烘乾2天，然後進行粉碎， 過20目篩，得到粒徑小於830μm的甘蔗渣粉； 2) 液態熱水處理：按固液質量體積比為250g/L，將步驟1)所得物於常溫下在水中浸泡 12h,之後用蒸汽預加熱45s,然後加入液態熱水,在200±3°C下,反應Ih,反應後進行過濾， 收集濾液I和固體殘餘物I; 3) 微波處理：調整步驟2)所得固態殘餘物I的溼度為40%，並置於反應器中，然後通入 氮氣排除氧氣，於4 °C下放置8-12h，之後將反應器置於微波熱解爐中，在120 °C下反應7 min，再將反應所得物降溫至常溫，用90%乙醇對反應所得物進行浸洗，之後進行過濾，收集 濾液II和固體殘餘物Π; 4) 微生物分解：烘乾步驟3)所得固體殘餘物II，之後加入培養液進行混合，再於121 °C下進行滅菌，滅菌後，調整其溼度為30%，以質量百分比計，再加入10%的分解菌菌液，於 30°C下發酵10d，之後進行過濾，收集濾液III和固體殘餘物III; 所述培養液的配方為：30mgH3B03、20mgMnC12. 4H20、185mgZnS04*7H20、20mg Na2Mo04.2H20、280mgFeS04*H20、200mgCuS04、5gNH4NO3UgKH2P04、0. 15gMgS04*H20、 0· 11gCaCl2 和ILddH20,pH為 7. 0 ; 所述分解菌為 ATCC1015、fricAoofe/mareeseiATCC26921 和 PenicilliumjanthinelIum 中飽一種； 5) 氨處理：用CldH2O對步驟4)所得固體殘餘物III進行清洗，之後將其烘乾，以固液質量 比為1:2,將烘乾後的固體殘餘物III與氨水混合，在0.IMPa壓強下，於90 °C反應30min，之 後進行過濾，收集濾液IV和固體殘餘物IV; 6) 酶解處理：將所述固體殘餘物IV於水中浸泡2h，調節pH為7. 0,濃縮後將其烘乾， 然後配製酶解混合物，每500ml該酶解混合物由下述物質組成：50g烘乾了的所述固體殘 餘物IV、10g纖維素酶、100mlOPTMSHBG、5mg氯黴素和2. 5mg卡那黴素；調整酶解混合 物的pH為5. 0,在溫度為55°C，搖床轉速為220rpm下，反應60h，之後進行過濾，收集濾液 V和固體殘餘物V; 7) 將濾液I、濾液II、濾液III、濾液IV和固體殘餘物IV合併，留待SSF發酵，或將所述濾 液I、濾液II、濾液III、濾液IV和濾液V合併並旋蒸濃縮，留待SHF發酵。
[0011] 優選的，在進行微生物分解時，所用的分解菌為reeseiJTTCr 26921〇
[0012] 在現有預處理方式中，單獨使用某一種預處理方式時，不能充分降解甘蔗渣纖維 素，產糖率極低；如與稀酸法聯用，雖然產糖率有所改善，但會對反應器產生腐蝕和出現汙 染問題，同時，對抑制劑濃度的控制效果也不理想。
[0013] 本發明首先選擇高熱水處理，先通過在常溫下在水中浸泡12h，之後用蒸汽預加熱 45s，然後加入液態熱水，在200±3°C下，反應lh，便可實現破壞纖維素與木質素間結合牢 固的分子結構。這是因為首先必須對甘蔗渣纖維素的結構進行破壞，使甘蔗渣處於"鬆散" 狀態，以便進行下一步處理。在較為高壓，且溫度不太高的預處理條件下，蒸汽能與甘蔗渣 的表面充分接觸，從而破壞纖維素與木質素間結合牢固的分子結構。
[0014] 雖然經過第一步預處理，甘蔗渣的結構呈現一定程度的"鬆散"狀態，但是甘蔗渣 還是沒有得到充分的降解，因此第二步採用微波預處理。在120°c下，將經第一步預處理的 甘蔗渣在微波下進行處理，可使得處於"鬆散"狀態的甘蔗渣進一步的分解，但經微波預處 理後，可能會產生一些生物油、柴油等物質，用90%的乙醇洗滌，可洗脫產生的油類物質，便 於下一步微生物的分解生長。
[0015] 經過前兩步預處理後，甘蔗渣可以進行第三步分解，即微生物分解。微生物主要利 用自身產生的酶系分解纖維素，在酶切割的情況下，纖維素得到再進一步的分解。可用的分 犧舊％AspergillusnigerKK￡VdMTrichodermareeseiΚΚ￡ 2明2\ 熱Penicillium ATCC44750 中的一種，其中Ti-icAoofe/mareeseiATCC26921 的分解效果最 好，這可能是因為該菌更偏向對甘蔗渣的分解利用。
[0016] 然而以上幾步主要在於分解性纖維素和半纖維素，但是某些木質素可能還沒得到 充分的分解，因此，第四步採用氨水浸泡，氨水浸泡的目的在於使已經被破壞了的纖維素和 木質素得到分離，只有分離了木質素，下一步中的酶解才能使纖維素得到進一步的再分解。 在氨水浸泡中，浸泡時間、壓力和溫度較為重要，通過合適的設置，可提高甘蔗渣的分解效 率，並減少抑制劑的產生。經過以上幾步預處理後，最後一步採用酶解。
[0017] 上述預處理步驟的順序是固定的。通過上述步驟處理，不僅可以得到較高的產糖 率，而且水解液中所有主要的抑制物含量低於影響發酵菌生長的濃度，或低至檢測不出。
[0018] 由於甘蔗渣的大小影響著分解的難易程度，一般而言，越小的甘蔗渣更易分解，但 考慮到能耗因素，將甘蔗渣的大小控制在860μm以下，不僅分解效果好，且能耗較低。
[0019] 液態熱水法相比於稀酸法，無需添加酸試劑，不會對反應器造成腐蝕，產生的水解 液中的殘留物也較少，是一種較為溫和的預處理方法。然而，其甘蔗殘餘物回收率較低，單 獨使用時無法達到有效分解甘蔗渣的目的。
[0020] 經過液態熱水法處理後，再利用微波進行處理，可較大幅度的提高還原糖的產量、 並縮短反應時間和降低能耗。進行微波處理時，微波可加速對晶體結構的破壞，使微生物更 容易對甘蔗渣進行進一步分解。通過分解菌分解後，可再提高10%左右的甘蔗渣分解率。
[0021] 優選的，在利用分解菌分解甘鹿漁時，利用reeseiJTTCr激似7可實 現更好的分解效率。
[0022] 進行氨處理時，由於氨是木質素的良好溶劑，可將木質素和木質纖維素進行分離， 從而可提高後續纖維素酶對甘蔗渣的分解效率。
[0023] 經過上述處理後，再利用酶解處理，可最大化的水解甘蔗渣。
[0024] 本發明的有益效果： 1、 能夠高效水解甘蔗渣，水解率可達到74. 41% ; 2、 可得到高濃度的葡萄糖，葡萄糖濃度可達到15. 21 ±1. 65g/L; 3、 預處理條件溫和，能耗低、不腐蝕設備； 4、 無需後續純化步驟，微生物發酵生產成本低； 5、 主要抑制劑呋喃甲醛和羥甲基糠醛含量低，不影響發酵微生物的生長，同時基本不 產生葡糖醛酸、對香豆酸、丁香酸和阿魏酸等其它抑制劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 1、圖1所示為本發明預處理方法步驟的示意圖； 2、 圖2所示，為利用甘蔗渣水解產物(濾液)作為發酵底物時，發酵產物與發酵時間的關 系圖；其中HAN表示為：在步驟4)採用Asper價7ΛΛ5 /?i職rATCC1015作為發酵菌，並將所 述濾液I、濾液II、濾液III、濾液IV和濾液V合併，用作SHF發酵；HTR表示為：在在步驟4) 採用reeseiATCC26921作為發酵菌，並將所述濾液I、濾液II、濾液III、濾液 IV和濾液V合併，用作SHF發酵；HPJ表示為：在在步驟4)採用 ATCC44750作為發酵菌，並將所述濾液I、濾液II、濾液III、濾液IV和濾液V合併，用作SHF發酵；HANNY表示為：在步驟4)採用/?i職rATCC1015作為發酵菌，並將濾 液I、濾液II、濾液III、濾液IV和固體殘餘物IV合併，用作SSF發酵；HTRNY表示為：在步 驟4)米用reeseiATCC26921作為發酵菌，並將濾液I、濾液II、濾液III、 濾液IV和固體殘餘物IV合併，用作SSF發酵；HPYNY表示為：在步驟4)採用 ATCC44750作為發酵菌，並將濾液I、濾液II、濾液III、濾液IV和固體殘餘物IV合併並旋蒸濃縮，用作SSF發酵； 3、 圖3所示，為利用甘蔗渣水解產物(濾液)作為發酵底物時，在SSF和SHF發酵過程中 pH的變化圖；其中，HAN、HTR、HPJ、HANNY、HTRNY、HPJNY的含義與圖2中的一致；a為SSF發 酵；b為SHF發酵； 4、 圖4所示，為SSF和SHF發酵過程中，對不同糖成分的轉化使用情況；其中a、b、c為 SHF發酵，b、d、f為SSF發酵，HAN、HTR、HPJ、HANNY、HTRNY、HPJNY的含義與圖 2 中的一致； 5、 圖5所示，為在發酵終點，由不同發酵底物產生的總殘餘物碳水化合物；其中，HAN、 HTR、HPJ、HANNY、HTRNY、HPJNY的含義與圖 2 中的一致； 6、 圖6所示，為利用純葡萄糖作為發酵底物時，在發酵過程中，不同參數的變化圖； 7、 圖7所示，為利用糖組合物作為發酵底物時，不同產物、糖和pH的變化圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面通過實施例對本發明進行具體描述，有必要在此指出的是以下實施例只是用 於對本發明進行進一步的說明，不能理解為對本發明保護範圍的限制，該領域的技術熟練 人員根據上述
【發明內容】
所做出的一些非本質的改進和調整，仍屬於本發明的保護範圍。
[0027] 實施例1 : 1) 將500g甘蔗進行切段至長度為5-lOcm，在65 ± 2°C下烘乾2天，然後進行粉碎，過 20目篩，得到粒徑小於830μm的甘蔗渣粉； 2) 將步驟1)所得物於常溫下在2L的水中浸泡12h，之後用蒸汽預加熱45s，然後加入 液態熱水，在200±3°C下，反應lh，反應後進行過濾，收集濾液I和固體殘餘物I; 3) 調整步驟2)所得固態殘餘物的溼度為40%，並置於三頸圓底燒瓶中，然後通入氮氣 排除氧氣，於4 °C下放置12h，之後將反應器置於微波熱解爐中在120 °C下反應7min，排 出熱氣，待溫度降到室溫後，用90%乙醇對反應所得物進行浸洗，之後進行過濾，收集濾液 Π和固體殘餘物II; 4) 烘乾步驟3)所得固體殘餘物，之後加入培養液進行混合，再於121 °C下進行滅菌， 滅菌後，調整混合物的溼度為30%，再加入20mlAsper價7ΛΛ5 /?i職rATCC1015菌液，於 30°C下發酵10d，之後進行過濾，收集濾液III和固體殘餘物III; 培養液的配方為：30mgH3B03、20mgMnC12. 4H20、185mgZnS04*7H20、20mg Na2MoO4CH2O, 280mgFeS04*H20, 200mgCuSO4, 5gNH4NO3,IgKH2PO4,0. 15g MgS04.H20，0· 11gCaCl2andILddH20，pH為 7.0 ; 5) 用CldH2O對步驟4)所得固體殘餘物進行清洗，之後將其烘乾，以固液質量比為1: 2， 將烘乾後的固體殘餘物III與氨水混合，在高壓下（O.IMPa)，於90°C反應30min，之後進行 過濾，收集濾液IV和固體殘餘物IV; 6) 將步驟5)所得固體殘餘物IV於900ml的雙蒸水中浸泡2h，用1%的H2SO4調節 PH為7. 0,用旋轉蒸發儀對其進行濃縮，再於60°C下將其烘乾。然後配製酶解混合物，每 500ml該酶解混合物由下述物質組成：50g烘乾了的固體殘餘物IVUOg纖維素酶、100ml OPTMSHBG、5mg氯黴素和2. 5mg卡那黴素；調整酶解混合物的pH為5.0,在溫度為55°C， 搖床轉速為220rpm下，反應60h，之後進行過濾，收集濾液V和固體殘餘物V。
[0028] 各步驟的固體回收率見表1。
【權利要求】
1. 一種利用甘蔗渣發酵產丁醇的預處理方法，其特徵在於：所述方法包括如下步驟： 1) 機械粉碎：對甘蔗進行切段至長度為5-lOcm，在65±2°C下烘乾2天，然後進行粉碎， 過20目篩，得到粒徑小於830 的甘蔗渣粉； 2) 液態熱水處理：按固液質量體積比為250g/L，將步驟1)所得物於常溫下在水中浸泡 12h,之後用蒸汽預加熱45s,然後加入液態熱水，在200±3°C下，反應lh,反應後進行過濾， 收集濾液I和固體殘餘物I; 3) 微波處理：調整步驟2)所得固態殘餘物I的溼度為40%，並置於反應器中，然後通入 氮氣排除氧氣，於4 °C下放置8-12h，之後將反應器置於微波熱解爐中，在120 °C下反應7 min，再將反應所得物降溫至常溫，用90%乙醇對反應所得物進行浸洗，之後進行過濾，收集 濾液II和固體殘餘物II ; 4) 微生物分解：烘乾步驟3)所得固體殘餘物II，之後加入培養液進行混合，再於121 °C下進行滅菌，滅菌後，調整其溼度為30%，以質量百分比計，再加入10%的分解菌菌液，於 30°C下發酵10 d，之後進行過濾，收集濾液III和固體殘餘物III ; 所述培養液的配方為：30 mg H3B03、20 mg MnC12. 4H20、185 mg ZnS04*7H20、20 mg Na2Mo04.2H20、280 mg FeS04*H20、200 mg CuS04、5 g NH4N03、1 g KH2P04、0. 15 g MgS04*H20、 0? 11 g CaCl2 和 1 L ddH20, pH 為 7. 0 ; 所述分解菌為 ATCC 1015、fricAoofe/ma reesei ATCC 26921 和 Penicillium janthinellum 中飽一種； 5) 氨處理：用ddH20對步驟4)所得固體殘餘物III進行清洗，之後將其烘乾，以固液質量 比為1:2,將烘乾後的固體殘餘物III與氨水混合，在O.IMPa壓強下，於90 °C反應30 min，之 後進行過濾，收集濾液IV和固體殘餘物IV ; 6) 酶解處理：將所述固體殘餘物IV於水中浸泡2 h，調節pH為7. 0,濃縮後將其烘乾， 然後配製酶解混合物，每500 ml該酶解混合物由下述物質組成：50 g烘乾了的所述固體殘 餘物1￥、108纖維素酶、100 11110?1嫩51186、5 11^氯黴素和2.5 11^卡那黴素；調整酶解混合 物的pH為5. 0,在溫度為55 °C，搖床轉速為220rpm下，反應60 h，之後進行過濾，收集濾液 V和固體殘餘物V; 7) 將濾液I、濾液II、濾液III、濾液IV和固體殘餘物IV合併，留待SSF發酵，或將所述濾 液I、濾液II、濾液III、濾液IV和濾液V合併並旋蒸濃縮，留待SHF發酵。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵在於：所述方法中，步驟4)中所用的分解菌為 Trichoderma reesei ATCC 26921 〇
【文檔編號】C12R1/80GK104357491SQ201410744063
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月9日 優先權日:2014年12月9日
【發明者】譚芙蓉, 蘇海鋒, 何明雄, 胡啟春 申請人:農業部沼氣科學研究所