梅山豬高產抗病新品系的培育方法
2023-05-20 04:26:56 2
梅山豬高產抗病新品系的培育方法
【專利摘要】本發明涉及梅山豬高產抗病新品系的培育方法，其特點是：對梅山豬核心群進行F18大腸桿菌感染，根據表型鑑定結果組建梅山豬F18大腸桿菌抗病育種基礎群；對基礎群中F18大腸桿菌抗性型群體細胞因子（IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α和IFN-γ）進行濃度測定；通過建立主成分綜合評價模型，根據不同個體的綜合得分來對一般抗病力進行綜合指數選育，同時對繁殖性能等性狀進行檢測和選擇，組建第一個世代；用群體繼代選育和分子標記輔助選擇的方法，經過4-5個世代，逐步實現育種目標，建立新品系核心群。新品系豬具有抗斷奶仔豬腹瀉和水腫病、抗應激、適應環境能力強、肉質優、飼料報酬高、產仔數多的優點。
【專利說明】梅山豬高產抗病新品系的培育方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及梅山豬高產抗病新品系的培育方法，屬於動物遺傳育種與繁殖、分子 生物學【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 我國養豬業具有強大的肉豬生產系統，也就是常說的"我國是養豬大國"，但是在 "金字塔"繁育體系中頂端核心種豬資源長期依賴進口。在很長的一段時間內，對於種豬，我 國都處於"引種一維持一退化一再引種"的惡性循環，在加入WT0後，這一狀況更嚴重。總 之，明顯的種豬引進依賴對我國養豬業的持久發展十分不利，從國家的長遠利益考慮，此種 現象不宜再發展下去。面對這一狀況，迫使我們必須變依賴進口為創造性地進行選育，尋求 適合我國國情、在國際種豬市場佔有一席之地的特色種豬品系和繁育體系。
[0003] 豬病是養豬生產的大敵。育種實踐中，單純追求高產通常導致豬的抵抗力降低， 一些原有疾病未根除，又出現了新的疾病，嚴重製約了養豬業的發展。疾病可導致畜禽產品 低劣、產量下降，同時它還嚴重降低遺傳進展，給養豬業造成的直接經濟損失約佔總產值的 12%?15%，因此，做好疾病預防是發展養豬業的前提。
[0004] 產腸毒素性大腸桿菌（ETEC)是初生和斷奶仔豬腹瀉和水腫病最常見和最重要的 病原菌，是養豬業中的重要威脅因素 （Boldin B，2008)，其中F18大腸桿菌又是目前在養豬 業中發生最普遍、危害最大的大腸桿菌病原之一（Van den Broeck W et al，2000)。儘管 當前對仔豬腹瀉採取的一些預防性措施（如提高管理水平、改善衛生環境、注射藥物以及 亞單位疫苗接種等），在一定程度上減少了該病的發生，但並沒有從根本上消除斷奶仔豬腹 瀉的發生與流行，大腸桿菌性仔豬腹瀉仍然是引起仔豬高發病率和死亡率最主要的原因之 一。為進一步保障我國養豬業步入高產、高效和優質的新時期，非抗生素治療、廣譜、直接、 高效和全新的仔豬細菌性腹瀉防治措施的研發是目前最迫切的攻關難題。從長遠來看，採 用現代遺傳學方法，提高豬對大腸桿菌的抗病力，進行抗病育種，才是治本的辦法。
[0005] 為了獲得更多的疾病防治方法，必須清楚地了解動物的免疫抗病系統及致病機 理。疾病的發生一般是動物的遺傳背景與其所處環境之間相互作用的結果。若某一動物在 遺傳上對一種疾病易感，則環境條件（包括常規疾病防治方法）可能僅對疾病的防治部分 有效。一個可取代疾病常規防治法是針對提高家畜抗病力進行選擇性育種。遺傳性抗病力 包括了機體免疫抗病系統及其相互作用的許多方面，因而極為複雜。目前從根本上開展豬 的抗性遺傳機制研究，進行抗病育種，已引起了國內外學者的高度重視。
[0006] 病原體在傳染過程中，會遇到3道防禦機制，即上皮防禦機制、非特異性防禦機制 和特異性防禦機制。當個體受到病原體侵染時，會調動這3方面的防禦機制加以抵抗。豬是 否發病取決於侵染和防禦機能相互作用的結果，防禦機能加強的豬便表現出自然抗病力。 抗病力按遺傳基礎的不同可分為特殊抗病力和一般抗病力。特殊抗病力是指豬對某種特定 疾病或病原體的抗性，這種抗性主要受一個主基因位點控制，同時也可不同程度地受其它 位點（包括調控子）及環境因素影響。現有的研究結果表明，特殊抗病力的內在機理在於 宿主體內存在或缺少某種分子或其變體，這不僅能決定異體識別及特異性異體反應，還能 決定病原體的特殊附著力，病原體進入體內後在體內增殖，能否導致宿主發病。一般抗病力 不限於抗某一種病原體，它受多基因和環境的綜合影響，病原體的抗原性差異對一般抗病 力影響極小，甚至根本沒有影響，這種抗病力體現了機體對疾病的整體防禦功能。
[0007] 研究發現，不少豬病的發病機制與豬本身的遺傳背景有關，即豬可能對一些疾病 存在完全或部分抗性。廣義上講，任何疾病的發生都是遺傳與環境因素共同作用的結果，幾 乎所有疾病都與遺傳有關。狹義上講，遺傳病是由於生殖細胞或受精卵中遺傳物質發生了 結構或功能上的變異所致。因此，從長遠角度來看，採用遺傳學方法從遺傳基礎上提高豬對 疾病的一般抗性具有治本的功效。而一般抗性是維持豬在不良環境中生存和生產的必要條 件，因此培育具有一般抗性的豬種成為育種領域的主要課題之一。
[0008] 衡量動物機體對疾病抵抗能力大小的指標有很多，細胞因子（cytokines，CK)是 其中一項重要指標，其是由機體免疫細胞分泌的一類具有廣泛生物學活性的小分子多肽， 具有免疫調節、抗腫瘤、促進造血、參與炎症反應以及神經內分泌效應等多種生物學功能； 在動物體內，絕大多數細胞因子含量較低，其主要作用是提高動物的免疫功能。據報導，免 疫指標可代表機體的免疫功能狀態，從而間接反映機體的抗病能力，因此可通過免疫指標 的測定來了解動物的一般抗病力。然而迄今為止，尚未建立對梅山豬一般抗病力的評價體 系，因而無法從眾多的細胞因子測定指標中選擇最佳數量指標，形成一套適用的綜合評價 指標體系。
[0009] -般抗病力多個測量指標中需要構建一套適用的綜合評價指標體系，在該體系中 指標模型的構建是關鍵問題之一，主成分分析法（principal component analysis, PCA)正 好科學地解決了這一問題。PCA是研究如何將多指標問題轉化為較少的綜合指標的一種重 要統計方法，能使問題變得比較簡單、直觀，近來已成為多指標綜合評價和權重係數確定的 重要方法。
[0010] 梅山豬作為我省優良地方品種太湖豬的一個品系，以高繁殖力和肉質鮮美而著稱 於世。作為世界產崽冠軍的梅山豬，是遺傳資源中經濟雜交和培育新品種的優良親本。國外 多個國家自上世紀八十年代起，先後從我國引進優良地方豬種一梅山豬，作為育種資源，改 良提高自身豬種的產仔與肉質性狀等，並已取得顯著成效。同樣，在國內，以中梅山豬為代 表，以優良地方豬種為基礎培育中國瘦肉型豬種也取得較大進展。梅山豬的優良特性主要 是高繁殖性能和優良的肉質，但是也存在瘦肉率不高、抗病力下降等問題和不足，尤其是近 年來仔豬腹瀉水腫病及氣喘病等疾病的發病率較高，直接和間接導致母豬受胎率、產活仔 數和斷奶仔豬成活率下降，使梅山豬公認的高繁殖力不能得到充分發揮。本發明在組建梅 山豬抗大腸桿菌病群體的基礎上，測定不同發育時期幹擾素、白介素等細胞因子及主要抗 體水平等免疫應答指標，在分析免疫應答指標及其與生長發育關係的基礎上，確定免疫應 答和一般抗病力的評價指標並納入常規選種選育體系，篩選有效的一般抗病力分子標記並 進行育種效率評估。選留一般抗病力強的個體，同時對繁殖性能、生長速度、瘦肉率、胴體品 質等性狀進行檢測和選擇，組建第一個世代；用群體繼代選育和分子標記輔助選擇的方法， 經過4-5個世代，逐步實現既定育種目標，建立新品系核心群。有望降低氣喘病等呼吸道疾 病的發病率，培育具有抗大腸桿菌病和一般抗病力強、生長速度快、適於相對粗放條件下飼 養的梅山豬高產抗病新品系，從根本上為實現梅山豬健康高效養殖奠定基礎，取得可觀的 社會效益、經濟效益和社會效益。
【發明內容】
[0011] 本發明的目的是提供一種梅山豬中科學可行的抗F18大腸桿菌病新品系的培育 方法，新品系豬具有抗斷奶仔豬腹瀉和水腫病、抗應激、適應環境能力強、肉質優、飼料報酬 高、產仔數多的優點，該方法還可以為國內其他地方豬品種的抗病育種和新品系選育提供 指導。
[0012] 本發明的技術方案是：對梅山豬核心群採用飼料添加的方法進行F18大腸桿菌感 染試驗,根據表型鑑定的結果，組建梅山豬F18大腸桿菌抗病育種基礎群；同時基於主成分 分析構建一般抗病力的評估模型，對梅山豬F18大腸桿菌抗病育種基礎群進行一般抗病力 綜合指數選育，結合生長速度、瘦肉率、胴體品質等性狀進行檢測和選擇，運用最佳線性無 偏預測（Best Linear Unbiased Prediction, BLUP)模型進行種豬的遺傳評估。運用群體 繼代選育和分子標記輔助選擇的方法，通過4-5個世代的培育，最終培育出梅山豬高產抗 病新品系。
[0013] 所述的新品系培育方法包括以下步驟：
[0014] (1)對梅山豬核心群採用飼料添加的方法進行F18大腸桿菌感染試驗，根據表型 鑑定結果，組建梅山豬F18大腸桿菌抗病育種基礎群；
[0015] (2)對基礎群中F18大腸桿菌抗性型群體細胞因子白介素2(IL-2)、白介素 6(IL_6)、白介素10(IL-10)、白介素12(IL_12)、腫瘤壞死因子α (TNF-α )和γ幹擾素 (IFN-γ)進行濃度測定；通過建立主成分綜合評價模型，根據不同個體的綜合得分來對梅 山豬一般抗病力進行綜合指數選育，同時對繁殖性能、生長速度、瘦肉率、胴體品質等性狀 進行檢測和選擇，組建第一個世代；
[0016] (3)用群體繼代選育和分子標記輔助選擇的方法，經過4-5個世代，逐步實現既定 育種目標，建立新品系核心群。
[0017] 所述抗F18大腸杆囷病新品系豬的性能指標為：
[0018] 抗病力：抗斷奶仔豬腹瀉和水腫病，並具有很強的抗應激能力和抗逆性。
[0019] 繁殖性能：新品系豬總產仔數達到21頭以上，核心群經產母豬產仔在14. 5頭以 上。
[0020] 生長性能：20kg?75kg育肥期間，平均日增重450g以上，料重比3.6 :1。
[0021] 屠宰性能及肉質：胴體屠宰率72%以上，瘦肉率，45%以上，肉質優良，肌內脂肪 6. 0%以上。
[0022] 本發明的有益技術效果主要體現在：
[0023] (1)從豬抗逆性入手開展抗病育種，提高豬的免疫應答能力和一般抗病力，可以更 有效地解決豬很多疾病如呼吸道疾病與環境相互作用的問題，從根本上降低諸多疾病的發 病率。
[0024] (2)傳統的新品系培育技術，主要基於表型性狀進行選擇，存在周期長、遺傳進展 緩慢等缺點，本發明將免疫學原理、分子育種技術及常規育種手段相結合，提高梅山豬的特 殊抗病力（抗F18大腸桿菌引起的斷奶仔豬腹瀉）和一般抗病力，尤其是先前的一般抗病 力評估還僅局限於研究少數幾個參數進行判斷，無法綜合、準確地判斷一般抗病力的強弱。 本發明則很好地解決了如何從眾多指標中選擇最佳數量指標的難題，最終達到科學評價豬 個體一般抗病力的目的。
[0025] (3)本發明培育的新品系豬不僅抗斷奶仔豬腹瀉和水腫病，還具有瘦肉率高、肉質 優、飼料報酬高、產仔數多、抗應激、適應環境能力強的優點，可以直接用於優質瘦肉型商品 豬生產，還可以組成雜交配套系的母系；本發明還可以為其他地方豬品種的抗病育種和新 品系選育提供技術支持和指導。
【具體實施方式】
[0026] 實施例：
[0027](一）對梅山豬核心群採用飼料添加的方法進行F18大腸桿菌（從中國獸醫藥品 監察所購買）感染試驗，根據表型鑑定的結果，組建梅山豬F18大腸桿菌抗病育種基礎群；
[0028] 1)細菌培養將F18大腸桿菌的單個菌落接種到3?5mL的LB培養基中，並37°C 振蕩培養過夜（約18h)，次日將細菌用PBS反覆離心洗滌3次，並將大腸桿菌菌株與PBS按 照1:20的比例進行稀釋，調整細菌濃度為4. 6 X 108CFU/L。
[0029] 2)飼料配製按照斷奶仔豬的營養需求飼餵含有21. 7%粗蛋白的顆粒飼料，飼 料中不含有任何抗生素和微生態製劑，配製不含有抗生素和微生態製劑的飼料，主要是為 了避免飼料中抗生素等對試驗產生的幹擾和影響。
[0030] 3)E. coli F18菌株和輪狀病毒的檢測攻毒之前，檢測所有個體糞便中是否含有 F18大腸桿菌和輪狀病毒，採用棉花棒在肛門處採集少量糞便，每個肛拭子中加入800uL高 壓雙蒸水混勻，取其中的200uL到另外一個EP管中，取20uL塗布麥康凱平板，其餘120°C 變性lOmin，12000r/minX lmin，取上清做DNA模板，用於檢測F18大腸桿菌；剩餘的600uL 反覆凍融2次，用試劑盒提取RNA，反轉成cDNA，-20°C凍存用於檢測輪狀病毒。糞便DNA的 PCR擴增產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，只有糞便中均未發現F18大腸桿菌和輪狀病毒 時，排除了攻毒個體自身攜帶輪狀病毒和大腸桿菌導致腹瀉的可能性，才可以進行下一步 的攻毒試驗，。
[0031] F18 大腸桿菌檢測：PCR 反應體系：模板 DNA5. 0μ L，10XBuffer5. 0μ L，MgCl22uL， dNTP混合物3. 0μ L，F18大腸桿菌（Sta和Stx2)上下遊引物各1. 25μ L(引物見表1)，Taq 酶（5U/y L) 1. 0μ L，加雙蒸水補足至50μ L。PCR擴增條件為：94°C預變性2min，94°C變性 30s，50°C退火45s，72°C延伸90s，共進行30個循環，然後72°C後延伸lOmin，最後放入4°C 保存備用。PCR擴增產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0032] 輪狀病毒檢測：PCR 反應體系：模板 cDNA3. 0 μ L，10XBuffer2. 5 μ L，MgCl2l. OuL， dNTP混合物1. 0 μ L，RAV-VP7引物各1. 0 μ L (引物見表1)，Taq酶（5U/ μ L) 0· 5 μ L，加雙蒸 水補足至25μ L。PCR擴增條件為：95°C預變性5min，95°C變性lmin，55°C退火lmin，72°C 延伸lmin，共進行30個循環，然後72°C後延伸lOmin，最後放入4°C保存備用。PCR擴增產 物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測。
[0033] 表1 F18大腸桿菌和輪狀病毒檢測引物
[0034]
【權利要求】
1. 一種梅山豬高產抗病新品系的培育方法，其特徵在於，該方法包括以下步驟： (1) 採用飼料添加的方法對梅山豬核心群進行F18大腸桿菌感染試驗，根據表型鑑定 的結果，組建梅山豬F18大腸桿菌抗病育種基礎群； (2) 對基礎群中F18大腸桿菌抗性型群體細胞因子白介素2、白介素6、白介素10、白介 素12、腫瘤壞死因子α和γ幹擾素進行濃度測定；通過建立主成分綜合評價模型，根據不 同個體的綜合得分來對梅山豬一般抗病力進行綜合指數選育，同時對繁殖性能、生長速度、 瘦肉率、胴體品質性狀進行檢測和選擇，組建第一個世代； (3) 用群體繼代選育和分子標記輔助選擇的方法，經過4-5個世代，逐步實現既定育種 目標，建立新品系核心群。
2. 根據權利要求1所述的梅山豬高產抗病新品系的培育方法，其特徵在於： 步驟（1)所述的梅山豬F18大腸桿菌抗病育種基礎群的組建方法具體是： 1) 選取的健康的35日齡梅山仔豬自由飲水，按照斷奶仔豬的營養需求飼餵含有21. 7% 粗蛋白的顆粒飼料，飼料中不含有任何抗生素和微生態製劑；每天餵料4次，一次飼料計量 50 g，連續飼餵3天； 2) 採用飼料添加的方法進行F18大腸桿菌感染試驗，將F18大腸桿菌菌株與飼料混合 飼喂，每頭豬每天接受F18菌株的平均劑量是4. 6 X 108 CFU，連續進行10天，每天對豬的糞 便採集進行檢測，以"正常"、"糊狀"、"水樣"對糞便的粘稠度進行記錄； 3) 對感染試驗後個體的大腸桿菌F18抗性/易感性進行進一步驗證，結合常規選種的 標準，選留感染試驗後表型一直為"正常"的個體，並且在相同飼養管理環境條件下按家系 分開飼養，組建梅山豬F18大腸桿菌抗病育種基礎群。
3. 根據權利要求1所述的梅山豬高產抗病新品系的培育方法，其特徵在於：步驟（2)第 一世代的組建具體是： 1) 將梅山豬F18大腸桿菌抗病育種基礎群繼續一般抗病力性狀的檢測和選擇；對F18 大腸桿菌抗病育種基礎群梅山仔豬在35日齡時採集前腔靜脈血，獲得血清樣品後利用豬 多細胞因子檢測試劑盒對細胞因子IL-2、IL-6、IL-10、IL-12、IFN-α和IFN-γ進行濃度 測定；將上述6個指標數據轉化為標準化Z分值，代入下述綜合選擇指數公式，計算每個個 體或者家系的綜合選擇指數值/7, /7值越大表示該個體或者家系的一般抗病力越強； /}=0·323Ζχ7+ 0.267?^ 0.318Zxj+ 0·379Ζα+ 0.285ZA+ 0·012Ζ々，其中 Ζχ7、Ζχ2、 2^、2^、2^、2&分別為11^-2、11^-6、11^-10、11^-12、正^〇和正^￥測定值的標準化數據； 結合其他性狀的育種目標選留值高的個體； 2) 對一般抗病力強的個體實行五階段選擇，運用BLUP模型進行種豬的遺傳評估：測定 的主要項目有生長速度、活體膘厚、體尺、體型外貌評定、繁殖性能，同時剔除出現遺傳損徵 的個體；通過測定和評定，選留符合育種目標的個體； 第一次選擇階段：仔公豬在25日齡前初選，仔母豬在40日齡左右，體重約8 - 9Kg ; 第二次選擇階段：公豬在體重約17 -18 Kg，進入測定站前選留，母豬在種豬出售前體 重約20- 25 Kg之間進行，選中母豬進入測定站； 第三次選擇階段：公豬達50 Kg，母豬達60 Kg體重時進行； 第四次選擇階段：公豬體重達80 Kg時； 第五次選擇階段：公母豬年齡一歲半，有2胎產仔成績； 3)公母豬根據綜合指數值及體質外貌鑑定選留，公豬留種率約30%，母豬留種率約 50%，即綜合指數在平均數以上部分；個別數量性狀表現很好，得分在單項總分的90%以上 種豬也可入選。
4.根據權利要求1所述的梅山豬高產抗病新品系的培育方法，其特徵在於：步驟（3)群 體繼代選育的方法是： 1) 運用BLUP模型進行種豬的遺傳評估，結合在梅山豬群體中使用的高繁殖力ESR分子 標記信息，進行育種值估計； 2) 世代選育，不斷穩定遺傳性和主要性狀的一致性，每個世代選留公豬20頭，母豬100 頭；用群體繼代選育和分子標記輔助選擇的方法，經過4-5個世代，逐步實現既定育種目 標。
【文檔編號】A01K67/027GK104186423SQ201410480181
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月18日 優先權日:2014年9月18日
【發明者】包文斌, 趙喬輝, 朱世平, 吳聖龍, 朱國強, 孫壽永, 華金第 申請人:揚州大學