寡核苷酸的合成的製作方法

2023-05-03 10:33:11

專利名稱：：寡核苷酸的合成的製作方法
技術領域：
：本發明涉及用於製備寡核苷酸的方法。
背景技術：
：寡核苷酸是生命科學中的重要化合物，在不同領域具有重要作用。例如，它們在基因表達分析領域中作為探針來使用，在PCR中或針對DNA測序作為引物來使用。此外，還存在多種潛在的治療性應用，包括，即，反義寡核苷酸。應用數目的增長要求大量的寡核苷酸，因此，針對研究改進的合成方法存在著持續的需要。針對總體性概述，參見，例如"Antisense-FromTechnologytoTherapy"BlackwellScience(Oxford,1997)。在寡核苷酸的合成中構建塊(buildingblock)的一個顯著類型是亞磷醯胺；參見例如S丄.Beaucage,M.H.Caruthers,TetrahedronLetters1859(1981)22。這些核苷的亞磷醯胺、脫氧核糖核苷、以及它們的衍生物的是可商購的。在通常的固相合成中，使用3'-0-亞磷醯胺，但是在其他的合成操作中也使用5'-0以及2'-0-亞磷醯胺。在這些核苷的亞磷醯胺的製備中的一個步驟是這些(受保護的)核苷的亞磷醯化。亞磷醯化作用之後，這些所製備的亞醯胺(amidite)通常通過使用成本密集性方法(例如色譜法)進行分離。分離之後，這些敏感的亞醯胺必須在特殊的條件下(例如，低溫、無水)進行存儲。在存儲過程中，這些亞醯胺的質量可能由於一定程度的分解和水解而被減低。這兩種副反應均可出現並且這些結果是可檢測的。最普遍地，在對剩餘的3'-、5'-或2'-0羥基集團進行亞磷醯化之前，對在核苷中存在的羥基基團以及氨基基團以及其他官能團進行保護。然後，將這些亞磷醯胺結合至核苷酸或寡核苷酸的羥基基團上。在亞醯胺結合過程中使用這些已分離的亞醯胺還可以導致部分水解。亞磷醯胺是昂貴的化合物。脫氧亞醯胺(deoxyamidite)的典型性價格在每克40,00歐元的範圍內。相對應的RNA構建塊甚至更加昂貴。WO2006/094963披露了用於製備寡核苷酸的一種方法，包括以下步驟在一種活化劑I的存在下合成一種氨基磷酸酯，並且在一種活化劑II的存在下進行結合。對作為活化劑II的四唑衍生物、吡啶鎗鹽以及4,5-二氰基咪唑進行了說明。發明概述本發明的一個目的是提供用於製備寡核苷酸的一種方法，克月艮了現有技術中這些缺點中的至少一些。本專利申請涉及在專利申請WO2006/094963中所披露的發明的一項改進，該專利申請的內容通過引用結合在本專利申請之中。本發明具體涉及使用一種改進的活化劑II來製備根據WO2006/094963的權利要求1的一種寡核普酸的方法。在一個實施方案中，本發明提供了用於製備一種寡核苷酸的一種方法，包括以下步驟a)提供具有以下化學式的一種含羥基的化合物其中B是一個雜環g以及i)R2是H、一個受保護的2，-羥基基團、F、一個受保護的M基團、一個O-烷基基團、一個O-取代的烷基、一個取代的烷M或一個C4'-02'亞甲基(methylen)連接R3是ORVNHR"3、NR3R3,其中R3是一個羥基的保護基團、一個受保護的核苷酸或一個受保護的寡核苷酸，R"3、R'"3獨立地是胺的保護基團，並且R5是OH或ii)R2是H、一個受保護的2，-羥基基團、F、一個受保護的氨基基團、一個O-烷基基團、一個O-取代的烷基、一個取代的烷氨基或一個C4、02'亞甲基連接R3是OH並且R5是OR'5並且R'5是一個羥基的保護基團、一個受保護的核苷酸或一個受保護的寡核苷酸或iii)R2是OHR3是ORVNHR"3、NR3R3，其中R3是一個羥基的保護基團、一個受保護的核苷酸或一個受保護的寡核苷酸，R"3、R"'3獨立地是胺的保護基團，並且R5是OR'5並且R'5是一個羥基的保護基團、一個受保護的核苷酸或一個受保護的寡核苷酸b)將所述化合物與一種亞磷醯化試劑(phosphitylatingagent)在具有以下化學式I的一種活化劑(活化劑I)的存在下進行反應formulaseeoriginaldocumentpage8其中R=烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基Rp112=11或者一起形成一個5至6元的環XpX2=獨立地N或CH之一Y-H或Si(R4)3，其中Rj=烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基B=去質子的酸以便製備一種亞磷醯化的化合物c)在一種活化劑II的存在下，將未經分離的所述亞磷醯化的化合物與具有以下化學式的一種第二化合物進行反應，該活化劑II選自下組，其構成為咪唑、咪唑鎗鹽，其中對Rs、R3、R2、B獨立地進行選擇，但是Rs、R3、R2、B具有如以上所定義的相同含義。"咪唑"是一種未取代的雜環化合物；IUPAC名稱是l,3-二唑或l，3-重氮環戊-2，4-二烯。"咪唑錄"是以上所定義的一種質子化形式的咪唑。與在WO2006/094963中所明確地披露的活化劑II相比，上述的活化劑II對於引發步驟(c)的反應是高度有效的並且是有利的，特別是達到了工業安全並考慮到了環境保護。根據本發明，通過使用具有化學式I的活化劑(它優選地是咪唑(imidazol)的衍生物)通過將一種核普、核苷酸或寡核苷酸的羥基基團進行亞磷化而製備了這種亞磷醯化的化合物。無需純化或分離，所製備的敏感的亞磷醯胺與核苷、核苷酸或寡核苷酸的羥基基團在不同於活化劑I的一種活化劑II的存在下進行結合。沒有所製備的亞磷醯胺的分離，沒有從活化劑I中分離這種亞醯胺。優選地，這種反應在相同的反應容器中繼續進行。活化劑II可以在活化劑I的存9在下使用。用於亞醯胺結合的現有技術的活化劑對這種亞醯胺的功能的活化具有高度的反應性。使用這種用於亞磷醯化作用的活化劑還產生了一定程度的"過"應"(例如3，-3，副產物)。為了克服這種問題以及其他問題，對這種活化劑的反應性進行了調節.在這種情況下，這種反應M擇性地停止在基本上沒有副產物(例如3，-3，-副產物)的亞醯胺水平上。僅此結果(原位生成亞醯胺)允許通過以亞醯胺結合為起始而繼續進行整個方法。活化劑II有能力誘髮結合步驟。加入活化劑II之後，這種亞醯胺會以亞醯胺結合來開始。作為活化劑化合物，咪唑以及咪唑鐵鹽是適宜的，即，咪唑與一種酸(優選一種強酸)的鹽。這些適宜的^1，例如三氟醋酸鹽、三氟甲磺酸鹽、二氯乙酸鹽、甲磺醯基(mesyl)、甲^t醯基(tosyl)、鄰氯酚鹽(o-chlorophenolate)。對於用咪唑來構建鹽類而言，具有低於4,5的pKa的酸^l優選的。在一個實施方案中，所述活化劑是一個質子化的N-1-(H)咪唑。抗衡離子通常地如在WO2006/094963中所說明。三氟醋酸鹽作為抗衡離子是優選的。使用咪唑的一個特別優選的反應方案在圖2中示出，其中Rl(CHrOH)和R2(CHrOH)表示(寡)核苷或-核苷酸。咪唑或咪唑鐵可以與其他活化劑II(例如，在WO2006/094963中所披露的那些)結^^吏用。在一個第二方面，所述活化劑是四唑-貧的。"四唑"應被理解為具體是指在WO2006/094963中所說明的四唑化合物。四哇-貧應被理解為是指在溶液中一定量的四唑，該量值是每摩爾含羥基的化合物中小於l摩爾(如在WO2006/094963的權利要求1中所說明)。該量值優選是每摩爾的含羥基的化合物中小於0.5摩爾並且更優選每摩爾的含羥基化合物中小於0.1摩爾。在這一方面，所述活化劑優選^^本上沒有或完全沒有四唑的。在第二方面所優選的活化劑^!^艮據第一方面的那些活化劑。在這兩個方面所優選的溶劑是C-H酸性溶劑，特別是含有一個羧基基團的那些溶劑。此類溶解可以選自，例如酯類，如乙酸乙酯或乙醯乙酸乙酯以及酮類。丙酮是優選的。除其他之外，本發明覆蓋了根據WO2006/094963的權利要求l的一種方法，其中活化劑II是具有一個N、H鍵的咪喳。優選地，這種咪唑是質子化的N-1-(H)咪唑。本發明進一步覆蓋了根據WO2006/094963的權利要求1的一種方法，其中活化劑II是四唑-貧的。優選地，這種活化劑II是具有一個N、H鍵的咪唑，優選是質子化的N-1-(H)咪唑。結合之後，典型地4吏用了氧化反應(PO形成)或硫化作用(PS形成)。對於PO形成而言，過氧化物法是優選的。有可能進行這個反應，無需任何萃取步驟(碘氧化要求一些萃取步驟)來。在硫化作用的情況下，有可能使用針對疏化作用所已知的每種試劑(即，PADS、S-Tetra、beaucage)。一種優選的用於PS形成的試劑^l^克。生產成本的差別有利於硫的使用。在一個實施方案中，該^^應可以在丙酮的存在下進行。與含羥基的化合物的羥基基團相比，這種亞磷醯化試劑能夠以一個或多或少等摩爾的比值來使用。在另一個實施方案中，可以對其進行過量使用，例如在含羥基的化合物中3至5mol/mo1的羥基基團。在另一個優選的實施方案中，在權利要求1的步驟b)之後加入一種高分子醇。適宜的高分子醇包括聚乙烯醇(PVA)，如從Merck,Darmstadt可商購的PVA145000。優選的是具有顆粒大小>120jtm(80%)的大孔PVA。具有羥基基團或其他能夠形成烯醇的化合物的膜也是適宜的。這種活化劑I能夠化學計量地，催化地(3摩爾％至50摩爾％，優選10摩爾％至30摩爾％)或過量進行4吏用。在一個優選的實施方案中，這種活化劑I具有選自下組的一個化學式，該糹且的構成為formulaseeoriginaldocumentpage12其中Y是H或Si(R4)3，其中Rt-烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基B=去質子的酸R是甲基、苯基或千基。這些活化劑的製備，例如說明於Hayakawaetal，J.Am.Chem.Soc.123(2001)8165-8176中。在一個實施方案中，這種活化劑與一種添加劑結合使用。這些添加劑可以選自具有化學式I以及其他雜環鹼(例如吡啶)的未質子化形式的化合物。活化劑與添加劑之間的適宜的比值是l:l至1:10。在一個優選的實施方案中，這種活化劑可以按照一種"原位，，^Mt來進行製備。在這種情況下，這種活化劑將不會被分離，這導致了改進的反應結果。目標分子的7jc解或分解受到抑制。對於在寡核苷酸(二、三、四、五、六、七以及八聚體)的3，-和/或5，-位上的一個高產的亞磷醯化反應而言，這種活化劑的原位製備以及與一種添加劑的結合是優選的。如以上所說明，亞磷醯化在寡核苷酸以及在構建塊的亞磷醯胺的合成中是尤為有用的。因此，在一個優選的實施方案中，這種含幾基的化合物包括一個糖部分(moiety)，例如一個核普或由其衍生的一個低聚物。此類核苷是，例如腺苷、胞嘧啶、鳥嘌呤核苷以及尿嘧啶、脫氧腺苷、脫氧鳥嘌呤核苷、脫氧胸腺嘧咬核苷、脫氧胞嘧啶以及它們的衍生物，可任選地包括多種保護基團。通常，它們會在其雜環的官能度上適宜地受到保護並且除應該被亞磷醯化的那一個羥基之外，在其所帶的多個羥基上適宜地受到保護。典型地，二甲氧三苯甲基、單甲氧三苯甲基或叔丁基二甲基-曱矽烷基(TBDMS)作為5'OH-基團的保護基團來使用，允許3'-OH基團的亞磷醯化作用。其他有可能的基團是磷酸酯類(phosphatesters)以及H-膦酸酯類，參見例如5'國0國位3'-0-位3'-0-位對於磷酸酯以及磷酸二酯而言，R可以選自烷基、芳基、烷芳基。苯基是優選的。針對5'、3'以及2'的其它的羥基的保護基團在本領域內是已知的，例如TBDMS。總體而言，這種亞磷醯化試劑可以與在使用l-H-四唑的亞磷醯化反應中的試劑相同。在一個優選的實施方案中，它具有以下化學式其中Z表示一個離去基團，例如-CH2CH2CN、-CH2CH=CHCH2CN、對國CH2C6H4CH2CN、(CH2)2-5N(H)COCF3、CH2CH2Si(C6H5)2CH3、或-CH2CH2N(CH3)COCF3，並且R和112獨立地是仲氨基N(R3)2，其中R3是具有從1個至大約6個碳的烷基；或者R3是一個雜環烷基或雜環鏈烯基的環，該環含有從4至7個原子，並且具有高達3個選自氮、^琉和氧的雜原子。一種典型的亞磷醯化試劑是2-氰基乙基-N,N，N，，N，-四異丙基亞磷醯二胺。其他優選的亞磷醯化試劑是噁哇磷烷(oxazaphospholidine)衍生物，如在通過引用所結合的N.Oketal.,J.Am.Chem.Soc.2003，125，8307至8317中所說明。這種亞磷醯化試劑允許合成寡核苷酸，其中核苷酸之間的鍵可以按照立體選擇性的方式被轉化成硫代磷酸酯。此類所合成的非對映立體選擇性的核苷酸之間的硫代磷酸酯(phosphotWoate)的連接對將硫代磷酸酯作為反義藥物或免疫刺激性藥物來使用具有令人希望的作用。圖1示出了相L據本發明的一個反應方案。去質子的酸B-的適宜的例子是三氟醋酸鹽(trifluoroacetat)、三氟甲磺酸鹽、二氯乙酸鹽(dichloroacetat)、甲磺醯基、曱^t醯基、鄰氯酚鹽。具有低於4.5的pKa的^A優選的。優選地，它們具有低親核性。在一個實施方案中，該反應是在一種分子篩的存在下進行以便將反應介質乾燥。總體而言，在A^過程中水應該被排除或通itxt介質進行乾燥而進行固定。也有可能將本發明的活化劑I與這種亞磷醯化試劑相結合，並且^加入羥基組分。還有可能將活化劑I與含羥基的化合物相結合，並且此後加入這種亞磷醯化試劑。在使用一種添加劑的情況下，在加入亞磷醯化試劑之前將這種活化劑與這種羥基組分相混合。對於"原位，，生成這種活化劑而言，在加入這種添加劑之後在受控的反應溫度下優選將所選擇的酸加入。可以在加入所選擇的酸之前或之後將這種亞磷醯化試劑加入。對於加入酸和亞磷醯化試劑而言，可以在結束或開始時將這種核苷組分加入。在一個優選的實施方案中，將這種活化劑所對應的鹼，含羥基的化合14物，以及這種亞磷醯化試劑進行結合併且將這種酸加入以使反應開始。然後，在一種活化劑II的存在下將這種亞磷醯化的化合物(亞磷醯胺)結合至一個核苷、核苷酸或寡核苷酸的一個羥基基團上。在如以上所說明將一種化合物進行反應之後，將所製備的三酯進行氧化。例如，氧化反應可以用來製備穩定的磷酸酯鍵或硫代磷酸酯鍵。如在此所使用，寡核苷酸也覆蓋了寡核苷、寡核苷酸類似物，經修飾的寡核普酸、核苷酸模擬物，以及處於RNA和DNA的形式的類似物。總體而言，這些化合物包括所連接的單體的亞單元的主鏈，其中每個所連接的單體的亞單元直接或間接地附連至一個雜環鹼部分上。將這些單體的亞單元、單體的亞單元與雜環鹼部分相連接的這些連接結構在結構上是可變的，從而產生了對於所得到的化合物的多種模體形式(motives)。本發明的尤為有用之處在於合成具有化學式Xn的寡核苷酸，其中每個X是選白A、dA、C、dC、G、dG、U、dT，並且11=2至30，優選2至12，更優選2至8或2至6，以及它們的包括保護基團的衍生物。本領域內已知的修飾是雜環鹼，糖或將這些單體的亞單元相連接的連接結構的修飾。核苷酸之間的連接的變化是，例如說明於通過引用所結合的WO2004/011474中，從第ll頁的底部開始。這些典型的衍生物是硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、曱基以及烷基膦酸酯以及膦耽基乙跣衍生物。其他典型的修飾是在糖部分上。或者核糖(ribrose)是被一個不同的糖所取代，或者這些位置中的一個或多個是用其他基團(如，F、O-烷基、S-烷基、N-烷基)所取代。優選的實施方案是2'-甲基以及2'-曱猛乙氧基。所有這些修飾在本領域內都是已知的。關於雜環鹼部分，存在著在本領域內所使用的多個其他的合成的鹼，例如5-甲基-胞嘧啶、5-羥基-甲基-胞嘧啶、葉黃素、次黃嘌呤、2-Jl^腺嘌呤、腺嘌呤的6-或2-烷基衍生物以及鳥嘌呤、2-硫尿嘧啶(2-thiouracyl)。此類修飾還披露於WO2004/011474中，從第21頁開始。當在合成中使用時，這些鹼通常具有保護基團，例如N-6-節基腺嘌呤、N-4-節基胞嘧咬或N-2-異丁醃基鳥嘌呤。總體而言，所有的並非旨在用於另外反應的及JI基團必須受到保護，尤其是糖的羥基基團。在涉及寡核苷酸合成的實施方案中，有用的是在醛或酮的存在下進行反應，這些搭或酮可以作為反應介質或者作為針對其他溶劑的一種共溶劑來使用。適宜的化合物是可以形成烯醇的那些化合物。這些典型的化合物具有化學式RiR;rC=O,其中和R2獨立地是H或者由1至20個碳原子構成，這些原子可以單獨地形成環狀結構，或者R和R2—起形成環狀體系，其中並非R和112都是H。一種非常優選的酮是丙酮。丙酮的存在淬滅了任何量的胺(像二異丙胺(DIPA))的活性，它在亞磷醯化的過程中得到釋放。這可以用於具有類似結果(沒有分解)的更短或更長的寡核苷酸的亞磷醯化作用。還可使用其他具有化學式Rx-C(-O)-Ry的酮化合物(其中Rx和Ry獨立地是d-C6烷基或一起形成一個環烷基)，只要它們在例如在a-位置上具有一個CHr基團的胺的存在下能夠形成烯醇化物。本發明通過以下非限制性的實例進一步進行解釋。實例l將5，-0-(4，4，-二甲氧基三苯基甲基)-N-異丁醯基-2，-脫氧鳥嘌呤核苷U-G-OH)以及N-甲基咪唑総三氟醋酸鹽(MIT)溶解於丙酮和二氯甲烷(1:1)中，並且加入分子篩.在室溫下猛烈攪拌將這個懸浮液加至BisPhos在二氯曱烷的溶液中。加入3，-0-塊莖糖基(Levulinyl)-]\-異丁醯基-2，-脫氧鳥噪呤核苷(HO-G-l)、乙硫基四唑(ETT)或咪唑鎗三氟乙酸鹽(IT，CHK346/06)以及NMI溶解於丙酮和二氯曱烷(1:1)中的溶液。該M之後跟隨RP-HPLC，並且在完全轉化之後，加入CuroxM400。該^^應之後跟隨RP-HPLC，並且在完全轉化之後4吏用一個過濾步驟以除去分子篩，之後跟隨使用丙酮/二氯甲烷(1:1)的一個洗滌步踝。將這種溶液轉移至MTBE中以俊/fit^應產物發生沉澱。將沉澱過濾，用MTBE洗滌，並且在減壓條件下在40°C下進行乾燥。加料產量[gl1%1d-G"OH[mmolBisPhos[mmol]MIT[mmol]HO-G-llrninolETT/IT[mmol]117,9412515,6318,7319,8812,0632,78215,4610815,6317,191，6812,0628,893n.b.n.b.1,561,721,841,212,2316tableseeoriginaldocumentpage17實例3將5'-0-(4，4，-二曱氧基三苯基甲基)-N-異丁醯基-2，-脫氧鳥嘌呤核苷(d-G-OH)以及NMI溶解於丙酮和二氯甲烷(1:1)中，並且加入分子篩。在室溫下逐滴加入BisPhos，並且還逐滴加入TFA在二氯曱烷中的溶液。該反應之後跟隨RP-HPLC，並且完全轉化之後加入3，-0-塊莖糖基胸腺嘧咬核苷(Levulinyltymidine)(HO-T-l)以及咪唑溶解於丙酮和二氯甲烷(1:1)中的溶液。此外，逐滴加入TFA在二氯曱烷中的溶液。該^1應之後跟隨RP-HPLC，並且完全轉化之後，加入CuroxM400。該反應之後再跟隨RP-HPLC。完全M之後，將其過濾以去除分子篩，用丙酮/二氯甲烷(1:1)洗滌，並且轉移至MTBE中以4吏產物發生沉澱。將沉澱過濾，用MTBE洗滌，並且在減壓條件下在40。C下進行乾燥。tableseeoriginaldocumentpage18權利要求1.一種用於製備寡核苷酸的方法，包括以下步驟a)提供具有下式的含羥基的化合物其中B是雜環鹼基並且i)R2是H、受保護的2』-羥基、F、受保護的氨基、O-烷基、O-取代的烷基、取代的烷氨基或C4′-02′亞甲基鍵R3是OR′3、NHR″3、NR″3R′″3，其中R′3是羥基的保護基團、受保護的核苷酸或受保護的寡核苷酸，R″3、R′″3獨立地是胺的保護基團，並且R5是OH或ii)R2是H、受保護的2』-羥基、F、受保護的氨基基團、O-烷基、O-取代的烷基、取代的烷氨基或C4′-02′亞甲基鍵R3是OH並且R5是OR′5並且R′5是羥基的保護基團、受保護的核苷酸或受保護的寡核苷酸或iii)R2是OHR3是OR′3、NHR″3、NR″3R′″3，其中R′3是羥基的保護基團、受保護的核苷酸或受保護的寡核苷酸，R″3、R′″3獨立地是胺的保護基團，並且R5是OR′5並且R′5是羥基的保護基團、受保護的核苷酸或受保護的寡核苷酸b)使所述化合物與亞磷醯化試劑在具有下式I的活化劑(活化劑I)的存在下進行反應以製備亞磷醯化的化合物其中R＝烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基R1、R2＝H或者一起形成5至6元的環X1、X2獨立地＝N或CHY＝H或Si(R4)3，其中R4＝烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基B-＝去質子的酸c)在活化劑II的存在下，使未經分離的所述亞磷醯化的化合物與具有下式的第二化合物進行反應，該活化劑II選自咪唑、咪唑鎓鹽以及它們的混合物，其中對R5、R3、R2、B獨立地進行選擇，但是R5、R3、R2、B具有如上相同的含義。2.如權利要求l所述的方法，其中所述具有式I的活化劑具有選自以下各項的式其中formulaseeoriginaldocumentpage4丫其中Y是如在權利要求1中所定義R是甲基、苯基或苄基。3.如權利要求1或2所述的方法，其中所述亞磷醯化試劑具有下式IIformulaseeoriginaldocumentpage4其中Z代表離去基團並且Ri和&獨立地是仲氨基。4.如權利要求1至3中任一項所述的方法，其中所述亞磷醯化試劑是2-氰基乙基-N,N，N，，N，-四異丙基亞褲醯二胺。5.如權利要求1至4中任一項所述的方法，其中所述去質子的酸衍生自三氟乙酸、二氯乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、鄰氯酚鹽。6.如權利要求1至5中任何一項的方法，其中所述反應在丙酮的存在下進行。7.如權利要求1至6中任一項所述的方法，其中所述亞磷醯化試劑的用量是1.0至1.2mol/mo1所述含羥基的化合物中的羥基。8.如權利要求1至7中任一項所述的方法，其中所述亞磷醯化試劑的用量是3至5mol/mo1所述含羥基的化合物中的羥基。9.如權利要求1至8中任一項所述的方法，其中在權利要求1的步驟b)之後加入高分子醇。10.如權利要求1至9中任一項所述的方法，其中所述高分子醇是聚乙烯醇。11.如權利要求1至10中任一項所述的方法，其中所述去質子的酸衍生自三氟乙酸、二氯乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸(三氟曱磺酸鹽)、鄰氯酚鹽以及它們的混合物。12.如權利要求1至11中任一項的方法，其中所述反應在丙酮的存在下進行。13.如權利要求12所述的方法，其中至少95%(重量/重量)的反應介質是丙酮。14.如權利要求1至13中任一項的方法，其中反應混合物包含小於0.5摩爾的四唑或四唑衍生物/每摩爾步驟c)的所述第二化合物。15.如權利要求14所述的方法，其中所述反應混合物包含小於0.1摩爾的四唑或四唑衍生物/每摩爾步驟c)的所述第二化合物或不包含四唑或四哇衍生物。全文摘要用於製備一種寡核苷酸的一種方法，包括以下步驟a)提供具有化學式(1)的一種含羥基的化合物，其中B是一個雜環鹼基，並且基團R2、R3和R5是如在說明中所定義；b)在具有化學式(I)的一種活化劑(活化劑I)的存在下，將所述化合物與一種亞磷醯化試劑進行反應，其中R＝烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基；R1、R2＝H或者一起形成一個5至6元的環；X1、X2＝獨立地N或CH之一；Y＝H或Si(R4)3，其中R4＝烷基、環烷基、芳基、芳烷基、雜烷基、雜芳基；B＝去質子的酸；以便製備一種亞磷醯化的化合物；c)在一種活化劑II的存在下，將未經分離的所述亞磷醯化的化合物與具有化學式(1)的一種第二化合物進行反應，該活化劑選自下組咪唑、咪唑鎓鹽以及它們的混合物，其中對R5、R3、R2、B獨立地進行選擇，但是R5、R3、R2、B具有如以上定義的相同含義。文檔編號C07H21/00GK101679474SQ200780053003公開日2010年3月24日申請日期2007年11月21日優先權日2007年5月22日發明者克裡斯蒂娜·基希霍夫,奧拉夫·格羅塞爾,安德烈亞斯·舍恩貝格爾,安德烈亞斯·霍爾菲爾德,邁諾爾夫·朗格申請人:集潤德斯股份公司