細菌毒力基因的製作方法

2023-04-24 17:44:06 3

專利名稱：細菌毒力基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及參與胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)的毒力之基因的鑑定，胸膜肺炎放線桿菌減毒突變株的生產，以及靶向所鑑定的基因和它們產物的抗菌劑的鑑定。
胸膜肺炎放線桿菌是豬胸膜肺炎，一種接觸傳染性很高的豬呼吸疾病的病原體。該病常常是致命的，結果在豬生產工業中導致嚴重的經濟損失。作為一種豬呼吸道的專性寄生蟲，近年來胸膜肺炎放線桿菌感染的發生率在增加，尤其是在進行集中飼養條件下的動物。細菌的傳播是通過氣霧，或者通過與感染豬直接接觸。
胸膜肺炎可在所有年齡的豬中發生，現在還不清楚與誘發疾病的病毒或細菌感染的聯繫。胸膜肺炎放線桿菌可以是慢性的或者是急性的，疾病的特點是逐漸嚴重的肺窘迫，其迅速進展到死亡，或者發展成為慢性感染導致衰竭以至於不能健康生長。典型地觀察到出血、壞死性支氣管肺炎，伴隨纖維蛋白性胸膜炎。
基於它們莢膜多糖中抗原性差異以及它們的胞外毒素產物，已經鑑定了15種不同的胸膜肺炎放線桿菌血清型。血清型1、5和7是美國胸膜肺炎放線桿菌感染的最普通的類型，而血清型1、2、5、7和9在歐洲佔優勢。
感染胸膜肺炎放線桿菌的豬的治療通常包括直接注射抗生素(典型地是四環素)。然而這種方法費時費力，而且昂貴，並且由於疾病的迅速進展可能常常使用受限。然而，來自田間和實驗研究的證據已經顯示胸膜肺炎放線桿菌的感染可提供抵抗隨後再次感染的終生保護，因此提示接種疫苗可能是替代抗生素治療的可行方法。有效疫苗的開發迄今為止一直被15種不同血清型的抗原多樣性阻礙。
在生產疫苗組合物的嘗試中，發現殺死的、整個細胞細菌僅提供血清型特異性保護，但是已經顯示高毒力血清型的自然感染可刺激抗多種血清型的強烈的保護性交叉免疫[Nielsen，Nord Vet Med.31407-13(1979)；Nielsen，Nord Vet Med.36221-234(1984)；Nielsen，Can J VetRes.29580-582(1988)；Nielsen，ACTA Vet Scand.1580-89(1994)]。某些未明確的活的減毒突變體也已經顯示有希望用於豬的交叉保護[Inzana等，Infect Immun.611682-6(1993)；Paltineanu等，InInternational Pig Veterinary Society，1992，p.214；Utrera等，InInternational Pig Veterinary Society，1992，p.213]，但是由於與包含具有這種不明確的、自發突變的細菌株的疫苗相關的不確定性，本領域中需要合理構建活的減毒株，其將安全地刺激針對同源物的保護性免疫，優選異源胸膜肺炎放線桿菌血清型。也需要鑑定參與胸膜肺炎放線桿菌的毒力的基因，以便於發展用於鑑定靶向那些基因和/或其產物的抗菌劑的方法。
公開的國際專利申請WO 00/61724(Pharmacia Upjohn)描述了使用標籤標記的誘變(STM)鑑定負責革蘭氏陰性細菌毒力的基因。也討論了含有減毒細菌的疫苗的開發。在Fuller等，MicrobialPathogenesisvol.26；pp.39-51中也描述了該項工作。
在STM技術中，通過轉座子整合的方法產生了許多不同的細菌株，其中的每一個在其基因組中都攜帶隨機突變。插入的轉座子攜帶不同的DNA標記標籤，以便單個突變體相互之間區分。標籤中的每一個都包括可變的中央區，兩側是不變的「臂」，後者允許通過PCR擴增可變的中央部分。在微量滴定皿中收集多個標記的突變株，然後結合起來形成用於動物感染的「接種池」。
在感染後的適當時間，從感染動物中分離細菌，並將細菌結合起來形成「回收池」。將回收池中的標籤和接種池中的標籤分開擴增、標記、並用作探針檢測排列有接種物中突變體的所有不同標籤的濾膜。具有減毒的突變株通常是不能從感染動物中回收的那些菌株，即，具有當用接種池的標籤探針檢測時產生雜交信號，但是當用回收池的標籤探針檢測時不產生雜交信號的標籤的菌株。STM的優點是可在單個動物中針對細菌毒力喪失同時篩選大量插入突變株。在例如WO 96/17951中更全面地描述了STM。
在相當多的研究後，本發明的發明人提供了一種用於鑑定參與胸膜肺炎放線桿菌毒力的基因的改良方法和手段。該方法鑑定出一個「毒力基因」新家族，家族成員中的每一個包含選自SEQ ID NO1-56所定義的那些核苷酸序列中的任何一種的核苷酸序列。如這裡所使用的，術語「毒力基因」指這樣的細菌基因，其正確的功能涉及，例如，是在宿主動物中建立和/或維持感染所必需的。因此，毒力基因和它們的產物(產物可能是多核苷酸(例如，rRNA)和/或多肽)參與細菌的致病性，但是可能不是其體外生長必需的。
毒力基因中的突變可導致「減毒細菌」，即，與相應的相同菌株和血清型的野生型細菌相比，其在宿主動物中建立和/或維持細菌感染的能力降低的細菌。可通過將其給予受試動物的方法證實細菌的減毒，其中其不能引起導致例如，可觀察到的慢性感染或死亡的持續感染。豬胸膜肺炎的症狀(例如，肺窘迫、出血壞死性支氣管肺炎和/或纖維蛋白性胸膜炎)未產生也可作為細菌減毒的指標。減毒細菌在疫苗組合物中有很重要的商業價值。
在一個方面，本發明因而提供減毒的胸膜肺炎放線桿菌細菌。
在具體的實施方案中，本發明提供在包含選自SEQ ID NO.1-56的核苷酸序列的基因中具有突變的減毒胸膜肺炎放線桿菌細菌。
突變可抑制或妨礙基因的功能，例如，通過降低其表達的水平(例如，通過減少轉錄和/或翻譯)，和/或通過削弱基因產物的生物學活性(例如，通過導致由突變基因所編碼產生的基因產物的無活性型)。基因產物可能是多核苷酸或者多肽。
基因中的突變可以是插入、缺失或者取代。其可位於基因編碼多肽的區域，或者位於負責(或者參與)基因表達調控的序列，例如位於啟動子區。也考慮包括一個或多個插入、缺失和/或取代組合的突變。本發明的減毒胸膜肺炎放線桿菌株同樣地包括那些具有兩個或多個突變的菌株，突變中的每一個可能是插入、缺失、取代、或者其組合。多個突變可發生在單個基因中，或者它們可發生在相同細菌基因組內的不同基因中。它們可導致減毒水平的疊加或協同。多個突變可通過設計製備，或者可由於引入單個突變的技術偶然產生。
缺失突變體包括那些毒力基因的全部或者部分缺失的突變。在一個方面，突變導致缺失毒力基因的至少約10％，至少約20％，至少約30％，至少約40％，至少約50％，至少約60％，至少約70％，至少約80％，至少約90％，至少約95％，至少約98％，或者至少約99％。缺失可發生在SEQ ID NO.1-56所示的適當的核苷酸序列中，或者其可發生在基因的鄰近區，例如，在相關的控制序列中。
可使用本領域技術人員公知的任何技術構建缺失突變體。一種策略是使用可反選擇的標記，並在許多不同細菌中用於缺失基因。這種技術的細節，可參考例如Reyrat等，Infection and Immunityvol.66；pp.4011-4017，和Oswald等，FEMS Microbiol Lettvol.179；pp.153-160。
該方法使用雙選擇策略，其中構建編碼可選擇和可反選擇標記兩者標記的質粒，兩側具有來自細菌基因組中期望缺失位點兩側的DNA序列。可選擇的標記用於選擇其中質粒已經在適當位置和以適當方式整合到基因組中的細菌。接著可反選擇的標記用於選擇比例很少的自發消除整合質粒的細菌。那些所得細菌中的一部分將含有期望的缺失，不保留外源DNA。
在獲得缺失的另一個技術中，使用cre-lox系統用於DNA的位點特異性重組。該系統由可被細菌cre重組酶識別的34個鹼基對的lox序列構成。如果將lox位點以適當的方向引入到基因組DNA中，可通過cre重組酶的表達切除兩側是lox位點的序列，保留lox位點的一個拷貝。使用標準重組技術，可能缺失胸膜肺炎放線桿菌基因組中感興趣的序列，並且用兩側是lox位點的可選擇的標記(例如，編碼卡那黴素抗性的基因)置換。cre重組酶的瞬間表達(例如，來自含有在胸膜肺炎放線桿菌中有功能的啟動子控制下的cre基因的電穿孔的自殺(非複製)質粒)接著將導致有效切除兩側是lox的標記。這種方法導致含有期望缺失以及一個lox序列拷貝的細菌突變體。
在提供缺失的另一個方法中，可用標記基因缺失(置換)胸膜肺炎放線桿菌基因組中的靶序列，例如，綠色螢光蛋白(GFP)、β-半乳糖苷酶或者螢光素酶。兩側是期望缺失的DNA片段通過PCR製備，並克隆到用於胸膜肺炎放線桿菌的自殺載體中。然後將含有在胸膜肺炎放線桿菌中有活性並可操作地連到合適的標記基因上的啟動子的表達盒克隆到側翼序列之間。將質粒引入到野生型細菌中，分離整合併表達標記基因的突變體，以及檢驗期望的重組事件(用標記基因置換野生型基因)。
如對於插入突變體，這些包括其中終止密碼子被插入到天然，即內源性終止信號上遊(5′)開放閱讀框(ORF)內的基因。因此可通過該基因表達(多肽)毒力基因產物的截斷的、無活性型。同樣地考慮使用導致移碼的插入生產無活性產物。胸膜肺炎放線桿菌的突變的毒力基因將也包括轉座子被插入到基因的蛋白編碼或調控序列中的那些基因。通過STM技術生產的減毒細菌是插入突變體，其中通過轉座子序列，例如Tn10，的插入使毒力基因無功能。
因為插入突變體(例如，通過STM產生的那些突變體)將仍然含有細菌毒力所需遺傳信息的全部，因此有它們恢復至致病狀態的風險，例如，通過插入序列的自發缺失。因此，當製備基於插入突變體，例如，通過STM鑑定的突變體的疫苗或其它治療性組合物時，其可能期望從STM衍生的菌株中獲得信息，即，被破壞的毒力基因的鑑定，然後重新產生該毒力基因中的一些，大多數，或者全部被缺失的突變體。這應當排除細菌恢復到毒力狀態並因此致病而不是將其向宿主動物施用獲得預防性保護的可能性。
在相關的方面，本發明提供含有根據本發明第一方面的減毒胸膜肺炎放線桿菌的組合物。該組合物可能是免疫原性組合物，即，一種能在其施用的宿主動物中引起對引起抗體反應的組合物。組合物可能是治療性(例如，預防性)組合物。其可能是疫苗，優選一種其給予動物後賦予保護不受隨後不同於那些疫苗本身中存在的胸膜肺炎放線桿菌的血清型和菌株感染程度(交叉保護)的疫苗。本發明進一步提供本發明第一方面的減毒胸膜肺炎放線桿菌細菌用於生產預防或減輕動物胸膜肺炎放線桿菌感染和/或預防或減輕與這種感染相關症狀，例如，用於預防性保護豬抗豬胸膜肺炎的藥物(例如，疫苗)的用途。
為了減毒細菌在疫苗組合物中有效，毒力基因中的(一個或多個)突變應當足夠明顯以防止病原體引起嚴重的臨床症狀，但是不應當顯著多以便允許在宿主動物中細菌的有限複製和生長，由此引起導致免疫學記憶的適當的防禦機制。優選毒力所必需的(明顯不同於僅僅參與)基因中的突變。
本發明的組合物可含有許多不同的減毒胸膜肺炎放線桿菌細菌，例如，在相同的毒力基因中具有不同突變的細菌，和/或在兩個或多個不同基因中具有相似或不同突變的細菌。雖然可能單獨施用本發明的無毒力(減毒)細菌，如在本文別處討論的，優選以含有一種或多種合適的佐劑、稀釋劑、載體、運載體和/或賦形劑的固體或液體組合物施用。根據，以及在本發明中使用的組合物，因此可包括這些物質中的一種或多種，其應當在與減毒細菌相容以及對免疫的動物無害的意義上是藥理學「可接受的」。另外的物質優選是無菌和無致熱原。
可在本發明中使用的佐劑的實例包括基於油的佐劑，如弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、基於黴菌酸酯的佐劑(例如，海藻糖二黴菌酸酯)、細菌脂多糖(LPS)、肽聚糖(例如，胞壁質、粘肽、或者糖蛋白如N-Opaca、胞壁醯二肽[MDP]、或者MDP類似物)、蛋白聚糖(例如，那些從肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)中提取的蛋白聚糖)、鏈球菌製劑(例如，OK432)、Biostim TM(例如，O1K2)、EP 109 942，EP 180 564和EP 231 039的「Iscoms」、氫氧化鋁、皂甙、DEAE-葡聚糖、中性油(如miglyol)、植物油(如花生油)、脂質體、多聚醇、Ribi氏佐劑系統(見例如，GB-A-2 189 141)以及白介素、特別是那些刺激細胞介導的免疫佐劑。已經描述了由放線菌目中的一個細菌屬，無枝酸菌目(Amycolata)的提取物構成的佐劑(U.S.4,877,612)。佐劑混合物都可商業獲得。使用的佐劑將取決於，至少部分取決於受體動物。施用佐劑的量也將取決於動物的種類和大小。可以很容易地通過本領域技術人員公知的常規方法確定最佳劑量。
對於任何稀釋劑、載體、運載體和/或賦形劑，那些物質性質上可以是液體、半固體、或者固體。可使用本領域技術人員已知的任何適當的物質。示範性的物質包括聚氧乙烯山梨聚糖單月桂酸酯、硬脂酸鎂、甲基和丙基羥基苯甲酸酯(propylhydroxybenzoate)、滑石粉、藻酸鹽、澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、山梨糖醇、甘露醇、阿拉伯膠、磷酸鈣、礦物油、可可脂以及可可油。
本發明的組合物可包裝成便於或者適合具體給藥途徑的各種形式。治療性組合物(例如，疫苗)可適於通過例如靜脈內、真皮內、肌肉內、乳房內、腹膜內和/或皮下注射，和/或通過口服、舌下、鼻、肛門或陰道輸送施用給受試動物。治療可由單劑量或者由在一段時間中多劑量構成。對給藥方案的決定在本領域技術人員的範圍內是公知的。組合物可配製和包裝成適當的形式。
在另一個方面，本發明提供一種分離的多核苷酸，其編碼參與胸膜肺炎放線桿菌的毒力(例如，必需的)的基因產物。該多核苷酸的序列因此發現於胸膜肺炎放線桿菌的毒力基因中。本發明也提供編碼基因產物的多核苷酸，其不是在胸膜肺炎放線桿菌中天然發現的，但是其表達能夠調節(例如，降低)該細菌的毒力。可將這種多核苷酸引入到細菌中產生這種表達(例如，通過轉化、轉染或者電穿孔)。表達可產生細菌的減毒株，例如用於疫苗或者其它免疫原性組合物。也考慮不是在胸膜肺炎放線桿菌中天然發現的，但是其能夠通過它們與胸膜肺炎放線桿菌毒力基因或者基因產物的直接相互作用(而不是由它們自己的基因產物通過間接作用)調節該細菌毒力的多核苷酸。
根據本發明的多核苷酸的任何基因產物可以是多核苷酸(例如，RNA)或者多肽。多肽基因產物這裡稱作「毒力多肽」，參與/能夠調節胸膜肺炎放線桿菌的毒力，無論它們是否由野生型細菌基因組天然編碼。可影響胸膜肺炎放線桿菌毒力的多核苷酸基因產物包括例如，反義RNA和核酶。可通過測定對表達能在動物中建立和/或維持感染的產物的胸膜肺炎放線桿菌菌株的影響程度與不表達該產物的相同株和血清型的胸膜肺炎放線桿菌比較，證明任何基因產物對細菌毒力的影響。
根據這個方面，本發明更具體地提供分離的多核苷酸，包括(例如，由下列序列構成)(a)選自SEQ ID NO.1-56的核苷酸序列(這些序列是如本文別處鑑定的胸膜肺炎放線桿菌的毒力基因內發現的)；(b)編碼由(a)中所述的核苷酸序列所編碼的多肽的核苷酸序列；(c)在中等至高度嚴格條件下，與(a)和/或(b)的核苷酸序列，或與其互補鏈雜交的核苷酸序列；或者(d)(a)-(c)的核苷酸序列中的任何一種的片段，其片段保留(a)-(c)所述的核苷酸序列的免疫學性質和/或生物學活性。本發明的多核苷酸可以是DNA或者是RNA，如本文別處所描述的。
一旦從(a)的核苷酸序列中獲得胺基酸序列，可以很容易地鑑定(b)型核苷酸序列，並且列出遺傳密碼。
至於(c)，示範性的中等嚴格條件包括在35℃到45℃，在包含2xSSC/0.1％SDS的緩衝液中的最後衝洗。示範性的高度嚴格條件包括在65℃到75℃，在包含2xSSC/0.1％SDS的緩衝液中的最後衝洗。應當理解的是在本領域中，可通過改變溫度和緩衝液或者鹽濃度的方法獲得同等嚴格的條件。在這點上，可參考Ausubel等，Protocols inMolecular Biology，John Wiley Sons(1994)，pp.6.0.3 to 6.4.10。雜交條件的修改可根據經驗決定或者基於鳥苷/胞嘧啶(GC)鹼基對的長度和百分率精確計算。可根據Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory PressColdSpring Harbor，New York(1989)，pp.9.47 to 9.51描述的方法計算雜交條件。
對於(d)型的片段，根據(a)，(b)或者(c)的核苷酸序列的知識，技術人員能夠得到該核苷酸序列的每個可能的片段。片段可以是至少10個、至少15個、至少20個、至少25個、至少30個、至少35個、至少40個、至少45個、或者至少50個核苷酸長。它們可以在中等到高度嚴格條件下能與(a)、(b)或(c)的核苷酸序列，或者與其互補序列雜交，可選擇地在存在競爭性核酸時，例如，在存在來源於胸膜肺炎放線桿菌的cDNA或mRNA文庫的核酸時。保留的免疫學性質可能是該片段能夠被特異性結合全長核苷酸序列的抗體特異性結合。構思了至少107M-1的結合親和力。片段保留的生物學活性可以是能夠編碼與全長核苷酸序列所編碼的多肽具有相同結合能力的多肽，例如能夠結合到其在體內天然結合配體中的一種，或者相同抗體。
由於對於本領域技術人員將很顯而易見，胸膜肺炎放線桿菌毒力基因的鑑定能夠鑑定其它相關細菌，例如，巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)的其它成員中的相應(即，同源)基因。以分離的形式，這種基因序列可能包括在所要求的包含根據上述(c)型核苷酸序列(或者由其構成)的多核苷酸內。使用(a)型核苷酸序列(或其片段)作為探針的Southern雜交可鑑定其它細菌的基因組、cDNA或者mRNA文庫中這種相關序列。另外，使用PCR，使用包含胸膜肺炎放線桿菌序列或其片段的引物，可以跨過物種分界線同樣有效地鑑定毒力基因。作為另一種可供選擇的方法(其不依賴雜交但是仍然能鑑定同源基因)，可使用胸膜肺炎放線桿菌突變體株與其它物種的多核苷酸(例如，DNA或mRNA)文庫的互補來鑑定具有相同，或者相關生物活性的基因。總之，本發明的多核苷酸，其包含根據(c)型的核苷酸序列，可能發現位於，或者構成與胸膜肺炎放線桿菌相關的其它細菌的毒力基因。
相關毒力基因的鑑定可通過該基因的突變導致產生其它生物的減毒株，以及可能因此用於生產疫苗和其它免疫學組合物。在另一個方面，本發明因此提供(1)在包括在中等到高度嚴格條件下，能與SEQ IDNO1-56所定義的核苷酸序列中的任何一種雜交的核苷酸序列的基因中含有突變的減毒細菌(例如，巴斯德氏菌科的細菌)；(2)含有這種細菌的組合物(例如，疫苗)；以及(3)這種細菌用於生產治療性治療或預防性保護動物避免相應野生型細菌(或者不同的菌株或其血清型)感染的藥物(例如，疫苗)的用途。
如本文別處所解釋的，(a)-(d)型的本發明的多核苷酸可以是例如，DNA、RNA、或者肽核酸，根據例如在Corey，TIBTECH 15224-229(1997)中所描述的。DNA序列包括來源於(提取或者擴增的)基因組DNA，或者cDNA，以及完全地或者部分化學合成的核苷酸序列的那些DNA序列。可通過本領域技術人員公知的任何方法完成擴增，例如，通過PCR。
與生產多核苷酸的酶促(例如基於PCR)方法相對，這裡使用的「化學合成」指純粹地化學方法。「完全地」合成的多核苷酸是完全通過化學方法生產的那些多核苷酸，「部分地」合成的多核苷酸包括那些其中僅部分所得的序列是通過化學方法生產的。
本發明的多核苷酸，或者它們的基因產物，可以是核酶。這種多核苷酸可能包括或者由根據上述(c)型的(RNA)核苷酸序列構成，即一種能夠與(a)或(b)中所述核苷酸序列中的任何一種在中等到高度嚴格條件下雜交的多核苷酸。對於核酶技術的回顧，參考Gibson和Shillitoe，Mo1.Biotech.7125137(1997)。可利用核酶以序列特異性方式抑制mRNA的翻譯(例如從毒力基因中轉錄的mRNA)，例如，通過(i)核酶的互補RNA序列與靶mRNA的雜交；以及(ii)通過核酶固有的核酸酶活性切割雜交的靶mRNA。本發明的多核苷酸因此可用於抑制胸膜肺炎放線桿菌或者其它相關細菌，例如巴斯德氏菌屬細菌的毒力基因的表達。核酶可通過根據經驗的方法鑑定，但是它們可能不是基於靶mRNA上的可及位點特異性設計，例如，基於SEQ ID NO1-56所定義的核苷酸序列的mRNA轉錄產物(也見Bramlage等，Trends in Biotech16434-438(1998))。
為了控制mRNA翻譯，可使用本領域技術人員公知的輸送技術靶細胞輸送核酶。外源性輸送方法可包括使用靶向脂質體或者直接局部注射。內源性方法包括使用病毒載體和使用非病毒質粒。
本發明的某種多核苷酸也可用於調節胸膜肺炎放線桿菌中毒力基因的轉錄，例如，通過寡核苷酸指導的三螺旋結構形成的方法。對於這種技術的回顧，參考Lavrovsky等，Biochem.Mol.Med.6211-22(1997)。使用在主溝(根據在Watson-Crick模型中所定義的)與雙鏈DNA雜交的序列特異性寡核苷酸完成三螺旋結構形成。這種序列特異性寡核苷酸的雜交可在此後調節DNA-結合蛋白，包括例如，轉錄因子和聚合酶的活性。優選的用於雜交的靶序列包括調節毒力基因表達的轉錄調節區。能夠形成三螺旋的寡核苷酸也用於毒力基因中靶DNA序列的位點專一的共價修飾。根據例如Lavrovsky等，Biochem.Mol.Med.6211-22(1997)中所描述的方法將用於共價修飾的寡核苷酸偶聯到DNA破壞劑上。
在另一個方面，本發明提供了包含根據本發明的多核苷酸的載體。載體性質上可以是DNA或RNA。為了在合適的宿主細胞中在適當的條件下，促進其轉錄，以及可選擇地能使其翻譯，其可含有可操作地連到多核苷酸上的一個或多個調控序列。載體可以是質粒，或者病毒載體。它們可能能夠自主複製。調控序列可以是內源的(即，在本發明的多核苷酸來源的野生型細菌內發現的，例如胸膜肺炎放線桿菌)或者它們可以是外源的(例如，在相關的細菌中，例如在巴斯德氏菌科的另一個成員中發現的調控序列)。調控序列尤其包括啟動子和轉錄終止子。
進一步構思了含有(例如，轉化、轉染、或者電穿孔)本發明的多核苷酸或載體的宿主細胞。這種宿主細胞是以允許多核苷酸的轉錄，以及可選擇地使所得mRNA翻譯的方式，用本發明的多核苷酸或載體穩定地或瞬時轉化、轉染、或者電穿孔的原核細胞或者真核細胞。本發明的宿主細胞包括細菌、酵母、真菌、無脊椎動物以及哺乳動物細胞。也考慮含有本發明的多核苷酸或載體的病毒。
本發明的宿主細胞可用於大規模生產毒力多肽(其中本發明的多核苷酸編碼多肽序列)的方法。在有利的條件下在適當的培養基中培養細胞，通過本領域技術人員公知的任何純化技術，例如，通過親合柱上的捕獲，從細胞中或者從細胞生長的培養基中分離期望的多肽。這種細胞可以是用於發展特異性結合毒力多肽的抗體的免疫原的有價值的來源。可使用任何合適的宿主細胞用於表達根據本發明的多核苷酸。
對於這種和其它目的，可使用在本領域技術人員的範圍內公知的標準技術操作本發明的多核苷酸，例如，在Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，New York(1989)中所描述的技術。通過舉例的方式，通過例如，PCR，例如，使用基因組DNA、cDNA或mRNA作為模板，可擴增和克隆本發明的多核苷酸。為了容易地將克隆的序列插入到載體中，例如表達載體，可選擇PCR引物使得PCR擴增的序列在起始密碼子ATG前的5』端具有限制性酶切位點，以及在終止密碼子TAG、TGA、或TAA後的3』端有限制性酶切位點。根據Grosjean和Fiers，Guide，18199-209(1982)以及Konigsberg和Godson，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，80687-691(1983)所描述的方法，如果需要的話，根據想要轉化宿主細胞例如大腸桿菌(E.coli)的優選密碼子，可改變克隆序列中的密碼子，而不改變胺基酸。當在該宿主中生產時，密碼子使用的最優化可導致基因產物的表達增加。
如果在細胞外生產毒力多肽，例如，在宿主細菌的周質中，或者在宿主細胞周圍的培養基中，那麼可克隆無其起始密碼子的本發明的多核苷酸，並在適當的信號序列後將其置於表達載體中。已知許多原核生物和真核生物的信號序列在重組蛋白的分泌中起作用。在蛋白分泌過程期間，可通過信號肽酶除去信號肽，產生成熟蛋白。
為了簡化毒力多肽的純化，可將純化標籤添加到多肽編碼序列的5′和/或3′端。通常使用的純化標籤包括六組氨酸殘基的一段序列(美國專利Nos.5,284,933和5,310,663)、Schmidt和Skerra，ProteinEngineering，6109-122(1993)所描述的鏈黴抗生物素-親和性標籤、FLAG肽(Hopp等，Biotechnology，612051210(1988))、穀胱甘肽S-轉移酶(Smith和Johnson，Gene，6731-40(1988))、以及硫氧還蛋白(La Vallie等，BiolTechnology，11187-193(1993))。為了除去這些標籤，可在融合接點插入蛋白酶剪切識別位點。通常使用的蛋白酶是Xa因子、凝血酶以及腸激酶。
在另一個方面，本發明提供生產本發明的多核苷酸編碼的毒力多肽的方法。該方法可包括下列步驟(i)在允許多肽表達的條件下培養根據本發明的宿主細胞；以及(ii)從宿主細胞或者從其周圍的培養基中回收並且可選擇地分離所表達的多肽。本發明的多核苷酸的鑑定很容易獲得它們所編碼的多肽，因此這些多肽可選擇地用化學方法合成。
本發明的多核苷酸所編碼的多肽(和這種多肽的變體)是本發明的另一方面。這種多肽是如本文別處所討論的「毒力多肽」。進一步考慮含有這種多肽的組合物，這些包括疫苗和其它免疫原性組合物。這種組合物可含有如本文別處所討論的一種或多種佐劑、載體、稀釋劑、運載體或者賦形劑。
變體包括本發明的多核苷酸編碼的多肽的生物學和/或免疫學活性片段，例如，在SEQ ID NO.1-56中任何一種所定義的多核苷酸序列所編碼的多肽的片段、多肽或其片段與例如，異源多肽的融合(因此生產嵌合體)、以及多肽的類似物，例如，其中缺失、取代或添加一個或多個胺基酸的多肽(i)不喪失一種或多種對多肽特異的生物學活性和/或免疫學特性；或者(ii)特異性失去多肽的特定生物學活性。可使用保守的胺基酸進行置換。
考慮在-1位置上有額外蛋氨酸殘基的毒力多肽，以及在-2和-1位置上有額外甲硫氨酸和賴氨酸殘基的毒力多肽。這些類型的變體在細菌細胞類型中對於重組蛋白生產特別有用。本發明也包含使用特殊表達系統產生具有額外胺基酸殘基的變體。例如，使用表達期望多肽為與穀胱甘肽-S-轉移酶(GST)融合蛋白的商業可獲得的載體，提供從期望多肽上切除GST元件後在-1位置上具有額外甘氨酸殘基的期望多肽。本發明的多肽的變體也包括已經除去前導或信號序列的那些變體，例如，成熟形式。
變體多肽包括與SEQ ID NO.1-56中的任何一個所定義的核苷酸序列編碼的毒力多肽具有至少約99％、至少約95％、至少約90％、至少約85％、至少約80％、至少約75％、至少約70％、至少約65％、至少約60％、至少約55％、以及至少約50％序列同一性和/或同源性的那些變體多肽。這裡將胺基酸序列的「同一性」百分率定義為將序列和引入的缺口進行序列比對之後，候選序列中與毒力多肽中的殘基完全相同的胺基酸殘基的百分率，如果必要的話，獲得最高序列同一性百分率，不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分。關於SEQ ID NO1-56中任何一個所編碼的毒力多肽的胺基酸序列的「同源性」百分率是指將兩個序列和引入的缺口序列比對之後，候選序列中與毒力多肽的殘基完全相同的胺基酸殘基的百分率，如果必要的話，獲得最高序列同一性百分率，也考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分。
保守取代意味著用一個胺基酸交換相同類型的胺基酸，類型如下脂肪族非極性 GAPILV極性-不帶電硫 CM極性-不帶電羥基ST極性-帶電酸性 DENQ極性-帶電鹼性 KRH芳香族 FWY在另一個方面，本發明擴展到特異性識別本發明的多核苷酸或多肽的抗體。抗體可以是單克隆或多克隆抗體。它們包括嵌合抗體，例如人源化的抗體，例如互補決定區(CDR)-移植抗體，以及抗體(其可以是嵌合的)的片段，例如Fab，F(ab』)2，Fd和單鏈抗體。它們也包括具有CDR序列特異性識別本發明的多核苷酸或多肽的化合物。本發明也提供特異性結合本發明的抗體的抗獨特型抗體。
術語「特異性」表示本發明抗體的可變區僅識別靶多肽或多核苷酸(即，它們能夠從相關的多肽或多核苷酸中區別單一多肽或者多核苷酸)。考慮至少約107M-1，至少約108M-1，或者至少約109M-1的結合親和力。那並不是說，抗體將不與其它蛋白(例如，金黃色葡萄球菌(S.aureus)蛋白A或者在ELISA技術中的其它抗體)通過與在抗體可變區外面的序列，特別的，在分子的恆定區中的相互作用而相互作用。篩選試驗以確定本發明抗體的結合特異性是本領域技術人員公知的和常規實踐的方法。為了全面討論這種試驗，可參考Harlow等.(編輯)，Antibodies.A Laboratory Manual；Cold Spring Harbor Laboratory；Cold Spring Harbor，NY(1988)，Chapter6。
根據本發明的另一個方面，提供用於鑑定能夠調節本發明鑑定的胸膜肺炎放線桿菌毒力基因、或者相關物種中同源基因功能的抗菌劑的材料和方法。同樣考慮能夠調節這種毒力基因功能的藥劑本身。更具體地，本發明的方法包括篩選能夠幹擾宿主細菌中SEQ ID NO.1-56中任何一個所示核苷酸序列所編碼的基因產物的表達和/或生物活性的潛在藥劑。幹擾毒力基因產物表達的藥劑包括(但不限於)含有與SEQ IDNO.1-56的核苷酸序列中的任何一個同源的核苷酸序列的反義多核苷酸和核酶(它們結合其互補鏈)。本發明進一步包括通過使用寡核苷酸指導的三螺旋形成調節這種毒力基因轉錄的方法。
除了通過給予這種抗菌劑或組合物治療患巴斯德氏菌屬(例如胸膜肺炎放線桿菌)感染的動物的方法，含有根據本發明鑑定的抗菌劑的組合物是本發明的另一方面。本發明也包含這種藥劑或組合物用於生產治療巴斯德氏菌屬感染，例如胸膜肺炎放線桿菌感染和/或豬胸膜肺炎的藥物的用途。
幹擾毒力基因功能的藥劑包括(i)可與野生型產物競爭其生理學結合位點的毒力基因產物的非功能性變體；以及(ii)毒力基因產物的結合配偶體，其螯合和任選地破壞所述產物。藥劑也包括變構酶抑制劑，在毒力基因產物是酶時。
可通過使用本發明的多核苷酸或它們所編碼的產物(其可能是RNA多核苷酸或者多肽)的高通量篩選試驗的方法鑑定抑制劑。建立基於活性以及篩選能調節(例如，抑制)該活性的潛在藥劑的試驗，其中篩選使用具有酶促活性的多肽基因產物。對於通過與多肽或多核苷酸相互作用發揮它們功能的毒力基因產物，建立結合試驗以測量這種相互作用，以及篩選能夠調節，例如抑制該相互作用的潛在的試劑。
在結合試驗的一個實施方案中，毒力基因產物固定在固體支持物上，在存在和缺乏推定的抑制劑化合物時，評定與(生理學的)結合配偶體的相互作用。在另一個實施例中，在存在和缺乏推定的抑制劑化合物時，在溶液鑑定中評定毒力基因產物和其結合配偶體之間的相互作用。在兩個試驗中，抑制劑被鑑定為降低毒力基因產物和其結合配偶體之間結合的化合物。當毒力基因產物和其結合配偶體都是多肽時，使用的試驗包括雙雜交試驗的變通方式，其中根據例如在公開的國際專利申請WO 95/20652中所描述的方法，通過檢測轉化或轉染的宿主細胞中的陽性信號鑑定蛋白/蛋白相互作用的抑制劑。
考慮的在本發明的方法中使用的候選抑制劑包括選自潛在抑制劑文庫中的化合物。可使用許多不同文庫作為小分子調節劑的來源，包括(1)化學文庫；(2)天然產物文庫；以及(3)由隨機肽、寡核苷酸或者有機分子構成的組合文庫。
化學文庫由已知化合物的結構類似物構成。天然產物文庫是用於產生所篩選混合物的微生物、動物、植物、或者海洋微生物的集合，其中混合物通過下列步驟進行篩選(i)土壤、植物或者海洋微生物的肉湯培養基的發酵和提取；或者(ii)植物或海洋微生物的提取。天然產物文庫在例如Science 28263-68(1998)中進一步討論。對於組合物文庫，這些文庫由大量肽、寡核苷酸、或者有機化合物作為混合物組成。它們相對容易通過傳統的自動合成方法、PCR、克隆、或者專有合成方法製備。特別感興趣的是肽和寡核苷酸組合文庫。對於組合化學文庫的回顧，可參考Myers，Curr.Opin.Biotechnol.8701-707(1997)。
可特異性設計考慮在本發明的方法中使用的其它候選抑制劑。這些包括毒力多肽的可溶形式的結合配偶體。如這裡使用的術語「結合配偶體」包含包括片段和其衍生物的抗體(儘管在某些實施方案中它們被除外)，以及包括特異性結合靶基因產物的抗體結構域的修飾的化合物。
當毒力基因產物的多肽結合配偶體不是已知的時，可使用鑑定生理學，或者非生理學的以及因此螯合結合配偶體的試驗，例如，使用其上固定毒力基因產物的親和柱的試驗。可選擇地，可使用根據在Fields和Song，Nature，340245-246(1989)，以及Fields和Sternglanz，Trendsin Genetics，10286-292(1994)中所描述的酵母雙雜交系統鑑定多肽之間的結合相互作用。其它可用於搜尋結合多肽毒力基因產物的試劑的試驗包括在美國專利No.5,585,277中所描述的試驗，其依靠蛋白通常以摺疊和未摺疊狀態的混合物存在並且在這兩個狀態之間不斷交替的原理。當試驗配體結合到摺疊形式的靶毒力多肽時，被配體結合的靶蛋白分子保持其摺疊狀態。因此，在存在結合靶蛋白的試驗配體時，呈現出比缺乏配體時更高程度的摺疊的靶蛋白。可通過區分靶蛋白的摺疊和非摺疊狀態的任何方法測定配體對靶蛋白的結合。為了進行這種試驗不必知道靶蛋白的功能。事實上可通過這種方法評估任何試劑作為試驗配體，包括，但不限於金屬、多肽，包括蛋白質，脂類，多糖，多核苷酸和有機小分子。
在Wieboldt等，Anal.Chem.，691683-1691(1997)中描述了鑑定毒力基因多肽配體的另一個方法。該技術在溶液相中每次篩選結合靶毒力多肽的20到30個試劑的組合文庫。通過離心超濾將結合靶的試劑與其它較小的文庫組分分離。隨後將在濾器上保留的特異性選擇的分子從靶蛋白中釋放，並且通過，例如HPLC和充氣促進的電噴射(離子噴射)離子化MS進行分析。這種方法選擇對靶蛋白具有最高親和力的文庫組分，對小分子文庫特別有用。
通過最初篩選鑑定的結合試劑也可評估它們在體內對毒力的影響。妨礙細菌毒力的藥劑可預防產生感染，或者一旦產生感染逆轉感染的結果。根據這裡別處所描述的，結合試劑可包含在含有藥學上可接受的佐劑、賦形劑、稀釋劑、載體或運載體的組合物中。
一旦考慮其中描述了目前所準備的其實施方案的本發明的下列詳細描述，本發明的許多另外的方面和優點現在對於本領域技術人員將是顯而易見的。
實施例1A.材料和方法1.細菌菌株和生長條件使用常規方法選擇毒性胸膜肺炎放線桿菌血清型1菌株4074的自發抗萘啶酮酸的衍生物，稱作4074NalR。通過在豬中傳代驗證這種菌株的毒力。在37℃、5％CO2的在補充了10％Levinthal氏鹼(BHIL)的腦心浸液(BHI)平板上，或者在37℃，在含有5μg/mlβ-煙醯胺嘌呤二核苷酸(NAD)和11mM氯化鈣的Colombia肉湯培養基中繁殖胸膜肺炎放線桿菌株。
在本研究中使用的大腸桿菌(E.coil)株是在Miller和Mekalanos(1988)J.Bacteriol.170，pp.2575-2583中描述的S17λpir[用λpir噬菌體溶原化的recA thi pro hsdR-M+RP4∷2-Tc∷Mu∷Km Tn 7]；根據在deLorenzo等，(1990)J.Bacteriol.172，pp.6657-6667中所描述的CC118λpir[用λpir噬菌體溶原化的Δ(are-leu)araD ΔlacX74 galE galK pho A20thi-1 rpsE rpoB argE recA1]；以及XL1-Blue(recA1 endA1 gyrA96 thi-1hsdR17 supE44 relA1 lac [F′proAB laclqZΔM15 Tn10(Tetr)])。在含有適當抗生素的Luria-Bertani(LB)培養基中維持大腸桿菌株，其中抗生素使用下列濃度氨苄青黴素100μg/ml；卡那黴素100μg/ml；萘啶酮酸20μg/ml；四環素10μg/ml。
2.DNA操作、擴增、標記、以及標籤的雜交根據生產商的使用說明，使用QIAamp mini DNA試劑盒(Qiagen)從胸膜肺炎放線桿菌中分離染色體DNA。再次根據生產商的使用說明，使用Qiagen質粒midi試劑盒從大腸桿菌(E.coil)中分離質粒DNA。根據Sambrook等，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory PressCold Spring Harbor，New York(1989)中所描述的標準技術進行DNA操作。根據生產商所描述的方法，使用PCR DIG探針合成試劑盒(Roche)用[地高辛(DIG)-11]-dUTP標記DNA印跡的探針。根據在Hensel等(1995)Science 269 pp.400-403中所描述的方法進行DNA標記-標籤的擴增和標記。使用下列引物通過PCR方法從基因組DNA中開始擴增標籤P6(5′-CGACTACAACCTCAAGCT-3′)P7(5′-CGACCATTCTAACCAAGC-3′)擴增的標籤在2％Nusieve GTG瓊脂糖凝膠上純化並在再次使用P6和P7的第二次PCR中用[32P]-dCTP進行放射性標記。兩次PCR的循環條件如下在95℃變性和酶活化12分鐘，隨後進行20個循環95℃30秒，50℃ 45秒以及72℃ 10秒。使用1單位AmpliTaq Gold(Perkin-Elmer)聚合酶在Perkin-Elmer 2400熱循環儀中進行反應。使用前，通過用HindIII在37℃消化18小時從可變的標記-標籤中分離恆定的側翼DNA。
對於集落印跡，使含有pLOF/TAG 1-48質粒中的每一個的大腸桿菌(E.coli)S17λpir株長到指數期的中期，將每種培養物的100μl培養物轉移到微量滴定皿的孔中。使用複製平板器(Sigma)將細菌從微量滴定皿中轉移到尼龍膜(Hybond N)上，並將接種的膜置於乾燥的含有氨苄青黴素(100μg/ml)的LB瓊脂平板的表面。37℃過夜生長後，將膜用1.5M NaCl，0.5M NaOH處理10分鐘。通過微波在最大功率處理30秒鐘，將DNA固定到膜上，通過在2XSSC中洗滌除去細菌碎屑。在65℃ Rapid-hyb緩衝液(Amersham)中分別進行1小時預雜交和過夜雜交。根據標準方法洗滌印跡。為了鑑定潛在的減毒突變體，將從輸入池(接種物)中製備的用標記的標籤所探測的印跡上的雜交信號和與從至少兩個不同動物的相應輸出池中製備的標記標籤雜交的完全相同的印跡進行比較。
3.DNA標記-標籤和pLOF/TAG1-48的構建通過可變的寡核苷酸池RT1的PCR擴增獲得雙鏈DNA標記標籤(Hensel等，1995 Science 269 pp.400-403)，使用下列引物P3SAL(5′-CGCCATGTCGACCATTCTAACCAAGCTT-3′)P5SAL(5′-CGCCTAGTCGACTACAACCTCAAGCTT-3′)其中的每一種在其5』末端含有限制性內切酶SalI識別位點。為了便於標記-標籤在質粒pLOF/Km中的克隆，對質粒進行修飾以摻入唯一的SalI位點。這通過將下列互補寡核苷酸退火完成SALTOP(5′-GTCGACCCT-3′)和SALBTM(5′-GTCGACAGG-3′)產生含有兩側是SfiI-相容端的SalI位點的雙連結頭。質粒pLOF/Km用SfiI消化，用小牛腸鹼性磷酸酶(CIAP)處理，並連接到磷酸化的雙連結頭上產生質粒pLOF/Sal。PCR擴增的雙鏈DNA標記標籤用SalI消化，凝膠純化，並且克隆到SalI消化的，CIAP處理的pLOF/Sal上產生獨特標記的pLOF/TAG質粒文庫。
通過菌落印跡與它們相應的[32P]-dCTP標記的標籤雜交，篩選大腸桿菌株CC118λpir中的單個轉化體，鑑定高效擴增和標記的100個標籤。然後檢驗這些標籤是否缺乏交叉雜交，選擇48個質粒(pLOF/TAG1-48)進一步使用。
4.標籤-標記的突變體庫的構建將在質粒pLOF/TAG 1-48上攜帶的48個標籤-標記的mini-Tn10轉座子通過接合各自引入到胸膜肺炎放線桿菌中。使胸膜肺炎放線桿菌4074NalR株和含有pLOF/TAG 1-48質粒中的每一種的大腸桿菌S17λpir在37℃過夜生長到生長靜止期。通過3,000rpm離心15分鐘收穫細菌，並用10mM MgSO4洗滌兩次。將大約相同數量的胸膜肺炎放線桿菌受體和大腸桿菌供體細胞混合，濃縮，並鋪到0.22μM濾器上。將濾器置於含有1mM IPTG的BHIL平板上，在37℃，5％CO2孵育5小時。其後，將細菌移到5ml無菌PBS中，將等分試樣鋪於補充了萘啶酮酸(20μg/ml)和卡那黴素(100μg/ml)的BHIL平板上。對48個標籤-標記的微型Tn10轉座子中的每一個進行4個單獨的接合。對轉接合子突變體進行氨苄青黴素敏感性篩選，因此除去攜帶插入到染色體中的自殺載體的共合體的菌株。從48個單個接合中分離總共2064個轉座子突變體，並將它們安排到43個池中，每個池中48個突變體。將突變體裝於含有15％甘油的1.5ml冷凍管中-80℃貯藏。
5.感染研究將每個池中的48個胸膜肺炎放線桿菌標籤標記的突變體中的單個菌株各自培養到生長對數期中期。在OD600大約0.3時，將單個突變體菌株組合起來，在HEPES中將匯集的培養物稀釋到大約2×106cfu/ml。向6到10周齡以及通過細菌學和血清學分析確定無胸膜肺炎放線桿菌的大白十字(Large White Cross)小豬，氣管內接種3ml稀釋培養物。將接種物的連續稀釋液鋪在選擇性BHIL後，通過活菌計數核實接種物中的cfu的數量。使用每個突變體池感染至少兩個動物。
在感染後大約24小時，無痛處死存活的動物並分離肺。通過(i)用Hanks緩衝鹽溶液(HBSS)充分灌洗；或者(ii)在500ml HBSS中將肺勻漿，從感染的肺中回收存活的細菌。將細菌懸液的等分試樣鋪於選擇性培養基上，接著在7℃，5％CO2，過夜生長，匯集大約10,000個菌落(「輸出池」)，製備全部染色體DNA。
6.競爭指數為了測定單個STM突變體的體內競爭性指數(CI)，使突變體和野生型細菌在含有5μg/ml NAD和11mM CaCl2的Colombia肉湯培養基中生長到OD600為0.3。然後將培養物組合起來產生相等數量的突變體和野生型微生物，稀釋到2×106cfu/ml，並且氣管內接種到至少兩個動物中。將接種物的連續稀釋液平行鋪於BHIL+20μg/ml萘啶酮酸(突變體和野生型)，以及BHIL+20μg/ml萘啶酮酸+100μg/ml卡那黴素(僅是突變體)後，通過活菌計數核實接種物中突變體與野生型的比例。感染後大約24小時，無痛處死存活的動物並分離肺。將肺在500ml HBSS中勻漿，將等分試樣鋪於選擇性培養基(見上面所述)上以回收存活的細菌。根據突變體對野生型微生物的輸出率除以突變體對野生型微生物的輸入率，計算體內CI。為了測定體外CI，使突變體和野生型微生物生長到指數期中期，以相等數量混合，在37℃再振蕩培養聯合培養物3小時。在固定間隔採集樣本，稀釋，並同前面一樣鋪於選擇性BHIL上，根據上面描述的方法計算體外CI。
7.毒力基因鑑定和DNA測序為了鑑定體內減弱的損害，通過反向PCR克隆或擴增轉座子插入位點兩側的DNA。對於克隆，用一組限制性酶消化染色體DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分離，轉移到尼龍膜上，在DNA印跡中用DIG標記的對Tn10卡那黴素基因特異的探針探測。從凝膠中切下與探針雜交的適當大小的片段，純化並克隆到適當消化的pBR322中。在含有100μg/ml卡那黴素的LB瓊脂上選擇大腸桿菌株XL1-Blue中的轉化體。
為了便於測序，使用Tn10特異性寡核苷酸引物BS401(5′-GACAAGATGTGTATCCACC-3′)將克隆的插入片段進一步亞克隆到質粒pBCKS(Stratagene)中。根據在Fuller，(2000)Microb.Pathog.29，pp.25-38中所描述的方法進行轉座子插入位點兩側DNA的反向PCR擴增，用SspI(其在轉座子中一次切割)消化染色體DNA，稀釋到150ng/ml，使用快速DNA連接試劑盒(Roche)自我連接15分鐘。然後使用引物對BS401+TEF48，以及BS401+TEF62擴增連接的DNA(Fuller，2000 Microb.Pathog.29，pp.25-38)。反向PCR的反應條件同以前所描述的一樣(Fuller，2000Microb.Pathog.29，pp.25-38)。瓊脂糖凝膠電泳後，使用QIAQUICK凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化得到的擴增子。使用BigDye終止子循環測序試劑盒(Perkin-Elmer)進行DNA測序反應。使用相似搜索程序的BLAST設置，用減毒突變體中的每個序列查詢未過多公開的DNA和蛋白質資料庫(Altschul等1990J.Mol Biol.15，pp.403-410)。
B.結果和討論1.標籤標記的胸膜肺炎放線桿菌突變體的增殖修飾在胸膜肺炎放線桿菌中有功能的質粒pLOF/Km，使通過在微型-Tn10元件中插入唯一SalI位點接受標記-標籤。將PCR擴增的隨機標記-標籤克隆到SalI位點，在大腸桿菌CC118λpir中獲得大約30,000個標記質粒的文庫。通過與它們相應放射性標記標籤的菌落印跡篩選這些轉化體的子集，選擇含有強烈雜交信號的標籤標記的質粒。除去含有交叉雜交的質粒，收集48個獨特標籤標記質粒的池。將這些質粒(pLOF/TAG 1-48)轉化到大腸桿菌S17λpir中，通過接合獨立轉移到胸膜肺炎放線桿菌4074NalR株中。
除去氨苄青黴素抗性質粒共整合體(0.5-1％)後，從48個單獨的接合中分離2064個轉座子突變體，然後安排到43個池中，每個池中48個突變體。10個隨機選取的含有微型-Tn10-特異性探針的接合後體的DNA印跡分析證實標記轉座子是單一、隨機插入(數據沒有顯示)。然而，減毒克隆隨後的序列分析顯示在胸膜肺炎放線桿菌中微型-Tn10的插入不完全是隨機的。
2.胸膜肺炎放線桿菌突變體在豬中的標記標籤的篩選使用豬氣管內感染模型篩選標籤標記的胸膜肺炎放線桿菌突變體，鑑定毒力中所包含的基因。根據以前的研究將細菌直接滴注進氣管已經顯示噴嚏所產生的氣霧顆粒足夠小以至於能夠滲透到下呼吸道內，避免需要定居到上呼吸道(Kaltreider HB.，Immunologic and infectiousdiseases，the lung.(1976)pp.73-97，Kirkpatrick Reynolds(Eds)Marcel Dekker，New York)。
按照豬宿主體內選擇能夠可重複地回收大多數單個突變體前，研究了包括感染劑量以及回收方法的一系列試驗因素。使用例如103、104或105cfu的攻擊劑量，感染劑量和出現疾病的臨床或形態學體徵之間相關性差。此外，當用相同的池感染不同豬時，傳代後池的雜交模式提示指定池通過不同動物的傳代後，失去不同克隆(數據沒有顯示)。這種不一致可通過將攻擊量增加到106-107cfu/豬克服。
在豬中進行的胸膜肺炎放線桿菌感染的較早的STM研究中[Fuller，2000 Microb.Pathog.29，pp.39-51]，實驗性感染後通過肺灌洗回收細菌。然而，發現這種方法不可靠，產生基本上隨機回收單個標記標籤。相反，我們觀察到整個肺在HBSS中勻漿後，持續回收活菌。這兩個決定性參數的最優化導致回收大多數單個克隆(＞90％，感染後20-48小時)，動物之間具有極好的重複性(見

圖1；比較A和B)。
篩選總計2064個轉座子突變體(43個池，每個池48個突變體)用於體內減毒，每個池接種至少兩個不同動物。通過在無菌HBSS中肺的勻漿回收存活的細菌。這種初步篩選鑑定了在輸入池中存在但是在輸出池中失去或者顯著減少的550個突變體。將這些潛在的減毒突變體重新匯集成新池，將每個新池用於感染另外兩個動物。這種第二次篩選後，發現105/410個突變體在輸出池中始終缺乏，保留這些突變體進行進一步分析。
3.胸膜肺炎放線桿菌毒力基因的鑑定和分析獲得上述105個減毒突變體中每一個的轉座子插入位點兩側DNA的核苷酸序列，並用於搜索GenBank資料庫尋找同源基因。在表1中顯示這種分析的結果，基因被分配到5個功能種類之一細胞表面、運輸、代謝、應激反應、以及調控。將在編碼與資料庫中的蛋白無顯著同源性，或者與未知功能的蛋白或預測蛋白同源的蛋白的基因中的插入歸為「未知的」一類。鑑定了含有在53個單個基因中的轉座子插入和許多Tn10插入熱點的105個減毒突變體。特別是，在推定的rfbP基因(在第444密碼子中的Tn插入)中獨立地分離了7個相同的插入，在胸膜肺炎放線桿菌fur基因中的4個插入中，3個位於第128密碼子。有趣地是，在本研究中鑑定的3個熱點兩側的DNA序列彼此不相似，也不與以前已經鑑定的插入到胸膜肺炎放線桿菌中的Tn10插入的共有序列相似(Fuller等(2000)Microb.Pathog.29，pp.25-38)。
(i)細胞表面已知莢膜和脂多糖(LPS)基因中的突變降低胸膜肺炎放線桿菌的毒力(Rioux等，Can.J Microbiol.45pgs1017-1026，1999)(Rioux等，Microb Pathog 28pgs 279-289，2000；Ward等，Infect Immun 66pgs3326-3336，1998)。突變體9C2在cpxC基因中含有轉座子插入，其中該基因編碼在胸膜肺炎放線桿菌莢膜輸出中所包含的蛋白(Ward和Inzana，1997)。這種突變體在體內CI試驗中用作對照(已知減毒)株。在這個STM篩選中鑑定了在胸膜肺炎放線桿菌血清型1的O-抗原的合成中所包含的5個基因。在O-抗原操縱子的基因9(突變體10B11)、12(突變體25B7)、15(突變體15A9)、17(突變體12D5)、以及18(突變體21B8)中含有插入的突變體(Labrie等，2002，J.Endotox Res.827-38)全部都是減毒的。另一個突變體9B7具有編碼在LPS核心的合成中所包含蛋白的胸膜肺炎放線桿菌galU基因上遊20個鹼基的轉座子插入。以前證明galU的突變降低胸膜肺炎放線桿菌的毒力(Rioux等，1999)。最後，突變體26A9在與lcbB同源的基因中含有插入，一種在腦膜炎奈瑟氏球菌(N.meningiditis)血清型L莢膜或LPS生物合成中所涉及的推定的雙功能聚合酶。
4D4株在編碼推定的脂蛋白的基因中含有轉座子插入。4D4株顯示與多殺巴斯德氏菌(P.multocida)的未知蛋白有最高的同源性，但是其與流感嗜血桿菌(H.influenzae)和睡眠嗜血菌(H.somnus)的脂蛋白和推定的脂蛋白相似[Theisen(1993)Infect Immun 611793-1798]。睡眠嗜血菌LppB結合剛果紅染料(一種血紅素的結構類似物)，並且提示是毒力因子，但是這一直沒有被正式地證明[Theisen(1993)InfectImmun 611793-1798]。最後，17A4株在與流感嗜血桿菌的P2膜孔蛋白同源的ORF中含有插入[Duim等(1993)Microb.Pathog.14，pp.451-462]。P2蛋白構成大約流感嗜血桿菌全部外膜蛋白中的一半，代表對無法分型的流感嗜血桿菌感染的免疫反應的重要靶[Yi等(1997)Infect-Immun-65，150-155]。
(ii)代謝10B12株在ADP-核糖焦磷酸酶(adpP)基因同系物中含有轉座子插入。ADP-核糖(ADP-核糖來自NAD)的細胞水平的調節在預防蛋白的非酶促ADP-核糖基化中很重要。大腸桿菌ADP-核糖焦磷酸酶催化ADP-核糖水解成核糖-5-P和AMP，化合物可作為核苷酸代謝的一部分再循環[Gabelli等(2001)Nat Struct.Biol.8，pp.467-472]。
10A11株在精氨琥珀酸合酶，argG，基因同系物中攜帶插入。精氨琥珀酸合酶催化瓜氨酸和天冬氨酸轉化成精氨琥珀酸，經所謂的天冬氨酸-精氨琥珀酸支路連接尿素循環和檸檬酸循環。天冬氨酸-精氨琥珀酸支路提供加工胺基酸的氨基和碳骨架路徑之間的代謝連接。(Glansdorff(1996)，精氨酸和多胺的生物合成，Escherichia coli andSalmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.等人，編)，pp.408-433，ASM Press)。
在33C7株中，發現減小的損害發生在與編碼F1F0ATP合成酶的F1α亞單位的流感嗜血桿菌atpA同源的基因中。ATP合酶負責在需氧或者厭氧生長的細胞中利用跨細胞質膜的質子電化學梯度合成ATP。通過atp操縱子編碼細菌酶的所有8個亞單位。在多殺巴斯德氏菌中atpA基因兩側是atpH和atpG，而在胸膜肺炎放線桿菌中基因順序是未知的，以前在胸膜肺炎放線桿菌感染的發病機理中已經涉及了atpH和atpG兩者[Fuller(2000)Microb.Pathog.29，pp.39-51]。
在0A7株中，轉座子使編碼NAD(P)轉氫酶β亞單位的pntB基因失活。轉氫酶是一種固有膜蛋白，其由兩個亞單位α和β構成，組織起來成為α2β2四聚物。轉氫酶將NAD(H)和NADP(H)之間的氧化還原反應與跨內膜的質子轉運偶聯(Penfound Foster(1996)，NAD的生物合成和再循環Escherichia coli and Salmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.等，編)，pp.408-433，ASM Press)。它在能量代謝、生物合成以及解毒作用中起關鍵作用。
在19D5株中，轉座子在胸膜肺炎放線桿菌mrp基因中插入。可得到的部分胸膜肺炎放線桿菌mrp基因序列與流感嗜血桿菌和大腸桿菌的mrp基因高度同源。在流感嗜血桿菌中，在LPS的Gala(1-4)βGal成分的生物合成中涉及mrp基因，而在大腸桿菌中mrp中的突變影響硫胺素的合成[High等(1996)FEMS Microbiol.Lett.145，pp.325-331；Petersen(1996)J.Bacteriol.178，pp.5676-5682]。在胸膜肺炎放線桿菌中，mrp基因位於編碼體內誘導RTX毒素ApxIV的apxIVA基因上遊大約1kb處[Schaller(1999)Microbiology 1452105-2116]。
29B11株在napB基因同系物中含有轉座子插入，該基因編碼異二聚體周質硝酸還原酶(NAP)的較小的dihaem細胞色素c亞單位。在流感嗜血桿菌(和假單胞菌屬(Pseudomonas sp))中，NAP是唯一的硝酸還原酶，功能可能是在存在硝酸時支持厭氧性生長[Brige(2001)Biochem.J.356，pp.851-858；Fleischmann(1995)Science 269，pp.496-512；Bedzyk(1999)J Bacteriol 1812802-2806]。在大腸桿菌中情況更複雜，除了NAP外，存在兩個膜結合的呼吸硝酸還原酶[Moreno-Vivian(1999)J Bacteriol 1816573-6584]。有證據提示NAP是用於氧化還原平衡的異化(dissimilatory)酶。此外，提示NAP在從需氧條件轉變到厭氧條件後對厭氧代謝的適應，替代還原劑的利用，或者甚至在形成高硝酸水平作為一種自我防禦機制抑制競爭細菌的生長中起作用[Moreno-Vivian(1999)J Bacteriol 1816573-6584]。與在厭氧適應中的作用一致，在暴露於厭氧條件的細胞中，以Fnr-依賴方式誘導鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)napB基因的轉錄[Wei和Miller(1999)J.Bacteriol.181，pp.6092-6097]。
17B8株，在與流感嗜血桿菌ccmH同源的基因中含有插入，其中該基因是腸細菌中包括NAP的C-型細胞色素的裝配所必需的[Thony-Meyer(1995)J.Bacteriol.177，pp.4321-4326；Kranz(1998)Mol Microbiol 29，pp.383-396]。CcmH是由ccm操縱子的最後基因編碼，並含有CcmF和CcmG，據信能催化細胞色素c脫輔蛋白質中二硫鍵的還原並便於血紅素附著[Kranz(1998)Mol Microbiol 29，pp.383-396]。而在大腸桿菌中nap和ccm操縱子相鄰，並可能共轉錄[Grove(1996)Mol Nicrobiol 19，pp.467-481]，它們在流感嗜血桿菌和多殺巴斯德氏菌中位於不同的基因座[Fleischmann(1995)Science 269，pp.496-512；May(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98，pp.3460-3465]。
4B9株在moaA基因同系物中含有轉座子插入。在大腸桿菌中moaA-E基因是從GTP合成molybdopterin必需的[Rivers(1993)MolMicrobiol 81071-1081]。Molybdopterin(molybdopterin鳥嘌呤二核苷酸)是在包括周質硝酸還原酶的原核molybdopterin中發現的主要輔因子。厭氧生活誘導moa基因的表達[Anderson(2000)J.Bacteriol.182，pp.7035-7043]，鼠傷寒沙門氏菌moaA突變體削弱了它們在上皮細胞中複製的能力[Contreras(1997)Microbiology 143，pp.2665-2672]。
突變體29B12在胸膜肺炎放線桿菌recR基因同系物中含有插入。RecR蛋白是在重組(recombinatorial)DNA修復的RecF途徑中包含的蛋白；recR突變體在補平最新合成的DNA的子代鏈缺口中有缺陷[Kuzminov(1999)Microbiol Mol Biol Rev 63，pp.751-813]。RecR中的突變延遲大腸桿菌中SOS應答的誘導，這種突變體對UV照射和絲裂黴素C敏感[Keller(2001)Mutat Res 486，pp.21-29]。
在26A10株中，轉座子插入到與流感嗜血桿菌的thrC高度同源的基因中。thrC基因編碼蘇氨酸合酶，在導致產生蘇氨酸的生物合成途徑中的決定性酶(Patte(1996)，蘇氨酸和賴氨酸的生物合成，Escherichiacoli and Salmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.等人，編)，pp.408-433，ASM Press)。肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)thrC基因同系物中的突變在肺炎的鼠模型中降低這種生物體的毒力[Lau(2001)MolMicrobiol 40，pp.555-571]。
在26D12株中，轉座子使GMP合酶，guaA，基因同系物失活。GMP合酶催化從XMP合成GMP，作為嘌呤生物合成途徑的一部分。GuaBA操縱子中的突變降低包括大腸桿菌、福氏志賀氏菌(S.flexneri)、和鼠傷寒沙門氏菌的多種腸病原體的毒力，ΔguaBA鼠傷寒沙門氏菌衍生物顯示有望作為活性減毒載體[Wang(2001)Infect Immun 69，pp.4734-4741；Noriega(1996)Infect Immun 64，3055-3061；Russo(1996)Mol Microbiol 22，pp.217-229]。此外，以前在中無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和多殺巴斯德氏菌中的STM篩選在體外生長和發病機理中分別涉及guaA和guaB[Jones(2000)Mol Microbiol 37，pp.1444-1455；Fuller(2000)Microb Pathog 29，pp.39-51]。
突變體27A12在以前在胸膜肺炎放線桿菌中鑑定為tonB的基因中含有轉座子插入(Tonpitak等，Infect Immun 681164-1170 2000)(現在稱作tonB1)。發現該基因緊靠exbB，exbD以及轉鐵蛋白結合蛋白(tbp)基因的上遊，並且與它們共轉錄。相反，0F6株在編碼與多殺巴斯德氏菌和嗜血桿菌屬(Haemophilus sp.)的TonB蛋白(現在稱作tonB2)同源的蛋白的ORF中含有轉座子插入。此外，在0F6中轉座子插入上遊區的序列分析顯示存在獨特的exbB和exbD基因同系物，提示胸膜肺炎放線桿菌，同包括霍亂弧菌(V.cholerae)和銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)的其它細菌病原體一樣，具有兩個獨立的TonB系統(Occhino等，Mol Microbiol 291493-15071998；Zhao和Poole，FEMSMicrobiol Lett 184127-132 2000)。
35D11株在與流感嗜血桿菌dsbA同源的基因中含有插入。DsbA是小周質蛋白並且是硫氧還蛋白超家族的成員[Debarbieux(1999)Cell 99，pp.117-119]。DsbA中的突變是多效的，影響包括細菌毒力因子、III型分泌體系的組分、以及包括NAP的c-型細胞色素的多種傳導型(translocated)蛋白的產生[Yu和Kroll(1999)Microbes Infect 1，pp.1221-1228]。在福氏志賀氏菌[Yu(1998)Infect Immun 66，3909-3917]和多殺巴斯德氏菌[Fuller(2000)Microb Pathog 29，pp.25-38]的毒力中已經分別涉及在dsbA和dsbB中的突變。
在26C3株中，轉座子使穀氨醯-tRNA還原酶，hemA，基因同系物失活，而在26D5株中，轉座子在推定的尿卟啉原脫羧酶uroD/hemE基因同系物中插入。穀氨醯-tRNA還原酶催化穀氨酸還原成穀氨酸1-半醛，從穀氨酸形成δ-氨基乙醯丙酸(ALA)獨有的第一關鍵步驟。從ALA形成的下遊，尿卟啉原脫羧酶催化尿卟啉原III脫羧產生糞卟啉原，是在尿卟啉原III經原卟啉IX轉化成正鐵血紅素中的第一步。血紅素，包括正鐵血紅素，是電子轉移裝置的關鍵組分，另外作為酶修復基在礦物營養和氧化催化中起重要作用(Beale，，血紅素的生物合成，Escherichia coli and Salmonella(Vol.1)(Neidhardt，F.C.et al.，eds)，pp.408-433，ASM Press)。
在15A11株中，轉座子插到與多殺巴斯德氏菌visC同源的基因中。VisC編碼的蛋白編碼屬於UbiH/CoQ6家族的推定的單加氧酶。UbiH是泛醌生物合成必需的[Nakahigashi(1992)J.Bacteriol.174，pp.7352-7359]，在原核生物質膜的呼吸電子鏈中起作用的異戊二烯化的苯醌。泛醌和正鐵血紅素通過便於DsbA被DsbB的氧化，也在周質蛋白的二硫鍵的形成中起作用[Kobayashi(1997)Proc Natl Acad Sci USA 94，pp.11857-11862]。
29A10株在與流感嗜血桿菌的prfC同源的基因中含有轉座子插入。prfC基因編碼肽鏈釋放因子3(RF3)，在存在GTP時，翻譯終止後催化從核糖體除去RF1和RF2的GTP酶[Freistroffer(1997)EMBO J 164126-4133]。儘管在原核生物中不是生存必需的，但是經RF3-GTP的RF1和RF2的高效再循環對於最大生長率是必需的[Kisselev(2000)Trends Biochem Sci 25，pp.561-566]。
在26A6和33B7株中，轉座子在與tRNA/rRNA甲基轉移酶的trmH家族同源的基因中插入。26A3株中被破壞的ORF顯示與流感嗜血桿菌yibK同源性最高，而在33B7株中顯示與流感嗜血桿菌的yjfH最相似。
(iii)調節在這個篩選中鑑定了在環境的感應和協同調節中涉及的毒力基因。發現高鐵攝入調節劑的胸膜肺炎放線桿菌同系物fur在6C12株中失活。顯示Fur或Fur樣蛋白在包括大腸桿菌(志賀樣毒素)、白喉桿菌(Corynebacterium diptheriae)(白喉毒素)、以及銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)(外毒素A)的多種病原體中調節毒力因子表達[Prince(1991)Mol.Microbiol 5 pp.2823-2831；Schmitt(1991)Infect Immun 59，pp.1899-1904；Calderwood(1987)J.Bcateriol 169，pp.4759-4764]。21D3和19B10株分別在胸膜肺炎放線桿菌rpoE和上遊mclA(rseA)基因同系物中含有轉座子插入。RpoE編碼σ因子，σE/σ-24，是σ因子的胞質外功能亞家族的成員，其中σ因子作為效應分子在對包括熱休克和氧化應激的胞質外刺激的反應中起作用[Raina(1995)EMBO J 14，pp.1043-1055；Rouviere(1995)EMBO J.141032-1042；Ades(1999)Genes Dev 13，pp.2449-2461；Dartigalongue(2001)J Biol Chem 276，pp.20866-20875]。在鼠傷寒沙門氏菌中，σE是毒力和免疫原性的重要決定子[Humphreys(1999)Infect Immun 67，pp.1560-1568l。MclA(RseA)是作為σE特異性抗σ因子起作用的內膜蛋白。MclA(RseA)在對胞質外應激反應中迅速降解，導致σE濃度增加以及引發應激反應[Ades(1999)Genes Dev 13，pp.2449-2461]。最後，觀察到在胸膜肺炎放線桿菌固有感應luxS同系物中的插入(26D3株)降低胸膜肺炎放線桿菌毒力。最近，在EHEC和EPEC兩者中，在由腸細胞脫落致病性島的基因座所編碼的腸定居因子的調控中涉及大腸桿菌luxS同系物[Sperandio(2001)J Bacteriol 183，pp.5187-5197；Sperandio(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96，pp.15196-15201]。
(iv)運輸胸膜肺炎放線桿菌基因aopA在23C9株中失活。AopA基因編碼被檢驗的胸膜肺炎放線桿菌中所有血清型共有的48kDa免疫原性外膜蛋白[Cruz(1996)Infect Immun 64pp.83-90]。有趣地是，AopA與流感嗜血桿菌的Nqr1(解藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)的NqrA)高度同源(75％相同，84％相似)，編碼鈉-轉運NADH-泛醌氧化還原酶(NQR)複合體的α鏈[Hayashi(1996)FEBS Lett 381pp.174-176；Beattie(1994)FEBS Lett 356pp.333-338]。NQR酶是連接呼吸的建立跨膜鈉離子電化學梯度的Na+泵。得到的鈉動力可用於溶質轉運、ATP合成、以及鞭毛的旋轉。這種偶聯鈉離子而不是質子的交替能量使細菌在鹼性環境中能將細胞質的pH維持在接近中性。在解藻朊酸弧菌中NQR酶是最廣泛研究的酶，據認為其是在pH和離子穩態中包含的酶[Beattie(1994)FEBS Lett 356pp.333-338；Unemoto(1993)J.BioenergBiomembr 25pp.385-391]。在霍亂弧菌(Vibrio cholerae)中，通過其對ToxT表達的影響在毒力因子表達的調節中涉及NQR複合體[Hase(1999)Proc Natl Acad Sci USA 96 pp.3183-3187]。
鑑定了胸膜肺炎放線桿菌毒力必需的幾種不同推定的ABC運輸系統的組分。ABC運輸系統是在高分子跨細菌和真核生物細胞質膜的不同排列的運輸(攝入或流出)中包含的系統。這些系統通常由三個基本部分構成一個或兩個ATP酶，一個或兩個整合膜蛋白以及底物特異的結合蛋白。13B12，0C5，19D1，和24A4株在ABC轉運裝置的ATP酶組分中含有轉座子插入。在0C5株中失活的基因編碼與原核半乳糖轉運裝置的MglA具有顯著同源性的蛋白(Richarme等，J Biol Chem 2689473-9437，1993)。這種突變體的體內CI表明在呼吸道環境內某些糖的有限的有效性。在19D1和24A4株中被破壞的ORF與多殺巴斯德氏菌(分別是PM1728和PM0996)中未知特異性的運輸系統的假定的ATP酶同源。在20D10株中，轉座子使與杜氏嗜血菌(H.ducreyi)的znuA和流感嗜血桿菌的pzp1具有廣泛同源性的基因失活(Lewis等，InfectImmun 675060-5068，1999；Lu等，J Biol Chem 27229033-29038 1997and FEMS Microbiol Lett 165129-1371998)。ZnuA(PZP1)是在鋅攝取中起關鍵作用的周質鋅-結合蛋白。在杜氏嗜血菌中znuA基因的失活導致在實驗性軟下疳的兔子模型中毒力顯著降低(Lewis等，InfectImmun 675060-5068，1999)。在0D6株中，轉座子在編碼與多殺巴斯德氏菌(PM0997)和腦膜炎奈瑟氏球菌(N.Meningitidis)(NMB0549)的推定的固有膜蛋白同源的蛋白的基因中插入。在多殺巴斯德氏菌中PM0997位於緊靠在24A4株中失活的ATP酶的上遊，提示它們是相同運輸系統的一部分(May等，Proc Natl Acad Sci USA 983460-34652001)。這個基因也被Fuller等鑑定為apvD(Fuller等，Microb Pathog 2939-51 2000)，其預測的產物顯示與大環內酯特異性ABC型流出蛋白MacA同源(Kobayashi等，J Bacteriol 1835639-5644 2001)。在突變體9D10中，被破壞的基因序列編碼與調節鎂流入和流出以及鈷流出的CorC同源的蛋白(Gibson等，Mol Microbiol.，5pgs 2753-2762，)。
(v)應激在13A3株中，轉座子在dnaJ基因同系物中插入。DnaJ是細菌的Hsp70伴侶系統的基本組分，其中其作為共伴侶起作用，提供對其Hsp70伴侶，DnaK，底物特異性[Rudiger(2001)EMBO J 20 pp.1042-1050]。除了它們在蛋白摺疊和運輸中的基本作用外，DnaK/DnaJ構成大腸桿菌熱休克反應的初級應激感應和轉導系統[Tomoyasu(1998)MolMicrobiol 30 pp.567-581]，其中它們通過改變熱休克σ因子σ32的穩定性，調節熱休克反應的誘導。有意義地，以前已經證明DnaK中的突變降低胸膜肺炎放線桿菌毒力，降低豬布魯氏菌(Brucella suis)在人巨噬細胞樣細胞系中的存活[Fuller(2000)Microb Pathog 29 pp.39-51；Kohler(1996)Mol Microbiol 20 pp.701-712]。
26B6株在htpG基因同系物中含有插入。HtpG是熱休克誘導的分子伴侶，其在大腸桿菌中有助於在適度應激的細胞中細胞質蛋白的正確摺疊[Thomas(2000)Mol Microbiol 36 1360-1370]。HtpG似乎不與伴侶蛋白穩定聯繫，關於其作用機理知道很少。建議HtpG用作固定器伴侶，在可進入DnaK/DnaJ的構象中短暫地維持de novo合成蛋白的子集[Freeman(1996)EMBO J 15 pp.2969-2979]。
13D8株在lon基因同系物中含有轉座子插入。Lon(也稱作蛋白酶La)是可熱休克誘導的，依賴於ATP的絲氨酸蛋白酶，在除去異常摺疊蛋白中起重要作用[Gottesman(1996)Annu Rev Genet 30 465-506；Suzuki(1997)Trend Biochem Sci 22 pp.118-123]。除了其被證明的作為應激反應蛋白酶的作用外，Lon也通過降解不穩定的調節蛋白作為基因表達的多效調節劑起作用，其中調節蛋白包括RcsA，莢膜合成的正調節劑[Keenleyside(1992)J Bacteriol 174 pp.8-16]和SulA，細胞分裂的抑制劑以及大腸桿菌(E.coli)SOS反應的組分[Mizusawa(1983)Proc NatlAcad Sci USA 80 pp.358-362]。最近在流產布魯氏菌(Brucella abortus)中的研究已經證明Lon是在鼠巨噬細胞中生存和在感染的小鼠模型中野生型毒力所必需的[Robertson(2000)Mol Microbiol 35577-588]。
13C1株在prc基因同系物中攜帶轉座子插入。Prc是一種周質蛋白酶，其天然底物似乎是包括TonB的膜蛋白[Gottesman(1996)Annu RevGenet 30 pp.465-506]。據推測Prc作為蛋白在周質間隙中的摺疊和轉換中所包含的伴侶蛋白起作用[Bass(1996)J Bacteriol 178 pp.1154-1161]。
序列表110Imperial College Innovations，Ltd.
120細菌毒力基因130MRM/PJG/24342150GB 0228691.21512002-12-0916063170PatentIn version 3.221012113344212DNA213胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)4001gaattctaaa ttgagctgcc aatgcttgtt gttcgtcaca attcacggtt gccaataaaa 60attgtgccgg attttcatcc gccaaccggc gtaataatga atccatttcc aatgaagcca 120cttctctcgg cgagataaaa ttaaacacga ccggcacttg tgtcgccgca ttccacactt 180cactaaaatt actttcggta acattgacaa aataattcat actcttttcc taatctaaaa 240aatcggcaaa ttatacttta tttttagtaa gccgtttcaa tcggtaaacc gcttctttcc 300caaccgtcga aaccgccttt cacgctatat acgcgatcaa aaccctgttc gactaaaaat 360tgtgcggtat tacgactgct cacgccgtga tagcacatga cgatgaccgg ttcttcataa 420tccacttcat ctaaaaaacg cccgtagctt tcattagtta aatggaacgc atcttgcgga 480tggctatagg cataacgacg tccatcacga atatccgcta aagtcgcacc ttcgttttcg 540attaattccc acgcctgatg cgggctgatc tcagtaaatg tttcactcat atttcatgct 600caataagaaa aataaaccaa ataaaattaa tcgactatac cataagacgt ttacaaaaat 660aaacgagaat acctattatt acgagttgaa ttttctgact tacttagtat aattgcaaac 720
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223合成引物40058cgaccattct aaccaagc 182105921128212DNA213人工序列220
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223合成引物40060cgcctagtcg actacaacct caagctt 27210612119212DNA213人工序列220
223合成引物40061gtcgaccct 9210622119212DNA213人工序列220
223synthetic ol igonucleotide40062gtcgacagg 92106321119212DNA213人工序列220
223合成引物40063gacaagatgt gtatccacc 19
權利要求
1.一種減毒胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)細菌。
2.一種在細菌毒力所需基因中具有突變的減毒胸膜肺炎放線桿菌細菌。
3.一種在包含選自SEQ ID NO.1-56的核苷酸序列的基因中具有突變的減毒胸膜肺炎放線桿菌細菌。
4.一種具有在單個基因內或者在不同基因內發生多重突變的減毒胸膜肺炎放線桿菌細菌。
5.一種含有根據前面任何一項權利要求的減毒胸膜肺炎放線桿菌細菌的組合物。
6.根據權利要求5的組合物，包括許多不同的減毒胸膜肺炎放線桿菌細菌，其在相同毒力基因中具有不同突變和/或在兩個或更多不同基因中具有相似，或不同突變的細菌。
7.根據權利要求5或6中任何一項的組合物，進一步包含一種或多種藥理學上可接受的佐劑、稀釋劑、載體、運載體和/或賦形劑。
8.根據權利要求5-7中任何一項的組合物，其被包裝成適於通過靜脈內、真皮內、肌內、乳房內、腹膜內和/或皮下注射、和/或通過口服、舌下、鼻、肛門或陰道輸送施用的形式。
9.根據權利要求5-8中任何一項的組合物，其選自免疫原性組合物、治療性(例如，預防性)組合物和疫苗。
10.根據權利要求9的組合物，其中該組合物是疫苗，所述疫苗施用給動物後賦予一定程度的交叉保護。
11.根據權利要求1-4中任何一項的減毒胸膜肺炎放線桿菌細菌在製備預防或減輕動物患胸膜肺炎放線桿菌感染的藥物中的用途。
12.根據權利要求1-4中任何一項的減毒胸膜肺炎放線桿菌細菌在製備預防或減輕與胸膜肺炎放線桿菌感染相關症狀的藥物中的用途，如豬抗豬胸膜肺炎的預防性保護。
13.一種分離的多核苷酸，其編碼在胸膜肺炎放線桿菌毒力中所天然涉及(例如，必需)的基因產物。
14.一種分離的多核苷酸，其編碼不是在胸膜肺炎放線桿菌中天然存在的基因產物，但是在其中的表達能夠調節(例如，降低)該細菌的毒力。
15.一種分離的多核苷酸，其不是在胸膜肺炎放線桿菌中天然存在的，但是其能夠通過其與胸膜肺炎放線桿菌毒力基因或基因產物直接相互作用調節該細菌的毒力。
16.一種分離的多核苷酸，包括(a)選自SEQ ID NO.1-56的核苷酸序列；(b)編碼多肽的核苷酸序列，其中多肽是由在(a)中所述的核苷酸序列編碼；(c)與(a)和/或(b)的核苷酸序列或其互補鏈在中等到高度嚴格條件下雜交的核苷酸序列；或者(d)(a)-(c)的核苷酸序列中任何一種的片段，該片段保留(a)-(c)所述核苷酸序列的免疫學特性和/或生物學活性。
17.包含根據權利要求13-16中任何一項的多核苷酸的載體。
18.含有根據權利要求13-17的多核苷酸或載體的宿主細胞。
19.一種在基因中含有突變的減毒細菌，其中該基因包含在中等到高度嚴格的條件下能與SEQ ID NO1-56所定義的核苷酸序列中的任何一種雜交的核苷酸序列。
20.根據權利要求19的減毒細菌，具有在單個基因內或者在不同基因內發生的多重突變。
21.一種含有根據權利要求19或20的細菌的組合物。
22.根據權利要求21的組合物，包含許多不同的減毒細菌，其在相同毒力基因中具有不同的突變和/或在兩個或多個不同基因中具有相似，或不同突變的細菌。
23.根據權利要求21或22中任何一項的組合物，進一步包含一種或多種藥理學上可接受的佐劑、稀釋劑、載體、運載體和/或賦形劑。
24.根據權利要求21-23中任何一項的組合物，其被包裝成適於通過靜脈內、真皮內、肌內、乳房內、腹膜內和/或皮下注射、和/或通過口服、舌下、鼻、肛門或陰道輸送施用的形式。
25.根據權利要求21-24中任何一項的組合物，其選自免疫原性組合物、治療性(例如，預防性)組合物和疫苗。
26.根據權利要求25的組合物，其中該組合物是疫苗，所述疫苗施用給動物後賦予一定程度的交叉保護。
27.根據權利要求19或20的細菌在製備治療性治療或預防性保護動物對抗相應野生型細菌(或者其不同的菌株或血清型)感染的藥物中的用途。
28.一種分離的胸膜肺炎放線桿菌毒力多肽。
29.一種生產根據權利要求28的毒力多肽的方法，包括下列步驟(i)在允許多肽表達的條件下培養根據權利要求18的宿主細胞；以及(ii)從宿主細胞中，或者從其周圍培養基中回收和任選地分離所表達的多肽。
30.根據權利要求13-16中任何一項的多核苷酸所編碼的毒力多肽。
31.包含根據權利要求28或30的多肽的組合物。
32.根據權利要求31的組合物，進一步包含一種或多種藥理學上可接受的佐劑、稀釋劑、載體、運載體和/或賦形劑。
33.一種特異性識別根據權利要求13-16和權利要求28或30中任何一項的多核苷酸或多肽的抗體。
34.一種鑑定能夠調節本發明的胸膜肺炎放線桿菌毒力基因，或者相關物種中同源基因功能的抗菌劑的方法。
35.根據權利要求34的方法，包括篩選在宿主細菌中能夠幹擾SEQ ID NO.1-56中任何一種所示核苷酸序列所編碼的基因產物的表達和/或生物學活性的潛在的藥劑。
36.通過權利要求34或35的方法鑑定的藥劑。
37.一種通過使用寡核苷酸指導的三螺旋形成調節毒力基因轉錄的方法。
38.一種含有根據權利要求36的抗菌劑的組合物。
39.一種通過施用根據權利要求36或38中任何一項的抗菌劑或組合物治療患巴斯德氏菌屬(Pasteurellaceae)(例如，胸膜肺炎放線桿菌)感染動物的方法。
40.根據權利要求36或38的藥劑或組合物在製備治療巴斯德氏菌屬感染和/或豬胸膜肺炎的藥物中的用途。
全文摘要
減毒的胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)細菌在細菌毒力必需基因中具有突變。提供了基於該細菌的疫苗，以及分離的毒力基因和多肽及其用途。
文檔編號A61K39/102GK1735689SQ200380108421
公開日2006年2月15日 申請日期2003年12月8日 優先權日2002年12月9日
發明者J·S·克羅爾, P·R·蘭福德, J·博斯, A·貝德克, A·裡克羅夫特, B·希恩 申請人:英皇學院創新有限公司