細胞保存液及其調製方法、細胞保存方法、細胞培養方法

2023-05-20 12:56:26 2

專利名稱：細胞保存液及其調製方法、細胞保存方法、細胞培養方法
技術領域：
本發明涉及細胞保存液，其特徵在於至少包括糖類、鈉離子和鉀離子，且所含鈉離子的摩爾濃度與鉀離子的摩爾濃度相等或者比鉀離子的摩爾濃度更大，還涉及採用它的細胞保存方法。
背景技術：
活細胞具有生理功能和生物學活性，在很多方面具有應用價值。但是，若在高溫條件下放置，由於代謝和改性而隨時間發生改變，細胞的生理功能和生物學活性便下降或喪失。因此，細胞必需進行冷凍保存。一直以來，細胞冷凍保存採用DMSO(二甲亞碸)、乙二醇、甘油等細胞膜通透型冷凍保存劑，並採用聚乙烯吡咯烷酮等細胞膜非通透型冷凍保存劑。此外，還公開了若採用含有精製白蛋白和DMSO的細胞保存液，則可在-80℃下保存，短時間內還可以在-4℃下保存(專利文獻1)。
但是，若這些冷凍保存劑濃度大，則通常存在對細胞顯示毒性的問題。並且在進行培養時，由於上述保存劑阻礙細胞的增殖，必需事先從細胞中除去冷凍保存劑，因此很繁瑣。並且，冷凍保存在例如-80℃的極低溫度條件下進行，因而存在必需昂貴的專門冷凍裝置的問題。此外，由於冷凍·解凍工序必然會對細胞產生顯著的損害，因而使存活率下降。而且，根據細胞的種類，還存在不能進行冷凍保存的情況。
作為冷凍保存用的不含DMSO等可能顯示毒性的物質的細胞·組織等保存液，已經公開了含有多糖類果聚糖、果聚寡糖的保存液(專利文獻2)、含有果寡糖種類之一的1-蔗果三糖作為有效成分的保存液(專利文獻3)等。
另外，據報導，使緩衝液中含有海藻糖和基質蛋白質填充劑以及單糖的組合物(專利文獻4)，或者含有具有抗氧化作用的聚酚的保存液(專利文獻5)很有用。前者應用向該組合物中混合細胞後進行乾燥保存的方法。此外，如果將細胞懸浮於在能夠與水混溶的醇中加入螯合劑等的溶液中，則在約37℃下細胞能夠保存約3星期(專利文獻6)。
除上述溶液以外，作為現有技術所用的細胞·組織保存液，可以列舉Euro-collins液(非專利文獻1)和UW液(University ofWisconsin液)(非專利文獻2)。但是，這些溶液存在維持細胞生理功能的效果不夠好、製劑學上不穩定等問題。為了解決這種問題，已公開了以ET-Kyoto液(專利文獻7)或Euro-collins液或UW液為有效成分，添加綠茶兒茶素的棓酸表棓兒茶酯的溶液(專利文獻8)。
專利文獻1特開2002-233356號公報專利文獻2特開平9-25501號公報專利文獻3特開平5-38284號公報專利文獻4特表2003-50504號公報專利文獻5國際公開WO02/07952號公報專利文獻6特開2002-168858號公報專利文獻7特開平6-40801號公報專利文獻8特開2003-267801號公報非專利文獻1Wahlberg，J.A.，et al.，Transplantation，43，pp.5-8，198非專利文獻2Squifflet，J.P.，et al.，Transplant Proc.，13，693，1981發明內容本發明的目的是提供一種細胞保存液，是一種提高了細胞保存性能的細胞保存液，不僅能夠冷凍保存，還能夠冷藏保存，並且不需要為了除去保存液的洗滌操作，在保存液的存在下也可以進行細胞培養等。
為了解決上述問題，本發明者們進行了專心研究，結果，著眼於通過至少含有糖類、鈉離子和鉀離子，且所含鈉離子的摩爾濃度與鉀離子的摩爾濃度相等或者比鉀離子的摩爾濃度更大，使保存液與現有的細胞保存液如Euro-collins液相比細胞保存性能更高，從而完成了本發明的細胞保存液。
即，本發明內容如下1、一種細胞保存液，其特徵在於至少含有糖類、鈉離子和鉀離子，且所含鈉離子的摩爾濃度與鉀離子的摩爾濃度相等或者比鉀離子的摩爾濃度更大。
2、上述第1項所述的細胞保存液，其中鉀離子與鈉離子的摩爾比為1∶1～1∶85。
3、上述第1項或第2項所述的細胞保存液，其中糖類的含量為0.5～150mM。
4、上述1～3任意一項所述的細胞保存液，其中糖類為選自葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖或海藻糖的任意一種或多種。
5、上述1～3任意一項所述的細胞保存液，其中糖類為葡萄糖和/或麥芽糖。
6、上述1～5任意一項所述的細胞保存液，進一步含有碳酸氫根離子和/或碳酸根離子。
7、上述第6項所述的細胞保存液，其中碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的含量為1～75mM。
8、上述1～7任意一項所述的細胞保存液，進一步含有從鈣離子、鎂離子、氯化物離子、磷酸根離子、硫酸根離子和乳酸根離子構成的群組中選出的任意一種或者多種離子。
9、上述第8項所述的細胞保存液，其中1000mL水溶液中含有以下組成糖類0.5～150mM鈉離子 20～260mM鉀離子 3～125mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 1～75mM鈣離子 1～4mM鎂離子 0～1mM氯化物離子 75～245mM磷酸根離子 0.5～65mM硫酸根離子 0～1mM乳酸根離子 0～20mM10、製備上述1～9任意一項所述的細胞保存液的方法，其特徵在於將日本藥典林格氏溶液、日本藥典碳酸氫鈉注射液和市售的脫水補充液按照體積比為80∶3∶20～50的比例混合。
11、上述第10項所述的製備細胞保存液的方法，其中市售的脫水補充液選自以下的1)或者2)的注射液1)1000ml的水溶液中含有以下成分的注射液，氯化鈉1.92g氯化鉀1.00g乳酸鈉2.80g
氯化鎂 0.10g磷酸一鈉 0.14g磷酸二鉀 1.00g葡萄糖 23.5g2)由以下組分組成的注射液氯化鈉 0.270w/v％氯化鉀 0.149w/v％乳酸鈉 0.224w/v％磷酸二氫鈉 0.031w/v％磷酸氫二鈉 0.287w/v％葡萄糖 3.2w/v％作為添加物的L-乳酸 8mEq/L12、一種細胞保存方法，其特徵在於採用上述1～9任意一項所述的細胞保存液在冷藏的條件下保存細胞。
13、上述第12項所述的細胞保存方法，其中細胞為淋巴細胞。
14、一種細胞培養方法，其特徵在於將細胞懸浮於上述1～9任意一項所述的細胞保存液中，將該懸浮液直接接種到培養基中，對該細胞進行培養。
根據至少含有糖類、鈉離子和鉀離子，且所含鈉離子的摩爾濃度與鉀離子的摩爾濃度相等或者比鉀離子的摩爾濃度更大的細胞保存液，可以提供使細胞存活率提高，能夠維持細胞生理功能，且能夠使細胞保存性能保持在較高狀態的細胞保存液。並且，通過採用本發明的細胞保存液，可以提供不僅可冷凍保存，而且可以在冷藏條件下保存細胞的方法。而且如果使用本發明的細胞保存液，可以提供一種細胞培養方法，其可以在不經過洗滌等工序的條件下，將細胞懸浮在該細胞保存液中直接接種在培養基而進行細胞培養。


圖1是實施例1、16、比較例2、3的細胞保存液中淋巴細胞存活率隨時間的變化的曲線(實施例4)。
圖2是實施例18～21、比較例2、3的細胞保存液中淋巴細胞存活率隨時間的變化的曲線(實施例4)。
具體實施例方式
本發明的細胞保存液特徵在於至少含有糖類、鈉離子和鉀離子，且所含鈉離子的摩爾濃度與鉀離子的摩爾濃度相等或者比鉀離子的摩爾濃度更大。
這裡使用的糖類包括以葡萄糖、半乳糖、果糖、核糖、甘露糖、海藻糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇等為首的各種單糖類、二糖類、三糖類、多糖類和糖醇。這些糖還可以一種或多種組合使用。其中從經濟性·操作難易的角度考慮，優選葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖或海藻糖，更優選葡萄糖或麥芽糖。這些糖類可以使用市售的糖。細胞保存液中糖類的含量為0.5～150mM，優選為0.5～100mM，更優選為0.5～50mM。當糖類的含量超過150mM時，會出現在細胞保存時細胞發生凝聚而形成塊的情況，解開該塊需要繁瑣的操作，因此不優選。
這裡使用的鈉離子和鉀離子，可以通過添加有機酸的鈉鹽或鉀鹽、氯化鈉等而使其包含在保存液中。若所含鈉離子的摩爾濃度比鉀離子摩爾濃度高，則可以作為細胞外液型保存液，所含鉀離子與鈉離子的摩爾比可以為1∶1～1∶85，優選為1∶2～1∶60，更優選為1∶5～1∶30。具體地說，鈉離子的含量為20～260mM，優選為50～200mM，更優選為100～150mM。並且，鉀離子與鈉離子的摩爾比落在符合上述條件的範圍，鉀離子的含量可以從3～125mM，優選3～100mM，更優選3～75mM的範圍內進行選擇。
本發明的細胞保存液優選進一步含有碳酸氫根離子和/或碳酸根離子。這裡碳酸氫根離子表示HCO3-，碳酸根離子表示CO32-。這些離子在溶液中處於平衡狀態，並可根據pH等條件而發生改變。碳酸氫根離子和/或碳酸根離子可以通過在細胞保存液中添加各種碳酸鹽、碳酸氫鹽而使它們包含在該保存液中。作為這樣的化合物的例子，可以列舉碳酸氫鈉(也稱作為「小蘇打」)、碳酸鈉、碳酸鈣、碳酸氫鈣、碳酸鎂等，從經濟性和操作難易性角度考慮，優選碳酸氫鈉(小蘇打)。碳酸氫鈉可以使用市售品(下述實施例中使用和光純藥工業株式會社製品)。細胞保存液中碳酸氫根離子和/碳酸根離子的含量可以從1～75mM，優選10～50mM，更優選20～30mM的範圍內選擇。
本發明的細胞保存液通過防止細胞和組織在保存過程中膨脹或收縮等，可以提高細胞的存活率。為此該細胞保存液的滲透壓被調節至200～500mOsm/kg，優選調節至200～400mOsm/kg，更優選250～350mOsm/kg。保存液的滲透壓由包含該保存液所含離子的所有物質的濃度決定。保存液的滲透壓可以通過改變糖類、碳酸氫根離子和/或碳酸根離子、保存液所含的其它離子的含量而進行適當地調節，或者也可以添加羥乙基澱粉等無害滲透壓調節劑。
此外，本發明的細胞保存液pH被調節至5.0～8.5，優選6.0～8.5，更優選7.0～8.0。pH可以通過添加上述有機酸的鈉鹽或鉀鹽等電解質進行調節。
本發明的細胞保存液中還可以進一步含有鈣離子、鎂離子等金屬離子、氯化物離子、磷酸根離子、硝酸根離子、硫酸根離子以及乳酸根離子等通常細胞保存液中可能含有的離子。這些離子還可以一種或者多種組合使用。由於這些離子的濃度取決於保存液的滲透壓、pH、以及保存液中的其它物質的含量等，因而難以進行統一規定，不過，例如鎂離子可以從0.0～1mM，優選0.2～0.8mM的範圍內選擇，鈣離子可以從1～4mM，優選1.5～3.5mM的範圍內選擇，氯化物離子可以從75～245mM，優選100～150mM的範圍內選擇，磷酸根離子可以從0.5～65mM，優選0.5～2mM的範圍內選擇，硫酸根離子可以從0～1mM，優選0.5～1mM的範圍內選擇，乳酸根離子可以從0～20mM，優選0～15mM的範圍內選擇。
本發明的細胞保存液中還可以適當地含有現有保存液中的其它成分，例如抗生素、抗菌藥、抗氧化劑、血清、維生素、蛋白質、胺基酸、pH指示劑、螯合劑等。
本發明的細胞保存液，優選可以通過如下方法製備於無菌的條件下在日本藥典林格氏溶液和日本藥典碳酸氫鈉溶液中混合市售的輸液製劑脫水補充液，使其含有必需濃度的必需成分。作為其它方法，還可以通過例如分別稱取必需量的必需成分，混合於純水中，將混合溶液進行除菌過濾而製備。
作為市售的輸液製劑脫水補充液，可以使用作為綜合電解質輸液、輸液用電解質溶液銷售的藥物製劑。更具體地說，可以使用具有以下1)或者2)的組成的注射液1)1000ml的水溶液中含有以下成分的注射液，氯化鈉 1.92g氯化鉀 1.00g乳酸鈉 2.80g氯化鎂 0.10g磷酸一鈉 0.14g
磷酸二鉀1.00g葡萄糖 23.5g2)由以下成分組成的注射液氯化鈉 0.270w/v％氯化鉀 0.149w/v％乳酸鈉 0.224w/v％磷酸二氫鈉 0.031w/v％磷酸氫二鈉 0.287w/v％葡萄糖 3.2w/v％作為添加物的L-乳酸 8mEq/L日本藥典林格氏溶液、日本藥典碳酸氫鈉溶液以及市售的輸液製劑可以以體積比為80∶3∶20～50的比例混合。具體地說，例如可以在800mL日本藥典林格氏溶液和30mL日本藥典碳酸氫鈉溶液中混合250～300mL上述1)的注射液而製備。此外作為另一方法，例如可以在800mL日本藥典林格氏溶液和30mL日本藥典碳酸氫中混合400～450mL上述2)的注射液而製備。
作為可以用本發明細胞保存液保存的細胞，可以列舉從包括人在內的哺乳動物分離出的各種細胞，例如淋巴細胞、幹細胞、皮膚細胞、黏膜細胞、肝細胞、胰島細胞、神經細胞、軟骨細胞、內皮細胞、上皮細胞、骨細胞、肌細胞等、骨髓細胞、造血幹細胞，或者哺乳動物以外的魚類的精子·卵子·受精卵、昆蟲細胞等。例如在保存人的活化淋巴細胞時也可以使用。
本發明還涉及採用上述細胞保存液保存細胞的方法。作為保存方法，可以將細胞懸浮於細胞保存液後，使其按照現有技術進行冷凍而保存，但也可以不冷凍而在冷藏的條件下保存。冷藏條件是指不使溶液凍結的條件，只要是低溫即可，優選為0～25℃，更優選為0～10℃，特別優選為4～6℃。
此外，由於用本發明細胞保存液的細胞保存期限取決於細胞的種類、保存溫度等條件，因而難以進行統一的規定，作為目標，能夠達到8～12天的水平，優選能夠達到4～6天的水平。作為具體的使用方式，可以用於將活性淋巴細胞從接受培養的設備輸送到患者本身時的保存。在這種短期保存時，可以在冷藏的條件下保存，這一點是本發明保存液和保存方法的優點。
在保存時，懸浮在細胞保存液中的細胞濃度取決於細胞的種類、細胞的大小、保存期限等條件，因而很難進行統一的規定，可以為1.0×104～1.0×108細胞/mL的水平，優選為1.0×105～1.0×108細胞/mL的水平。此外，保存容器可以在考慮細胞種類、保存溫度、保存期限、保存後的細胞用途等的情況下，從已知的容器中適當地選擇使用。
此外，本發明還涉及採用如上保存的細胞進行細胞培養的方法。保存後的細胞可以在通過離心分離而與細胞保存液分離後，接種於常用的培養基中進行培養，但也可用保留細胞保存液，將細胞懸浮液直接接種在常用的培養基中進行培養。
實施例(實施例1)含有葡萄糖和小蘇打的細胞保存液配製由以下組分組成的細胞保存液。滲透壓在280～300mOsm/kg的範圍內。滲透壓採用OSMOMETER OM 802-D(VOGEL公司製造)測定。
葡萄糖(和光純藥工業株式會社生產) 5.5mM鈉離子 143.8mM鉀離子 5.4mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 23.7mM
鈣離子 1.8mM鎂離子 0.8mM氯化物離子 130.8mM磷酸根離子 1.0mM硫酸根離子 0.8mM純水合計 1,000mL(實施例2)含有麥芽糖和小蘇打的細胞保存液配製除了將實施例1中的葡萄糖替換為麥芽糖(和光純藥工業株式會社生產)以外與實施例1同樣的細胞保存液。
(實施例3)含有甘露醇和小蘇打的細胞保存液配製除了將實施例1中的葡萄糖替換為甘露醇(和光純藥工業株式會社生產)以外與實施例1同樣的細胞保存液。
(實施例4)含有蔗糖和小蘇打的細胞保存液配製除了將實施例1中的葡萄糖替換為蔗糖(西格瑪公司生產)以外與實施例1同樣的細胞保存液。
(實施例5)含有海藻糖和小蘇打的細胞保存液配製除了將實施例1中的葡萄糖替換為海藻糖(和光純藥工業株式會社生產)以外與實施例1同樣的細胞保存液。
(實施例6)不含碳酸氫根離子和/或碳酸離子的細胞保存液配製除了不含碳酸氫根離子和/或碳酸離子(小蘇打)以外與實施例1同樣的細胞保存液。因此，其由以下組分組成，葡萄糖 5.5mM鈉離子 142.4mM鉀離子 5.4mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 0mM
鈣離子 1.8mM鎂離子 0.8mM氯化物離子 132.4mM磷酸根離子 1.0mM硫酸根離子 0.8mM純水合計 1,000mL(實施例7)滲透壓為200mOsm/kg的細胞保存液配製由以下組分組成的細胞保存液。細胞保存液的滲透壓約為200mOsm/kg。
葡萄糖 5.5mM鈉離子 93.0mM鉀離子 5.4mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 23.8mM鈣離子 1.8mM鎂離子 0.8mM氯化物離子 79.6mM磷酸根離子 1.0mM硫酸根離子 0.8mM純水合計 1,000mL(實施例8)滲透壓為240mOsm/kg的細胞保存液配製滲透壓約為240mOsm/kg的細胞保存液。滲透壓通過向實施例7的組成中添加氯化鈉進行調節。
(實施例9)滲透壓為300mOsm/kg的細胞保存液配製滲透壓約為300mOsm/kg的細胞保存液。滲透壓通過向實施例7的組成中添加氯化鈉進行調節。
(實施例10)滲透壓為400mOsm/kg的細胞保存液配製滲透壓約為400mOsm/kg的細胞保存液。滲透壓通過向實施例7的組成中添加氯化鈉進行調節。
(實施例11)滲透壓為500mOsm/kg的細胞保存液配製滲透壓約為500mOsm/kg的細胞保存液。滲透壓通過向實施例6的組成中添加氯化鈉進行調節。
(實施例12)pH為5.0的細胞保存液配製由以下組分組成的細胞保存液。細胞保存液的滲透壓約為299mOsm/kg，pH約為5.0。
葡萄糖 5.4mM鈉離子 138.8mM鉀離子 5.2mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子23.2mM鈣離子 1.8mM鎂離子 0.8mM氯化物離子 145.0mM磷酸根離子 1.0mM硫酸根離子 0.8mM純水合計 1,000mL(實施例13)pH為6.0的細胞保存液配製由以下組分組成的細胞保存液。細胞保存液的滲透壓約為293mOsm/kg，pH約為6.0。
葡萄糖 5.5mM鈉離子 139.2mM鉀離子 5.3mM
碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 23.5mM鈣離子1.8mM鎂離子0.8mM氯化物離子137.4mM磷酸根離子1.0mM硫酸根離子0.8mM純水合計 1,000mL(實施例14)pH為7.0的細胞保存液配製由以下組分組成的細胞保存液。細胞保存液的滲透壓約為283mOsm/kg，pH約為7.0。
葡萄糖5.5mM鈉離子140.8mM鉀離子5.4mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 23.7mM鈣離子1.8mM鎂離子0.8mM氯化物離子127.8mM磷酸根離子1.0mM硫酸根離子0.8mM純水合計 1,000mL(實施例15)pH為8.0的細胞保存液配製由以下組分組成的細胞保存液。細胞保存液的滲透壓約為281mOsm/kg，pH約為8.0。
葡萄糖 5.5mM
鈉離子 141.7mM鉀離子 5.4mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 23.8mM鈣離子 1.8mM鎂離子 0.8mM氯化物離子 125.2mM磷酸根離子 1.0mM硫酸根離子 0.8mM純水合計 1,000mL(實施例16)配製由以下組分組成的細胞保存液。這時的滲透壓約為288mOsm/kg。
葡萄糖 47.8mM鈉離子 121.4mM鉀離子 4.6mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 20.5mM鈣離子 1.6mM鎂離子 0.7mM氯化物離子 110.0mM磷酸根離子 0.9mM硫酸根離子 0.7mM純水合計 1,000mL(實施例17)配製由以下組分組成的細胞保存液。這時的滲透壓約為283mOsm/kg。
葡萄糖 5.5mM鈉離子 140.8mM鉀離子 5.4mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 23.7mM鈣離子 1.8mM鎂離子 0.8mM氯化物離子 127.8mM磷酸根離子 1.0mM硫酸根離子 0.8mM純水合計 1,000mL(實施例18)向800mL日本藥典林格氏溶液中混合250mL由以下1)的組分組成的注射液(市售的脫水補充液)和30mL日本藥典碳酸氫鈉注射液，配製細胞保存液。
1)1000mL水溶液中含有以下成分的注射液氯化鈉瑩 1.92g氯化鉀 1.00g乳酸鈉 2.80g氯化鎂 0.10g磷酸一鈉 0.14g磷酸二鉀 1.00g葡萄糖 23.5g這時，最終組成如以下2)所示，滲透壓約為317.7mOsm/kg，pH為7.749(24.4℃)。
2)最終組成葡萄糖30.2mM鈉離子145.7mM鉀離子8.7mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 23.1mM鈣離子3.3mM鎂離子0.2mM氯化物離子126.4mM磷酸根離子1.6mM乳酸根離子5.8mM合計溶液量1,080mL(實施例19)向800mL日本藥典林格氏溶液中混合300mL由實施例18的1)組分組成的注射液(市售的脫水補充液)和30mL日本藥典碳酸氫鈉注射液，配製細胞保存液。
這時，最終組成如以下所示，滲透壓約為316.7mOsm/kg，pH為7.351(25.2℃)。
最終組成葡萄糖34.6mM鈉離子141.9mM鉀離子9.4mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 22.1mM鈣離子3.2mM鎂離子0.3mM氯化物離子122.9mM磷酸根離子1.8mM
乳酸根離子6.6mM合計溶液量1,130mL(實施例20)向800mL日本藥典林格氏溶液中混合400mL由以下1)的組分組成的注射液(市售的脫水補充液)和30mL日本藥典碳酸氫鈉注射液，配製細胞保存液。
1)1000mL水溶液中含有以下成分的注射液氯化鈉0.270w/v％氯化鉀0.149w/v％乳酸鈉0.224w/v％磷酸二氫鈉0.031w/v％磷酸氫二鈉0.287w/v％葡萄糖3.2w/v％作為添加物的L-乳酸8mEq/L這時，最終組成如以下2)所示，滲透壓約為339.7mOsm/kg，pH為7.442(24.2℃)。
2)最終組成葡萄糖57.8mM鈉離子143.3mM鉀離子9.1mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 20.3mM鈣離子2.9mM鎂離子0.0mM氯化物離子122.7mM磷酸根離子3.3mM乳酸根離子9.1mM
純水合計 1,230mL(實施例21)向800mL日本藥典林格氏溶液中混合450mL由實施例20的1)組分組成的注射液(市售的脫水補充液)和30mL日本藥典碳酸氫鈉注射液，配製細胞保存液。
這時，最終組成如以下所示，滲透壓約為316.7mOsm/kg，pH為7.351(25.2℃)。
最終組成葡萄糖 62.4mM鈉離子 141.0mM鉀離子 9.5mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子19.5mM鈣離子 2.8mM鎂離子 0.0mM氯化物離子 120.5mM磷酸根離子 3.5mM乳酸根離子 9.8mM純水合計 1,280mL(比較例1)不含糖類的細胞保存液配製除了不含葡萄糖與實施例1同樣的細胞保存液。因此，其由以下組成組成，葡萄糖 0mM鈉離子 145.3mM鉀離子 5.4mM
碳酸氫根離子和/或碳酸根離子 23.7mM鈣離子1.8mM鎂離子0.8mM氯化物離子132.4mM磷酸根離子1.0mM硫酸根離子0.8mM純水合計 1,000mL(比較例2)磷酸緩衝液以通常作為細胞保存液使用的磷酸緩中液作為細胞保存液。
(比較例3)生理鹽水以通常作為細胞保存液使用的生理鹽水(含有2.5v/v％的人白蛋白)作為細胞保存液。
(比較例4)Euro-collins液以通常作為臟器保存液的市售Euro-collins液作為細胞保存液。本比較例的Euro-collins液組成中，作為糖的含量葡萄糖為194.3mM，鈉離子濃度為10.0mM，鉀離子濃度為115.0mM。
(比較例5)pH為9.0的細胞保存液配製由以下組分組成的細胞保存液。細胞保存液的滲透壓約為285mOsm/kg，pH約為9.0。
葡萄糖 5.5mM鈉離子 147.1mM鉀離子 5.3mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子23.7mM鈣離子 1.8mM鎂離子 0.8mM
氯化物離子128.1mM磷酸根離子1.0mM硫酸根離子0.8mM純水合計 1,000mL(試驗例1)本發明細胞保存液中的細胞存活率在保存液滲透壓恆定的情況下，對含有各種糖類的細胞保存性能進行比較，並與現有技術的細胞保存液進行比較。具體地說，採用實施例1～6、比較例1～4的細胞保存液，使細胞懸浮液的濃度為約2.0×106細胞/mL，將淋巴細胞(T淋巴細胞)於各保存液中在冷藏條件(4℃)下進行保存。通過錐蟲藍染色進行死活判斷，計算出保存後第4天淋巴細胞的存活率。其結果列於表1。
表1

*由於產生凝聚塊，不能測定。
表1的結果表明，以糖類和碳酸氫根離子和/或碳酸根離子為有效成分的細胞保存液(實施例1～6)與比較例相比顯示出更高的存活率，實施例1、2顯示出特別高的存活率。
(試驗例2)細胞保存液滲透壓的影響研究了保存液對滲透壓的依賴性。具體地說，採用實施例7～11的細胞保存液，使細胞懸浮液的濃度為約1.5×106細胞/mL，將淋巴細胞(T淋巴細胞)於各保存液中在冷藏條件(4℃)下進行保存。通過錐蟲藍染色進行死活判斷，計算出保存後第4天淋巴細胞的存活率。其結果列於表2。用市售的細胞保存液(比較例2、
3)進行比較。
表2

從表2的結果看出，以糖類、鈣離子和鈉離子為有效成分，滲透壓為200～500mOsm/kg範圍內的任意數值(實施例7～11)時，均比市售的細胞保存液(比較例2，3)的存活率高，顯示了本發明的有效性。特別是在200～300mOsm/kg範圍內(實施例7～9)顯示出更高的存活率。
(試驗例3)細胞保存液pH值的影響研究了細胞保存液中有葡萄糖、鈣離子和鈉離子的存在，且滲透壓基本恆定的情況下對pH值的依賴性。具體地說，採用實施例12～15、比較例5的細胞保存液，使細胞懸浮液的濃度為約1.0×106細胞/mL，將淋巴細胞(T淋巴細胞)於各保存液中在冷藏條件(4℃)下進行保存。通過錐蟲藍染色進行死活判斷，計算出保存後第4天淋巴細胞的存活率。其結果列於表3。
表3

*由於產生凝聚塊，不能測定。
表3的結果表明，pH值在5.0～8.0的範圍內(實施例12～15)顯示出比較高的存活率，pH為6.0～8.0(實施例13～15)時顯示出特別高的存活率。
(試驗例4)細胞存活率隨時間的變化圖1是測定實施例1、16的細胞保存液與現有技術的細胞保存液(比較例2、3)的細胞存活率隨時間的變化的結果。本發明的細胞保存液從保存開始經過6天後仍顯示出較高的存活率。
(試驗例5)保存後的細胞培養將活化培養開始後第5天的處於對數增殖期的淋巴細胞用實施例17的細胞保存液以20×106細胞/mL的濃度冷藏保存4天。回收保存後的細胞，不進行洗滌操作，將其一部分直接加入到含有10％FBS的淋巴細胞培養基(ALyS505N培養基，細胞科學研究所社製備)中，接種時濃度為2.7×105細胞/mL，在37℃、5％CO2環境下培養4天。結果，4天後淋巴細胞濃度達到1.7×106細胞/mL。因此可以確認實施例17的細胞保存液對細胞培養沒有妨礙。
(試驗例6)細胞存活率隨時間的變化圖2是測定實施例18～21各細胞保存液與現有技術的細胞保存液(比較例2、3)的細胞存活率隨時間的變化的結果。本發明的細胞保存液從保存開始經過4天後仍顯示出較高的存活率。
根據以上說明，通過使用本發明的細胞保存液，不僅可以冷凍保存，在冷藏條件下也可以提高細胞保存性能，且能夠提高細胞存活率。並且，由於根據本發明可提供在冷藏條件下的細胞保存方法，使得一直以來難以保存的細胞種類也可以保存。此外，在不具備冷凍保存所必需的程序製冷器等昂貴裝置·設備的情況下，也可以進行細胞保存。並且如果使用本發明的細胞保存液，可以在不經過洗滌工序的情況下將細胞在懸浮於該細胞保存液中而直接接種於培養基進行培養，因此可以簡便地進行細胞培養。例如，在近年來正廣泛採用的免疫細胞療法領域，本發明的細胞保存液可以在將活化培養後的淋巴細胞從接受培養的設備輸回到患者本身時使用。這樣，可以抑制細胞存活率下降，維持細胞的質量，因此認為其對最終治療也能發揮作用。
權利要求
1.一種細胞保存液，其特徵在於至少含有糖類、鈉離子和鉀離子，且所含鈉離子的摩爾濃度與鉀離子的摩爾濃度相等或者比鉀離子的摩爾濃度更大。
2.權利要求1所述的細胞保存液，其中鉀離子與鈉離子的摩爾比為1∶1～1∶85。
3.權利要求1所述的細胞保存液，其中糖類的含量為0.5～150mM。
4.權利要求1～3任意一項所述的細胞保存液，其中糖類為從葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、蔗糖或海藻糖構成的群組中選出的任意一種或多種。
5.權利要求1～3任意一項所述的細胞保存液，其中糖類為葡萄糖和/或麥芽糖。
6.權利要求1～3任意一項所述的細胞保存液，進一步含有碳酸氫根離子和/或碳酸根離子。
7.權利要求6所述的細胞保存液，其中碳酸氫根離子和/或碳酸根離子的含量為1～75mM。
8.權利要求1～3任意一項所述的細胞保存液，進一步含有從鈣離子、鎂離子、氯化物離子、磷酸根離子、硫酸根離子和乳酸根離子構成的群組中選出的任意一種或者多種離子。
9.權利要求8所述的細胞保存液，其中1000mL水溶液中含有以下組成糖類 0.5～150mM鈉離子 20～260mM鉀離子 3～125mM碳酸氫根離子和/或碳酸根離子1～75mM鈣離子 1～4mM鎂離子 0～1mM氯化物離子 75～245mM磷酸根離子 0.5～65mM硫酸根離子 0～1mM乳酸根離子 0～20mM
10.製備權利要求1～9任意一項所述的細胞保存液的方法，其特徵在於將日本藥典林格氏溶液、日本藥典碳酸氫鈉注射液和市售的脫水補充液按照體積比為80∶3∶20～50的比例混合。
11.權利要求10所述的製備細胞保存液的方法，其中市售的脫水補充液選自以下的1)或者2)的注射液1)1000ml的水溶液中含有以下成分的注射液，氯化鈉 1.92g氯化鉀 1.00g乳酸鈉 2.80g氯化鎂 0.10g磷酸一鈉 0.14g磷酸二鉀 1.00g葡萄糖 23.5g2)由以下組分組成的注射液氯化鈉 0.270w/v％氯化鉀 0.149w/v％乳酸鈉 0.224w/v％磷酸二氫鈉 0.031w/v％磷酸氫二鈉 0.287w/v％葡萄糖 3.2w/v％作為添加物的L-乳酸 8mEq/L
12.一種細胞保存方法，其特徵在於採用權利要求1～9任意一項所述的細胞保存液在冷藏的條件下保存細胞。
13.權利要求12所述的細胞保存方法，其中細胞為淋巴細胞。
14.一種細胞培養方法，其特徵在於將細胞懸浮於權利要求1～9任意一項所述的細胞保存液中，將該懸浮液直接接種到培養基中，對該細胞進行培養。
全文摘要
提供一種細胞保存液，使細胞不僅能夠冷凍保存，還能夠冷藏保存，並且提高了細胞保存性能，還提供使用該保存液的簡便細胞保存方法。該細胞保存液特徵在於至少含有糖類、鈉離子和鉀離子，且所含鈉離子的摩爾濃度與鉀離子的摩爾濃度相等或者比鉀離子的摩爾濃度更大。這樣細胞不僅能夠冷凍保存，還能夠冷藏保存，從而能夠提供一種簡便的細胞保存方法。並且，採用本發明的細胞保存液，可以不需經過洗滌等工序而將細胞懸浮於該保存液中直接接種於培養基中進行細胞培養，因此很簡便。
文檔編號C12N5/00GK1772882SQ20051011264
公開日2006年5月17日 申請日期2005年10月11日 優先權日2004年10月12日
發明者田口淳史, 佐藤威, 矢部則次 申請人:尼普洛株式會社