核酸的鹼基序列的識別方法

2023-04-28 08:39:01 2

專利名稱：核酸的鹼基序列的識別方法
技術領域：
本發明涉及一種核酸的鹼基序列的識別方法。更具體而言，本發明涉及一種利用核酸擴增法來進行在標本中的DNA中含有的特定的序列的檢測、基因的多態性的檢測及1鹼基多態(SNPs)的分析等的方法。

背景技術：
人們正在積極地利用從基因組(genome)分析研究獲得的成果，將基因多態等基因組信息應用到醫療領域。
例如，1鹼基多態(SNPs)被認為是在1000個鹼基中存在1個，人們認為這些SNPs是產生各個體差、個人的特性或先天體質差異的原因之一。而且，目前逐漸明確了如下結論，即主要因素基因作為危險因素參與本來被認為環境因素的作用的比例較高的疾病(糖尿病或高血壓症等)，其中的大多數被確定為1鹼基多態。而且，人們還認為SNPs分析會有助於按照個人的體質進行給藥或治療(TaylorMade醫療)，因而備受矚目。
另一方面，HCV、流感病毒(influenza virus)、幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)等細菌或病毒的亞型(subtype)也被認為是一種多態，而各種藥劑的治療效果由於這些亞型的不同而不同。因而，對這種病毒等的多態的檢測還會給治療方法的選擇提供重要的信息。
作為識別核酸的鹼基序列的方法，已知使用設計成具有與應檢測的序列互補的序列的引物，進行利用DNA聚合酶的核酸擴增反應的方法。
作為核酸的擴增方法，聚合酶鏈反應(PCR)已被廣泛地認識。在PCR法中，為了使作為目的的目標核酸序列擴增，包括以下3個工序，即將作為模板的兩條鏈DNA變性成一條鏈DNA的工序(變性工序)；使引物在一條鏈DNA上退火的工序(退火工序)；以及，以引物為起點延長互補鏈的工序(延長工序)。在普通的PCR法中，使用基因擴增儀(thermalcycler)，在分別不同的溫度下進行變性工序、退火工序、延長工序。但是，為了在3種不同的溫度下進行核酸擴增反應而必需進行精密的溫度控制，從而難以用小型的裝置簡便地進行檢查。另外，還存在時間的浪費與循環數成比例地增大的問題。
因此，開發出了可以在等溫狀態下實施的核酸擴增反應。例如可以舉出RCA(滾環擴增技術(Rolling Circle Amplification)Proc.Nat.Acad.Sci，vol.92，4641-4645(1995))、SDA法(鏈置換擴增(Strand DisplacementAmplification)；特開平5-130870號)、ICAN(等溫的和嵌合引物起始的核酸擴增(Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids))、LAMP(環介導等溫DNA擴增技術(Loop-Mediated Isothermal Amplification of DNA)；Bio Industry，第18卷、2號(2001))、NASBA(基於核酸序列的擴增技術(Nucleic acid Sequence-based Amplification method)；Nature，350，91～(1991))、TMA(轉錄介導擴增技術(Transcription mediated amplification method)；J.Clin Microbiol.第31卷、3270～(1993))等。
但是，這些方法還存在如下問題，即如果必需與聚合酶一起使用核酸外切酶、RNAseH或逆轉錄酶等或者必需特殊的引物，則增加了成本，同時引物設計也非常困難。
在特開2002-233379號公報中記載了在具有鏈置換能的DNA聚合酶的存在下，利用至少1組寡核苷酸引物，利用等溫下的反應來擴增成為目的的區域的DNA的方法。但是，在特開2002-233379號公報中記載的方法中，存在必需較長的反應時間等問題。
進而，作為利用核酸擴增反應來識別核酸的鹼基序列時的共同的問題，可以舉出在引物與目標序列不完全互補的情況下，也常常發生擴增反應(非特異擴增)。例如，在為1鹼基多態的識別的情況下，識別對象的核酸與非識別對象的核酸的差異只有1個鹼基，所以該問題變得顯著。由於非特異擴增的發生與否受到機器或周圍的環境等微妙的條件左右，所以難以抑制非特異擴增。
非專利文獻1Proc.Natl.Acad.Sci.vol.92，4641～4645(1995) 非專利文獻2Bio Industry，第18卷、2號(2001) 非專利文獻3Nature，350，91～(1991) 非專利文獻4J.Clin Microbiol.第31卷、3270～(1993) 專利文獻1特開平5-130870號公報 專利文獻2特開2002-233379號公報

發明內容
本發明想要解決的課題是提供一種利用在等溫狀態下特異地擴增核酸序列的方法來精密度良好地識別核酸序列的方法。進而還想解決的課題是利用更簡單的引物設計來實現該課題。
本發明人等發現通過使用與第一核酸實質上互補的至少一種寡核苷酸(以下為引物)和被設計成相對該第一核酸和第二核酸的應識別的鹼基序列部位雜交而且相對第二核酸比相對第一核酸更互補、進而不成為利用聚合酶的延長反應的起點的至少一種寡核酸(以下為屏蔽寡核酸)，進而該引物的一部分和該屏蔽寡核酸的一部分與該第一核酸及該第二核酸的同一區域雜交，可以利用等溫擴增法，簡便且迅速地、精密度良好地識別2種核酸的鹼基序列的差異。
進而，本發明人等還發現通過在含有脫氧核苷酸3磷酸、具有鏈置換能的DNA聚合酶、2價的陽離子、表面活性劑、寡核苷酸引物及成為模板的核酸片斷的反應溶液中進行擴增反應，則可以利用像在過去的等溫擴增法中使用的沒有複雜結構的寡核苷酸引物(不必具有採取例如像在ICAN法中使用的嵌合(chimera)結構或在LAMP法中使用的環(loop)結構之類的結構。)在等溫狀態下特異地擴增核酸序列，以至完成本發明。
即，如果利用本發明，則可以提供一種識別核酸的鹼基序列的差異的方法，其是利用在實質上等溫下進行的核酸擴增法來識別第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異的方法，其特徵在於，使用(1)與第一核酸實質上互補的至少一種寡核苷酸(以下為引物)和(2)被設計成相對該第一核酸和第二核酸的應識別的鹼基序列部位雜交而且相對第二核酸比相對第一核酸更互補、進而不成為利用聚合酶的延長反應的起點的至少一種寡核酸(以下為屏蔽寡核酸)，該引物的一部分和該屏蔽寡核酸的一部分與該第一核酸及該第二核酸的同一區域雜交。
優選與引物和屏蔽寡核酸的二者雜交的第一核酸及第二核酸上的區域與引物的包括3』末端的區域雜交。
優選與引物和屏蔽寡核酸的二者雜交的第一核酸及第二核酸上的區域與屏蔽寡核酸的包括5』末端的區域雜交。
優選引物相對第一核酸比相對第二核酸更互補。
優選引物被設計成只在3』末端的連續的區域與第一核酸或第二核酸雜交。
優選第一核酸與第二核酸存在單鹼基多態的關係。
優選使用至少兩種引物，這至少兩種引物被設計成彼此與DNA兩條鏈的不同鏈互補，而且在與DNA鏈上的自身相同的序列的3』末端側存在的區域，另一方寡核苷酸引物成為互補。
優選培養內含至少1種脫氧核苷酸3磷酸、具有至少1種鏈置換能的DNA聚合酶及成為模板的核酸片斷的反應溶液，進行以上述引物的3』末端為起點的聚合酶反應，從而擴增該核酸片斷，由此識別第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異。
優選利用擴增速度的差來識別第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異。
優選反應溶液進一步含有至少0.01％以上的表面活性劑。
更優選反應溶液進一步含有至少0.05％以上的表面活性劑。
優選表面活性劑為非離子性表面活性劑。
優選非離子性表面活性劑的HLB值為12以上。
更優選非離子性表面活性劑的HLB值為14以上。
優選非離子性表面活性劑為聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系或聚氧化乙烯烷基醚系的表面活性劑。
更優選非離子性表面活性劑為聚氧乙烯山梨糖醇酐一脂肪酸酯。
進而優選非離子性表面活性劑由以下式表示。

(式中，x+y+z+w＝20，R表示碳原子數12～18的烷基。) 優選非離子性表面活性劑為聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一棕櫚酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一硬脂酸酯或聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯的任意1種。
優選反應溶液進一步含有2價的陽離子。
優選反應溶液進一步含有熔解溫度調節劑。
優選具有至少1種鏈置換能的聚合酶為從嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)來源的5』→3』核酸外切酶缺損Bst.DNA聚合酶、及卡都特納芽孢桿菌(Bacillus caldotenax)來源的5』→3』核酸外切酶缺損BcaDNA聚合酶、Thermococcus litoralis來源的5』→3』核酸外切酶缺損Vent.DNA聚合酶中選擇的聚合酶。
優選在實質上等溫下培養反應溶液。
優選在50℃以上100℃以下的實質上等溫下培養反應溶液。
優選在等溫下培養反應溶液的時間為60分鐘以內。
如果利用本發明，則可以利用核酸擴增方法，簡便且迅速地、精密度良好地識別2種核酸的鹼基序列的差異。更具體而言，可以在屏蔽寡核酸的存在下抑制引物的非特異擴增，精密度更高地利用擴增反應確定核酸的鹼基序列。



圖1表示在將3』末端磷酸化寡DNA用作屏蔽寡核酸時的β3AR190(T/C)的變異檢測的結果。
圖2表示在將RNA用作屏蔽寡核酸時的β3AR190(T/C)的變異檢測的結果。
圖3表示在不使用屏蔽寡核酸時的β3AR190(T/C)的變異檢測的結果。
圖4表示在實施例中使用的正向引物(forward primer)、反向引物(reverse primer)、屏蔽寡核酸的位置關係。

具體實施例方式 以下更詳細地說明本發明。
本發明的識別核酸的鹼基序列的差異的方法是利用在實質上等溫下進行的核酸擴增法來識別第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異的方法，其特徵在於，使用(1)與第一核酸實質上互補的至少一種寡核苷酸(以下為引物)和(2)被設計成相對該第一核酸和第二核酸的應識別的鹼基序列部位雜交而且相對第二核酸比相對第一核酸更互補、進而不成為利用聚合酶的延長反應的起點的至少一種寡核酸(以下為屏蔽寡核酸)，該引物的一部分和該屏蔽寡核酸的一部分與該第一核酸及該第二核酸的同一區域雜交。
如果利用本發明的優選方式，則通過使用(1)與第一核酸實質上互補、與第二核酸不互補的至少一種寡核苷酸(以下為引物)和(2)被設計成相對該第一核酸和第二核酸的應識別的鹼基序列部位雜交而且相對第二核酸比相對第一核酸更互補、進而不成為利用聚合酶的延長反應的起點的至少一種寡核酸(以下為屏蔽寡核酸)，設計成該引物的一部分和該屏蔽寡核酸的一部分與該第一核酸及該第二核酸的同一區域雜交，通過培養內含至少1種脫氧核苷酸3磷酸、具有至少1種鏈置換能的DNA聚合酶及成為模板的核酸片斷的反應溶液來進行核酸擴增反應，由此可以識別第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異。其中，第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異可以利用擴增速度的差來識別。
以下對在本發明中使用的成分進行說明。
(1)脫氧核苷酸3磷酸 作為延長反應的底物，使用脫氧核苷酸3磷酸。具體而言，優選使用dATP、dCTP、dGTP、dTTP的混合物。作為脫氧核苷酸3磷酸，也可以包括dNTP的類似物(analog)(例如7-deaza-dGTP等)。
另外，脫氧核苷酸3磷酸(dATP、dCTP、dGTP、dTTP混合物)的最終濃度分別為0.1mM～3.0mM的範圍，優選為0.75mM～3.0mM的範圍，進而優選為1.0mM～2.0mM的範圍，特別優選為1.0mM～1.5mM的範圍。
(2)具有鏈置換能的聚合酶 在本發明中，使用具有鏈置換能的聚合酶。在本說明書中，「鏈置換能」是指在按照成為模板的核酸序列進行DNA複製時，與DNA鏈的置換同時進行，使退火的互補鏈從模板鏈上游離，即能夠進行鏈置換(stranddisplacement)的活性。作為具有鏈置換能的聚合酶的具體例，可以舉出嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)來源的5』→3』核酸外切酶缺損Bst.DNA聚合酶、及卡都特納芽孢桿菌(Bacillus caldotenax)來源的5』→3』核酸外切酶缺損Bca DNA聚合酶、Thermococcus litoralis來源的5』→3』核酸外切酶缺損Vent.DNA聚合酶等，但不限定於這些。具有鏈置換能的聚合酶可以為天然來源的聚合酶，也可以為利用基因工程製造的重組蛋白質。
(3)2價的陽離子 在本發明中，可以對應使用的酶的金屬要求性等，使用2價的陽離子。作為2價的陽離子，可以使用鎂鹽或其他金屬鹽，例如可以使用氯化鎂、乙酸鎂、硫酸鎂等。2價的陽離子的濃度的最終濃度優選為1mM～20mM的範圍，進而優選為2mM～10mM的範圍。
(4)表面活性劑 在本發明中，在反應溶液中添加表面活性劑。通過使用表面活性劑，可以實現被稱為防止非特異的核酸的擴增的本發明的有利效果。對可以在本發明中使用的表面活性劑的種類，沒有特別限定，可以使用烷基苯磺酸鹽、月桂基硫酸酯鹽(SDS)、磺基琥珀酸辛酯鹽、硬脂酸肥皂等陰離子(anion)性表面活性劑，山梨糖醇酐脂肪酸酯、POE山梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween等)、POE烷基醚(Brij等)、POE烷基苯基醚(Triton等)、壬基苯酚、月桂醇、聚乙二醇、聚環氧乙烷·聚環氧丙烷嵌段聚合物、POE烷基胺、POE脂肪酸聯苯基醚等非離子(nonion)性表面活性劑、氯化鯨蠟基吡啶、月桂基二甲基苄基氯化銨、硬脂醯基三甲基氯化銨之類的陽離子(cation)性表面活性劑，還有烷基二甲基氧化胺、烷基羧基甜菜鹼之類的雙性(兩性)表面活性劑等。表面活性劑的使用量只要能夠實現本發明的效果即可，沒有特別限定，優選0.01％以上，更優選0.05％以上，更優選0.1％以上。對表面活性劑的使用量的上限沒有特別限定，通常為10％以下，優選為5％以下，更優選為1％以下。
在表面活性劑中，特別優選使用非離子性表面活性劑。在非離子性表面活性劑中，優選親水性更強的表面活性劑，如果用HLB值表示，則優選為12以上。更優選為14以上，上限可以優選使用至20。進而優選為17以下，更優選為14以上17以下。在結構上，優選從聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系、聚氧化乙烯烷基醚系中選擇。進而，在聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯中，優選脂肪酸酯只有一種。例如可以由以下結構式表示。

(式中，x+y+z+w＝20，R表示碳原子數12～18的烷基。) 對烷基的位置沒有特別限定，也可以優選使用如下所示的結構。

x+y+z+w＝20 R碳原子數12～18的烷基
x+y+z+w＝20 R碳原子數12～18的烷基
x+y+z+w＝20 R碳原子數12～18的烷基 作為這樣的表面活性劑，物質名為聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系的非離子性表面活性劑可以舉出聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一棕櫚酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯等。可以舉出(商品名Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等)的表面活性劑。另外，對使用量也沒有特別限定，優選為0.01％以上，更優選為0.05％以上，更優選為0.1％以上。在本發明中，也可以在反應溶液中添加表面活性劑。通過使用表面活性劑，有時可以實現防止非特異的核酸的擴增之類的效果。對可在本發明中使用的表面活性劑的種類沒有特別限定，可以使用烷基苯磺酸鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS)、磺基琥珀酸辛酯鹽、硬脂酸肥皂等陰離子(anion)性表面活性劑，蔗糖脂肪酸酯山梨糖醇酐脂肪酸酯、POE山梨糖醇酐脂肪酸酯(Tween20、Tween40、Tween60、Tween80等)、脂肪酸烷醇醯胺、POE烷基醚(Brij35、Brij58等)、POE烷基苯基醚(TritonX-100、TritonX-114、NonidetP40等)、壬基苯酚、月桂醇、聚乙二醇、聚環氧乙烷·聚環氧丙烷嵌段聚合物、POE烷基胺、POE脂肪酸聯苯基醚等非離子(nonion)性表面活性劑，還有氯化鯨蠟基吡啶鎓、月桂基二甲基苄基氯化銨、硬脂醯基三甲基銨氯化物之類的陽離子(cation)性表面活性劑等。表面活性劑的使用量只要能夠實現本發明的效果即可，沒有特別限定，優選0.01％以上，更優選為0.05％以上，更優選為0.1％以上。對表面活性劑的使用量的上限沒有特別限定，通常為10％以下，優選為5％以下，更優選為1％以下。
在表面活性劑中，優選使用非離子性表面活性劑。其中，特別優選使用POE山梨糖醇酐脂肪酸酯系、POE烷基酚醚系、POE烷基醚系的任意一種。如上所述，對非離子性表面活性劑的種類沒有特別限定，對使用量也沒有特別限定，優選為0.01％以上，更優選為0.05％以上，更優選為0.1％以上。
(5)寡核苷酸 (a)寡核苷酸引物 在本發明中，寡核苷酸引物的定義如下具有通過對成為模板的DNA退火而DNA鏈在DNA聚合酶的作用下從其3』末端延長的性質的寡核苷酸。作為在本發明中使用的寡核苷酸引物，可以使用由脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸構成的寡核苷酸引物，進而也可以為內含修飾核糖核苷酸或修飾脫氧核糖核苷酸的寡核苷酸引物。
在本發明中，使用與第一核酸互補的至少1種寡核苷酸引物。更優選使用與第一核酸互補但不與第二核酸互補的至少1種寡核苷酸引物。進而優選使用包括與第一核酸互補但不與第二核酸互補的至少1種寡核苷酸引物的2種寡核苷酸引物(1組寡核苷酸引物對(set))。在此使用的1組寡核苷酸引物對是指被設計成彼此與DNA兩條鏈的不同鏈互補，而且在與DNA鏈上的自身相同的序列的3』末端側存在的區域，另一方寡核苷酸引物成為互補(被設計成在與自身互補的序列的5』末端側的區域，存在與另一方寡核苷酸引物相同的序列)的至少2種寡核苷酸引物的組合。
進而，上述寡核苷酸引物不必需像在以往的等溫擴增反應中使用的複雜的設計。可以使用在普通的PCR反應中使用的至少一組以上的引物進行等溫擴增反應是本發明的一個較大的特徵。具體而言，這些引物不具有像在LAMP法等中使用的5』末端與從3』末端延長的部分互補的環結構之類的結構。就是說，引物的3』末端的連續的區域與模板核酸互補。進而，還不具有像在SDA法或ICAN法中使用的引物在反應途中被切斷從而被切斷的3』末端成為新的合成起點之類的複雜的計劃。
對寡核苷酸引物的長度沒有特別限定，通常為10～100核苷酸左右的長度，優選為10～50核苷酸左右的長度，進而優選為10～40核苷酸左右的長度。
寡核苷酸引物可以通過使用市售的DNA合成機(例如美國應用生物系統公司(Applied Biosystem Inc.)的DNA synthesizer 394型等)，利用亞磷醯胺(phosphoramidite)法合成。
寡核苷酸引物的使用量在反應溶液中優選為0.1μM以上，進而優選為1μM以上，特別優選為1.5μM以上。
(b)屏蔽寡核酸 在本發明中，進而使用至少一條寡核酸(以下也稱為屏蔽寡核酸)，該寡核酸被設計成相對第一核酸和第二核酸的應識別鹼基序列部位雜交，而且，相對第二核酸比第一核酸更互補，進而，不成為核酸擴增的起點。
作為不成為核算擴增的起點的手段，可以舉出修飾(例如磷酸化、氨基化、生物素(biotin)化、利用各種螢光色素的標記(label)等)寡核酸的3』末端的方法，另外還有使用RNA、PNA(肽(peptide)核酸)或LNA(鎖(locked)核酸)作為寡核酸的方法等。
進而，在本發明中使用的屏蔽寡核酸被設計成與第一核酸或第二核酸雜交的區域的一部分或全部與引物雜交的區域的一部分或全部為同一部分。
優選在本發明中使用的屏蔽寡核酸被設計成與引物的至少3』末端的鹼基雜交的第一核酸或第二核酸上的區域雜交。
更優選在本發明中使用的屏蔽寡核酸被設計成與引物的3』末端側的至少2個鹼基雜交的第一核酸或第二核酸上的區域雜交。
進而優選在本發明中使用的屏蔽寡核酸被設計成與引物的3』末端側的至少5個鹼基雜交的第一核酸或第二核酸上的區域雜交。
進而更優選在本發明中使用的屏蔽寡核酸被設計成與引物的3』末端側的至少8個鹼基雜交的第一核酸或第二核酸上的區域雜交。
另外，對與引物和第一核酸或第二核酸雜交的區域雜交的屏蔽寡核酸上的區域沒有特別限定，通常位於屏蔽寡核酸的5』末端側的區域。
優選屏蔽寡核酸的至少5』末端的鹼基與引物的至少3』末端的鹼基雜交的第一核酸或第二核酸上的區域雜交。
更優選屏蔽寡核酸的5』末端側的至少2個鹼基與引物的3』末端側的至少2個鹼基雜交的第一核酸或第二核酸上的區域雜交。
進而優選屏蔽寡核酸的5』末端側的至少5個鹼基與引物的3』末端側的至少5個鹼基雜交的第一核酸或第二核酸上的區域雜交。
進而更優選屏蔽寡核酸的5』末端側的至少8個鹼基與引物的3』末端側的至少8個鹼基雜交的第一核酸或第二核酸上的區域雜交。
對在本發明中使用的屏蔽寡核酸的Tm沒有特別限定，通常被設計成引物的Tm的±20℃以內。更優選被設計成高於比引物的Tm低10℃的溫度，低於比引物的Tm高20℃的溫度。其中，Tm可以使用最鄰近法，例如作為Na+的濃度，可以使用50mM。
對在本發明中使用的屏蔽寡核酸的長度沒有特別限定，通常為5～100核苷酸左右的長度，優選為10～50核苷酸左右的長度，進而優選為10～40核苷酸左右的長度。
在本發明中使用的屏蔽寡核酸可以通過使用市售的DNA合成機(例如美國應用生物系統公司(Applied Biosystem Inc.)的DNA synthesizer 394型等)，利用亞磷醯胺法合成。
在本發明中使用的屏蔽寡核酸的使用量在反應溶液中優選為0.1μM以上，進而優選為1μM以上，特別優選為1.5μM以上。
引物的一部分和屏蔽寡核酸的一部分與應識別的第一核酸和第二核酸的同一區域雜交，該同一區域可以為1個鹼基，但進而優選為3個鹼基以上，特別優選為6個鹼基以上。
屏蔽寡核酸與引物的量比優選屏蔽寡核酸存在引物量的10％以上，進而優選存在50％以上，特別優選存在100％以上。
(6)成為模板的核酸片斷 在本發明中，成為模板的核酸(DNA或RNA)可以為基因組DNA、cDNA、合成DNA、mRNA、全RNA的任意一種。可以使用從具有內含成為模板的核酸的可能性的樣品中配製的核酸。也可以直接使用具有內含成為模板的核酸的可能性的樣品。對內含成為模板的核酸的樣品的種類沒有特別限定，例如可以舉出體液(例如全血、血清、尿、腦脊髓液、精液、唾液等)、組織(例如癌組織等)、細胞培養物之類的生物體來源樣品，病毒、細菌、黴、酵母、植物及動物之類的核酸含有樣品，具有混入微生物的可能性的樣品(例如食品等)，或者土壤、廢水之類的環境中的樣品。在從如上所述的樣品中配製核酸的情況下，對其配製方法沒有特別限定，例如可以使用利用表面活性劑的處理、超聲波處理、使用玻璃珠的純化等從業者公知的方法。核酸的從樣品的純化可以通過苯酚抽提、色譜、凝膠電泳或密度梯度離心分離等進行。
在想要擴增具有RNA來源的序列的核酸的情況下，可以利用將該RNA作為模板的逆轉錄反應合成cDNA，將該cDNA作為模板，實施本發明的方法。在逆轉錄反應中使用的引物可以為具有與特定的模板RNA互補的鹼基序列的引物，也可以為寡聚dT引物或具有隨機(random)的序列的引物。逆轉錄用引物的長度優選為6～100核苷酸左右，更優選為9～50核苷酸左右。作為在逆轉錄反應中使用的酶，只要是具有以RNA為模板的cDNA合成活性的酶，則沒有特別限定，例如可以使用禽類成髓細胞瘤病毒來源逆轉錄酶(AMV RTase)、莫洛尼鼠類白血病病毒來源逆轉錄酶(MMLV RTase)、rous相關病毒2逆轉錄酶(RAV-2RTase)等。另外，還可以使用同時具有逆轉錄活性的鏈置換型DNA聚合酶。
在本發明中，可以使用基因組DNA或核酸擴增片斷之類的兩條鏈DNA及利用逆轉錄反應從RNA配製的cDNA之類的一條鏈DNA作為模板DNA。上述兩條鏈DNA可以在變性成一條鏈DNA之後在本發明的方法中使用，也可以不進行這樣的變性而在本發明的方法中使用。
(7)熔解溫度調節劑 可以在本發明中的反應溶液中添加熔解溫度調節劑。作為熔解溫度調節劑的具體例，可以舉出二甲亞碸(DMSO)、甜菜鹼、甲醯胺或甘油、四烷基季銨鹽、或它們的2種以上的混合物。對熔解溫度調節劑的使用量沒有特別限定，而在為DMSO或甲醯胺、甘油的情況下，通常可以在反應溶液中含有10％以下的量。甜菜鹼或四烷基銨鹽可以添加0.2～3.0M，優選添加0.5～1.5M左右。
(8)緩衝成分 可以在本發明中的反應溶液中含有緩衝成分。作為緩衝成分，沒有特別限定，例如可以使用巢菜鹼、麥黃酮、HEPES、Tris、磷酸鹽(磷酸鈉、磷酸鉀等)等。緩衝成分的最終濃度為5mM～100mM的範圍，特別優選為10mM～50mM的範圍，另外，pH根據在擴增反應中使用的酶的最適pH不同而不同，但通常可以使用6.0～9.0的pH，特別優選使用pH7.0～9.0。
(9)本發明中的核酸的鹼基序列的識別方法 接著，對本發明中的核酸的鹼基序列的識別方法進行說明。在本發明中，培養內含如下所述的成分的反應溶液，即(1)包括與第一核酸互補但不與第二核酸互補的至少1種引物的至少2種引物；(2)被設計成相對該第一核酸和第二核酸的應識別的鹼基序列部位雜交而且相對第二核酸比相對第一核酸更互補，進而不成為核酸擴增的起點的至少一條寡核酸；(3)至少1種脫氧核苷酸3磷酸；(4)具有至少1種鏈置換能的DNA聚合酶；以及(5)成為模板的核酸片斷。這樣，可以進行以上述引物的3』末端為起點的聚合酶反應，從而擴增該核酸片斷。在此，可以根據相對第一核酸迅速地發生核酸擴增、相對第二核酸不發生核酸擴增或者緩慢發生，來識別第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異。在本發明中，優選可以在實質上等溫下進行擴增核酸的工序。培養反應溶液時的溫度優選為50℃以上，更優選為55℃以上，例如，可以在60℃左右培養。優選的溫度範圍例如約50℃～約70℃，進而優選為約55℃～約65℃。這種情況下，引物的非特異性的退火受到抑制，DNA擴增的特異性提高，另外，模板DNA的二級結構被消除，由此DNA聚合酶的延長性也提高。本發明中的核酸的擴增方法可以在實質上等溫下實施。在本發明中，等溫是指沒有極大地改變各工序的反應溫度，各工序在實質上一定的溫度下進行。
在本發明中，在實質上等溫下培養反應溶液的時間只要能夠擴增目標核酸片斷即可，沒有特別限定。培養的時間例如可以為5分鐘以上12小時以內。培養的時間優選為5分鐘以上2小時以內，更優選為5分鐘以上60分鐘以內，進而優選為5分鐘以上30分鐘以內，還可以為5分鐘以上15分鐘以內。
本發明中的核酸的鹼基序列的識別方法的特徵之一在於，在核酸的合成方法中，不必需使溫度上升或降低。在以往的PCR法中，必需使溫度上下變化，例如必需基因擴增儀之類的反應裝置，而在本發明的方法中，可以只用能夠保持一定溫度的裝置實施。
(10)本發明中的核酸的鹼基序列的識別方法的利用 可以為了識別核酸的鹼基序列而使用本發明中的方法，例如可以為了檢測單鹼基多態而使用，進而，可以為了識別正常型純合子(homo)、變異型純合子或雜合子(hetero)的任意一種基因型而使用。
利用本發明的核酸的擴增方法得到的擴增物可以利用從業者公知的方法檢測。例如如果利用凝膠電泳，則可以通過用溴化乙錠對凝膠進行染色來檢測特定尺寸的反應產物。用於檢測擴增產物的檢測系可以使用螢光偏振光、免疫分析法、螢光能量轉移、酶標記(例如過氧化物酶、鹼性磷酸酶等)、螢光標記(例如螢光黃、若丹明等)、化學發光或生物發光等。還可以通過使用用生物素等標記的標記核苷酸檢測擴增物。這種情況下，擴增產物中的生物素可以使用螢光標記親和素(avidin)或酶標記親和素等檢測。
用實施例更具體地說明本發明，但本發明不被這些實施例所限定。
實施例
β3AR190(T/C)的變異檢測中的3』末端修飾核酸的效果 (1)內含靶(target)核酸片斷的核酸樣品液的配製 與7.5ng前處理液(30mM NaOH、0.05％Tween20)一起，在98℃下加熱作為β3AR190(T)的模板(template)(以下為野生型)及作為β3AR190(C)的模板(以下為變異型)、作為β3AR190(T/C)的模板(以下為雜合子型)，在成為1條鏈之後，以以下條件進行β3AR基因中的序列的擴增。
以β3AR基因為目標設計引物。以下示出各引物的序列。
引物(1)(正向) 5』-ATCGTGGCCATCGCCT-3』(序列編號1) 引物(2)(反向) 5』-CCAGCGAAGTCACGAAC-3』(序列編號2) 其中，該引物對相對β3AR190(T)為互補，而相對β3AR190(C)為非互補。
(屏蔽寡核酸) 作為屏蔽寡核酸，加入具有以下序列的修飾核酸。其中，Phos表示已被磷酸化。此外，將在實施例中使用的正向引物、反向引物、屏蔽寡核酸的位置關係示於圖4。
屏蔽寡核酸(3) 5』-CGTGGCCATCGCCCGGA-Phos-3』(序列編號3) (2)核酸擴增反應 利用以下示出的反應液的組成，使其在60℃下反應60分鐘，實施擴增反應。其中，將pH調節至8.8。
Tris-HCl 20mM KCl 10mM (NH4)2SO4 10mM MgSO4 8mM Tween20 0.10％ DMSO 5.0％ dNTP 各1.4mM SYBR Green稀釋50000倍 引物(1) 3.6μM 引物(2) 3.6μM 屏蔽寡核酸(3』末端磷酸化寡聚DNA)3.6μM Bst.Polymerase(NEB公司制)8.0U 模板DNA 7.5ng (3)擴增產物的檢測 使用實時螢光檢測裝置(Mx3000p，Stratagene公司制)，對上述(2)中的擴增反應進行螢光檢測。將結果示於圖1。
可知從核酸樣品來源的樣本發生了核酸的擴增。在此，使用Mx3000p的分析軟體，算出在上述的曲線圖中螢光量達到250時的時間(定義為Ct值)，結果野生型(β3AR190(T))為Ct＝36.2±0.7分鐘，變異型(β3AR190(C))為Ct＝62.2±3.6分鐘，雜合子型(β3AR190(T/C))為Ct＝37.5±0.8分鐘。
β3AR190(T/C)的變異檢測中的RNA的效果 (1)內含靶核酸片斷的核酸樣品液的配製 與7.5ng前處理液(30mM NaOH、0.05％Tween20)一起，在98℃下加熱作為β3AR190(T)的模板(以下為野生型)及作為β3AR190(C)的模板(以下為變異型)、作為β3AR190(T/C)的模板(以下為雜合子型)，在成為1條鏈之後，以以下條件進行β3AR基因中的序列的擴增。
以β3AR基因為目標設計引物。以下示出各引物的序列。
引物(1)(正向) 5』-ATCGTGGCCATCGCCT-3』(序列編號1) 引物(2)(反向) 5』-CCAGCGAAGTCACGAAC-3』(序列編號2) 其中，該引物對相對β3AR190(T)為互補，而相對β3AR190(C)為非互補。
(屏蔽寡核酸) 作為屏蔽寡核酸，加入具有以下序列的RNA。此外，將在實施例中使用的正向引物、反向引物、屏蔽寡核酸的位置關係示於圖4。
屏蔽寡核酸(3) 5』-CGUGGCCAUCGCCCGGA-3』(序列編號4) (2)核酸擴增反應 利用以下示出的反應液的組成，使其在60℃下反應60分鐘，實施擴增反應。其中，將pH調節至8.8。
Tris-HCl20mM KCl 10mM (NH4)2SO4 10mM MgSO4 8mM Tween20 0.10％ DMSO5.0％ dNTP各1.4mM SYBR Green 稀釋50000倍 引物(1) 3.6μM 引物(2) 3.6μM 屏蔽寡核酸RNA 3.6μM Bst.Polymerase(NEB公司制)8.0U 模板DNA 7.5ng (3)擴增產物的檢測 使用實時螢光檢測裝置(Mx3000p，Stratagene公司制)，對上述(2)中的擴增反應進行螢光檢測。將結果示於圖1。
可知從核酸樣品來源的樣本發生了核酸的擴增。在此，使用Mx3000p的分析軟體，算出在上述的曲線圖中螢光量達到250時的時間(定義為Ct值)，結果野生型(β3AR190(T))為Ct＝34.9±0.4分鐘，變異型(β3AR190(C))為Ct＝50.8±3.2分鐘，雜合子型(β3AR190(T/C))為Ct＝37.8±1.0分鐘。
不使用屏蔽寡核酸時的β3AR190(T/C)的變異檢測 (1)內含靶核酸片斷的核酸樣品液的配製 與7.5ng前處理液(30mM NaOH、0.05％Tween20)一起，在98℃下加熱作為β3AR190(T)的模板(以下為野生型)及作為β3AR190(C)的模板(以下為變異型)、作為β3AR190(T/C)的模板(以下為雜合子型)，在成為1條鏈之後，以以下條件進行β3AR基因中的序列的擴增。
以β3AR基因為目標設計引物。以下示出各引物的序列。
引物(1)(正向) 5』-ATCGTGGCCATCGCCT-3』(序列編號1) 引物(2)(反向) 5』-CCAGCGAAGTCACGAAC-3』(序列編號2) 其中，該引物對相對β3AR190(T)為互補，而相對β3AR190(C)為非互補。
(2)核酸擴增反應 利用以下示出的反應液的組成，使其在60℃下反應60分鐘，實施擴增反應。其中，將pH調節至8.8。
Tris-HCl 20mM KCl 10mM (NH4)2SO4 10mM MgSO4 8mM Tween20 0.10％ DMSO 5.0％ dNTP 各1.4mM SYBR Green稀釋50000倍 引物(1) 3.6μM 引物(2) 3.6μM Bst.Polymerase(NEB公司制)8.0U 模板DNA 7.5ng (3)擴增產物的檢測 使用實時螢光檢測裝置(Mx3000p，Stratagene公司制)，對上述(2)中的擴增反應進行螢光檢測。將結果示於圖3。
可知從核酸樣品來源的樣本發生了核酸的擴增。在此，使用Mx3000p的分析軟體，算出在上述的曲線圖中螢光量達到250時的時間(定義為Ct值)，結果野生型(β3AR190(T))為Ct＝31.5±0.3分鐘，變異型(β3AR190(C))為Ct＝41.6±3.0分鐘，雜合子型(β3AR190(T/C))為Ct＝32.4±1.2分鐘。
序列表
F富士膠片公司
一種核酸擴增方法
A81014A
4
1
16
DNA
人工合成序列

人工合成序列註解合成DNA
1
atcgtggcca tcgcct 16
2
17
DNA
人工合成序列

人工合成序列註解合成DNA
2
ccagcgaagt cacgaac 17
3
17
DNA
人工合成序列

人工合成序列註解合成DNA
3
cgtggccatc gcccgga 17
4
17
RNA
人工合成序列

人工合成序列註解合成DNA
4
cguggccauc gcccgga1權利要求
1.識別核酸的鹼基序列的差異的方法，其是利用在實質上等溫下進行的核酸擴增法來識別第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異的方法，其特徵在於，
使用(1)與第一核酸實質上互補的至少一種寡核苷酸，和(2)被設計成相對該第一核酸和第二核酸的應識別的鹼基序列部位雜交、而且相對第二核酸比相對第一核酸更互補、進而不成為利用聚合酶的延長反應的起點的至少一種寡核酸，將(1)中的寡核苷酸稱為引物，將(2)中的寡核酸稱為屏蔽寡核酸，該引物的一部分和該屏蔽寡核酸的一部分與該第一核酸及該第二核酸的同一區域雜交。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，
與引物和屏蔽寡核酸的二者雜交的第一核酸及第二核酸上的區域與引物的包括3』末端的區域雜交。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，
與引物和屏蔽寡核酸的二者雜交的第一核酸及第二核酸上的區域與屏蔽寡核酸的包括5』末端的區域雜交。
4.根據權利要求1～3中任一項所述的方法，其特徵在於，
引物相對第一核酸比相對第二核酸更互補。
5.根據權利要求1～4中任一項所述的方法，其特徵在於，
引物被設計成只在3』末端的連續的區域與第一核酸或第二核酸雜交。
6.根據權利要求1～5中任一項所述的方法，其特徵在於，
第一核酸與第二核酸存在單鹼基多態的關係。
7.根據權利要求1～6中任一項所述的方法，其特徵在於，
使用至少兩種引物，該至少兩種引物被設計成彼此與DNA兩條鏈的不同鏈互補，而且在與DNA鏈上的自身相同的序列的3』末端側存在的區域，另一方寡核苷酸引物成為互補。
8.根據權利要求1～7中任一項所述的方法，其中，
培養含有至少1種脫氧核苷酸3磷酸、具有至少1種鏈置換能的DNA聚合酶及成為模板的核酸片斷的反應溶液，進行以上述引物的3』末端為起點的聚合酶反應，從而擴增該核酸片斷，由此識別第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異。
9.根據權利要求8所述的方法，其中，
利用擴增速度的差來識別第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異。
10.根據權利要求1～9中任一項所述的方法，其中，
反應溶液進一步含有至少0.01％以上的表面活性劑。
11.根據權利要求10所述的方法，其中，
反應溶液進一步含有至少0.05％以上的表面活性劑。
12.根據權利要求10或11所述的方法，其中，
表面活性劑為非離子性表面活性劑。
13.根據權利要求12所述的方法，其特徵在於，
非離子性表面活性劑的HLB值為12以上。
14.根據權利要求13所述的方法，其特徵在於，
非離子性表面活性劑的HLB值為14以上。
15.根據權利要求1～14中任一項所述的方法，其特徵在於，
非離子性表面活性劑選自聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系、聚氧化乙烯烷基醚系。
16.根據權利要求15所述的方法，其特徵在於，
聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系的非離子性表面活性劑為聚氧乙烯山梨糖醇酐一脂肪酸酯。
17.根據權利要求16所述的方法，其特徵在於，
由以下化學式表示
式中，x+y+z+w＝20，R表示碳原子數12～18的烷基。
18.根據權利要求17所述的方法，其特徵在於，
聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯系的非離子性表面活性劑選自聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一月桂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一棕櫚酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨糖醇酐一油酸酯的至少1種。
19.根據權利要求1～18中任一項所述的方法，其中，
反應溶液還含有2價的陽離子。
20.根據權利要求1～19中任一項所述的方法，其中，
反應溶液還含有熔解溫度調節劑。
21.根據權利要求1～20中任一項所述的方法，其中，
具有至少1種鏈置換能的聚合酶選自嗜熱脂肪芽胞桿菌Bacillusstearothermophilus來源的5』→3』核酸外切酶缺損Bst.DNA聚合酶、及卡都特納芽孢桿菌Bacillus caldotenax來源的5』→3』核酸外切酶缺損BcaDNA聚合酶、立投拉裡斯嗜熱球菌Thermococcus litoralis來源的5』→3』核酸外切酶缺損Vent.DNA聚合酶。
22.根據權利要求1～21中任一項所述的方法，其中，
在實質上等溫下培養反應溶液。
23.根據權利要求1～22中任一項所述的方法，其中，
在50℃以上100℃以下的實質上等溫下培養反應溶液。
24.根據權利要求1～23中任一項所述的方法，其中，
在等溫下培養反應溶液的時間為60分鐘以內。
全文摘要
本發明提供一種簡便且迅速地利用核酸擴增方法來識別2種核酸的鹼基序列的差異的方法。該識別核酸的鹼基序列的差異的方法是利用在實質上等溫下進行的核酸擴增法來識別第一核酸與第二核酸的鹼基序列的差異的方法，其特徵在於，使用(1)與第一核酸實質上互補的至少一種寡核苷酸(以下為引物)和(2)被設計成相對該第一核酸和第二核酸的應識別的鹼基序列部位雜交而且相對第二核酸比相對第一核酸更互補、進而不成為利用聚合酶的延長反應的起點的至少一種寡核酸(以下為屏蔽寡核酸)，該引物的一部分和該屏蔽寡核酸的一部分與該第一核酸及該第二核酸的同一區域雜交。
文檔編號C12Q1/68GK101591712SQ20091020285
公開日2009年12月2日 申請日期2009年5月26日 優先權日2008年5月27日
發明者三好隼人, 巖木義英, 森壽弘 申請人:富士膠片株式會社