具有增強免疫刺激能力的c類寡核苷酸類似物的製作方法

2023-04-23 12:58:51

專利名稱：：具有增強免疫刺激能力的c類寡核苷酸類似物的製作方法
技術領域：
：本發明大體涉及免疫刺激性核酸、其組合物和使用免疫刺激性核酸的方法。
背景技術：
：細菌DNA具有活化B細胞和自然殺傷細胞的免疫刺激作用，但脊椎動物DNA不行。TokunagaTetal.(1988)/Owcer及es79:682-6;TokunagaTetal.(1984)/iVC772:955-62;MessinaJPetal.(1991)//挑柳朋o/147:1759-64;並有以下綜述Krieg，1998,In:AppliedOligonucleotideTechnology,C.A.SteinandA.M.Krieg,(Eds.)，JohnWileyandSons,Inc.,NewYork,NY,pp.431-448)andKriegAM(2002)Wev/附附聽o/20:709-60。現已知道細菌DNA的這些免疫刺激作用是由於在特定鹼基環境中存在未甲基化的CpG二核苷酸(CpG基序)，這在細菌DNA中常見，但在脊椎動物DNA中它們被甲基化而沒有代表性。KriegAMetal.(1995)7Vfl/""374:546-9;KriegAM(1999)fi/r;c^/附1489:107-16.細菌DNA的免疫刺激作用可用含這些CpG基序的合成寡核苷酸(ODN)模擬。這種CpGODN對人和小鼠白細胞具有高度刺激作用，誘導B細胞增殖；細胞因子和免疫球蛋白分泌；自然殺傷(NK)細胞裂解活性和y幹擾素(IFN-y)分泌；並活化樹突細胞(DC)和其它抗原提呈細胞表達共剌激分子和分泌細胞因子，尤其是對於促進Thl樣T細胞應答重要的Thl樣細胞因子。天然磷酸二酯骨架CpGODN的這些免疫刺激作用是高度CpG特異性的，如果CpG基序被甲基化、改變成GpC或消除或改變，這些作用則大大降低。KriegAMetal.(1995)JVflfMre374:546-9;HartmannGetal.(1999)ProcTV/i//.96:9305-10.早期研究中認為，免疫刺激性CpG基序符合下列通式嘌呤一嘌呤一CpG—嘧啶一嘧啶。KriegAMetal.(1995)Ato"w374:546-9;PisetskyDS(1996)//柳柳朋o/156:421-3;HackerHetal.(1998)五M醜OJ17:6230-40;LipfordGBetal,(1998)7>erfsAf/crc^/o/6:496-500.然而，現已清楚，小鼠淋巴細胞對不符合該"式"的磷酸二酯CpG基序具有非常好的應答(YiAKetal.(1998)//ww""o/160:5898-%6)，並且對於人B細胞和樹突細胞也是如此(HartmannGetal.(1999)7VocA^/v4oirfSd96:9305-10;LiangHetal.(1996)/C7/wJ"ve"98:1119-29)。
發明內容本發明部分涉及含CpG的免疫刺激性寡核苷酸和寡核苷酸類似物，在分子3，端或附近具有反向重複的二級結構。在一定條件下該二級結構參與形成雙鏈體或高級結構。作為本發明寡核苷酸和寡核苷酸類似物的重要特性，反向重複不是嚴格的沃森一克裡克回文，而可以被間插序列或核苷酸類似物中斷。作為本發明寡核苷酸和寡核苷酸類似物的另一個特性，可以修飾骨架以包括策略性放置的核酸酶抗性和核酸酶敏感性核苷酸間連鍵，從而既有利於活性又降低潛在毒性。此外，已發現這些寡核苷酸和寡核苷酸類似物同時具有A類和B類免疫刺激活性，因此被分類為新的C類免疫刺激性核酸分子。本發明部分是基於發明人的這一發現，在分子3，端處或附近含有不完善回文的、含CpG的免疫刺激性寡核苷酸和寡核苷酸類似物在其製備和生物活性上具有某些優點。具體而言，本發明的C類寡核苷酸和寡核苷酸類似物在溶液中特徵性地是單體。據信這些相同核酸分子可以在體外形成分子內雙鏈結構，使之對核酸酶消化更穩定。也相信在核內體區隔內(intraendosomalcompartment)的環境中這些相同核酸分子可以形成分子間雙鏈甚至可能形成高級結構，並在內體中發揮其生物活性。在本發明的一個方面，提供包括式I的免疫刺激性核酸分子的組合物。Z！[(X!Y&)N(X2Y2R2)kZ2]p(S!)qN'(H0…(N2)(N,)S2(Nw)(N淡)…(N^)Z3(式D其中&、Z2和Z3相互獨立地是0-12個核苷酸長的任意序列，其任選地包含非核苷酸連接子或無鹼基dSpacer;X,和X2相互獨立地是含胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤或5-取代尿嘧啶的核苷酸；Y,和Y2相互獨立地是胞嘧啶(C)或修飾胞嘧啶；R和R2相互獨立地是鳥嘌呤(G)或修飾鳥嘌呤；N和N，相互獨立地是0-12個核苷酸長的任意序列，其任選地包含非核苷酸連接子或無鹼基dSpacenSt是非核苷酸連接子、15無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元，任選地提供2，5，-、5，5，-、3'3'-、2'2'-或2'3'-核苷間連鍵；S2是l-10個核苷酸長的任意非迴文序列或非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元；N,、N2、…和N^、N2#、…N^分別是任意核苷酸或修飾核苷酸，其中Ni與N^形成鹼基對、N2與N;^形成鹼基對、…&與N^形成鹼基對；k是0-5的整數；II是2-16的整數；p是1-6的整數；q是0-10的整數，並且其中當(N。…(N2)(N0S2(Nw)(N^)…(N一是10-42個核苷酸長時，S2是4-10個核苷酸長，S2包含非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元，和/或(Nn)…(N2)(N0S2(Nw)(N^)…(N一具有小於2/3的GC含量。在一個實施方案中，、N2、…Nn和N^、N2#、…N^分別選自C、G或其修飾物，其中C與G鹼基配對。在一個實施方案中，N,、N2、…Nn和N^、N2#、…N^分別選自T、A或其修飾物，並且T與A鹼基配對。在這些和其它實施方案中，C、G、A和T分別能表示具有對應鹼基胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶的脫氧核苷酸。在一個實施方案中，Ni、N2、…Nn和N1#、N2#、…N^分別選自C、T、A、G或其修飾物，並且C與G鹼基配對，T與G鹼基配對，A與T鹼基配對，A與G鹼基配對。在一個實施方案中，、N2、…Nn和N^、N2#、…N^分別選自形成沃森一克裡克鹼基對的未修飾或修飾核苷酸，即各鹼基對-N^、N2-N2#、…Nn-N^是沃森一克裡克鹼基對。在一個實施方案中，各N,、N2、…Nn禾PN^、N2#、…N^中至少一個選自形成非沃森一克裡克鹼基對的未修飾或修飾核苷酸，即至少一個鹼基對N,-Nw、N2-N^、…No-N^是非沃森一克裡克鹼基對。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包括具有至少一個磷酸二酯鍵的部分穩定化骨架。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包括具有至少一個穩定化核苷酸間連鍵的骨架。在一個實施方案中，所述寡核苷酸的核苷酸間連鍵都是硫代磷酸酯鍵。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包括具有磷酸二酯鍵的部分穩定化骨架，所述磷酸二酯鍵連接Yjl^或Y2R2的至少一個。在一個實施方案中，K是C。在一個實施方案中，Ri是G。在一個實施方案中，Y,是C，R,是G。在一個實施方案中，^或X2是T。在一個實施方案中，Xi是T，X2是T，Yj是C，R是G，k是l。在一個實施方案中，X、是T，X2是T，Yt是C，R是G，k是l，p是l，N和N，和Z3分別含0個核苷酸，並且Z2是TTTT或d(UUUU)，其中d(UUUU)代表dU麵UdU艮口(脫氧U)4。在一個實施方案中，S2是非核苷酸連接子。在一個實施方案中，S2含至少一個無鹼基dSpacer殘基。在一個實施方案中，所述寡核苷酸包括至少一個帶分支的非核苷連鍵。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包括至少一個雙體(dmibler)單元、至少一個三體(trebler)單元，或至少一個雙體單元和至少一個三體單元。在一個實施方案中，S,是雙體單元或三體單元。在一個實施方案中，所述寡核苷酸包括至少一個2，5，-、5，5，-、3，3，-、2，2，-或2，3，-核苷間連鍵。在一個實施方案中，式I的免疫剌激性核酸分子不是反義核酸。在本發明的一個方面，提供式II的免疫刺激性核酸分子。Z！(Nn)(N^)…(N2)(N,)S2(NwKN2j!(》.,(Nn-1#)(Nn#)(S,)qZ3[(X，Y,R!)N(X2Y2R2)kZ2]p(式II)其中Z,、Z2和Z3相互獨立地是0-12個核苷酸長的任意序列，其任選地包含非核苷酸連接子或無鹼基dSpacer;X!和X2相互獨立地是含胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤或5-取代尿嘧啶的核苷酸；Y,和Y2相互獨立地是胞嘧啶(C)或修飾胞嘧卩定；R,和R217相互獨立地是鳥嘌呤(G)或修飾鳥嘌呤；N是0-12個核苷酸長的任意序列，其任選地包含非核苷酸連接子或無鹼基dSpacer;S,是非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元，任選地提供2，5，-、5，5，-、3，3，-、2'2，誦或2'3'-核苷間連鍵；S2是l-10個核苷酸長的任意非迴文序列或非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元；N2、…N^、Nn和N^、N2#、…Nn^、N^分別是任意核苷酸或修飾核苷酸，其中與Nw形成鹼基對、N2與&#形成鹼基對、…Nw與N禱形成鹼基對，Nn與N^形成鹼基對；k是0-5的整數；n是2-16的整數；p是1-6的整數；q是0-10的整數，並且其中當(N。…(N2)(N0S2(Nw)(N^)…(N一是10-42個核苷酸長時，S2是4-10個核苷酸長，Sz包含非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元，和/或(Nn)…(N2)(N,)S2(Nw)(N加)…(N一具有小於2/3的GC含量。在一個實施方案中，Z"Nn)(N^)是TYR，其中Y是胞嘧啶或修飾胞嘧啶，R是鳥嘌呤或修飾鳥嘌呤。在一個實施方案中，N,、N2、…Nw、Nn和N^、N2#、Nn-1#、&#分別選自C、G或其修飾物，其中C與G鹼基配對。在一個實施方案中，Nj、N2、…Nn.i、Nn禾BN^、N2#、…Nn.w、N^分別選自T、A或其修飾物，並且T與A鹼基配對。在這些和其它實施方案中，C、G、A和T分別能表示具有對應鹼基胞嘧啶、鳥嘌呤、腺嘌呤和胸腺嘧啶的脫氧核苷酸。在一個實施方案中，N"N2、…N^、No和Nw、N2#、…Nn.w、N^分別選自C、T、A、G或其修飾物，並且C與G鹼基配對，T與G鹼基配對，A與T鹼基配對，A與G鹼基配對。在一個實施方案中，M、N2、…N"、Nn和N^、N2#、一^.|#、N^分別選自形成沃森一克裡克鹼基對的未修飾或修飾核苷酸，即各鹼基對N,-N^、N2-N^、Nn-N#是沃森一克裡克鹼基對。在一個實施方案中，各Nt、N2、…N^、Nn和N^、N2#、…Nn^、N^中至少一個選自形成非沃森一克裡克鹼基對的未修飾或修飾核苷酸，即至少一個鹼基對NrN1#、N2-N2#、…Nn-N^是非沃森-克裡克鹼基對。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包括具有至少一個磷酸二酯鍵的部分穩定化骨架。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包括具有至少一個穩定化核苷酸間連鍵的骨架。在一個實施方案中，所述寡核苷酸的核苷酸間連鍵都是硫代磷酸酯鍵。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包括具有磷酸二酯鍵的部分穩定化骨架，所述磷酸二酯鍵連接KRi或Y2R2的至少一個。在一個實施方案中，K是C。在一個實施方案中，Ri是G。在一個實施方案中，Y,是C，！^是G。在一個實施方案中，X,或X2是T。在一個實施方案中，X,是T,X2是T，Yi是C,R,是G，k是l。在一個實施方案中，X!是T,X2是T，Y,是C，R,是G，k是l，p是l，N和N，和Z3分別含0個核苷酸，並且Z2是TTTT或d(UUUU)，其中d(UUUU)代表(脫氧U)4。在一個實施方案中，S2是非核苷酸連接子。在一個實施方案中，S2含至少一個無鹼基dSpacer殘基。在一個實施方案中，所述寡核苷酸包括至少一個帶分支的非核苷連鍵。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包括至少一個雙體單元、至少一個三體單元，或至少一個雙體單元和至少一個三體單元。在一個實施方案中，S,是雙體單元或三體單元。在一個實施方案中，所述寡核苷酸包括至少一個2，5，-、5，5，-、3，3，-、2，2，-或2，3，-核苷間連鍵。在一個實施方案中，式I的免疫剌激性核酸分子不是反義核酸。在本發明的一個方中，提供式III的免疫刺激性核酸分子。(z，)mz3(s3)(式m)其中Z，是Zi〖(X!Y!R0N(X2Y2R2)!cZ2]p(S!)qN'(Nn).…(N3)(N2)(N0S2(Nw)(N效)(N站)…(H^;Zi、Z2和Z3相互獨立地是0-12個核苷酸長的任意序列，其任選地包含非核苷酸連接子或無鹼基dSpacer;X！和X2相互獨立地是含胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤或5-取代尿嘧啶的核苷酸；Yt和Y2相互獨立地是胞嘧卩定或修飾胞嘧啶；R,和R2相互獨立地是鳥嘌呤或修飾鳥嘌呤；N和N，互相獨立地是0-12個核苷酸長的任意序列，其任選地包含非核苷酸連接子或無鹼基dSpacer;S,是非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元，任選地提供2，5，-、5，5，-、3'3'-、2'2'-或2'3'-核苷間連鍵；S2是l-10個核苷酸長的任意非迴文序列或非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元；S3是直接或間接的2'5'-、5'5'-、3'3'-、2'2'-或2'3'-核苷間連鍵或非核苷酸連接子，所述非核苷酸連接子包括無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元，有助於m序列部分的2，5，-、5，5，-、3，3，-、2，2，-或2，3，-連鍵；N,、N2、…Nn和Nw、N2#、…N^分別是任意核苷酸或修飾核苷酸，其中M與Nw形成鹼基對、N2與N^形成鹼基對、…Nn與N^形成鹼基對；k是0-5的整數；m是2-10的整數；！1是2-16的整數；p是l-6的整數；q是0-10的整數。在某些實施方案中，Zl[(XiYiKi)N(^Y^》kZ^p(S^是非迴文序列。在某些實施方案中，Z"(X!Y!R!)N(X2Y2R2)fcZ2]p(S0q是TCGTCGTTTT(SEQIDNO:40)，TCGTCGTTLL,TCGATCGAC，TCGACGTC或TCGACGTCG,其中L是dSpacer。在某些實施方案中，&'[(XiY!R!)N(X2Y2R2)kZ2]p(S^是迴文序列。在某些實施方案中，Zi[(XiYiRi)N(X2Y2R2)kZ2]p(S,)q是TCGACGTCGA(SEQIDNO:19)或TCGTCGACGA(SEQIDNO:34)。在某些實施方案中，ZlK^Yi111)N(X2Y2R2)kZ2]p(Si)q是TCGCGACGTT(SEQIDNO:26)或TCGCGTCGTT(SEQIDNO:69)。在一個實施方案中，(Nn)…(N2)(NDS2(NwO(NM)…(N一Z3包含序列AGCGAAGCT，CAATATTTATTG(SEQIDNO:l)，CCGTTTTGTGG(SEQEDNO:2)，CGGCGCCGTGCCG(SEQIDNO:19)，CGGCGCCGTTGCCG(SEQIDNO:34)，CGGCGLLCGCCG(SEQIDNO:5),CGGCGLLLTGCCG(SEQIDNO:6)，CGGCGGLLCCGCCG(SEQIDNO:7)，CGGCGTCGCCGCCG(SEQIDNO:8)，CGTCGACGGGACGGG(SEQIDNO:10)，CGTCGACGTGACGGG(SEQIDNO:l1)，GAGAGTTGGGCTCTC(SEQIDNO:12),GTCGAGGAGGT(SEQIDNO:14),TAATALLTATTA(SEQIDNO:15)，TAATATCCATTA(SEQIDNO:16)或TAATATTTATTA(SEQIDNO:17)，其中L是dSpacer。在一個實施方案中，(Nn)…(N2)(N!)S2(N^)(N站)…(Nn/0包含序列GGCGCGCTGCCG(SEQIDNO:13)。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包含序列TCGACGTCGACCGTTTTGTGG(SEQIDNO:20)，TCGACGTCGACGGGACGGG(SEQIDNO:21),TCGACGTCGACGTGACGGG(SEQIDNO:22)，TCGACGTCGAGAGTTGGGCTCTC(SEQIDNO:23),TCGACGTCGAGCGAAGCT(SEQIDNO:24)或TCGACGTCGAGGAGGT(SEQIDNO:25)。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包含序列TCGTCGTTLLACGGCGCCGTGCCG(SEQIDNO:37)，TCGTCGTTLLACGGCGLLLTGCCG(SEQIDNO:38),TCGTCGTTLLCGGCGCGGCGCCG(SEQIDNO:39)，TCGTCGTTTTACGGCGCCGTTGCCG(SEQIDNO:44),TCGTCGTTTTACGGCGLLLTGCCG(SEQIDNO:45)，TCGTCGTTTTACGGCGTTTTGCCG(SEQIDNO:49)，TCGTCGTTTTCAATATTTATTG(SEQIDNO:50)，TCGTCGTTTTCGGCGLLCGCCG(SEQIDNO:52),TCGTCGTTTTCGGCGGLLCCGCCG(SEQIDNO:54)，TCGTCGTTTTCGGCGTCGCCGCCG(SEQIDNO:55)'TCGTCGTTTTTAATALLTATTA(SEQIDNO:57),TCGTCGTTTTTAATATCCATTA(SEQIDNO:58)或TCGTCGTTTTTAATATTTATTA(SEQIDNO:59)，21其中L是dSpacer。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包含序列TCGCGTCGTTCGGCGCGCTGCCG(SEQIDNO:30)o在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包含序列TCGCGACGTTCGGCGCGCTGCCG(SEQIDNO:27)。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包含選自以下的序列-T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C—G*G*C—G*C*C_G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)'T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*A*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:42)，T*C*G*T*C*G*C*T*T*T*G*C*G*A*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:36),T*c*G*T*C*G*C*C*C*G*G*C*G*A*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:35)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*T*G*C*C*G(SEQIDNO:44)'T*C*G*T*C*G*T*T*L*L*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:37)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*L*L*L*T*G*C*C*G(SEQIDNO:45),T*C*G*T*C*G*T*T*L*L*A*C*G*G*C*G*L*L*L*T*G*C*C*G(SEQIDNO:38)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*L*L*C*C*G*C*C*G(SEQIDNO:54)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*T*C*G*C*C*G*C*C*G(SEQIDNO:55)，T*C*G*T*C*G*T*T*L*L*C*G*G*C*G*C*G*G*C*G*C*C*G(SEQIDNO:39)，T*c*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*L*L*C*G*C*C*G(SEQIDNO:52)，T*c*G*T*C*G*T*T*T*T*T*A*A*T*A*T*T*T*A*T*T*A(SEQEDNO:59)，T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*T*A*A*T*A*T*T*T*A*T*T*A(SEQIDNO:59),T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*C*A*A*T*A*T*T*T*A*T*T*G(SEOIDNO:50、.T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*T*A*A*T*A*T*C*C*A*T*T*A(SEQIDNO:58)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*A*A*T*A*L*L*T*A*T*T*A(SEQIDNO:57)，T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*L*L*L*T*G*C*C*G(SEQIDNO:45),T*C*G*T*C—G*T*T*L*L*A*C*G*G*C*G*L*L*L*T*G*C*C*G(SEQIDNO:38)，和T*c*G*T*C—G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*L*L*C*C*G*C*C*G(SEQIDNO:54),其中L是dSpacer,*是硫代磷酸酯，—是磷酸二酯。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包含選自以下的序列-T*C*G*A*C*G*T*C*G—A_C*G*G*G*A*C*G*G*G(SEQIDN0:21)，T*C*G*A*C*G*T*C*G—A—C*G*T*G*A*C*G*G*G(SEQIDNO:22)，T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C^G*G*G*A*C*G*G*G(SEQEDN0:21)，T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*G*G*A*G*G*T(SEQIDNO:25),T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*G*C*G*A*A*G*C*T(SEQIDNO:24)，T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*C*G*T*T*T*T*G*T*G*G(SEQIDNO:20),和T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*G*A*G*T*T*G*G*G*C*T*C*T*C(SEQIDNO:23),其中*是硫代磷酸酯，—是磷酸二酯。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包含選自以下的序列T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G*T*G*A*C*G*T*G,(SEQIDNO:62)，t*C*g*A*C*G*T*C*G*A*C*G*T*G*A*C*G(seqIDNO:61),T*C—G*T*C_G*A*C—G*T*T*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:65),T*C*G*T*C—G*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:66),T*C*G*T*C_G*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:67)，T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G*T*G*A*C*G*T*T(SEQIDNO:63),T*C*G*T*C_G*A*C—G*A*T*C—G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:64):T*C*G*T*C*G*A*C*G*A—T—C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:64):T*C*G*A*C—G*T*C*G*A*C—G*T*G*A*C*G*T*T(SEQIDNO:63)，T*C*G*A*C—G*T*C*G*A*C*G*T_G*A*C*G*T*T(SEQIDNO:63)，禾口T*C*G*T*C—G*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G*T(SEQIDNO:68),其中*是硫代磷酸酯，—是磷酸二酯。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包含選自以下的序列T*C*G*C_G*T*C*G*T*T*C—G*G*C*G*C—G*C*T*G*C*C*G(SEQIDNO:30),T*C*G_C*G*T*C*G*T*T*C—G*G*C*G*C—G*C*T*G*C*C*G(SEQIDNO:30),和T*C*G*C*G—T*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C—G*C*T*G*C*C*G(SEQIDNO:30)，其中*是硫代磷酸酯，—是磷酸二酯。在一個實施方案中，所述免疫剌激性核酸分子包含序列T*C*G*C_G*A*C*G*T*T*C—G*G*C*G*C_G*C*T*G*C*C*G(SEQIDNO:27),其中*是硫代磷酸酯，—是磷酸二酯。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包含選自以下的序列t*c—g*t*c*g*t*t*t*t*a*c*g*g*c*g*t*c*g*t*g*c*c*g(seqidno:48t*c_g*t*c*g*t*t*t*t*a*c*g*g*c*g*t*c*g*c*g*c*c*g(seqidno:47)，和t*c—g*t*c*g*t*t*t*t*a*c*g*g*c*g*t*c*g*c*g(seqidno:46)，其中*是硫代磷酸酯，一是磷酸二酯。在一個實施方案中，所述免疫刺激性核酸分子包含序列t*c_g*t*c*g*t*t*t*t*a*c*g*g*c*g*t*c*g*t*g*c*c*g(seqidno:48),其中*是硫代磷酸酯，_是磷酸二酯。在一個實施方案中，所述免疫剌激性核酸分子包括序列t*c—g*g*c*g*c*c—g*t*g*c*c*g*t*c*g*t*c—g*t*t*t(seqidno:33),其中*是硫代磷酸酯，一是磷酸二酯。在一個實施方案中，所述寡核苷酸中至少一個核苷酸是取代或修飾的嘌呤或嘧啶。在一個實施方案中，所述取代嘧疲是C5-或C6-取代的嘧啶。在一個實施方案中，所述取代嘌呤是C8-或C7-取代的嘌呤。在一個實施方案中，所述取代或修飾嘌呤或嘧啶選自5-取代胞嘧啶、6-取代胞嘧啶、n4-取代胞嘧啶、5-氮雜胞嘧啶、2-巰基-胞嘧啶、異胞嘧啶、假-異胞嘧啶、帶稠環系統的胞嘧啶類似物和尿嘧啶衍生物、胸腺嘧啶衍生物、7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜-7-取代鳥嘌呤、7-去氮雜-8-取代鳥嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-取代鳥嘌呤、5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑並[4，5-d吡啶-2，7-二酮、2,6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、取代腺嘌昤、8-取代鳥嘌呤和6-硫代鳥嘌呤。在一個實施方案中，所述取代或修飾嘌呤或嘧啶選自5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、6-羥基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-二氟甲基胞嘧啶和未取代或取代5-炔基胞嘧啶、n4-乙基胞嘧啶、n，n，-亞丙基胞嘧啶、吩噁嗪、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、4-硫代尿嘧澱、5-羥基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、4-硫代胸腺嘧啶、6-取代胸腺嘧啶、7-去氮雜-7-(c2-c6)炔基鳥嘌呤、n2-甲基-鳥嘌呤、n6-甲基-腺嘌呤、8-氧雜腺嘌呤、8-羥基鳥嘌呤和8-溴鳥嘌呤。在一個實施方案中，所述取代或修飾嘌呤或嘧啶選自通用鹼基、芳環系統、芳環系統和氫原子(dSpacer)。在一個實施方案中，所述取代或修飾嘌呤或嘧啶選自4-甲基吲哚、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、P鹼基(P-base)和K鹼基(K-base)、苯並咪唑、二氯苯並咪唑、1-甲基-lH-[l，2，4三唑-3-羧醯胺、氟苯和二氟苯。在一個實施方案中，N、S、X、或Z中任意一個被選自下組的殘基取代C6-C30垸基鏈、膽汁酸、膽酸、牛磺膽酸、脫氧膽酸、膽固醇、oleyllitocholkacid、油醯膽烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、類異戊二烯、類固醇、維生素、維生素E、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸酯、甘油三酯、芘類、卟啉類、Texaphyriiie、金剛烷、吖啶、生物素、香豆素、螢光素、羅丹明、德克薩斯紅、地高辛、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基矽垸基、叔丁基二苯基矽烷基、花青染料、花青染料Cy3、花青染料Cy576、Hoechst33258染料、補骨脂素和布洛芬。本發明的一個方面提供免疫刺激性核酸分子，包括(a)5'端，以選自(TCG)nN和RDCGY,Y2N的免疫刺激性基序起始，其中T是胸腺嘧啶，C是未甲基化胞嘧啶，G是鳥嘌呤，R是嘌呤，D不是C，Y,和Y2相互獨立地是嘧啶，n是l-4的整數(包括兩端)，N是0-12個鹼基長的任意序列；(b)3，端，以能形成髮夾或莖環結構的反向重複終止，所述結構包括長2-6個連續鹼基對的富含GC的莖和至少一個未匹配或錯配鹼基；和(c)部分穩定化的骨架，包括至少一個5，-CpG-3，磷酸二酯鍵。在一個實施方案中，富含GC的莖是2個連續鹼基對長。在一個實施方案中，富含GC的莖是3個連續鹼基對長。在一個實施方案中，富含GC的莖是4個連續鹼基對長。在一個實施方案中，富含GC的莖是5個連續鹼基對長。在一個實施方案中，富含GC的莖是6個連續鹼基對長。在一個實施方案中，富含GC的莖包括至少2個G-C鹼基對。在一個實施方案中，富含GC的莖包括至少3個G-C鹼基對。在某些實施方案中，所述至少一個未匹配或錯配的鹼基是T。在一個實施方案中，所述包括至少一個5'-CpG-3，磷酸二酯鍵的部分穩定化的骨架還包括多個核苷酸間硫代磷酸酯鍵。在一個實施方案中，所述5，端具有序列TCGTCGTTTTA(SEQIDNO:41)。在一個實施方案中，所述以反向重複終止的3，端具有鹼基序列CGGCGCCGTGCCG(SEQIDNO:19)。在一個實施方案中，所述以反向重複終止的3，端具有鹼基序列CGGCGTCGTGCCG(SEQIDNO:9)。在一個方面中，本發明提供具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG(SEQIDNO:43)。在一個方面中，本發明提供具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸TCGTCGTTTTACGGCGTCGTTGCCG(SEQIDNO:48)。在一個方面中，本發明提供具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸T*C—G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)，其中*代表核苷酸間硫代磷酸酯鍵，_代表核苷酸間磷酸二酯鍵。在一個方面中，本發明提供具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C_G*G*C—G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43),其中*代表核苷酸間硫代磷酸酯鍵，_代表核苷酸間磷酸二酯鍵。在一個方面中，本發明提供具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)，其中*代表核苷酸間硫代磷酸酯鍵，_代表核苷酸間磷酸二酯鍵。在一個方面中，本發明提供具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)，其中*代表核苷酸間硫代磷酸酯鍵，_代表核苷酸間磷酸二酯鍵。在一個方面中，本發明提供包括本發明免疫剌激性核酸分子和抗原的疫苗。在一個方面中，本發明提供包括本發明免疫刺激性核酸分子和藥學上可接受的載體的藥物組合物。在一個方面中，本發明提供誘導I型幹擾素(IFN)表達的方法。根據本發明此方面的方法涉及將能表達I型IFN的細胞與本發明的免疫刺激性核酸接觸，所述核酸的量可以有效誘導I型IFN表達。在一個實施方案中，所述I型IFN是幹擾素a(IFN-a)。在一個實施方案中，所述I型IFN是幹擾素P(IFN-P)。在一個方面中，本發明提供誘導y幹擾素(IFN-y)表達的方法。根據本發明此方面的方法涉及將能表達IFN-y的細胞與本發明的免疫刺激性核酸接觸，所述核酸的量可以有效誘導IFN-y表達。在一個方面中，本發明提供活化自然殺傷(NK)細胞的方法。根據本發明此方面的方法涉及將NK細胞與本發明的免疫刺激性核酸接觸，所述核酸的量可以有效活化NK細胞。在一個方面中，本發明提供治療感染的方法。根據本發明此方面的方法涉及向患有感染或有發生感染風險的對象給予本發明的免疫刺激性核酸，所述核酸的量可以有效治療或預防感染。在一個實施方案中，所述對象患有以下感染或有發生以下感染的風險病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染。在一個實施方案中，所述對象患有病毒感染或有發生病毒感染的風險，其中病毒選自B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、乳頭瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)或單純皰疹病毒(HSV)。在一個實施方案中，所述對象患有細菌感染或有發生細菌感染的風險，其中細菌物種選自利什曼蟲屬、利斯特氏菌屬或炭疽。在一個方面中，本發明提供治療變態反應疾病的方法。根據本發明此方面的方法涉及向患有變態反應疾病或有發生風險的對象給予本發明的免疫刺激性核酸，所述核酸的量可以有效治療或預防變態反應疾病。在一個實施方案中，所述變態反應性疾病是變態反應性哮喘。在一個方面中，本發明提供治療癌症的方法。根據本發明此方面的方法涉及向患有癌症或有發生癌症風險的對象給予本發明的免疫刺激性核酸，所述核酸的量可以有效治療或預防癌症。在一個實施方案中，所述癌症選自基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦和中樞神經系統癌症、乳癌、宮頸癌、絨膜癌、結直腸癌、結締組織癌症、消化系統癌症、子宮內膜癌、食管癌、眼癌、頭頸癌、胃癌、上皮內贅生物、腎癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、包括何杰金和非何杰金氏淋巴瘤的淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、直腸癌、腎癌、呼吸系統癌症、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、泌尿系統癌症、或其它癌和肉瘤。在一個實施方案中，所述癌症是對幹擾素a(IFN-a)治療敏感的癌症。在一個實施方案中，對IFN-a治療敏感的癌症選自毛細胞白血病、慢性髓性白血病、皮膚T細胞白血病、多發性骨髄瘤、濾泡淋巴瘤、惡性黑素瘤、鱗細胞癌、AIDS相關卡波希肉瘤(Kaposi'ssarcoma)、腎細胞癌、前列腺癌、宮頸癌或結腸癌。在一個方面中，本發明提供本發明免疫刺激性核酸在製造用於治療感染的藥物中的用途。在一個方面中，本發明提供本發明免疫刺激性核酸在製造用於治療變態反應疾病的藥物中的用途。在一個方面中，本發明提供本發明免疫刺激性核酸在製造用於治療變態反應性哮喘的藥物中的用途。在一個方面中，本發明提供本發明免疫刺激性核酸在製造用於治療癌症的藥物中的用途。對本發明的各種限定能涉及本發明的多種實施方案。因此可以預見，涉及任一種元素或元素組合的對本發明的各種限定可以被包括在本發明的各個方面中。附圖簡述當結合附圖時，可以更容易和完全地理解本發明。提供附圖僅僅是為了示例性目的，並不是理解或實施本發明所必需的。圖1是表示用ODN332、333和334誘導IFN-oc和TLR9信號傳遞的一系列圖。圖2是表示用ODN611、614和620誘導IFN-oc和TLR9信號傳遞的一系列圖。圖3表示一組寡核苷酸刺激的外周血單核細胞(PBMC)中產生IFN-a。圖4表示用lpgB肝表面抗原(HBsAg)和指定量ODN免疫以後抗原特異性總IgG的組平均效價(GMT)。圖5表示用lpgHBsAg和指定量ODN免疫以後抗原特異性各IgG亞型的GMT。圖6表示用lpgHBsAg和指定量ODN免疫以後抗原特異性細胞裂解性T淋巴細胞應答。圖7A表示小鼠神經母細胞瘤腫瘤模型中根據不同ODN處理的存活率。圖7B表示小鼠神經母細胞瘤腫瘤模型中根據不同ODN處理的腫瘤體積。tableseeoriginaldocumentpage30tableseeoriginaldocumentpage31發明詳述本發明在一個方面涉及一種發現，即具有確定二級結構的特異性亞類的CpG免疫刺激性寡核苷酸在介導免疫刺激作用中高度有效。這些CpG核酸可治療性和預防性用於刺激免疫應答，以治療癌症、傳染病、變態反應、哮喘和其它病症，並有助於預防癌症化療後可能的感染。來自CpG刺激的這種強而平衡的細胞和體液免疫應答反映對抗所侵入病原體和癌性細胞的機體自身天然防禦系統。本發明的序列與稱為C類或組合基序CpG寡核苷酸的一類CpG寡核苷酸具有一些結構相似性。見公開PCT國際專利申請W003/015711。與前述C類寡核苷酸相似，本發明的C類CpG寡核苷酸具有確定的5，和3，基序作為分子的一部分。這些前述C類寡核苷酸具有傳統"刺激性"CpG序列和"富含GC的回文"基序，前者通常位於分子的5，端或3，端或與之臨近，後者通常位於分子的另一端或與之臨近。這些組合基序核酸具有的免疫刺激作用落在與傳統"B類"CpGODN相關的作用和與更近描述的一類免疫刺激性核酸("A類"CpGODN)相關的作用之間，所述"B類"CpGODN是B細胞活化和樹突細胞活化的強誘導劑，所述"A類"CpGODN是IFN-a和NK細胞活化的強誘導劑，但對B細胞和DC活化的誘導相對較差。本發明的新的C類CpG寡核苷酸與前述的C類CpG寡核苷酸也是結構不同的。與前述C類CpG寡核苷酸比較，本發明的免疫刺激性核酸分子特徵在於對位於分子一端的富含GC的回文有非常寬鬆的要求。例如，前述C類寡核苷酸在一個實施方案中包括嚴格或完美的回文，具有至少10個核苷酸長並具有至少2/3的GC含量。在一些實施方案中，前述C類寡核苷酸的回文能包括至多最小數目的連續錯配核苷酸。與前述C類寡核苷酸相比較，本發明的C類寡核苷酸類似物特徵在於回文基序在多種實施方案中能具有少於IO個核苷酸；GC含量在0和小於2/3之間；具有多種核苷酸類似物和取代物，包括缺少任何核鹼基的類型(dSpacer);涉及四個或更多連續核苷酸或取代核苷酸的更長的間插序列，它們不形成沃森一克裡克鹼基配對；及其任意組合。而且在一些實施方案中，兩個或更多分子的3，部分可以通過它們的3，末端連接在一起。已經發現，不具有完美回文的這該新亞類的寡核苷酸仍然能誘導高水平IFN生成，包括I型IFN(如IFN-a、IFN-p)和IFN-y，這與前述的組合基序CpG寡核苷酸相似。"回文"和等價的"迴文序列"在此表示一種核酸序列，其自身完美的逆向互補(即序列如ABCDEE，D，C，B，A，，其中A和A，、B和B，、C和C，、D和D，、以及E和E，是能形成通常的沃森一克裡克鹼基對的鹼基，即G-C、A-T和A-U。在此，嚴格意義上的"回文"不包括不參與形成通常沃森一克裡克鹼基對的間插序列或間插非核苷酸結構。本文的"反向重複"表示不完美的回文，即核酸序列，其中既有能形成通常沃森一克裡克鹼基對的核苷酸，又有不參與形成通常沃森一克裡克鹼基對的核苷酸、核苷酸類似物或其它結構(例如序列如ABCDE-S-E'D'C，B，A，，其中A和A，、B和B，、C和C，、D和D，、以及E和E，是能形成通常的沃森一克裡克鹼基對的鹼基，而S是非迴文序列或非核苷酸連接子或無鹼基連接子(dSpacer))。在某些實施方案中，不參與形成通常沃森一克裡克鹼基對的核苷酸、核苷酸類似物或其它結構打斷完美回文。在某些實施方案中，不參與形成通常沃森一克裡克鹼基對的核苷酸可以與另一個核苷酸形成非沃森一克裡克鹼基對，如G-T。此處的非沃森一克裡克鹼基對是沃森一克裡克鹼基對以外的任意鹼基對，包括但不限於Hoogsteen鹼基對和所謂的擺動性鹼基對。在某些實施方案中，不參與形成通常沃森一克裡克鹼基對的核苷酸是未匹配的，沒有核苷酸鹼基或核苷酸鹼基類似物與之形成沃森一克裡克或非沃森一克裡克鹼基對，如G對dSpacer。在某些實施方案中，不參與形成通常沃森一克裡克鹼基對的核苷酸能與另一核苷酸形成非標準鹼基對，如二氨基吡啶能與黃嘌呤核苷形成鹼基對。在一個實施方案中，所述核酸的5'端始於選自(TCG)nN和RDCGYiYzN的免疫刺激性基序。T是胸腺嘧啶，C是未甲基化的胞嘧啶，G是鳥嘌呤，R是嘌呤，D不是C，Y,和Y2相互獨立地是嘧啶，n是包括l和4在內的l-4之間的整數，N是0-12個鹼基長的任意序列。所述核酸的3'端以能形成髮夾或莖環結構的反向重複終止。術語"終止"表示位於或接近3，端的結構。因此，不完美回文的末端可以位於分子的實際3，端，或者3，端可以包括不是反向重複結構部分的1或多個其他核苷酸。分子的3，端優選包括3個或更少不形成反向重複結構部分的核苷酸，在一個實施方案中，本文中"能形成髮夾或莖環結構的反向重複"表示一種核苷酸序列，它形成2-10個連續鹼基對長的富含GC的莖或髮夾，並包括至少一個未匹配或錯配的鹼基。在具體的實施方案中，富含GC的莖長2、3、4、5、6、7、8、9或10個連續鹼基對。在一些實施方案中，富含GC的莖包括至少2、3或4個G-C鹼基對。在一個實施方案中，本文的"能形成髮夾或莖環結構的反向重複"表示一種核苷酸序列，它形成2-10個連續鹼基對長的富含AT的莖或髮夾，並包括至少一個未匹配或錯配的鹼基。在具體的實施方案中，富含AT的莖長2、3、4、5、6、7、8、9或10個連續鹼基對。在一些實施方案中，富含AT的莖包括至少2、3或4個A-T鹼基對。有些情況下，至少一個未匹配或錯配的鹼基橋接莖或髮夾的末端。通過向莖提供分子中的柔性點而配對鹼基並形成髮夾，這可以允許形成二級結構。作為替代方案，未匹配或錯配鹼基可以在莖中。優選地，如果錯配鹼基在莖中，那麼莖至少是3個鹼基對長。未匹配或錯配鹼基可以是任意核苷酸。在一些實施方案中，未匹配或錯配鹼基是T。位於雙鏈末端的未匹配核苷酸也稱為突出核苷酸或懸垂端，它能顯著穩定雙鏈體形成或髮夾形成。FreierSMetal.(1983)Effectsof3'danglingendstackingonthestabilityofGGCCandCCGGdoublehelixes.22:6198-206.所述核酸也包括含至少一個5'-CpG-3'磷酸二酯鍵的部分穩定化的骨架。在一些實施方案中，分子的雙鏈部分也可以含有非天然(非標準)鹼基對(如，二氨基吡啶與黃嘌呤核苷配對)。LutzMJetal.(1998)Recognitionofanon-standardbasepairbythermostableDNApolymerases.MerfOe/w丄e"8:1149-52所述式定義表現優異免疫刺激特性的該類CpG寡核苷酸的亞組。在所述式中，5'表示寡核苷酸的游離5'端，3'表示寡核苷酸的游離3'端。寡核苷酸可具有一個或多個可接近的5，或3，端。在一些實施方案中，3，端可以與另一個3，端連接。因為5，和3，基序的重要性已經被發現並在此處描述，也可能創建具有兩個這種5'或3，端的修飾寡核苷酸。例如，這可以通過用3'-3'鍵連接兩個寡核苷酸而產生具有兩個可接近5'端的寡核苷酸。3'3'-或5'5'鍵可以是磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵或任意其它修飾的核苷酸間橋。實現這種連接的方法在本領域已知。例如，這種連接已經描述於SeligerHetal.(1991)Oligonucleotideanalogswithterminal3'-3'-and5'-5'-internueleotidiclinkagesasantisenseinhibitorsofviralgeneexpression,7VwcfewV/es<67V"c/eW/fifes10:469-77禾口JiangZetal.(1999)Pseudo-cyclicoligonucleotides:invitroandinvivoproperties,AferfOre柳7:2727-35。另外地，可以用另外的間隔如三-或四-乙二醇磷酸酯基團來製備3，-或5，-末端核苷間連鍵不是磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵或其它修飾橋的3'-3'-連鍵或5、5'-連鍵的ODN(DurandMetal.(1992)Triple-helixformationbyanoligonucleotidecontainingone(dA)12andtwo(dT)12sequencesbridgedbytwohexaethyleneglycolchains,醜/oc/^附/s,^31:9197-204;U.S.Pat.No.5,658,738;和U.S.Pat.No.5,668,265)。作為替代方案，通過使用常規的亞磷醯胺(phosphoramidite)化學，非核苷酸連接子可以衍生自乙二醇、丙二醇或無鹼基脫氧核糖(dSpacer)單元(FontanelMLetal.(1994)StericalrecognitionbyT4polynucleotidekinaseofnon-nucleosidicmoieties5，-attachedtooligonucleotides,7V"c/e/c及es22:2022-7)。所述非核苷酸連接子可以摻入一次或多次、或互相組合，以允許待連接的兩個ODN的3'端之間任意期望距離。本文中"非核苷酸連接子"表示不是核苷酸或其聚合物(即多核苷酸)的任意連接元件，其中核苷酸包括嘌呤或嘧啶核鹼基和糖磷酸。非核苷酸連接子因而包括無鹼基核苷酸(dSpacer),即其中核鹼基被氫原子取代的核苷酸樣糖磷酸單元。非核苷酸連接子可以是聚乙二醇，包括但不限於三乙二醇和六乙二醇。在一些實施方案中，所述寡核苷酸具有以下結構之一TCGTCGTTTTA(SEQIDNO:41),CGGCGCCGTGCCG(SEQE)NO:19)，CGGCGTCGTGCCG(SEQEDNO:9)，TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG(SEQIDNO:43),TCGTCGTTTTACGGCGTCGTGCCG(SEQIDNO:48)，T*C—G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C_G*G*C—G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)，和T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)。符號*表示存在穩定化的核苷酸間連鍵，_表示存在磷酸二酯鍵。所述免疫刺激性寡核苷酸一般長6-100個核苷酸。在一些實施方案中，長度範圍是6-40、13-100、13-40、13-30、15-50或15-30個核苷酸或其間的任意整數範圍。術語"核酸"和"寡核苷酸"可互換使用，表示多核苷酸(即包括與磷酸基以及可互換的有機鹼連接的糖(如核糖或脫氧核糖)的分子，所述有機鹼是取代嘧啶(如胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)或尿嘧啶(U))或取代嘌呤(如腺嘌呤(A)或鳥嘌呤(G))。本文中術語"核酸"和"寡核苷酸"表示寡聚核糖核苷酸以及寡聚脫氧核糖核苷酸。術語"核酸"和"寡核苷酸"也包括多聚核苷(即去除磷酸的多核苷酸)和任意的其它含有機鹼的聚合物。核酸分子可以從已有核酸來源(如基因組DNA)獲得，但優選是合成的(如經核酸合成產生)。本文中術語"核酸"和"寡核苷酸"包括本發明的核酸分子和寡核苷酸，以及本發明的寡核苷酸類似物。本文中術語"寡聚脫氧核糖核苷酸"和等價的"ODN"包括本發明的未修飾寡聚脫氧核糖核苷酸以及本發明的寡聚脫氧核糖核苷酸類似物。術語"核酸"和"寡核苷酸"也包括具有取代或修飾的核酸或寡核苷酸，如在鹼基和/或糖中具有取代或修飾。例如，它們包括具有這種糖骨架的核酸，其中糖與2'位羥基以外和5，位磷酸基或羥基以外的低分子量有機基團共價連接。因此，修飾核酸可以包括2，-0-烷基化核糖基團。此外，修飾核酸可以包括諸如阿拉伯糖或2，-氟阿拉伯糖的糖來代替核糖。因此所述核酸在骨架組成上可以是異質的，其中含有連接在一起的聚合物單元的任何可能組合，如肽一核酸(它具有肽樣骨架和核酸鹼基)。其它實例在下面更詳細描述。與包括磷酸二酯核苷間橋、卩-D-核糖單元和/或天然核苷鹼基(腺嘌呤、鳥嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、尿嘧啶)的天然RNA和DNA相比，本發明的免疫刺激性寡核苷酸可以包括多種化學修飾和取代。化學修飾的實例對本領域技術人員已知，例如已經描述於UhlmaimEetal.(1990)C7ie柳及ev卯:543;"ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs''SynthesisandProperties&SynthesisandAnalyticalTechniques,S.Agrawal,Ed，HumanaPress,Totowa，USA1993;CrookeSTetal.(1996)及evi^flr柳腳/7bjdco/36:107-29;禾口HunzikerJetal.(1995)Morf爭幼Af"歸s7:331-417。根據本發明的寡核苷酸可以具有一個或多個修飾，與由天然DNA或RNA組成的相同序列的寡核苷酸相比，其中各個修飾位於特定磷酸二酯核苷間橋和/或位於特定卩-D-核糖單元和/或位於特定天然核苷鹼基位置。例如，所述寡核苷酸可以包括一個或多個修飾，其中各個修飾相互獨立地選自a)位於核苷3'和/或5'端的磷酸二酯核苷間橋被修飾的核苷間橋替換，b)位於核苷3'和/或5'端的磷酸二酯核苷間橋被去磷橋替換，c)糖磷酸骨架的糖磷酸單元被另一個單元替換，d)卩-D-核糖單元被修飾糖單元替換，和e)天然核苷鹼基被修飾核苷鹼基替換。以下是寡核苷酸化學修飾的更詳細實例。所述寡核苷酸可以包括修飾的核苷酸間連鍵，如以上a和b所述。這些修飾鍵可以是部分抗降解的(如被穩定化)。"穩定化的寡核苷酸分子"意思是指由這些修飾導致的對體內降解(如經核酸外切酶或核酸內切酶)的相對抗性。在一些實施方案中，具有硫代磷酸酯鍵的寡核苷酸可以提供最大活性，保護寡核苷酸免受細胞內的核酸外切酶或核酸內切酶的降解。位於核苷3'和/或5'端的磷酸二酯核苷間橋可以用修飾的核苷間橋替換，其中修飾的核苷間橋例如選自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、NR'R、氨基磷酸酯、boranophosphate、a-羥苯甲基膦酸酯、磷酸-(CVC20-O-垸基酯、磷酸-[(CVd2)芳基-((:廣(:21)-0-烷萄酯、(d-C8)烷基膦酸酯和/或(C6-d2)芳基膦酸酯橋、(c"d2)-a-羥甲基-芳基(如公開於wo95/01363),其中(cvQ2)芳基、(0(:2)芳基和(<:6-(:14)芳基任選地被滷素、烷基、垸氧基、硝基、氰基取代，並且其中Ri和RZ相互獨立地是氫、(d-C,8)-垸基、(C6-C2Q)-芳基、(C6-d4)芳基-、(d-Cs)垸基，優選氫、(C,-Q)烷基，優選(Q-C4)垸基和/或甲氧基乙基，或W和W與攜帶它們的氮原子一起形成5-6員雜環，雜環另外可以含有選自O、S和N的雜原子。位於核苷3，和/或5'端的磷酸二酯橋由去磷橋替換(去磷橋例如描述在UhlmaimEandPeymanAin"MethodsinMolecularBiology",Vol.20，"ProtocolsforOligonucleotidesandAnalogs",S.Agrawal，Ed.，HumanaPress,Totowa1993,Chapter16，pp.355ff)，其中去磷橋例如選自去磷橋formacetal、3，-thioformacetal、甲羥胺、肟、亞甲基二甲基-肼撐、二亞甲基碸和/或矽烷基。所述糖磷酸骨架(即糖磷酸骨架由糖磷酸單元組成)的糖磷酸單元(即P-D-核糖和磷酸二酯核苷間橋一起形成糖磷酸單元)可以被另一個單元替換，其中所述其它單元例如適於構建"嗎啉代衍生"的寡聚物(例如描述於StirchakEPetal.(1989)A^c/e/c^"'A及"17:6129-41)，也就是說，例如由嗎啉代衍生物單元替換；或構建聚醯胺核酸("PNA"，例如描述於NielsenPEetal.(1994)肌oc緒yHgO^附5:3-7)，也就是說，例如由PNA骨架單元如由2-氨基乙基甘氨酸替換。所述寡核苷酸可以具有其它糖骨架修飾和替換，如帶磷酸酯基的肽核酸(PHONA)、被鎖的核酸(lockednucleicacids)(LNA)，和具有帶垸基連接子或氨基連接子的骨架區的寡核苷酸。所述烷基連接子可以是帶分支或未分支的，取代或未取代的，可以是手性純的或外消旋混合物。P-核糖單元或P-D-2'-脫氧核糖單元可以被修飾糖單元替換，其中所述修飾糖單元例如選自(3-D-核糖、a-D-2，-脫氧核糖、L-2，-脫氧核糖、2，-F-2，-脫氧核糖、2，-F-阿拉伯糖、2，-0-(d-C6)垸基-核糖(2，-0-(C!-C6)垸基-核糖優選是2，-0-甲基核糖)、2'-0-(C2-C6)烯基-核糖、2，--核糖、2，-NH2-2，-脫氧核糖、P-D-木-呋喃糖、a-阿拉伯-呋喃糖、2，4-二脫氧-P-D-赤蘚-吡喃己糖和碳環(例如描述於Froehler(1992)■/y4柳C&柳Soc114:8320)和/或開鏈糖類似物(例如描述於Vandendriesscheetal.(1993)rwra/^rfra"49:7223)和/或雙環糖類似物(例如描述於TarkovMetal.(1993)好e/vC7h附爿加76:481)。在一些實施方案中，糖是2，-0-甲基核糖，特別是對於一或兩個都由磷酸二酯或磷酸二酯樣核苷間連鍵而連接的核苷酸。核酸還包括取代嘌呤和嘧啶如C-5丙炔嘧啶和7-去氮雜-7-取代嘌呤修飾鹼基。WagnerRWetal.(1996)NatBiotechnol14:840-4。嘌呤和嘧啶包括但不限於腺嘌呤、胞嘧啶、鳥嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶，以及其它天然與非天然存在的核鹼基、取代和未取代芳香基團。修飾鹼基是與在DNA和RNA通常發現的天然存在鹼基如T、C、G、A和U化學上不同的任意鹼基，但它們與這些天然存在鹼基共有基本化學結構。所述修飾核苷鹼基例如可以選自次黃嘌呤、尿嘧啶、二氫尿嘧啶、假尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-氨基尿嘧啶、5-(d-C6)-烷基尿嘧啶、5-(C2-C6)-烯基尿嘧啶、5-(C2-C6)-炔基尿嘧啶、5-(羥甲萄尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-(d-C6)-烷基胞嘧啶、5-(CVC6)-烯基胞嘧啶、5-(C2-C6)-炔基胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、N、二甲基鳥嘌呤、2，4-二氨基嘌呤、8-氮雜嘌呤、取代7-去氮雜嘌呤優選7-去氮雜-7-取代和/7-去氮雜-8-取代嘌呤、5-羥甲基胞嘧啶、N4-垸基胞嘧啶如N4-乙基胞嘧啶、5-羥基脫氧胞嘧啶、5-羥甲基脫氧胞嘧啶、N4-烷基脫氧胞嘧啶如N4-乙基脫氧胞嘧啶、6-硫代脫氧鳥嘌呤，和硝基吡咯的脫氧核糖核苷、C5-丙炔基嘧啶，以及二氨基嘌呤如2，6-二氨基嘌呤、肌苷、5-甲基胞嘧啶、2-氨基嘌呤、2-氨基-6-氯嘌呤、次黃嘌呤或其它修飾的天然核苷鹼基。修飾鹼基可以摻入本文所述的特定通式中。例如胞嘧啶可以用修飾胞嘧啶替換。本文所用的修飾胞嘧啶是胞嘧啶的天然存在或非天然存在的嘧啶鹼基類似物，它們可以替換該鹼基而不影響所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修飾胞嘧啶包括但不限於5-取代胞嘧啶(如5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-二氟甲基胞嘧啶和未取代或取代的5-炔基胞嘧啶)，6-取代胞嘧啶(如6-羥基胞嘧啶)，N4-取代胞嘧啶(如N4-乙基胞嘧啶)，5-氮雜胞嘧啶、2-巰基胞嘧啶、異胞嘧啶、假異胞嘧啶、帶稠環系統的胞嘧啶類似物(如N，N'-亞丙基胞嘧啶或吩嗨嗪)，和尿嘧啶及其衍生物(如5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、4-硫代-尿嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶)。一些優選的胞嘧啶包括5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶和N4-乙基胞嘧啶。在本發明的另一個實施方案中，胞嘧啶鹼基由通用鹼基(如3-硝基吡咯、P-鹼基)、芳香環系統(如氟苯或二氟苯)或氫原子(dSpacer)替換。鳥嘌呤可以用修飾鳥嘌呤替換。本文所用的修飾鳥嘌呤是鳥嘌呤的天然存在或非天然存在的嘌呤鹼基類似物，它們可以替換該鹼基而不影響所述寡核苷酸的免疫刺激活性。修飾鳥嘌呤包括但不限於7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜-7-取代鳥嘌呤(如7-去氮雜-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤)、7-去氮雜-8-取代鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-取代鳥嘌呤(如N2-甲基鳥嘌呤)、5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑並[4,5-dj嘧啶-2，7-二酮、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、腺嘌呤、取代腺嘌呤(如N6-甲基-腺嘌呤、8-氧雜腺嘌呤)、8-取代鳥嘌呤(如8-羥基鳥嘌呤和8-溴鳥嘌呤)和6-硫代鳥嘌呤。在本發明的另一個實施方案中，鳥嘌呤鹼基被通用鹼基(如4-甲基吲哚、5-硝基吲哚和K-鹼基)、芳香環系統(如苯並咪唑或二氯苯並咪唑、l-甲基-lH-[l，2，4]三氮唑-3-羧醯胺)或氫原子(dSpacer)替換。在一個實施方案中，CG二核苷酸的C和G分別是未修飾的胞嘧啶和鳥嘌呤。在一個實施方案中，CG二核苷酸的C是未甲基化的。對於本發明的應用，本發明的寡核苷酸可以用本領域已知的多種方法中任一種從頭合成，例如(3-氰乙基亞磷醯胺法(BeaucageSLetal.(1981)rWraAerfTOM22:1859);或核苷H-膦酸酯法(Gareggetal.(1986)r"m脇簡27:4051-4;FroehlerBCetal.(1986)iV"c/"c及ey14:5399-407;Gareggetal.(1986)r"r"/^rfra"27:4055-8;Gaffneyetal.(1988)r"raAerfraw29:2619-22)。這些化學可用市場可用的多種自動核酸合成儀實施。這些寡核苷酸被稱為合成寡核苷酸。分離寡核苷酸一般表示與天然狀態下正常結合的組分分離的寡核苷酸。作為實例，分離寡核苷酸可以是從細胞、細胞核、線粒體或染色質分離的一種。修飾骨架如硫代磷酸酯可以用利用氨基磷酸酯或H-膦酸酯化學的自動化技術合成。芳基-和烷基-膦酸酯可以如U.S.Patent.No，4，469，863中所述製備；烷基磷酸三酯(其中帶電氧基團如U.S.Pat.No.5,023,243和EPNo.092,574所述被垸基化)可以通過自動化固相合成用商品試劑製備。已經描述了製造其它DNA骨架修飾和替換的方法(如UhlmannEetal.(19卯)C7ie柳及ev90:544;GoodchildJ(19卯)fi/oomy"gfl,eCAe附1:165)。所述免疫刺激性寡核苷酸還可以在核苷酸或核苷酸類似物結構之間含有一種或多種稀有連鍵。通常的核苷間連鍵是3，5，-連鍵。所有其它連鍵都被認為是稀有核苷間連鍵，如2，5，-、5'5，-、3，3，-、2，2，-、禾卩2，3，連鍵。因而，2，-5，的命名是根據核糖的碳原子。然而，如果使用稀有糖結構如環擴張糖類似物(如己糖、環己烯或吡喃糖)或雙環或三環糖類似物，那麼該命名根據單體的命名而改變。例如在3，-脫氧-(3-D-吡喃核糖類似物(也稱p-DNA)中，單核苷酸經4，2，-連鍵而連接。如果核苷酸含有一個3'3'-連鍵，那麼該寡核苷酸類似物通常具有兩個未連接的5，-端。與之相似，如果核苷酸含有一個5'5，-連鍵，那麼該寡核苷酸類似物通常具有兩個未連接的3，-端。核苷酸的未連接端的可接近性可以是對它們的受體更好接近。兩種類型稀有連鍵(3，3，-和5，5，-)描述於OrtigaoJFetal.(1992)Z)ev2:129-46，其中報導具有3，3'-連鍵的寡核苷酸顯示對核酸酶切割的增強的穩定性。不同類型的連鍵也可以組合在一個分子中，這可以導致寡聚物形成分支。如果寡聚物的一部分經3，3，-連鍵與第二個寡核苷酸部分連接，並經2，3，-連鍵在2，端與所述分子的第三部分連接，這導致例如具有三個5，-端的帶分支的寡核苷酸(3，3，-、2，3，-分支)。寡核苷酸不同部分之間或不同寡核苷酸之間的連接分別可以通過該分子的所有部分發生，只要不負面幹擾受體識別即可。根據核酸的本性，連接可以涉及糖結構(Su)、雜環核鹼基(Ba)或磷酸骨架(Ph)。因此，Su-Su、Su-Ph、Su-Ba、Ba-Ba、Ba-Su、Ba-Ph、Ph-Ph、Ph-Su和Ph-Ba類型的連接是可能的。如果寡核苷酸進一步被某種非核苷酸取代基修飾，連接也可以通過寡核苷酸的修飾部分發生。這些修飾還包括修飾核酸，如PNA、LNA或嗎啉代寡核苷酸類似物。連鍵優選由C、H、N、O、S、B、P和滷素組成，含3-300個原子。具有3個原子的實例是縮醛鍵(ODNl-3，-0-CH2-0-3，-ODN2;FroehlerandMatteucci)，它例如將一個核苷酸的3，羥基連接到第二個寡核苷酸的3，-羥基上。具有約300個原子的實例是PEG-40(tetracontapolyethyleneglycol)。優選的連鍵是磷酸二酯鍵、硫代磷酸酯鍵、甲級膦酸酯鍵、氨基磷酸酯鍵、boranophosphoiiate鍵、醯胺鍵、醚鍵、硫醚鍵、縮醛鍵、硫縮醛鍵、脲鍵、硫脲鍵、磺醯胺鍵、希弗氏鹼鍵和二硫鍵。另一種可倉旨性是使用SolulinkBioConjugationSystem(TriLinkBioTechnologies,SanDiego，CA)。如果寡核苷酸由兩個或更多序列部分組成，這些部分可以相同或不同。因此，在具有3'3'-連鍵的寡核苷酸中，序列可以相同，如5，-ODNl-3'3'-ODNl-5'，或不同，如5，-ODNl-3'3'-ODN2-5'。另外，多種寡核苷酸部分以及連接它們的連接子的化學修飾可以不同。因為端寡核苷酸的吸收似乎比長寡核苷酸更低效，兩個或更多短序列的連接導致更強的免疫刺激。短寡核苷酸的長度優選是2-20個核苷酸，更優選3-16個核苷酸，但最優選5-10個核苷酸。優選的是，連接的寡核苷酸具有兩個或更多未連接的5'-端。寡核苷酸部分序列還可以通過非核苷酸連接子連接，尤其是無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元。其它連接子包括烷氨基連接子，如C3、C6、C12氨基連接子，以及烷基硫醇連接子，如C3或C6硫醇連接子。寡核苷酸還可以用芳香殘基連接，所述芳香殘基可以進一步被垸基或取代垸基取代。寡核苷酸還可以含有雙體或三體單元(GlenResearch,Sterling,VA)，尤其是那些具有3'3'-連鍵的寡核苷酸。在一個實施方案中，雙體單元可以基於1，3-雙-[5-(4,4，-二甲氧基三苯氧基)戊醯胺丙基-2-[(2-氰乙基)-(N，N-二異丙基)卜亞磷醯胺。在一個實施方案中，三體單元可以基於三-2，2，2-[3-(4，4，-二甲氧基三苯氧基)丙氧基甲基乙基-[(2-氰乙基)-(1\^-二異丙基)1-亞磷醯胺的摻入。由多個雙體單元、三體單元或其它多倍單元產生的寡核苷酸分支導致枝狀體(deiidrimer)，這是本發明的進一步實施方案。寡核苷酸還可以含有由肽修飾試劑或寡核苷酸修飾試劑(GleiiResearch,SterlingVA)產生的連接子單元。此外，連接子可以含有由肽(醯胺)鍵連接的一個或多個天然或非天然胺基酸殘基。連接寡核苷酸的另一種可能性是通過交聯雜環鹼基(VermaSetal(1998)ifev別0c/^柳67:99-134;page124)。再一種可能性是一個序列部分的糖結構與另一個序列部分的雜環鹼基之間的連接(Iyeretal.(1999)CtwrMo/7T^ra/;eMrics1:344-58;page352)。含稀有連鍵的不同寡核苷酸用已知方法合成並可以在固相合成期間在線連接在一起。作為替代方案，可以在各部分序列合成以後再將它們連接在一起。在小鼠系統中具有強免疫刺激活性的CpG硫代磷酸酯寡核苷酸對於人和其它非嚙齒類免疫細胞傾向於表現較低活性。含這些(TCG、N或RDCGYiY2N基序的DNA強烈刺激人外周血細胞產生IFN-ot。根據本發明已經發現，所述亞類的CpG免疫刺激性寡核苷酸對於人細胞如PBMC具有強的免疫刺激作用，這提示這些CpG免疫刺激性寡核苷酸是用於人疫苗接種、癌症免疫療法、哮喘免疫療法、免疫功能的一般性增強、放射或化學療法後造血恢復的增強和其它免疫調節性應用的有效治療劑。本文中當用於疾病如傳染性疾病、癌症、變態反應或哮喘時，術語"治療(treat,treated或treating)"表示預防性治療，以增加治療對象對疾病發生(如感染病原體)的抗性，或換句話說，降低治療對象發生疾病(如感染病原體)的概率，以及在對象已經發生疾病以後的治療，以對抗疾病(如降低或消除感染)或預防疾病加重。因此，在本發明的一些方面中，CpG所述免疫刺激性寡核苷酸可用作治療患有變態反應或哮喘、感染傳染性生物或已鑑定到特定癌抗原的癌症或有發生這些疾病風險的對象的疫苗。因此所述CpG免疫刺激性寡核苷酸可以與抗原或變應原一起聯合給予治療對象，用於治療感染、變態反應、哮喘或癌症。作為替代方案和附加方案，所述CpG免疫刺激性寡核苷酸還可以不加抗原或變應原單獨給予，用於抵抗感染、變態反應或癌症，或可以與其它治療劑一起給予。所述CpG免疫刺激性寡核苷酸還可以與其它治療劑一起給予。重複給藥可允許更長保護。本文中處於風險中的對象是具有暴露於引起感染的病原體的任何可識別風險或發生癌症的風險的對象。例如，處於發生感染的風險中的對象可以是計劃到發現特定類型傳染因子的地區旅行的對象，或者可以是由於生活方式或醫學操作要暴露於可能含有傳染性生物的體液或直接暴露於這種生物的對象，或者可以是在已經鑑定了傳染性生物或變應原的地區生活的任何對象。處於發生感染的風險中的對象還包括醫療機構推薦接種特定傳染性生物抗原疫苗的一般人群。如果所述抗原是變應原，對象對該變應原發生變態反應並且對象可能暴露於該抗原，如花粉季節，那麼該對象處於發生變態反應的風險中。處於發生變態反應或哮喘風險的對象包括已鑑定患有變態反應或哮喘但在CpG免疫刺激性寡核苷酸治療期間不具有活躍疾病的對象。處於發生變態反應或哮喘風險的對象還包括由於遺傳或環境因素被認為處於發生這些疾病的風險中的對象。處於發生癌症的風險中的對象是具有發生癌症的高概率的對象。例如這些對象包括具有遺傳異常的對象，這種異常的存在已被證明與發生癌症的較高概率具有相關性；暴露於癌症相關物質如菸草、石棉或其它化學毒素的對象；和之前因癌症被治療並處於明顯好轉的對象。當處於發生癌症的風險中的對象用CpG免疫刺激性寡核苷酸和任選的抗原治療時，所述對象可以在癌細胞發生時將之殺死，其中所述抗原特異性針對所述對象有風險的癌症類型。如果腫瘤開始在對象中形成，所述對象將發生抗該腫瘤抗原的先天性免疫應答或特異性免疫應答。除了CpG免疫刺激性寡核苷酸用於預防性治療的用途以外，本發明還涉及CpG免疫刺激性寡核苷酸用於治療患有感染、變態反應、哮喘或癌症的對象的用途。患有感染的對象是已經暴露於傳染性病原體並且在身體中具有急性或慢性可檢測水平的該病原體的對象。所述CpG免疫刺激性寡核苷酸可與抗原或其它治療劑一起或不一起使用，以引發能夠降低該傳染性病原體的水平或根除該病原體的先天性或抗原特異性、系統性或黏膜免疫應答。本文中傳染性疾病是因身體中存在外來微生物而產生的疾病。特別重要的是開發有效的疫苗策略和治療以保護身體的黏膜表面，這是病原體進入的起始部位。患有變態反應的對象是能對變應原產生變態反應的對象。變態反應表示對物質(變應原)的獲得性超敏性。變態反應疾病包括但不限於溼疹、變應性鼻炎或傷風、枯草熱、結膜炎、支氣管哮喘、變應性哮喘、風疹(蕁麻疹)、食物變態反應和其它特應性疾病。變態反應一般由產生抗無害性變應原的IgE抗體而引起。系統或黏膜給予CpG免疫剌激性寡核苷酸誘導的細胞因子主要是稱作Thl(實例是IL-12、IP-IO、IFN-a和IFN-y)的類型，它們誘導體液免疫應答和細胞免疫應答。其它主要類型的免疫應答與產生IL-4和IL-5細胞因子相關，稱為Th2免疫應答。一般來說，看起來變應性疾病由Th2型免疫應答介導。基於此處所述CpG免疫刺激性寡核苷酸將對象中免疫應答由Th2(與產生IgE抗體和變態反應相關)為主轉移為Th2/Thl平衡的應答(保護抵抗變態反應)的能力，有效劑量的誘導免疫應答的CpG免疫刺激性寡核苷酸可以給予對象以治療哮喘和變態反應。因此，所述CpG免疫剌激性寡核苷酸在治療變態反應疾病和哮喘中具有顯著的治療用途。Th2細胞因子，尤其是IL-4和IL-5，在哮喘對象的氣道中增加。這些細胞因子促進哮喘炎性反應的重要方面，包括IgE同位(isotope)轉換、嗜酸性粒細胞的趨化性和活化和肥大細胞生長。Thl細胞因子，尤其是IFN-y和IL-12,能抑制Th2克隆形成和Th2細胞因子的產生。哮喘是以炎症、氣道狹窄和氣道對吸入因子反應性增加為特徵的一種呼吸系統疾病。儘管不絕對，哮喘經常與特應性或變應性症狀相關。因此，哮喘包括變應性哮喘和非變應性哮喘。患有癌症的對象是具有可檢測水平癌性細胞的對象。癌症可以是惡性或非惡性癌症。癌症或腫瘤包括但不限於膽管癌；腦癌；乳癌；宮頸癌；絨膜癌；結腸癌；子宮內膜癌；食管癌；胃癌；上皮內贅生物；淋巴瘤；肝癌；肺癌(如小細胞和非小細胞肺癌)；黑素瘤；神經母細胞瘤；口腔癌；卵巢癌；胰癌；前列腺癌；直腸癌；肉瘤；皮膚癌；睪丸癌；甲狀腺癌；和腎癌，以及其它癌和肉瘤。在一個實施方案中，癌症是毛細胞白血病、慢性髓性白血病、皮膚T細胞白血病、多發性骨髓瘤、濾泡性淋巴瘤、惡性黑素瘤、鱗狀細胞癌、腎細胞癌、前列腺癌、膀胱細胞癌或結腸癌。對象表示人或脊椎動物，包括但不限於狗、貓、馬、牛、豬、綿羊、山羊、火雞、雞、靈長目如猴，以及魚(水生生物)如鮭魚。因此所述化合物可用於治療人和非人對象中的癌症和腫瘤、感染和變態反應/哮喘。癌症是伴侶動物(如貓和狗)死亡的主要因素之一。當與抗原一起施用CpG寡核苷酸時，對象可能暴露於抗原。本文中術語"暴露於"表示使對象與抗原主動接觸的步驟或者將對象被動暴露於體內抗原。使對象主動暴露於抗原的方法在本領域公知。一般來說，通過任意方式如靜脈內、肌肉內、經口、透皮、黏膜、鼻內、氣管內或皮下給藥，將抗原直接施用於對象。抗原可以系統性或局部施用。施用抗原和CpG免疫刺激性寡核苷酸的方法在下面更詳細描述。如果抗原可以暴露於體內的免疫細胞，則對象被動暴露於抗原。例如可以通過使外來抗原進入體內或通過產生表達外來抗原在其表面上的腫瘤細胞，對象可以被動暴露於抗原。對象被動暴露於抗原的方法可能特別依賴於施用CpG免疫刺激性寡核苷酸的時間方案。例如，在處於發生癌症或傳染病或變態反應或哮喘反應風險的對象中，當該風險最大時，如在變態反應季節期間或暴露於引起癌症的因子之後，可以定期向對象施用CpG免疫刺激性寡核苷酸。另外，可以在旅行者處於暴露於傳染因子的風險中的外地旅行之前，向他們施用CpG免疫刺激性寡核苷酸。類似地，可以向處於暴露於生物戰爭風險中的士兵或平民施用CpG免疫刺激性寡核苷酸，以在對象暴露於抗原時誘導對抗原的系統或黏膜免疫應答。本文所用抗原是能喚起免疫應答的分子。抗原包括但不限於細胞、細胞提取物、蛋白質、多肽、肽、多糖、多糖綴合物、多糖和其它分子的肽和非肽模擬物、小分子、脂、糖脂、碳水化合物、病毒和病毒提取物，以及多細胞生物如寄生蟲和變應原。術語抗原廣義上包括被宿主免疫系統識別為外來物的任何類型的分子。抗原包括但不限於癌抗原、微生物抗原和變應原。本文中癌抗原是與腫瘤或癌症細胞表面結合併且就MHC分子而言當表達於抗原提呈細胞表面時能喚起免疫應答的化合物，如肽或蛋白質。癌抗原可以從癌細胞製備，這可以通過製備癌細胞的粗提取物，例如描述於CohenPAetal.(1994)Omceri^s54:1055-8，通過部分純化該抗原，通過重組技術，或通過從頭合成已知抗原。癌抗原包括但不限於重組表達的抗原、其免疫原性部分或整個腫瘤或癌細胞。這些抗原可以通過重組方式或本領域已知的任何其它方式分離或製備。本文中術語"癌抗原"和"腫瘤抗原"可以互換使用，表示由癌細胞差異表達並因而能被用於靶向癌細胞的抗原。癌抗原是潛在能刺激明顯腫瘤特異性免疫應答的抗原。其中一些癌抗原由正常細胞編碼，儘管不一定表達。這些抗原能被表徵為在正常細胞中正常沉默(即不表達)的抗原、只在某些發育階段表達的抗原和暫時性表達的抗原如胚抗原和胎抗原。其它癌抗原由細胞基因突變體如癌基因(如活化的ras癌基因)、抑制基因(如p53突變體)、由內部缺失或染色體轉位產生的融合蛋白編碼。還有其它癌抗原可以由病毒基因如RNA和DNA腫瘤病毒上攜帶的病毒基因編碼。本文中微生物抗原是微生物的抗原，包括但不限於病毒、細菌、寄生蟲和真菌。這些抗原包括完整微生物及其天然分離物和片段或衍生物，以及與天然微生物抗原相同或相似並誘導對該微生物特異性免疫應答的合成化合物。如果化合物誘導針對天然微生物抗原的免疫應答(體液和/或細胞免疫應答)，則該化合物與天然微生物抗原相似。這些抗原在本領域常規使用並且對本領域普通技術人員是公知的。已經在人中發現的病毒的實例包括但不限於逆轉錄病毒科(如人免疫缺陷病毒如HIV-1(也稱為HTLV-III、LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III;和其它分離物如HIV-LP;小RNA病毒科(例如脊髓灰質炎病毒、A肝病毒、腸病毒、人科薩奇病毒、鼻病毒、人腸道細胞病變孤兒病毒)；Cfl/dv'V7'rf"e(例如引起腸胃炎的毒株)；披膜病毒科(例如馬腦炎病毒、風疹病毒)；黃病毒科(例如登革熱病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；冠狀病毒科(例如冠狀病毒)；W/^6^W/vV/m(例如血管性口腔炎病毒、狂犬病毒)；F/^v/nV/M(例如伊波拉病毒)；副粘病毒科(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞體病毒)；正粘病毒科(例如流感病毒)；布尼亞病毒科(例如漢坦病毒、布尼亞病毒、白蛉熱病毒和Nairo病毒)；沙粒病毒科(出血熱病毒)；呼腸孤病毒科(例如呼腸孤病毒、環狀病毒和輪狀病毒)；5wflwW^e;肝DNA病毒科(B肝病毒)；細小病毒科(細小病毒)；乳多空病毒科(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(多數腺病毒)；皰疹病毒科(單純皰疹病毒(HSV)l和2、水痘帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒(CMV)、皰疹病毒；痘病毒科(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(如非洲豬熱病毒)；和未分類病毒(例如丁型肝炎因子(被認為是B肝病毒的缺陷型衛星病毒)、C型肝炎因子；諾沃克和相關病毒，以及星狀病毒)。革蘭氏陰性和革蘭氏陽性細菌都可以作為脊椎動物的抗原。這樣的革蘭氏陽性細菌包括但不限於巴斯德氏菌屬物種、葡萄球菌屬物種和鏈球菌屬物種。革蘭氏陰性細菌包括但不限於大腸埃希氏菌、假單孢菌屬物種和沙門氏菌屬物種。傳染性細菌的具體實例包括但不限於幽門螺桿菌、伯氏疏螺旋體(必or"Z/fl6H/"grfcy;/eri)、親肺軍團菌(￡eg^"e〃《/j"e"/o/;/7/fl)、分枝桿菌屬物種(例如結核分枝桿菌、鳥分支桿菌、胞內分支桿菌、堪薩斯分支桿菌、戈登分支桿菌)、金黃色葡萄球菌、奈瑟氏淋病雙球菌、腦膜炎奈瑟氏球菌、單核細胞增生性利斯特氏菌、化膿性鏈球菌(A群鏈球菌)、無乳鏈球菌fB群鏈球菌)、鏈球菌淳綠色鏈球菌,糞鏈球菌、牛鏈球菌、鏈球菌Cfl/mew6/c^^)、肺炎鏈球菌、致病性彎曲桿菌屬物種、腸球菌屬物種、流感嗜血桿菌、炭疽芽孢桿菌、白喉棒狀桿菌、棒狀桿菌屬物種、豬丹毒桿菌、產氣莢膜梭狀芽孢桿菌、破傷風梭菌、產氣腸桿菌、肺炎克雷伯氏菌、多殺性巴氏桿菌(/>W"m/tom"/toc/rffl人厭氧桿菌、具核梭桿菌、念珠狀鏈桿菌、梅毒螺旋體、雅司病螺旋體、螺旋體、立克次氏體和以色列放線菌(4cri"owy;c^/srae///)。真菌的實例包括新型隱球菌，莢膜組織胞漿菌、。CC/rf/wVfeS/加m,'他、B/oy勿考c^yrfe附fl"Y/rf/y、C7r/"附j;rf/fl/racAo附fl^/s、Om力V/"fl/6/caws。其它傳染性生物(即原生生物)包括瘧原蟲屬物種如鐮狀瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲、核間日瘧原蟲和鼠弓形體。血源和/或組織寄生蟲包括瘧原蟲屬物種、Bfl6ew'flm/cra"、醜"6es/fl<//vwge"s、熱帶利什曼原蟲、利什曼蟲屬物種、巴西利什曼原蟲、杜氏禾廿什曼原蟲、7Vj;/Jfl"oswnflgfl附6&附e禾口Jl^P""仍o柳flWorfesfewse(非洲昏睡病)、T)j/^woso附flct"z"恰力口斯病)禾口rax:o//tfsmgwifiW/。其它醫學相關微生物已經在文獻中廣泛描述，例如見.C.G..AThomas,AfcWo//MicraWo/0gv，BailliereTindall,GreatBritain1983，其全部內容通過引用併入本文。變應原指能在易感對象中誘導變態反應或哮喘反應的物質(抗原)。變應原的數量是巨大的，並可以包括花粉、昆蟲毒液、動物毛皮屑、塵、真菌孢子和藥物(如青黴素)。天然動物和植物變應原的實例包括但不限於特異於以下屬的蛋白質犬屬(家犬)；塵蟎屬(如粉塵滿)；貓屬(家貓)；豕草屬04柳6nm'fl"rte柳^/^V0;黑麥草屬(如丄0//柳pgfewwew或丄//,/MM,^/7ora附)；杉卩杉屬(Ojpto柳er/a)(曰本賴卩杉)；鏈格孢屬(交鏈格孢)；榿木屬(v4/flfef);A""S(v4/""sg"加"Ofl^l);樺屬(疣皮樺)；櫟屬(白櫟)；洋橄欖屬(油橄欖)；蒿屬(艾蒿)；車前草屬(如長葉蒲公英)；牆草屬(如直立牆草或猶大牆草)；小蠊屬(如德國小蠊)；蜜蜂屬(如J/;/s柳"toyw"附六/汔^7如地中海柏木、綠幹柏禾口大果柏木)；檢屬(如sfl6//KMV/es,v/rg/w/"wfl，和</mw//w"s"s/jd);崖柏屬(如側柏)；扁柏屬(如扁柏)；大蠊屬(如美洲大蠊)；冰草屬(如匍匐冰草)；黑麥屬(如黑麥)；小麥屬(如小麥)；鴨茅屬(如鴨茅);羊茅屬(如草地羊茅)；早熟禾屬(如草地早熟禾或加拿大早熟未)；燕麥屬(如燕麥);絨毛草屬(如絨毛草)；黃花茅屬(如香黃花茅)；燕麥草屬(如天鵝燕麥草)；翦股穎屬(如小糠草)；梯牧草屬(如貓尾草)；篛草屬(如篛草)；雀稗屬(如百喜草)；高粱屬(如Swg/i"柳/ifl/印e"wX);和雀麥屬(如無芒雀麥)。抗原可以基本是純化的。本文中術語基本純化的表示抗原即多肽基本沒有其它蛋白質、脂、碳水化合物或其它天然結合物質。本領域技術人員能用蛋白質純化的標準技術純化多肽抗原。基本純多肽經常在非還原聚丙烯醯胺凝膠上產生單一主帶。對於部分糖基化的多肽或具有幾個起始密碼子的多肽，在非還原聚丙烯醯胺凝膠上可能有幾條帶，但這些帶將形成該多肽的可區分模式。多肽抗原的純度也可以通過氨基端胺基酸序列分析確定。其它類型的抗原如多糖、小分子、模擬物等包括在本發明範圍內，並且任選地是基本純的。本發明的寡核苷酸可以與抗微生物劑一起給予對象。本文中抗微生物劑表示能殺死或抑制傳染性微生物的天然存在或合成化合物。根據本發明使用的抗微生物劑的類型將依賴於對象感染或有感染風險的微生物類型。抗微生物劑包括但不限於抗細菌劑、抗病毒劑、抗真菌劑和抗寄生蟲劑。短語如"抗感染劑"、"抗細菌劑"、"抗病毒劑"、"抗真菌劑"和"抗寄生蟲劑"和"殺寄生蟲劑"對於本領域普通技術人員具有明確含義並已經在標準醫學書籍中定義。簡單的說，抗細菌劑殺死或抑制細菌，包括抗生素以及具有相似功能的其它合成或天然化合物。抗生素是由細胞如微生物作為次生代謝物產生的低分子量分子。一般來說，抗生素幹擾一種或多種細菌功能或結構，這些功能和結構是微生物特異性的並且宿主細胞中沒有。抗病毒劑可從天然來源分離或合成，並可用於殺死或抑制病毒。抗真菌劑用於治療表面真菌感染以及可能的和原發性系統性真菌感染。抗寄生蟲劑殺死或抑制寄生蟲。抗寄生蟲劑用於人時也稱殺寄生蟲劑，它的實例包括但不限於阿苯達唑、兩性黴素B、苄硝唑、硫氯酚、鹽酸氯喹、磷酸氯喹、氯潔黴素、去氫依米丁、乙胺嗪、糠二氯散、依洛尼塞、呋喃唑酮、糖皮質激素、滷泛曲林、雙碘喹啉、伊維菌素、甲苯噠唑、甲氟喹、葡甲胺銻酸鹽、美拉胂醇、敵百蟲、滅滴靈、氯硝柳胺、硝呋莫司、奧沙尼喹、巴龍黴素、戊雙脒羥乙基磺酸鹽、哌嗪、吡喹酮、磷酸伯氨喹、氯胍、噻嘧啶雙羥萘酸鹽、乙胺嘧啶一磺醯胺、乙胺嘧啶一磺胺多辛、鹽酸阿的平、硫酸奎寧、葡萄糖酸奎納、螺旋黴素、銻葡糖酸鈉、蘇拉明、四環素、強力黴素、噻苯咪唑、替硝唑、trimethroprim-磺胺甲惡唑和錐蟲胂胺，其中一些單獨使用或與其它組合使用。抗細菌劑殺死或抑制細菌的生長或功能。一大類抗細菌劑是抗生素。可有效殺死或抑制廣譜細菌的抗生素，被稱為廣譜抗生素。其它類型的抗生素主要對革蘭氏陽性或革蘭氏陰性類型的細菌有效。這些類型的抗生素被稱為窄譜抗生素。對單個生物或疾病有效而不抗其它類型細菌的其它抗生素被稱為限制譜抗生素。抗細菌劑有時基於它們的主要作用模式分類。一般來說，抗細菌劑有細胞壁合成抑制劑、細胞膜抑制劑、蛋白質合成抑制劑、核酸合成或功能抑制劑和競爭性抑制劑。抗病毒劑是防止細胞被病毒感染或防止病毒在細胞內複製的化合物。與抗細菌藥物相比，抗病毒藥物少的多，因為病毒複製過程與宿主細胞內DNA複製緊密相關，以至於非特異性抗病毒劑經常對宿主有毒性。病毒感染過程中有幾個階段可以被抗病毒劑阻斷或抑制。這些階段包括病毒與宿主細胞附著(免疫球蛋白或結合肽)、病毒去包裝(如金剛烷胺)、病毒mRNA的合成或翻譯(如幹擾素)、病毒RNA或DNA的複製(如核苷類似物)、新病毒蛋白質的成熟(如蛋白酶抑制劑)和病毒出芽與釋放。核苷酸類似物是與核苷酸相似、但具有不完全或異常脫氧核糖或核糖基的合成化合物。核苷酸類似物在細胞中時，它們被磷酸化，產生三磷酸形式，與正常核苷酸競爭摻入病毒DNA或RNA中。核苷酸類似物的三磷酸形式摻入生長中核酸鏈時，引起與病毒聚合酶的不可逆結合併因而使鏈終止。核苷酸類似物包括但不限於阿昔洛韋(用於治療單純皰疹病毒和水痘帶狀皰疹病毒)、更昔洛韋(用於治療巨細胞病毒)、碘脫氧尿苷、利巴韋林(用於治療呼吸道合胞體病毒)、二脫氧肌苷、二脫氧胞苷、齊多夫定(疊氮胸苷)、咪喹莫特和resimiquimod。幹擾素是由感染病毒的細胞和免疫細胞分泌的細胞因子。幹擾素通過結合與感染細胞臨近的細胞上的特異性受體而發揮功能，引起細胞的改變，保護細胞免受病毒感染。oc-和P-幹擾素還誘導感染細胞表面上I類和II類MHC分子的表達，導致抗原提呈增加以使宿主免疫細胞識別。a-和(3-幹擾素有重組形式可用，並已經用於治療慢性B肝和C肝感染。在抗病毒治療有效的劑量下，幹擾素有嚴重副作用如發熱、不適和體重下降。用於本發明的抗病毒劑包括但不限於免疫球蛋白、金剛垸胺、幹擾素、核苷類似物和蛋白酶抑制劑，抗病毒劑的具體實例包括但不限於乙醯嗎喃；阿昔洛韋；阿昔洛韋鈉；阿德福韋；阿洛夫定；Alvirc印tSudotox;鹽酸金剛烷胺；阿拉諾丁；阿立酮;甲磺酸阿地維定；阿夫立定；西多福韋；西潘茶鹼；鹽酸阿糖胞苷；甲磺酸地拉韋定；地昔洛韋；地達諾新；二喁沙利；依度尿苷；恩韋拉登；恩韋肟；泛昔洛韋；鹽酸法莫汀；非西他濱；非阿尿苷；膦利酯；膦甲酸鈉；膦乙酸鈉；更昔洛韋；更昔洛韋鈉；碘脫氧尿苷；凱託沙；拉米夫定；洛布卡韋；鹽酸美莫汀；美替沙腙；奈韋拉平；戊昔洛韋；Pirodavir;利巴韋林；鹽酸金剛乙胺；甲磺酸沙喹那韋；鹽酸索金剛胺；索利夫定；匐枝青黴素；司他夫定、鹽酸乙胺芴酮；三氟尿苷；鹽酸伐昔洛韋(Valacydovir);阿糖腺苷；磷酸阿糖腺苷；磷酸鈉阿糖腺苷；Viroxime;扎西胞苷；齊多夫定；禾卩Zinviroxime。抗真菌劑用於治療和預防傳染性真菌。抗真菌劑有時根據其作用機理分類。一些抗真菌劑通過抑制葡萄糖合成酶作為細胞壁抑制劑發揮功能。這些包括但不限於basimigiii/ECB。其它抗真菌劑通過去穩定膜完整性而發揮功能。這些包括但不限於咪唑類如克黴唑、舍他康唑、氟康唑、伊曲康唑、酮康唑、咪康唑和奧利康唑。以及FK463、兩性黴素B、BAY38-9502、MK991、普那米星、UK292、丁萘芬和特比奈芬。其它抗真菌劑通過分解幾丁質(如幾丁質酶)或抑制免疫(501霜)而發揮功能。CpG免疫刺激性寡核苷酸可以與其它治療劑如佐劑組合以增強免疫應答。CpG免疫剌激性寡核苷酸和其它治療劑可以同時或依次施用。當其它治療劑同時施用時，它們可以相同或分離的製劑但相同時間施用。當其它治療劑和CpG免疫刺激性寡核苷酸在時間上分開施用時，其它治療劑與CpG免疫刺激性寡核苷酸互相先後依次施用。更具體地，CpG免疫刺激性寡核苷酸可以在施用(或暴露於)至少一種其它治療劑之前或之後施用。施用這些化合物之間時間上的分離可以是以分鐘計或更長時間。其它治療劑包括但不限於佐劑、細胞因子、抗體、抗原等。本發明的組合物還可以與非核酸佐劑一起施用。非核酸佐劑是除了能刺激體液和/或細胞免疫應答的本文所述CpG免疫刺激性寡核苷酸之外的任何分子或化合物。非核酸佐劑例如包括產生沉積作用的佐劑、免疫刺激性佐劑，和產生沉積作用並刺激免疫系統的佐劑。CpG免疫刺激性寡核苷酸還可用作黏膜佐劑。之前已經發現，經黏膜遞送CpG核酸誘導系統和黏膜免疫。因此，寡核苷酸可以與其它黏膜佐劑組合施用。與CpG免疫剌激性寡核苷酸一起施用或共線性表達細胞因子(Buder&Mulligan,1996;Chowetal.，1997;Geissleretal.，1997;I簡akietal"1997;Kimetal..1997)或共刺激分子如B7(Iwasakietal.，1997;Tsujietal.，1997)也可誘導或增強免疫應答。術語細胞因子用作多種可溶性蛋白質和肽的上位概念，它們在正常或病理條件下在納-或皮摩爾濃度起體液調節因子的作用，調節單個細胞和組織的功能活性。這些蛋白質也直接介導細胞間相互作用並調節細胞外環境中發生的過程。細胞因子的實例包括但不限於白介素-1(IL-1)、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-IO、IL-12、IL-15、IL-18、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、IFN-y、IFN-a、IFN-(3、腫瘤壞死因子(TNF)、TGF-p、Flt-3配體和CD40配體。除了細胞因子以外，CpG寡核苷酸還可與抗某些細胞因子的抗體如抗IL-10和抗TGF-P以及環氧合酶抑制劑即COX-1和COX-2抑制劑組合使用。寡核苷酸還可用於將免疫應答從Th2免疫應答重定向為Thl免疫應答。這導致產生相對平衡的Thl/Th2環境。從Th2免疫應答到Thl免疫應答的重定向能通過測量對所述核酸應答而產生的細胞因子水平來評價(如通過誘導單核細胞和其它細胞產生Thl細胞因子，包括IFN-a)。免疫應答從Th2向Thl應答的重定向或重平衡對於治療哮喘特別有用。例如，治療哮喘的有效量可以是用於重定向與哮喘相關的Th2型免疫應答為Thl型應答或平衡Thl/Th2環境的量。Th2細胞因子，尤其是IL-4和IL-5在哮喘患者氣道中增加。本文所述CpG免疫刺激性寡核苷酸引起Thl細胞因子增加，幫助重新平衡免疫系統，預防或降低與Th2為主免疫應答相關的不利作用。從Th2免疫應答向Thl免疫應答的重定向還可以通過測量具體同種型免疫球蛋白的水平來評價。例如，在小鼠中IgG2a與Thl免疫應答相關，IgGl和IgE與Th2免疫應答相關。CpG免疫刺激性寡核苷酸具有促進樹突細胞的細胞存活、分化、活化和成熟的獨特能力，並可用於涉及樹突細胞的體外、體內和離體方法。CpG免疫刺激性寡核苷酸還增加自然殺傷細胞裂解活性和抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)。ADCC可用CpG免疫刺激性寡核苷酸與對細胞靶如癌細胞特異的抗體組合來進行。當CpG免疫刺激性寡核苷酸與抗體組合給予對象時，對象的免疫系統被誘導以殺死腫瘤細胞。用於ADCC方法的抗體包括與體內細胞相互作用的抗體。很多這樣的特異性針對細胞靶的抗體已經在本領域描述並且很多可以商業獲得。CpG免疫剌激性寡核苷酸還可以與抗癌治療聯合施用。抗癌治療包括癌症藥物、放射和手術方法。本文中"癌症藥物"表示為治療癌症目的而給予對象的藥物。本文中"治療癌症"包括預防癌症發生、減小癌症症狀和/或抑制已有癌症生長。在其它方面中，癌症藥物被給予處於發生癌症風險中的對象，以降低發生癌症的風險。本文中描述多種類型治療癌症的藥物。對於本說明書的目的，癌症藥物被分類為化療藥、免疫治療劑、癌疫苗、激素治療和生物反應調節劑。另外，本發明的方法還涉及將一種以上的癌症藥物與CpG免疫刺激性寡核苷酸一起使用。例如，適當時，CpG免疫刺激性寡核苷酸可以與化療藥和免疫治療劑一起施用。作為替代方案，癌症藥物可以包括免疫治療劑和癌疫苗，或化療藥和癌疫苗，或化療藥、免疫治療劑和癌疫苗，它們一起施用於一個對象以治療患有癌症或處於發生癌症風險中的對象。化療劑可以選自氨甲蝶呤、長春新鹼、阿黴素、順鉑、不含糖的氯乙基亞硝基脲、5-氟尿嘧啶、絲裂黴素C、博來黴素、阿黴素(doxorubicin)、氮烯唑胺、紫杉醇、fragyline、蜜胺GLA、戊柔比星、卡莫司汀(carmustaine)禾Bpoliferposan、MMI270、BAY12-9566、RAS法尼基轉移酶抑制劑、法尼基轉移酶抑制劑、MMP、MTA/LY231514、LY264618/洛美曲索(Lometexol)、Glamolec、CI-994、TNP-470、Hycamtin/Topotecan、PKC412、Valspodar/PSC833、Novantrone/Mitroxantrone、Metaret/Suramin、巴馬司他、E7070、BCH-4556、CS-682、9-AC、AG3340、AG3433、Incd/VX-710、VX-853、ZD0101、ISI641、ODN698、TA2516/Marmistat、BB2516/Marmistat、CDP845、D2163、PD183805、DX8951f、LemonalDP2202、FK317、Picibanil/OK-432、AD32/戊柔比星、美他鍶種/鍶衍生物、Temodal/Temozolomide、Evacet/脂質體阿黴素、Yewtaxan/Paclitaxel、紫杉醇/Paclitaxd、希羅達/卡培他濱、Furtulon/Doxifluridine、Cyclopax/口月艮paclitaxel、口服Taxoid、SPU-077/順鉬、HMR1275/Flavopirido1、CP-358(774)/EGFR、CP-609(754)/RAS癌基因抑制劑、BMS-182751/口服鉬、UFT(Tegafur/尿嘧啶)、Ergamiso1/左咪唑、Eniluracil/776C85/5FU增強劑、開普拓/左咪唑、Camptosar/Irinotecan、Tumodex/Ralitrexed、Leustatin/Cladribine、Paxex/紫杉醇、Doxil/脂質體阿黴素、Caelyx/脂質體阿黴素、Fludara/氟達拉濱、Pharmarubicin/表阿黴素、DepoCyt、ZD1839、LU79553/Bis-Naphtalimide、LU103793/Dolastain、Caetyx/脂質體阿黴素、Gemzar/吉西他賓、ZD0473/Anormed、YM116、Iodineseeds、CDK4禾QCDK2抑制劑、PARP抑制劑、D4809/Dexifosamide、Ifes/Mesnex/異磷醯胺、Vumon/替尼泊苷、Paraplatin/卡波鉬、Plantinol/順鉑、Vepeside/依託泊苷、ZD9331、Taxotere/多西他賽、阿糖鳥苷的前藥、紫杉烷類似物、亞硝基脲、垸基化劑如melphelaii和環磷醯胺、氨魯米特、天冬醯胺酶、白消安、卡波鉑、苯丁酸氮芥、鹽酸阿糖胞苷、放線菌素D、鹽酸柔紅黴素、雌氮芥磷酸鈉、鬼臼乙叉苷(VP16-213)、氟尿苷、氟尿嘧啶(5-FU)、氟他米特、羥基脲(羥基尿素)、異環磷醯胺、幹擾素a-2a、a-2b、乙酸亮脯利特(LHRH釋放因子類似物)、洛莫司汀(CCNU)、鹽酸二氯甲基二乙胺(氮芥)，巰基嘌呤、美司鈉、米託坦(o.p'-DDD)、鹽酸米託蒽醌、生長抑素八肽、普卡黴素、鹽酸丙卡巴肼、鏈佐星，檸檬酸他莫西芬、硫代鳥嘌呤、硫替派、硫酸長春鹼、安吖啶(m-AMSA)、氮雜胞苷、紅細胞生成素，六甲基密胺(HMM)、白介素2、Mitoguazone(甲基-GAG;甲基乙二醛雙鳥嘌呤基腙；MGBG)、戊糖苷(2'脫氧柯福黴素)、司莫司汀(甲基-CCNU)、替尼泊苷(VM-26)和硫酸長春地辛，但不限於此。所述免疫治療齊何以選自Rituxan、Ributaxin、Herceptin、Quadramet、Panorex、IDEC-Y2B8、BEC2、C225、O譜lym、SMARTM195、ATRAGEN、Ovarex、Bexxar、LDP-03、iort6、MDX-210、MDX-ll、MDX-22、OV103、3622W94、抗-VEGF、Zenapax、MDX-220、MDX-447、MELIMMUNE-2、MELIMMUNE-1、CEACIDE、Pretarget、NovoMAb-G2、TNT、Gliomab-H、GNI-250、EMD-72000、LymphoCide、CMA676、Monopharm-C、4B5、ioregf.r3、iorc5、BABS、anti-FLK-2、MDX-260、ANAAb、SMARTlD10Ab、SMARTABL364Ab和ImmuRAIT-CEA，但不限於此。所述癌症疫苗可以選自EGF、抗獨特型癌症疫苗、Gp75抗原、GMK黑素瘤疫苗、MGV神經節苷脂綴合物疫苗、Her2/neu、Ovarex、M-Vax、O-Vax、L-Vax、STn-KHLtheratope、BLP25(MUC-I)、脂質體獨特型疫苗、Melacine、肽抗原疫苗、毒素/抗原疫苗、基於MVA的疫苗、PACIS、BCG疫苗、TA-HPV、TA-CIN、DISC-病毒和ImmuCyst/TheraCys，但不限於此。CpG免疫刺激性寡核苷酸聯合使用免疫治療劑如單克隆抗體能通過多種機制增加長期存活率，包括顯著增強ADCC(如上述)、活化NK細胞和增加IFN-a水平。當與單克隆抗體聯合使用時所述核酸用於降低實現生物學結果需要的抗體劑量。本發明還包括使用CpG免疫刺激性寡核苷酸誘導抗原非特異性自然免疫活化和對傳染性攻擊的廣譜抗性的方法。本文中術語自然免疫活化表示活化除記憶B細胞以外的免疫細胞，例如可以包括活化單核細胞、中性粒細胞、巨噬細胞、樹突細胞、NK細胞和/或能以不依賴於抗原的方式作出反應的其它免疫細胞。對傳染性攻擊的廣譜抗性被誘導是因為免疫細胞處於活性形式並被引發對任何侵入化合物或微生物作出反應。細胞不必被抗特定抗原的特異性引發。這尤其可用於生物戰和上述其它情況如旅行者。CpG免疫刺激性寡核苷酸可以直接施用於對象，或者可以與核酸遞送複合物聯合施用。核酸遞送複合物指與靶向物質(如導致對靶細胞更高親和力的分子)結合(如離子或共價結合，或包封在其中)的核酸分子。核酸遞送複合物的實例包括與甾醇(如膽固醇)、脂質(如陽離子脂質、病毒顆粒或脂質體)或靶細胞特異性結合因子(如由耙細胞特異性受體識別的配體)結合的核酸分子。優選的複合物可以在體內足夠穩定，以防止被靶細胞內化之前的顯著解偶聯。然而，複合物可以在細胞內適當條件下切割的，使得寡核苷酸以功能性形式釋放。CpG免疫刺激性寡核苷酸和/或抗原和/或其它治療劑可以單獨施用(如在鹽水或緩衝液中)，或用本領域已知的任何遞送載體。例如以下遞送載體己經描述Cochleates(Gould-Fogeriteetal"1994，1996);Emulsomes(Vancottetal.，1998，Lowelletal.，1997);ISCOM(Mowatetal"1993，Carlssonetal"1991，Huet"1998，Moreinetal"1999);月旨質體(Childersetal.，1999，Michaleketal.,1989，1992，deHaan1995a,1995b);活細菌載體(例如沙門氏菌、大腸桿菌、bacillusCalmette-Gu6rin，志賀菌、乳酸桿菌)(Honeetal"1996，Po畫lsetal"1998，Chatfieldetal"1993,Stoveretal"1991,Nugentetal.，1998);活病毒載體(如痘苗、腺病毒、單純皰疹)(Gallichanetal"1993，1995，Mossetal"1996，Nugentetal"1998，Flexneretal"1988，Mor雨etal"1999);微球(Guptaetal"1998，Jonesetal"1996，Maloyetal"1994，Mooreetal"1995,O'Haganetal.，1994，Eldridgeetal"1989);核酸疫苗(Fynanetal"1993，Kuklinetal"1997，Sasakietal"1998，Okadaetal"1997，Ishiietal"1997);聚合物(例如羧甲基纖維素、殼聚糖)(Hamajimaetal.，1998，Jabbal-Gilletal.，1998);聚合物環(Wyattetal.,1998);蛋白酶體(Vancottetal"1998，Lowelletal.，1988，1996，1997);氟化鈉(Hashietal.，1998);轉基因植物(Tacketetal"1998，Masonetal"1998，Haqetal"1995);Virosomes(Glucketal"1992，Mengiardietal"1995，Cryzetal.，1998);病毒樣顆粒(Jiangetal.，1999，Leibletal.，1998)。其它遞送載體在本領域已知。術語"有效量"通常指實現所期望生物效應所必需或足夠的兩。例如，與抗原一起施用來誘導黏膜免疫的CpG免疫刺激性寡核苷酸的有效量是與抗原接觸時導致對抗原應答而產生IgA所需的量，而誘導系統性免疫所必需的量是與抗原接觸時導致對抗原應答而產生IgG所需的量。與本文的教導相結合，通過在多種活性化合物中選擇，並和量因素如功效、相對生物利用度、患者體重、不良副作用嚴重性和優選的施用模式，可以安排不導致明顯毒性並對治療特定對象完全有效的有效預防性或治療性治療方案。任意特定應用的有效量可以根據下列因素變動待治療的疾病或病症、待施用的具體CpG免疫刺激性寡核苷酸、對象體型大小或疾病或病症的嚴整程度。本領域的普通技術人員可以根據經驗確定特定CpG免疫刺激性寡核苷酸和/或抗原和/或其他治療藥的有效量，而不需要過多的實驗。本文所述化合物用於黏膜或局部遞送的劑量典型範圍為每次施用約10pg-10g，根據應用可以每日、每周或每月和任意其它量的時間間隔或按需要給予。更典型地黏膜或局部劑量範圍為每次施用約lmg-500mg，最典型地約lmg-100mg，經2-4次施用，之間間隔數天或數周。更典型地，免疫剌激物劑量範圍為每次施用約l(Hig-100mg，最典型地約lOOpg-lOmg，每天或每周施用。為誘導抗原特異性免疫應答，其中所述化合物與抗原而非另一種治療劑一起遞送，本文所述化合物用於非胃腸道遞送的劑量典型地比用於疫苗佐劑或免疫刺激物應用地有效黏膜劑量高5-10,000倍，更典型地高IO-I，OOO倍，最典型地高20-100倍。當CpG免疫刺激性寡核苷酸與其它治療劑組合施用或於專用遞送載體中施用時，經非胃腸道遞送用於誘導先天性免疫應答或用於增強ADCC或用於誘導抗原特異性免疫應答的本文所述化合物的劑量典型範圍為每次施用約100)ag-10g，根據應用可以每日、每周或每月和任意其它量的時間間隔或按需要給予。對於這些目的，更典型劑量範圍為每次施用約lmg-5g，最典型地約lmg-lg,經2-4次施用，之間間隔數天或數周。然而在一些實施方案中，對於這些目的的非胃腸道劑量可以使用比上述典型劑量高5-10,000倍。對於本文所述任意化合物，治療有效量可以從動物模型初步確定。治療有效劑量還可以從已經人體試驗的其它CpG寡核苷酸和已知表現相似藥理活性的化合物如其它佐劑如LT和用於疫苗接種的其它抗原的人用數據確定。非胃腸道施用可以要求更高劑量。應用劑量可根據相對生物利用度和所施用化合物的效力而調節。基於上述方法和本領域公知的其它方法調節劑量以實現最大療效正好在普通技術人員的能力範圍內。本發明製劑以藥學上可接受的溶液施用，其中可常規含有藥學上可接受濃度的鹽、緩衝劑、防腐劑、兼容載體、佐劑和任選地其它治療成分。對於治療用途，有效量的CpG免疫刺激性寡核苷酸和/或其它治療劑可以任意方式給予對象，只要所述模式將化合物遞送到所期望表面，如局部、黏膜、系統性給予。施用本發明的藥物組合物可以通過本領域技術人員已知的任何方式。優選給藥途徑包括但不限於經口、非胃腸道、靜脈內、肌內、皮下、病灶內、腫瘤內、鼻內、舌下、氣管內、吸入、眼、陰道和直腸。對於經口給予，通過組合活性化合物與本領域公知的藥學上可接受的載體，化合物(即CpG免疫刺激性寡核苷酸、抗原和/或其它治療劑)可以容易地配製。這些載體能使本發明的化合物配製成片劑、丸劑、糖衣丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、淤漿、懸劑等，用於待治療對象經口攝入。口服藥物製劑可以如下獲得，固體賦形劑任選地研磨所得混合物、加工混合物顆粒、加入適當助劑以後，如果期望，獲得片劑或糖衣丸芯。適當賦形劑具體是填充劑如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨醇；纖維素製劑例如玉米澱粉、小麥澱粉、水稻澱粉、馬鈴薯澱粉、明膠、黃芪膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯垸酮(PVP)。如果期望，可以加入崩解劑，如交聯聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂或海藻酸，或其鹽如海藻酸鈉。任選地，口服製劑還可以配製成鹽水或緩衝液，以中和內部酸性條件，或可以不用任何載體施用。向糖衣丸芯提供合適包衣。對此目的，可使用濃縮糖液，其中任選地可含有阿拉伯膠、滑石、聚乙烯吡咯垸酮、卡巴浦爾凝膠、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液，以及合適的有機溶劑或溶劑混合物。染料或色素可以加入片劑或糖衣丸包衣中以識別或表徵不同組合的活性化合物劑量。可經口使用的藥物製劑包括由明膠製成的承插式膠囊，以及由明膠和增塑劑如甘油或山梨醇製成的軟密封膠囊。承插式膠囊可以含有活性成分並混合有填充劑如乳糖，粘合劑如澱粉，和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鎂，以及任選的穩定劑。在軟膠囊中，活性化合物可以溶解或懸浮於合適液體如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中。此外，可以加入穩定劑。也可以使用為口服施用而配製的微球。這種微球己在本領域良好地定義。所有口服製劑都應該是適於這種施用的劑量。對於含服，組合物可以使用以常規方式配製的片劑或錠劑形式。可用標準吸入裝置通過吸入肺道(尤其是進入支氣管，更尤其是進入肺深處的肺泡)來施用所述化合物。可以氣溶膠噴霧劑形式從壓力包裝或噴霧器中遞送化合物，其中使用合適的推進劑如二氯二氟甲垸、三氯氟甲烷、二氯四氟乙垸、二氧化碳或其它合適氣體。對於加壓氣溶膠，通過提供遞送計量劑量的閥可以確定劑量單位。可使用吸入裝置將化合物遞送給對象。本文中吸入裝置是遞送氣溶膠如乾粉形式化合物的任意裝置。此類型的裝置在本領域公知，並已詳細描述，如以下描述Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy,19thEdition,1995，MacPublishingCompany,Easton，Pennsylvania,pages1676-1692。很多美國專利也描述了吸入裝置，如U.S.Pat.No.6,116,237。本文中"粉末"表示由細分散固體顆粒組成的組合物。優選地，組合物相對自由流動並能被分配到吸入裝置中並隨之被對象吸入，使得化合物達到肺部以透入肺泡。"乾粉"表示這樣的粉末組合物，其含水量使得顆粒容易分配到吸入裝置中形成氣溶膠。以水重量(％w)計，含水量一般低於約10%，在一些實施方案中，低於約5%w，優選低於約3^w。粉末可以與聚合物一起配製，或任選地與其它物質如脂質體、白蛋白和/或其它載體一起配製。用於特定治療應用的氣溶膠給藥和遞送系統可以由本領域技術人員選擇，例如描述於Gonda,I."Aerosolsfordeliveryoftherapeuticanddiagnosticagentstotherespiratorytract,"inCriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems,6:273-313(1990),禾口Moren,"Aerosoldosageformsandformulations,"inAerosolsinMedicine.Principles,DiagnosisandTherapy,Moren，etal"Eds"Elsevier,Amsterdam,1985。當期望全身遞送時，可以配製化合物以通過注射進行非胃腸道給藥，例如經快速濃注或連續灌輸。注射劑可以單位劑量形式提供，如在安瓿或在多劑量容器中，其中具有另加的防腐劑。組合物可以採用諸如油性或水性載體中的懸液、溶液或乳液形式，並可以含有製劑形成劑(forimilatoryagent)如助懸劑、穩定劑和/或分散劑。非胃腸道施用的藥物製劑包括水溶形式活性化合物的水溶液。另外，活性化合物的懸液可以適當製備為適當的油性注射懸液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質體。水性注射懸液可以含有增加懸液粘度的物質，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。任選地，懸液還可以含有合適穩定劑或增加化合物溶解性的試劑，以製備高濃度溶液。作為替代方案，活性化合物可以是粉末形式，使用前用合適載體如無菌無致熱源的水配製。化合物還可以配製成例如含有常規栓劑基料如可可脂或其它甘油酯的直腸或陰道組合物，如栓劑或灌腸劑，。除了之前描述的劑型以外，化合物還可以配製成長效(depot)製劑。這種長效製劑可以用合適的聚合物或疏水材料(例如作為可接受油中的乳液)或離子交換樹脂配製，或配製成微溶性衍生物，例如微溶性鹽。藥物組合物還可以包括合適的固體或凝膠相載體或賦形劑。這些載體或賦形劑的實例包括但不限於碳酸鈣、磷酸鈣、多種糖、澱粉、纖維素衍生物、明膠和諸如聚乙二醇的聚合物。合適的液體或固體藥物製劑形式例如是水性或鹽水溶液，用於吸入、微膠囊化、encochleated、包覆於顯微金顆粒上、含於脂質體中、噴霧化，氣溶膠，植入皮膚的小丸或乾燥到要劃入皮膚的尖銳物體上。藥物組合物還可以包括顆粒、粉末、片劑、包衣片劑、(微)膠囊、栓劑、糖漿、乳液、懸液、霜、滴劑或延遲釋放活性化合物的製劑，在這些製劑中如上述常規使用賦形劑和添加劑和/或助劑如崩解劑、粘合劑、包衣劑、溶脹劑、潤滑劑、調味劑、增甜劑或助溶劑。藥物組合物適用於多種藥物遞送系統。藥物遞送方法的簡單綜述可見LangerR(1990)Science249:1527-33，該文經引用併入本文。CpG免疫剌激性寡核苷酸和任選的其它治療劑和/或抗原可以自身(淨)或以藥物接受的鹽形式給予。當用於藥物時，所述鹽應該是藥學上可接受的，但非藥學上可接受的鹽可以方便的用於製備藥學上可接受的鹽。這些鹽包括但不限於由以下酸製備的鹽鹽酸、氫溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、馬來酸、乙酸、水楊酸、對甲苯磺酸、酒石酸、檸檬酸、甲磺酸、甲酸、蘋果酸、琥珀酸、萘-2-磺酸和苯磺酸。另外，這些鹽可以製備成鹼金屬鹽或鹼土金屬鹽，如羧酸基的鈉、鉀或鈣鹽。合適的緩衝劑包括乙酸及其鹽(1-2%w/v);檸檬酸及其鹽(1-3%w/v);硼酸及其鹽(0.5-2.5%w/v);和磷酸及其鹽(0.8-2%w/v)。合適的防腐劑包括苯扎氯胺(0.003-0.03%w/v);氯丁醇(0.3-0.9%w/v);對羥基苯甲酸酯類(0.01-0.25%w/v)和硫柳汞(0.004-0.02%w/v)。本發明的藥物組合物含有有效量的CpG免疫刺激性寡核苷酸和任選的抗原和/或其它治療劑，並任選地包括於藥學上可接受的載體中。術語藥學上可接受的載體是指一種或多種相容性固體或液體填充劑、稀釋劑或包封物質，它們適於給予人或其它脊椎動物。術語載體表示活性成分與之組合有利於應用的天然或合成的有機或無機成分。藥物組合物的成分也能與本發明的化合物互相混合，這種方式應使得沒有會實質性影響預期藥物療效的相互作用。本發明進一步用以下實施例舉例說明，無論如何，這些實施例不應理解為進一步限制。實施例實施例1(:類0/^類敘激沐介誘導//^《分泌浙乂7Xi9活絲在此系列試驗中，體外測試本發明的C類ODN類似物剌激人外周血單核細胞(PBMC)分泌IFN-a的能力和刺激穩定轉染人TLR9和NF-kB報告基因構建體的HEK293細胞顯示TLR9信號傳遞的能力。ODN購自Biospring(Frankfurt,Germany)，並由ColeyPharmaceuticalGmbH(Langenfeld，Germany)控制其識別特徵和純度。ODN稀釋於磷酸鹽緩衝液(Sigma,Germany)中並保存於-2(TC。所有稀釋用無致熱源試劑進行。測試ODN包括以下128T*C—G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*T*C*G*T*G*C*C*G611t*c*G*t*c*G*t*t*t*t*a*c_G*G*c_G*c*c—G*T*G*C*C*G614T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G620T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C,G331T*C*G*C—G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*C*T*G*C*C*G332t*c*g*c—g*t*c*g*t*t*c—g*g*c*g*c—g*c*t*g*c*c*g333T*C*G*C—G*A*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C_G*T*C*G*C*C*G334T*C*(3*C—G*A*C*G*T*T*CJ3*G*C*G*G*C_T*C*G*C*C*G335t*c*g—c*g*t*c*g*t*t*c—g*g*c*g*c—g*c*t*g*c*c*g336t*c*g*c*g-t*c*g*t*t*c—g*g*c*g*c_g*c*t*g*c*c*"^類敘欽#^遂導//7\^分#希乂IZ/f9活性在此系列試驗中，體外測試本發明的C類ODN類似物刺激人外周血單核細胞(PBMC)分泌IFN-a的能力和刺激穩定轉染人TLR9和NF-kB報告基因構建體的HEK293細胞顯示TLR9信號傳遞的能力。基本操作方案如實施例1所述，只是測試ODN包括以下664T*c*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G*T*G*A*C*G*T*G(SEQIDNO:62)376T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G*T*G*A*C*G(SEQDDNO:61)801T*CG*T*CG*A*CG*T*T*CG*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:65)893T*C*G*T*CG*T*A*CG*G*C*G*C*CG*T*G*C*C*G(SEQIDNO:66)894T*C*G*T*CG*T*T*A*CG*G*C*G*C*CG*T*G*C*C*G(SEQIDNO:67)882T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G*T*G*A*C*G*T*T(SEQIDNO:63)22卯T*c*G*T*CG*A*CG*A*T*CG*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO鄰2292T*C*G*T*C*G*A*C*G*A—TC*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIL^O:64)2337T*C*G*A*CG*T*C*G*A*C—G*T*G*A*C*G*T*T(SEQIDNO:63)2341T*C*G*A*CG*T*C*G*A*C*G*T—G*A*C*G*T*T(SEQIDNO:63)2357T*C*G*T*CG*T*T*T*A*CG*G*C*G*C*CG*T*G*C*C*G*T(SEQIDNO:68)其中*代表硫代磷酸酯鍵，—代表磷酸二酯鍵。在TLR9報告基因測試中測試了不同濃度的ODN。用SigmaPlot(SigmaPlot2002forWindowsVersion8.0)計算EC50(作用為最大作用50%時的ODN濃度)。最大剌激指數(maxSI)計算為任意ODN測試的所有濃度最高值與培養基對照的商。結果表示於表l，其中可以看出刺激指數通常為10-30。表1本發明的C類CpGODN活化人TLR9tableseeoriginaldocumentpage65與這些C類CpGODN—起培養48小時後，人PBMC分泌大量IFN-a。與濃度小於或等於lpM的ODN—起培養後，IFN-a的典型量為3000-4000pg/ml。這些試驗中IFN-a的反應曲線與圖2中的非常相似。實施例4C類0ZW類敘激體力誘導拔嚴錄^絲慮資座麥在該系列試驗中，在體內測試本發明的C類ODN與小鼠疫苗接種相結合的情況。觀察到本發明的C類ODN以至少與B類CpGODN2006相當的方式增強抗原特異性總IgG和IgG2a(小鼠中Thl樣IgG)的效價，以及抗原特異性細胞裂解性T淋巴細胞(CTL)應答。ODN如實施例1所述獲得。雌性BALB/c小鼠(6-8周齡)用於所有試驗。動物購自CharlesRiverCanada(Quebec,Canada)，並飼養於OttawaHospitalResearchInstitute,CivicSite的動物養護設施中的微分離器(microisolator)中。幼年BALB/c小鼠脾細胞用於所有體外測試。用異氟烷麻醉動物並引頸處死。在無菌條件下取出脾，放置於磷酸鹽緩衝液(PBS)+0.2%牛血清白蛋白(SigmaChemicalCompany)中。然後勻漿脾，將脾細胞重懸於RPMI1640組織培養基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)中，培養基中還添加2%正常小鼠血清(CedarlaneLaboratories,Ontario,Canada)、青-鏈黴素溶液(終濃度分別是1000U/ml禾口1mg/ml,SigmaChemicalCompany)禾Q5xl(T5Mp-巰基乙醇(SigmaChemicalCompany)。用lpgB肝表面抗原(HBsAg)ad亞型(InternationalEnzymes,CA)單獨或與l-100|igCpGODN2006、608、611、618或CpGODN620組合免疫BALB/c小鼠(n-10/組)。動物被採血並在初次免疫後4周時增強。增強後2周時，將每組5隻動物處死並取出脾用於CTL測試。用終點稀釋ELISA測試檢測並定量特異性針對HBsAg(抗HBs)的抗體(總IgG、IgGl和IgG2)，來自單個動物的樣品重複三次。終點效價定義為導致吸光度值(OD450)超過非免疫血漿兩倍的最高血漿稀釋度，其中截止值為0.05。這些報告為組平均效價(GMT)±SEM。CTL測試根據標準方式進行。簡單的說，免疫後4周取出脾並勻漿為RPMI1640組織培養基(LifeTechnologies,GrandIsland,NY)中的單細胞懸液，培養基中還添加10%胎牛血清(LifeTechnologies)、青-鏈黴素溶液(終濃度分別是1000U/ml和1mg/ml，Sigma,Irvine,UK)和5xl(T5Mp-巰基乙醇(Sigma)(完全RPMI1640)。脾細胞懸液(3xl(^細胞/ml)中的HBsAg特異性淋巴細胞通過與表達HBsAg的小鼠細胞系(p815-S)—起培養5天而被再刺激。再刺激以後，淋巴細胞殺死表達HBsAg細胞的能力用"Cr釋放試驗確定。結果表示為不同效應子靶(E:T)比的％比裂解(specificlysis)。禁菜代表性結果表示於圖4-6。如圖4所示，ODN2006和ODN620的總IgG效價是劑量依賴的，發現在l^gODN劑量時大約分別為5xl0S和6.5xl03。在lOOjagODN劑量時發現ODN2006和ODN620的總IgG效價大約為lx104。如圖5所示，與非CpG對照ODN2137rTGCTGCTTTTGTGCTTTTGTGCTT;SEOIDNO:60)相比，ODN2006禾BODN620都顯著增強IgG2a(小鼠中Thl樣IgG)。具體而言，各自施用IO網劑量時，對於ODN2006、620和2137的IgG2a分別是約3xl03、6xl03和3xl02。如圖6所示，施用10和lOOpg劑量時，對於ODN2006、620,E:T比為100:1時的CTL活性顯著大於對照。例如，各自施用10pg劑量時，ODN2006、620和2137的百分比裂解約為26%、24%和12%。總的來說，這些試驗的結果證明本發明的C類ODN類似物在體內有效誘導抗原特異性免疫應答。實施例5在體力,蘑漠麥^C類OZ)7V類欽激箱裔存活率#減^#蘑沐積在該系列試驗中，本發明的C類ODN類似物在小鼠神經母細胞瘤模型中進行體內測試。發現本發明的C類ODN類似物顯著改善整體存活率和腫瘤負擔。ODN如實施例l獲得。BALB/c小鼠如實施例4獲得。在第0天向BALB/c小鼠左側皮下(s.c.)注射lxl(^神經母細胞瘤(Neuro-2a)細胞(如ATCCCCL-131,AmericanTypeCultureCollection,Manassas,VA)。從第10-25天，每天向小鼠皮下注射PBS、CpG2006、CpG620或非CpG對照ODN2137。測量存活率和腫瘤體積。碧菜代表性結果見圖7。如圖7A所示，與對應ODN2006、ODN2137或PBS的存活率0-20%相比，用100lagODN620處理的小鼠在第80天具有50X存活率。而且如圖7B所示，用lOOpgODN620處理的小鼠在第28天具有峰值腫瘤體積約lOOOmm3，在38天內減小到0mm3。相比之下，用ODN2137或PBS處理的小鼠具有更快、無變化的腫瘤生長。總的來說，這些試驗的結果證明在體內腫瘤模型中本發明的C類ODN類似物有效改善存活率並減小腫瘤體積。實施例6c類ozw鄉雄邀織/e謝浙，本發明的C類ODN類似物的吸收/分布研究在小鼠皮下處理後顯示有利的代謝和從器官如腎和肝中的清除。小鼠分成5組，每組小鼠在第0天單次皮下給予25(HigODN。在不同時間點，取出器官(肝、腎和脾)，提取寡核苷酸和其代謝物以定量含量。^^^^.與完全已知的硫代磷酸酯回文ODN如2429比較，本發明的ODN(如611和620)顯示較少積累於器官。例如，在第3天，ODN611、620和2429的腎水平分別是約70±28、30±18和卯土10mg/kg。相類似的，在第3天，ODN611、620和2429的肝水平分別是約45±15、28±12和150±15mg/kg。總的來說，這些結果證明本發明的C類ODN類似物有利的代謝，並從可能積累的器官中清除。實施例7C類ODiV類欽激遊激潘獰0在這組試驗中，ODN2429、611、620、608(t*C*g*T*C—G*T*T*T*T*C—G*G*C—G*C*G*C—G*C*C*G;SEQIDNO:51)禾q618(T*C*G*T*C—G^T""T^T^"PC一G承G化^G^GWK-G豐C^(^G;SEQIDNO:53)用體積排阻層析、毛細管凝膠電泳(CGE)、UV熱變性和高壓液相色譜(HPLC)進行表徵。當用體積排阻層析研究ODN611和ODN620(225|aMPBS溶液)時，每種化合物僅觀察到一個峰，即每種寡核苷酸以單體形式被洗脫。相反，當ODN608和618(各自含有迴文序列)用體積排阻層析研究時，每種寡核苷酸觀察到兩個峰，與除了單體以外還存在分子間二聚體相一致。然而，UV熱變性研究表明ODN611和ODN620在溶液中具有二級結構，這與分子內髮夾結構相一致。髮夾結構被認為來自611和620序列中的反向重複。一般來說，與ODN2429和ODN608相比，HPLC和CGE中觀察到這些序列的峰更尖。總的來說，這些結果證明在研究濃度下，本發明的C類ODN類似物在體外傾向於形成分子內二級結構並且不形成分子間複合物，而含回文的C類ODN傾向於通過分子間相互作用結合成複合物。然而，在體內，核內體區隔中可達到的ODN的濃度有可能足夠高，以有利於形成ODN的雙鏈體或更高級複合物，包括本發明C類ODN類似物的雙鏈體或更高級複合物。等價物前面的書面說明足以使本領域技術人員實施本發明。除了此處顯示和描述的以外，從前面的說明，本發明的多種改動對於本領域技術人員將是顯而易見的，並落在所附的權利要求範圍內。本發明的優點和目的不必被本發明的每個實施方案都包括。本文引用的所有參考文獻、專利和專利申請都通過引用全部併入本文。權利要求1.含有式I的免疫刺激性核酸分子的組合物，Z1[(X1Y1R1)N(X2Y2R2)kZ2]p(S1)qN′(Nn)...(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)...(Nn#)Z3(式I)其中Z1、Z2和Z3相互獨立地是0-12個核苷酸長的任意序列，其任選地包含非核苷酸連接子或無鹼基dSpacer；X1和X2相互獨立地是含胸腺嘧啶、尿嘧啶、腺嘌呤或5-取代尿嘧啶的核苷酸；Y1和Y2相互獨立地是胞嘧啶(C)或修飾胞嘧啶；R1和R2相互獨立地是鳥嘌呤(G)或修飾鳥嘌呤；N和N』相互獨立地是0-12個核苷酸長的任意序列，其任選地包含非核苷酸連接子或無鹼基dSpacer；S1是非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元，任選地提供2』5』-、5』5』-、3』3』-、2』2』-或2』3』-核苷間連鍵；S2是1-10個核苷酸長的任意非迴文序列或非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元；N1、N2、…Nn和N1#、N2#、…Nn#分別是任意核苷酸或修飾核苷酸，其中N1與N1#形成鹼基對、N2與N2#形成鹼基對、…Nn與Nn#形成鹼基對；k是0-5的整數；n是2-16的整數；p是1-6的整數；q是0-10的整數，並且其中當(Nn)…(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)…(Nn#)是10-42個核苷酸長時，S2是4-10個核苷酸長，S2包含非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元，和/或(Nn)…(N2)(N1)S2(N1#)(N2#)…(Nn#)具有小於2/3的GC含量。2.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中N,、N2、…Nn禾QN^、N2#、…N^分別選自C、G或其修飾物，並且其中C與G形成鹼基對。3.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，其中K、N2、…Nn和Nw、N2#、…N^分別選自T、A或其修飾物，並且其中T與A形成鹼基對。4.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中N,、N2、…Nn和N^、N2#、…N^分別選自C、T、A、G或其修飾物，並且其中C與G形成鹼基對，T與G形成鹼基對，A與T形成鹼基對，A與G形成鹼基對。5.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，其中N,、N2、…Nn和Nw、N2#、…N^分別選自形成沃森一克裡克鹼基對的未修飾或修飾核苷酸。6.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中各個N,、N2、…Nn和N^、N2#、…N^中至少一個選自形成非沃森一克裡克鹼基對的未修飾或修飾核苷酸。7.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，還包含具有至少一個磷酸二酯鍵的部分穩定化骨架。8.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，還包含具有至少一個穩定化核苷酸間連鍵的骨架。9.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中所述寡核苷酸的核苷酸間連鍵都是硫代磷酸酯鍵。10.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，還包含具有連接Y,Rt或Y2R2中至少一個的磷酸二酯鍵的部分穩定化骨架。11.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中Y,是C。12.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中R,是G。13.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，其中K是C，R,是G。14.權利要求l的免疫剌激性核酸分子，其中&或X2是T。15.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，其中Xi是T，X2是T，K是C,R,是G,k是l。16.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中Xi是T,X2是T，Y,是C，R,是G，k是l，p是l，N和N，和Z3分別含有0個核苷酸，並且Z2是TTTT或d(UUUU)。17.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，其中S2是非核苷酸連接子。18.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，其中S2含有至少一個無鹼基dSpacer殘基。19.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中所述寡核苷酸包括至少一個帶分支的非核苷連鍵。20.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，還包含至少一個雙體單元、至少一個三體單元，或至少一個雙體單元和至少一個三體單元。21.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中Si是雙體單元或三體單元。22.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中所述寡核苷酸包含至少一個2，5，-、5，5，-、3,3,-、2，2，陽或2，3，-核苷間連鍵。23.式III的免疫刺激性核酸分子formulaseeoriginaldocumentpage4(式m)其中z，是Z![(X、Y刷N(X2Y2R2)kZ2]p(S、)qN'(Nn)....(N3胸(Ni)S2(N1#...(N#);Z,、Z2和Z3相互獨立地是0-12個核苷酸長的任意序列，其任選地包含非核苷酸連接子或無鹼基dSpacer;Xi和X2相互獨立地是含胸腺嘧啶、尿嘧疲、腺嘌呤或5-取代尿嘧澱的核苷酸；和Y2相互獨立地是胞嘧啶或修飾胞嘧啶；Rt和R2相互獨立地是鳥嘌呤或修飾鳥嘌呤；N和N，互相獨立地是0-12個核苷酸長的任意序列，其任選地包含非核苷酸連接子或無鹼基dSpacer;S!是非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元，任選地提供2，5，-、5，5，-、3，3，-、2'2，-或2，3，-核苷間連鍵；S2是1-10個核苷酸長的任意非迴文序列或非核苷酸連接子、無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元；S3是直接或間接的2，5，-、5，5，-、3，3，-、2，2，-或2'3，-核苷間連鍵或非核苷酸連接子，所述非核苷酸連接子包含無鹼基連接子(dSpacer)、三乙二醇單元或六乙二醇單元，輔助m序列部分的2，5，-、5，5，-、3，3，-、2，2，-或2'3，-連接；NhN2、…Nn和N1#、N2#、…N^分別是任意核苷酸或修飾核苷酸，其中N!與N^形成鹼基對、N2與N^形成鹼基對、N3與>[3#形成鹼基對、一N與N^形成鹼基對;k是0-5的整數；m是2-10的整數；n是2-16的整數；p是l-6的整數；並且q是0-10的整數。24.包含權利要求1或23的免疫剌激性核酸分子的組合物，其中Z！[(X!Y!Ri)N(X2Y2R2)kZ2]p(S!)q是非迴文序列。25.包含權利要求1或23的免疫剌激性核酸分子的組合物，其中Z！〖(X,Y,R,)N(X2Y2R2)kZ2]p(S,)q是TCGTCGTTTT(SEQ歸0:40)，TCGTCGTTLL,TCGA,TCGAC,TCGACGTC或TCGACGTCG，其中L是dSpacer。26.包含權利要求1或23的免疫刺激性核酸分子的組合物，其中Zj[(X!Y^DN(X2Y2R2)kZ2]p(Si)q是迴文序列。27.權利要求1或23的免疫刺激性核酸分子，其中Z![(Xr5f^)N(X2Y2R2)kZ2]p(Si)q是TCGACGTCGA(SEOIDNO:19)或TCGTCGACGA(SEQIDNO:34)。28.權利要求1或23的免疫刺激性核酸分子，其中Z![(Xr^&)N(X2Y2R2)kZ2]p(S!)q是TCGCGACGTT(SEQIDNO:26)或TCGCGTCGTT(SEQIDNO:69)。29.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中(Nn)…(N2)(NOS2(Nw)(NaO…(N械)Z3包含序列AGCGAAGCT，CAATATTTATTG(SEQIDNO:1),CCGTTTTGTGG(SEQIDNO:2),CGGCGCCGTGCCG(SEQIDNO:19),CGGCGCCGTTGCCG(SEQIDNO:34),CGGCGLLCGCCG(SEQIDNO:5),CGGCGLLLTGCCG(SEQEDNO:6),CGGCGGLLCCGCCG(SEQIDNO:7),CGGCGTCGCCGCCG(SEQIDNO:8),CGTCGACGGGACGGG(SEQIDNO:10)，CGTCGACGTGACGGG(SEQIDNO:11),GAGAGTTGGGCTCTC(SEQIDNO:12)，GTCGAGGAGGT(SEQIDNO:14),TAATALLTATTA(SEQIDNO:15),TAATATCCATTA(SEQIDNO:16)或TAATATTTATTA(SEQIDNO:17),其中L是dSpacer。30.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，其中(Nn)…(N2)(N0S2(Nw)(N效)…(Hrf)包含序列GGCGCGCTGCCG(SEQIDNO:13)。31.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，包含序列TCGACGTCGACCGTTTTGTGG(SEQIDNO:20),TCGACGTCGACGGGACGGG(SEQIDNO:21),TCGACGTCGACGTGACGGG(SEQIDNO:22),TCGACGTCGAGAGTTGGGCTCTC(SEQIDNO:23),TCGACGTCGAGCGAAGCT(SEQIDNO:24)或TCGACGTCGAGGAGGT(SEQEDNO:25)。32.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，包含序列TCGTCGTTLLACGGCGCCGTGCCG(SEQIDNO:37)，TCGTCGTTLLACGGCGLLLTGCCG(SEQIDNO:38),TCGTCGTTLLCGGCGCGGCGCCG(SEQIDNO:39)，TCGTCGTTTTACGGCGCCGTTGCCG(SEQIDNO:44)，TCGTCGTTTTACGGCGLLLTGCCG(SEQIDNO:45),TCGTCGTTTTACGGCGTTTTGCCG(SEQIDNO:49)，TCGTCGTTTTCAATATTTATTG(SEQIDNO:50)，TCGTCGTTTTCGGCGLLCGCCG(SEQIDNO:52)，TCGTCGTTTTCGGCGGLLCCGCCG(SEQIDNO:54)'TCGTCGTTTTCGGCGTCGCCGCCG(SEQIDNO:55)，TCGTCGTTTTTAATALLTATTA(SEQIDNO:57)，TCGTCGTTTTTAATATCCATTA(SEQIDNO:58)或TCGTCGTTTTTAATATTTATTA(SEQIDNO:59)，其中L是dSpacer。33.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，包含序列TCGCGTCGTTCGGCGCGCTGCCG(SEQIDNO:30)。34.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，包含序列TCGCGACGTTCGGCGCGCTGCCG(SEQIDNO:27)。35.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，包含選自以下的序列T*c*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C—G*G*C—G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)，T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43),T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*A*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:42)，t*C*g*T*C*G*C*T*T*T*G*C*G*A*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:36),T*c*G*T*C*G*C*C*C*G*G*C*G*A*C*G*C*C，*T*G*C*C*G(SEQIDNO:35)，t*C*g*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*T*G*C*C*G(SEQIDNO:44)，T*C*G*T*C*G*T*T*L*L*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:37),T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*L*L*L*T*G*C*C*G(SEQIDNO:45),T*C*G*T*C*G*T*T*L*L*A*C*G*G*C*G*L*L*L*T*G*C*C*G(SEQIDNO:38),T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*L*L*C*C*G*C*C*G(SEQIDNO:54),T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*T*C*G*C*C*G*C*C*G(SEQIDNO:55),T*c*G*T*C*G*T*T*L*L*C*G*G*C*G*C*G*G*C*G*C*C*G(SEQIDNO:39)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*L*L*C*G*C*C*G(SEQIDNO:52)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*A*A*T*A*T*T*T*A*T*T*A(SEQIDNO:59)，T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*T*A*A*T*A*T*T*T*A*T*T*A(SEQIDNO:59)，T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*C*A*A*T*A*T*T*T*A*T*T*G(SEQIDNO:50),T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*T*A*A*T*A*T*C*C*A*T*T*A(SEQIDNO:58)，T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*A*A*T*A*L*L*T*A*T*T*A(SEQIDNO:57)，T*c*G*T*C—G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*L*L*L*T*G*C*C*G(SEQIDNO:45),T*C*G*T*C—G*T*T*L*L*A*C*G*G*C*G*L*L*L*T*G*C*C*G(SEQIDNO:38)，禾口T*c*G*T*C—G*T*T*T*T*C*G*G*C*G*G*L*L*C*C*G*C*C*G(SEQIDNO:54):其中L是dSpacer，*是硫代磷酸酯，—是磷酸二酯。36.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，包含選自以下的序列T*C*G*A*C*G*T*C*G—A—C*G*G*G*A*C*G*G*G(SEQIDNO:21)，T*C*G*A*C*G*T*C*G_A—C*G*T*G*A*C*G*G*G(SEQIDNO:22),T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G*G*G*A*C*G*G*G(SEQIDNO:21)，T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*G*G*A*G*G*T(SEQIDNO:25)，T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*G*C*G*A*A*G*C*T(SEQIDNO:24)，T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*C*G*T*T*T*T*G*T*G*G(SEQIDNO:20)禾口T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*G*A*G*T*T*G*G*G*C*T*C*T*C(SEQIDNO:23)，其中*是硫代磷酸酯，一是磷酸二酯。37.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，包含選自以下的序列-T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G*T*G*A*C*G*T*Q(SEQIDNO:62),T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G*T*G*A*C*G(SEQIDNO:61),T*C—G*T*C—G*A*C—G*T*T*C—G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:65)，T*C*G*T*C—G*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:66)，T*C*G*T*C—G*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C_G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:67),T*C*G*A*C*G*T*C*G*A*C*G*T*G*A*C*G*T*T(SEQIDNO:63),t*C*g*T*C—g*A*C_g*A*T*C_g*g*C*g*C*C_g*T*g*C*C*g(SEQIDno:64):t*C*g*T*C*G*A*C*G*A—T—c*g*g*c*g*c*c*g*t*g*c*c*g(SEQidno:64):T*C*G*A*C—G*T*C*G*A*CJ3*T*G*A*C*G*T*T(SEQIDNO:63),T*C*G*A*C_G*T*C*G*A*C*G*T—G*A*C*G*T*T(SEQIDNO:63)和T*C*G*T*C—G*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G*T(SE<3IDNO:68),其中*是硫代磷酸酯，—是磷酸二酯。38.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，包含選自以下的序列-T*C*G*C—G*T*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C—G*C*T*G*C*C*G(SEQIDNO:30)'T*C*G—C*G*T*C*G*T*T*C—G*G*C*G*C—G*C*T*G*C*C*G(SEQIDNO:30)，和T*C*G*C*G_T*C*G*T*T*C_G*G*C*G*C—G*C*T*G*C*C*G(SEQIDNO:30)，其中*是硫代磷酸酯，_是磷酸二酯。39.權利要求1的免疫剌激性核酸分子，包含序列T*c*g*C—G*A*C*G*T*T*C—G*G*C*G*C—G*C*T*G*C*C*G(seqIDno:27),其中*是硫代磷酸酯，—是磷酸二酯。40.權利要求l的免疫刺激性核酸分子，包含選自以下的序列T*C—G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*T*C*G*T*G*C*C*G(SEQEDNO:48)，T*C—G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*T*C*G*C*G*C*C*G(SEQIDNO:47),禾卩T*C—G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*T*C*G*C*G(SEQIDNO:46)，其中*是硫代磷酸酯，—是磷酸二酯。41.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，包含序列T*C_G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*T*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:48),其中*是硫代磷酸酯，_是磷酸二酯。42.權利要求1的免疫刺激性核酸分子，其中所述寡核苷酸中至少一個核苷酸是取代或修飾的嘌呤或嘧啶。43.權利要求42的免疫刺激性核酸分子，其中所述取代的嘧啶是C5-或C6-取代的嘧啶。44.權利要求42的免疫刺激性核酸分子，其中所述取代的嘌呤是C8-或C7-取代的嘌呤。45.權利要求42的免疫刺激性核酸分子，其中所述取代或修飾的嘌呤或嘧啶選自5-取代胞嘧啶、6-取代胞嘧啶、N4-取代胞嘧啶、5-氮雜胞嘧啶、2-巰基-胞嘧啶、異胞嘧啶、假-異胞嘧啶、帶稠環系統的胞嘧啶類似物和尿嘧啶衍生物、胸腺嘧啶衍生物、7-去氮雜鳥嘌呤、7-去氮雜-7-取代鳥嘌呤、7-去氮雜-8-取代鳥嘌呤、7-去氮雜-8-氮雜鳥嘌呤、次黃嘌呤、N2-取代鳥嘌呤、5-氨基-3-甲基-3H，6H-噻唑並[4,5-dl嘧P定-2,7-二酮、2，6-二氨基嘌呤、2-氨基嘌呤、嘌呤、吲哚、取代腺嘌呤、8-取代鳥嘌呤和6-硫代鳥嘌呤。46.權利要求42的免疫刺激性核酸分子，其中所述取代或修飾的嘌呤或嘧啶選自5-甲基胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-氯胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、5-羥基胞嘧啶、6-羥基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-二氟甲基胞嘧啶和未取代或取代5-炔基胞嘧啶、N4-乙基胞嘧啶、N，N，-亞丙基胞嘧啶、吩嗜嗪、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-羥基尿嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶、4-硫代胸腺嘧啶、6-取代胸腺嘧啶、7-去氮雜-7-(C2-C6)炔基鳥嘌呤、N2-甲基-鳥嘌呤、N6-甲基-腺嘌呤、8-氧雜腺嘌呤、8-羥基鳥嘌呤和8-溴鳥嘌呤。47.權利要求42的免疫刺激性核酸分子，其中所述取代或修飾的嘌呤或嘧啶選自通用鹼基、芳環系統、芳環系統和氫原子(dSpacer)。48.權利要求42的免疫刺激性核酸分子，其中所述取代或修飾的嘌呤或瞎啶選自4-甲基吲哚、5-硝基吲哚、3-硝基吡咯、P-鹼基和K-鹼基、苯並咪唑、二氯苯並咪唑、l-甲基-lH-l，2，4三唑-3-羧醯胺、氟苯和二氟苯。49.權利要求l的免疫剌激性核酸分子，其中N、S、X或Z中任意一個被選自下組的殘基取代C6-C30烷基鏈、膽汁酸、膽酸、牛磺膽酸、脫氧膽酸、膽固醇、oleyllitocholicacid、油醯膽烯酸、糖脂、磷脂、鞘脂、類異戊二烯、類固醇、維生素、維生素E、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、脂肪酸酉旨、甘油三酯、芘類、卟啉類、Texaphyrine、金剛烷、吖啶類、生物素、香豆素、螢光素、羅丹明、德克薩斯紅、地高辛、二甲氧基三苯甲基、叔丁基二甲基矽烷基、叔丁基二苯基矽垸基、花青染料、花青染料Cy3、花青染料Cy576、Hoechst33258染料、補骨脂素和布洛芬。50.免疫刺激性核酸分子，包括(a)5，端，始於選自(TCG)nN和RDCGY,Y2N的免疫刺激性基序，其中T是胸腺嘧啶，C是未甲基化胞嘧啶，G是鳥嘌呤，R是嘌呤，D不是C，^和Y2相互獨立地是嘧啶，n是l-4之間的整數，包括兩端，N是0-12個鹼基長的任意序列；(b)3'端，以能形成髮夾或莖環結構的反向重複終止，所述結構包括長2-6個連續鹼基對的富含GC的莖，和至少一個未匹配或錯配鹼基；和(c)部分穩定化的骨架，包含至少一個5，-CpG-3，磷酸二酯鍵。51.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中富含GC的莖是2個連續鹼基對長。52.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中富含GC的莖是3個連續鹼基對長。53.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中富含GC的莖是4個連續鹼基對長。54.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中富含GC的莖是5個連續鹼基對長。55.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中富含GC的莖是6個連續鹼基對長。56.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中富含GC的莖包含至少2個G-C鹼基對。57.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中富含GC的莖包含至少3個G-C鹼基對。58.權利要求50-57中任意一項的免疫刺激性核酸分子，其中所述至少一個未匹配或錯配的鹼基是T。59.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中所述包括至少一個5，-CpG-3，磷酸二酯鍵的部分穩定化骨架還包含多個核苷酸間硫代磷酸酯鍵。60.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中所述5'端具有序列TCGTCGTTTTA(SEQIDN0:41)。61.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中所述以反向重複終止的3'端具有鹼基序列CGGCGCCGTGCCG(SEQIDNO:19)。62.權利要求50的免疫刺激性核酸分子，其中所述以反向重複終止的3'端具有鹼基序列CGGCGTCGTGCCG(SEQIDNO:9)。63.具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸TCGTCGTTTTACGGCGCCGTGCCG(SEQIDNO:43)。64.具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸TCGTCGTTTTACGGCGTCGTGCCG(SEQEDNO:48)。65.具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸T*C—G*T*C*G*T*T*T*T*A*C*G*G*C*G*C*C*G*T*G*C*C*G(SEQIDNO線其中*代表核苷酸間硫代磷酸酯鍵，_代表核苷酸間磷酸二酯鍵。66.具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C—G*G*C—G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)'其中*代表核苷酸間硫代磷酸酯鍵，_代表核苷酸間磷酸二酯鍵。67.具有以下鹼基序列的免疫剌激性核酸T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*A*C—G*G*C*G*C*C-G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43),其中*代表核苷酸間硫代磷酸酯鍵，_代表核苷酸間磷酸二酯鍵。68.具有以下鹼基序列的免疫刺激性核酸T*C*G*T*C—G*T*T*T*T*A*C_G*G*C*G*C*C—G*T*G*C*C*G(SEQIDNO:43)，其中*代表核苷酸間硫代磷酸酯鍵，_代表核苷酸間磷酸二酯鍵。69.包含權利要求1-68中任意一項的免疫刺激性核酸分子和抗原的疫苗。70.包含權利要求1-68中任意一項的免疫刺激性核酸分子和藥學上可接受載體的藥物組合物。71.誘導I型幹擾素(IFN)表達的方法，包括使能表達I型IFN的細胞與權利要求1-68中任意一項的免疫剌激性核酸接觸，所述核酸的量可以有效誘導I型IFN表達。72.權利要求71的方法，其中所述I型IFN是幹擾素a(IFN-oc)。73.誘導y幹擾素(IFN-y)表達的方法，包括使能表達IFN-Y的細胞與權利要求1-68中任意一項的免疫刺激性核酸接觸，所述核酸的量可以有效誘導IFN-Y表達。74.活化自然殺傷(NK)細胞的方法，包括使NK細胞與權利要求1-68中任意一項的免疫刺激性核酸接觸，所述核酸的量可以有效活化NK細胞。75.治療感染的方法，包括向患有感染或有發生感染風險的對象給予權利要求1-68中任意一項的免疫刺激性核酸，所述核酸的量可以有效治療或預防感染。76.權利要求75的方法，其中所述對象患有以下感染或有發生以下感染的風險病毒、細菌、真菌或寄生蟲感染。77.權利要求75的方法，其中所述對象患有病毒感染或有發生病毒感染的風險，其中病毒選自B肝病毒(HBV)、C肝病毒(HCV)、巨細胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、乳頭瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)或單純皰疹病毒(HSV)。78.權利要求75的方法，其中所述對象患有細菌感染或有發生細菌感染的風險，其中細菌物種選自利什曼蟲屬、利斯特氏菌屬或炭疽。79.治療變態反應疾病的方法，包括向患有變態反應疾病或有發生風險的對象給予權利要求1-68中任意一項的免疫刺激性核酸，所述核酸的量可以有效治療或預防變態反應疾病。80.權利要求79的方法，其中所述變態反應疾病是變態反應性哮喘。81.治療癌症的方法，包括向患有癌症或有發生癌症風險的對象給予權利要求1-68中任意一項的免疫刺激性核酸，所述核酸的量可以有效治療或預防癌症。82.權利要求81的方法，其中所述癌症選自基底細胞癌、膽管癌、膀胱癌、骨癌、腦和中樞神經系統癌症、乳癌、宮頸癌、絨膜癌、結直腸癌、結締組織癌症、消化系統癌症、子宮內膜癌、食管癌、眼癌、頭頸癌、胃癌、上皮內贅生物、腎癌、喉癌、白血病、肝癌、肺癌、包括何杰金和非何杰金氏淋巴瘤的淋巴瘤、黑素瘤、骨髓瘤、神經母細胞瘤、口腔癌、卵巢癌、胰癌、前列腺癌、視網膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、直腸癌、腎癌、呼吸系統癌症、肉瘤、皮膚癌、胃癌、睪丸癌、甲狀腺癌、子宮癌、泌尿系統癌症，或其它癌和肉瘤。83.權利要求81的方法，其中所述癌症是對幹擾素ot(IFN-a)治療敏感的癌症。84.權利要求83的方法，其中所述對IFN-a治療敏感的癌症選自毛細胞白血病、慢性髓性白血病、皮膚T細胞白血病、多發性骨髓瘤、濾泡淋巴瘤、惡性黑素瘤、鱗細胞癌、AIDS相關卡波希肉瘤、腎細胞癌、前列腺癌、宮頸發育異常或結腸癌。85.權利要求1-68中任意一項的免疫剌激性核酸在製造用於治療感染的藥物中的用途。全文摘要本發明涉及一類含有CpG免疫刺激性基序和第二基序的CpG免疫刺激性寡核苷酸，所述寡核苷酸能在體內和體外形成二級結構，包括雙鏈體和更高級結構。本發明的寡核苷酸可用作疫苗接種中的佐劑。所述寡核苷酸也可用於誘導免疫應答、誘導表達I型幹擾素(IFN)、誘導表達γ-幹擾素，並用於治療多種疾病，包括變態反應、哮喘、感染和癌症。文檔編號A61K39/39GK101454451SQ200480032018公開日2009年6月10日申請日期2004年10月29日優先權日2003年10月30日發明者伯恩哈德·O·諾爾,歐根·烏爾曼,約爾格·福爾默,阿瑟·M·克裡格申請人:科勒製藥有限公司;科勒製藥集團有限公司