髮夾標記的探針及其使用方法

2023-04-23 19:15:01 5

專利名稱：髮夾標記的探針及其使用方法
相關申請的交叉參考本申請要求2003年7月7日提交的美國臨時專利申請60/485,471的利益，其以其全部內容引入這裡作為參考。
背景技術：
核酸雜交是檢測靶核酸的一種有效方法。不過，目前的檢測探針和方法具有某些損害在不同的應用中檢測低水平靶核酸的能力的缺點。例如，由於它們的大小較小，寡核苷酸探針不能使用化學方法(例如，鉑或補骨脂素化合物)或酶促方法(例如，隨機引物標記，聚合酶鏈式反應標記或切口平移標記)容易地進行標記。最常見地，其合成期間或，可選擇地，合成後，使用3′-末端標記進行寡核苷酸標記，其包括添加標記的核苷酸到寡核苷酸的3′-末端。可使用「鏈終止」核苷酸添加單一標記的核苷酸；可選擇地，可使用非終止的核苷酸，導致添加多個核苷酸而形成「尾」(圖1A)。然而，「形成尾」的缺點包括，例如，從一個實驗到另一個實驗中「尾」長度的變異性，一般添加的標記數量較少(大多數「具尾」寡核苷酸僅僅具有1-2個添加的標記)，以及只能標記較少量的寡核苷酸。
對於合成標記，另一種常見方法，在化學合成期間，標記的核苷酸(例如，亞磷醯胺核苷酸)被摻入到寡核苷酸中。可以把標記添加到寡核苷酸的5』，3』末端或者兩個末端(圖1B)(參見，例如，美國專利No.5,082,830)，或ODN內部的鹼基位置(圖1C)。然而，由於存在大的標記分子引起的對寡核苷酸雜種穩定性的有害影響，內標記對靶核酸是不利的。更進一步地，內標記受到序列中存在的同源核苷酸數目的限制。
目前的一些寡核苷酸探針包括形成髮夾結構的核苷酸序列。(參見，例如，美國專利No.5,674,683；5,808,036；6,114,121。)但是，這些探針也具有如上所述的類似的缺點，例如，內部核苷酸被標記，或寡核苷酸在5』末端被標記。更進一步地，雖然其它具有髮夾結構的寡核苷酸已經開發作為捕獲探針(參見，例如，美國專利No.5,770,365；6,380377)，但是這些結構尚未計劃用作具有增加的檢測靈敏度的檢測探針。
因此，目前的雜交探針和方法，限制了核酸的檢測能力，從而限制了它們在各種程序中的有效應用，包括診斷與分析應用。例如，使用目前的探針和方法，常常在無症狀的患者中，無法檢測到例如，人類免疫缺陷性病毒(HIV)，埃-巴二氏病毒(EBV)或巨細胞病毒(CMV)的病毒負荷，從而限制了其鑑定早期疾病或在潛伏期評估主要感染的細胞類型的能力。需要用於評估病毒感染的迅速的，靈敏的方法，包括病毒庫的更精確的識別，以最佳化治療介入。
因此，本領域需要標記用於增加的檢測靈敏度的寡核苷酸雜交探針。這裡提供的組合物和方法滿足這些及其它需要。

發明內容
本發明提供了標記的寡核苷酸，其包含(1)基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段和(2)包含莖區域和環區域的髮夾結構，其中髮夾結構內的兩個或多個核苷酸具有可檢測標記。在某些實施方案中，標記的寡核苷酸在靶結合區段與髮夾結構之間還包括接頭。在不同的實施方案中，具有可檢測標記的髮夾核苷酸位於環區域，莖區域，或者環和莖區域兩者內。在特定的實施方案中，至少5個核苷酸(例如，9個核苷酸)被可檢測地標記。此外，在本發明的某些實施方案中，髮夾標記的寡核苷酸可以具有，例如，至多60，至多100，或至多150個核苷酸。在其它的實施方案中，環區域具有3-10個核苷酸，和/或莖區域具有16-40個核苷酸。可檢測標記的核苷酸可以相鄰或者相隔至少2個核苷酸(例如，相隔2-6個核苷酸)。
在一些實施方案中，靶結合區段是預先確定的區段(也即，根據預先確定的核酸如，例如，病毒核酸(例如，HIV或EBV核酸)而計劃的)。在其它的實施方案中，靶結合區段是隨機區段或簡併區段。
在其它的實施方案中，可檢測標記是間接標記如，例如，生物素或半抗原(例如，地高辛配基，二硝基苯酚(DNP)，生物素和螢光素)。仍然在其它的實施方案中，可檢測標記是直接標記如，例如，螢光團(例如，螢光素，羅丹明，德克薩斯紅，藻紅蛋白，Cy3和Cy5)。
仍然在其它的實施方案中，本發明提供了一種標記的寡核苷酸，其包含(1)基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段；(2)包含第一莖區域和第一環區域的第一髮夾結構；和(3)包含第二莖區域和第二環區域的第二髮夾結構；其中第一髮夾結構內的至少一個核苷酸和第二髮夾結構內的至少一個核苷酸具有可檢測標記，而且其中髮夾結構與靶結合區段的相對末端連接。在某些實施方案中，第一，第二或兩個髮夾結構內至少2個核苷酸被可檢測地標記。
在某些實施方案中，本發明還提供了一種樹枝狀聚合體(dendrimer)探針，其包含(1)兩個或多個標記的寡核苷酸，其包含(a)基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段和(b)包含莖區域和環區域的髮夾結構，其中該髮夾結構內的兩個或多個核苷酸具有可檢測標記；和(2)連接寡核苷酸的分支分子。
仍然在其它實施方案中，本發明提供了一種標記的生物分子，其包含(1)形成包含莖區域和環區域的髮夾結構的寡核苷酸，其中該髮夾結構內的許多核苷酸具有可檢測標記；和(2)連接寡核苷酸與生物分子的接頭。
本發明還提供了一種在樣品中檢測靶核酸的方法。該方法包括以下步驟(1)使樣品與寡核苷酸探針接觸，該寡核苷酸探針包含(a)基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段；和(b)包含莖區域和環區域的髮夾結構，其中該髮夾結構內的許多核苷酸具有可檢測標記；(2)在足以允許靶結合區段與靶核酸雜交的條件下，孵育樣品和寡核苷酸探針；和(3)檢測雜交的寡核苷酸探針上的標記，以檢測靶核酸。在一些實施方案中，該方法更進一步包括在檢測標記之前除去未雜交的寡核苷酸探針。而且，在不同的實施方案中，用於該檢測方法的寡核苷酸探針是如上面所述的任何髮夾-標記的寡核苷酸。在另一個實施方案中，使用的探針是如上所述的髮夾標記的樹枝狀聚合體探針。
此外，在該方法的某些實施方案中，其中可檢測標記是間接標記，檢測包括使間接標記與次級標記接觸。例如，其中該間接標記是生物素時，間接標記可以是，例如，抗生蛋白鏈菌素。類似地，其中間接標記是半抗原時，次級標記可以是，例如，標記的抗半抗原抗體。
仍然在檢測方法的其它實施方案中，靶核酸固定於固體基質上。可選擇地，在其它實施方案中，靶核酸在細胞或組織樣品中，而且標記的寡核苷酸與靶核酸原位雜交。在某些實施方案中，雜交的寡核苷酸探針上的標記的檢測包括液相分析如，例如，包括流式細胞術的分析。
本發明還提供了一種用於引物延伸的方法，其包括在靶核酸用作模板用於從引物延伸以產生延伸的引物的條件下，使靶核酸與寡核苷酸引物接觸，該寡核苷酸引物包含(1)基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段和(2)包含莖區域和環區域的髮夾結構，其中髮夾結構內的兩個或多個核苷酸具有可檢測標記。在某些實施方案中，該方法還包括在靶核酸用作模板用於從寡核苷酸引物和第二引物擴增以產生擴增產物的條件下，使靶核酸與包含基本上與延伸的引物互補的引發區段的第二引物接觸。第二引物可以，例如，包括包含第二莖區域與第二環區域的第二髮夾結構，其中第二髮夾結構內的至少一個核苷酸具有可檢測標記。在包括使用兩個髮夾標記的引物的某些實施方案中，每個第一和第二引物的髮夾結構中至少一個核苷酸被可檢測地標記。
在引物延伸方法的一些實施方案中，在存在未標記的游離核苷酸時進行擴增。在其它的實施方案中，靶結合區段是隨機的(例如，具有例如3-10個核苷酸的隨機區段)。
本發明還提供了一種用於檢測靶核酸的試劑盒，該試劑盒包含提供(1)標記的寡核苷酸或(2)樹枝狀聚合體探針的至少一個第一容器，所述標記的寡核苷酸包含(a)基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段和(b)包含莖區域和環區域的髮夾結構，其中該髮夾結構內的兩個或多個核苷酸具有可檢測標記；所述樹枝狀聚合體探針包含(a)兩個或多個如(1)中所述的標記的寡核苷酸和(b)連接寡核苷酸的分支分子。在某些實施方案中，可檢測標記是間接標記，而且試劑盒還包括至少一個第二容器，其提供用於檢測間接標記的次級試劑。
本發明進一步提供了一種用於寡核苷酸引物的引物延伸的試劑盒，該試劑盒包含至少一個提供標記的寡核苷酸引物的第一容器，該標記的寡核苷酸引物包含(a)基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段和(b)包含莖區域和環區域的髮夾結構，其中該髮夾結構內的兩個或多個核苷酸具有可檢測標記，而且其中該髮夾結構位於靶結合區段的5』端。在某些實施方案中，該試劑盒進一步包含至少一個提供第二引物的第二容器，該第二引物包含基本上與延伸引物互補的引發區段，該延伸引物在靶核酸用作模板用於從標記的寡核苷酸引物延伸的條件下產生。仍然在其它的實施方案中，試劑盒還包括至少一個提供標記的或未標記的游離核苷酸的第三容器，至少一個提供聚合劑的第四容器，和至少一個提供適於引物延伸的緩衝液的第五容器。


圖1A和1B描繪了不同類型的寡核苷酸探針的例子(A)3′-生物素-結尾的寡核苷酸；(B)3′，5′-生物素化的寡核苷酸；和(C)內部生物素化的寡核苷酸。
圖2描繪了髮夾標記的寡核苷酸的例子，其顯示了與靶區域，短接頭，和具有莖和環區域的標記的髮夾互補的序列。
圖3A和3B描繪了使用髮夾標記的寡核苷酸引物，通過PCR(A)和隨機引發(B)產生標記探針的圖示。
圖4A和4B描繪了使用髮夾標記的寡核苷酸檢測新生核糖體RNA。使用間插轉錄序列-1(ITS-1)新生核糖體RNA內髮夾標記的或常規的3′，5′-生物素化的寡核苷酸探針靶向序列，進行螢光原位雜交(FISH)。雜交以後，使用Cy3-連接的抗生蛋白鏈菌素檢測結合的探針，而且對樣品進行同等地數字成像。(A)使用常規的生物素標記，檢測ITS-1 RNA。雜交信號僅僅對核仁是特異性的，與新生核糖體RNA的預期定位一致。(B)使用髮夾標記的寡核苷酸探針進行ITS-1檢測，顯示與(A)中相同的標記特異性，但是顯示顯著更強的雜交信號。
圖5描繪了使用不同的寡核苷酸探針的雜交信號強度的流式細胞術比較。使用常規的3′，5′-生物素化(C)或髮夾標記(D)，對新生核糖體RNA的間插轉錄序列-1(ITS-1)內的合成寡核苷酸探針靶向序列進行標記。液相雜交以後，使用流式細胞儀測量信號強度，並對結果的直方圖描記作圖。為了進行比較，還對不包含探針(A)或含有不相關探針(B)的樣品進行了分析。髮夾標記(綠色)導致信號強度比常規的標記(C)增加了大約50％。
圖6A-6F描繪了用於新生核糖體RNA和埃-巴二氏病毒EBER-1 RNA的代表性寡核苷酸探針的圖示和序列。(A).ITS-1新生核糖體RNA常規探針。(B).ITS-1髮夾標記探針。(C).EBER-1 RNA常規探針。(D).EBER-1 RNA髮夾標記探針。(E).生物素化的髮夾標記莖和環結構與序列。(◆)表示生物素標記。(B)與(D)中強調的序列表示與靶區域互補的序列。
圖7A-7D描繪了4個不同標記的髮夾結構，其顯示了標記方案中生物素的不同分布。
發明詳述I.定義除非另外進行定義，這裡使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常所理解的相同的含義。儘管與這裡所述的方法與材料類似的任何方法與材料都可用於實踐或測試本發明，但是僅僅描述了示例性的方法與材料。為了本發明的目的，下面對下列術語進行了定義。
術語「a」，「an」與「the」不是限定的，而且將包括複數對象，除非上下文另外清楚地標明。
術語「核苷酸」，除了指天然存在的核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸單體以外，這裡應當理解為指其相關的結構變體，包括衍生物和類似物，也即相對於特定上下文的功能等價體，其中正在使用該核苷酸(例如，形成髮夾結構，與互補鹼基雜交，或兩個非鄰近核酸區段的連接)，除非上下文中另外清楚地指明。
術語「核酸」與「多核苷酸」是同義的，指具有多個核苷酸單體的聚合物。核酸可以是單鏈或雙鏈的，而且可以是DNA(cDNA或基因組)，RNA，合成的形式，和混合的聚合物，還可以是化學或生物化學修飾的，或者可以包含非天然的或衍生的核苷酸鹼基。這種修飾包括，例如，甲基化，用類似物置換一個或多個天然存在的核苷酸，核苷酸間修飾如不帶電荷的連接(例如，膦酸甲酯，磷酸三酯，氨基磷酸酯，氨基甲酸酯，等等)，帶電荷連接(例如，硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，等等)，未定的部分(例如，多肽)，嵌入劑(例如，吖啶，補骨脂素，等等)，螯合劑，烷化劑和修飾的連接(例如，α端基異構核酸，等等)。還包括合成的分子，其通過氫鍵鍵合及其它化學相互作用，模仿多核苷酸與指定序列結合的能力。一般，核苷酸單體通過磷酸二酯鍵連接，雖然核酸的合成形式可以包含其它的連接(例如，如Nielsen et al.，上文，Science 254，1497-1500，1991中描述的肽核酸)。「核酸」或「多核苷酸」不指任何特定長度的聚合物，而且因此基本上可以是任何長度，一般是大約6個核苷酸到大約109個核苷酸或更大。在雙鏈聚合物的情況中，「核酸」或「多核苷酸」可以指兩個鏈中的任何一個或者兩者。
術語「寡核苷酸」指長度為大約6到大約175個核苷酸或更多的多核苷酸的子集。一般的寡核苷酸長度至多大約100個核苷酸。寡核苷酸可以使用已知的方法合成(例如，使用自動化寡核苷酸合成儀如，例如，Applied BioSystems(Foster City，CA)製造的那些)。
術語「靶核酸」指待檢測或將用作模板用於引發(例如，PCR或隨機引發)的核酸。靶核酸可以是單鏈或雙鏈的，雖然，為了這裡所述的應用，通常使用已知的方法使雙鏈靶成為單鏈的。靶核酸可以包括，例如，來自基本上任何天然來源的具有核酸的原核生物的，真核生物的，或病毒的多核苷酸(例如，細胞，組織或生物學液體)。
「寡核苷酸探針」定義為能通過一種或多種類型的化學鍵，通常通過互補鹼基配對，通常通過氫鍵形成，與基本上互補性的靶核酸結合的寡核苷酸。探針可以包括天然的(也即，A，G，C或T)或修飾的鹼基(例如，7-脫氮鳥苷或次黃嘌呤核苷)。而且，探針中的鹼基可以通過除了磷酸二酯鍵以外的鍵而進行連接，只要它不妨礙雜交。例如，寡核苷酸探針可以是肽核酸，其中組成鹼基通過肽鍵而不是磷酸二酯鍵進行連接。
「標記的寡核苷酸」是共價，通過接頭，或通過離子鍵，範德華力或氫鍵結合標記的寡核苷酸，以便可以通過檢測與探針結合的標記的存在而檢測探針的存在。
「間接標記」是特異性可結合的分子(「配體」)，其可使用與間接標記特異性結合的標記的次級試劑而進行檢測。相反地，「直接標記」可不用配體結合伴侶相互作用而進行檢測。對於間接標記，次級試劑一般具有直接標記，或，可選擇地，次級試劑也可以間接地進行標記。典型的「直接標記」包括，例如，螢光團(例如，螢光素，羅丹明或酞菁染料)，發色團(例如，藻膽蛋白)，發光團(例如，化學發光團和生物發光團)，鑭系元素螯合物(例如，Eu3+或Tb3+的複合物)，酶(例如，鹼性磷酸酶)，輔因子，和包含放射性同位素如，例如，3H，35S，32P，125I和14C的殘基。典型的間接標記包括，例如，半抗原，生物素或其它的特異性可結合的配體。
「半抗原」指分離的抗原表位，也即，具有抗原決定簇的分子。半抗原的例子包括二硝基苯酚(DNP)，地高辛配基，生物素和螢光素。作為間接標記，半抗原一般可使用抗半抗原抗體作為配體結合伴侶進行檢測。但是，半抗原還可以使用可選擇的配體結合伴侶進行檢測(例如，在生物素的情況中，例如，抗生物素抗體或抗生蛋白鏈菌素可用作配體結合伴侶)。更進一步地，在某些實施方案中，還可以直接地對半抗原進行檢測(例如，在螢光素的情況中，可使用抗螢光素抗體或螢光的直接檢測)。
在兩個核酸的情況中，「相似性」，當進行比較和最大對應的排列比對時，指兩個核酸具有相似的核苷酸序列(如通過目測觀察或使用序列比較算法如，例如，PILEUP或BLAST進行測定時)。例如，當進行比較和最大對應的排列比對時，如果兩個核酸具有至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，或至少95％的核苷酸同一性，那麼這兩個核酸是相似的。如果兩個核酸具有至少60％，典型地至少80％，更典型地至少90％，至少95％，或至少99％的核苷酸同一性，那麼它們是「基本相似」或「基本同一」的。
「預先確定的核酸」指用於設計寡核苷酸探針的靶結合區域的核酸(也即，用於基本上互補性)。例如，靶核酸或與靶相似的核酸可以預先確定。這裡根據預先確定的核酸設計的靶結合區域是寡核苷酸探針的「預先確定的靶結合區域」或「預先確定的區段」。
在寡核苷酸探針的情況中，「隨機區段」和「隨機靶結合區域」指具有隨機排序的核苷酸的靶結合區域或其衍生物，例如，四種鹼基中的任何一個在靶結合區域內佔據任何位置的可能性相等。
「簡併靶結合區域」或「簡併區段」指根據預先確定的肽或多肽基於遺傳密碼的簡併性設計的靶結合區域。因此，簡併靶結合區域具有固定的而且簡併的核苷酸位置。根據對應的胺基酸和密碼子位置，「簡併」核苷酸位置被兩種，三種或四種鹼基中的任何一種佔據的可能性相等。
術語「樣品」一般指生物來源的材料。樣品可包括，例如，組織；細胞；血漿；血清；脊髓液；淋巴液；淚水；唾液；血細胞；毛髮；腫瘤；器官；皮膚，呼吸道，腸道和泌尿生殖道的外切片。樣品也可包括上述的體外細胞培養物組分。可以對樣品進行純化或半純化以除去某些組分(例如，非多核苷酸或其它非靶組分)。
「基本互補」指核酸鏈能與靶核酸鏈雜交。「雜交」指互補的核苷酸或核苷酸鹼基之間足夠的氫鍵結合，其可以是，例如，Watson-Crick，Hoogsteen或反向的Hoogsteen氫鍵結合，以致核酸鏈之間發生穩定和特異性結合。雜交能力根據嚴格條件確定，包括合適的緩衝液濃度和溫度，其允許與具有完全或部分互補性區域的靶核酸特異性雜交。因此，不是核酸的所有核苷酸都需要互補。此外，當核酸鏈與靶核酸的所有，部分或重疊區域雜交時，核酸鏈是「基本互補」的。建立用於設計本發明寡核苷酸的嚴格雜交條件的定性和定量考慮事項是本領域已知的。(參見，例如，Ausubel et al.，ShortProtocols in Molecular Biology(4th ed.，John Wiley Sons1999)；Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(3d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；NucleicAcid HybridisationA Practical Approach(B.D.Hames S.J.Higgins eds.，IRL Press 1985).)嚴格雜交條件可包括，例如，大約45℃於6xNaCl/檸檬酸鈉(SSC)中進行雜交步驟，接著於50℃用2xSSC進行洗滌；或者，可選擇地，例如，42℃在5xSSC，20mMNaPO4，pH 6.8，50％甲醯胺中進行雜交，接著於42℃用0.2xSSC進行洗滌。典型地，當例如，至少90％的各自的鹼基互補時，更典型地當至少95％而且優選當100％的各自的鹼基互補時，兩個核酸區域是基本互補的。
「Tm」定義為50％的靶序列與完全匹配的探針雜交時的溫度(在規定的離子強度和pH下)。
術語「引物」指在合適的緩衝液中和在適當的溫度下，在合適的條件下(也即，存在4種不同的核苷三磷酸和用於聚合的試劑，如DNA或RNA聚合酶或逆轉錄酶時)，能充當模板定向核酸合成的起始點的多核苷酸。因此，引物包括與靶核酸(模板)雜交的靶結合區域。引物一般是寡核苷酸，而且是單鏈的，雖然，引物可指具有雙鏈區段的多核苷酸(例如，如下文所述，具有單鏈和髮夾區域的寡核苷酸)。適於引物的靶結合區域的合適長度取決於引物的預期用途，但是一般為6到40個核苷酸。短的引物分子通常需要較低的溫度，以與模板形成足夠穩定的雜交複合物。引物不必反映模板的確切序列，但是必須是充分互補的，以便與模板雜交。術語引物位點指靶核酸中引物與其雜交的區域。術語引物對指一組引物，其包括與待擴增核酸序列的5』末端雜交的5』上遊引物，和與待擴增序列的3』末端的互補物雜交的3』下遊引物。
術語「髮夾結構」指具有雙鏈「莖」區域和單鏈「環」區域的核酸，其中莖區域和環區域由具有以下部分的單鏈核酸組成(1)互相，基本上互補的兩個區域，以便形成包含莖的雙鏈區段(也即，通過互補鹼基配對)和(2)在兩個互相互補的區域之間插入的第三區域，其形成環。髮夾結構描述於，例如，Varani，Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.24379-404，1995。
術語「相鄰的」，當涉及核酸的兩個區段時，指兩個區段是非重疊的，而且沒有被插入區段隔離。
在核酸的兩個非相鄰和非重疊區段連接的情況中，「接頭」指在非相鄰區段之間插入而且與非相鄰區段相鄰的分子(單體或聚合體的)。接頭可以是核苷酸接頭(也即，位於非相鄰區段之間的而且與非相鄰區段相鄰的核酸區段)，或者是非核苷酸接頭。
術語「液相分析」指在溶液或懸浮液中對靶核酸進行檢測的任何分析(例如，在探針與靶核酸雜交時，在懸浮細胞中使用，例如，流式細胞術分析對探針進行原位檢測)。
「分離的核酸」指從它的原始環境中取出的核酸(例如，它天然存在的自然環境)。例如，在活的動物中天然存在的核酸不是分離的，但是從天然系統中共同存在的材料的一些或全部分離的相同的核酸是分離的。這種核酸可以是載體的一部分，和/或這種核酸可以是組合物的一部分，而且仍然是分離的，因為這種載體或組合物不是其自然環境的一部分。
II.髮夾標記的探針本發明提供了用於檢測靶核酸序列的新的雜交探針。該雜交探針包括合成來源的寡核苷酸，其具有能形成熱力學穩定的髮夾結構的一個或兩個末端。在髮夾結構內，兩個或多個核苷酸與可檢測分子連接(參見，例如，圖2)。每個寡核苷酸探針的具有髮夾結構的多重核苷酸的標記增強了檢測的靈敏度，同時保持了探針-靶雜種的穩定性，從而允許進行低水平靶核酸的檢測。還提供了具有許多標記的髮夾寡核苷酸分支的樹枝狀聚合體探針。髮夾標記的寡核苷酸或樹枝狀聚合體可用於以各種形式檢測核酸，包括例如，原位雜交和組織陣列，以及用於使用靶核酸作為模板，通過引物延伸方法製備標記的核酸。
寡核苷酸可以使用已知的方法合成(參加，例如，Glick andPasternak，Molecular BiotechnologyPrinciples andApplications of Recombinant DNA(ASM Press 1998))。可以使用液相或固相技術。合成方法一般是自動的，而且可包括，例如，亞磷醯胺，亞磷酸三酯，H-磷酸酯或磷酸三酯法。寡核苷酸的長度一般為至少25或至少30個核苷酸，而且可由至多100，125，150，175，或甚至更多個核苷酸組成。典型地，標記的寡核苷酸具有至多90或至多80個核苷酸，而且更典型地至多60或至多50個核苷酸。使用的合成方法可以取決於所需的寡核苷酸的長度。
髮夾區域典型地包括大約18到大約50個核苷酸，更典型地大約25到大約40個核苷酸。通過設計具有相當的反平行互補性，也即向相反的方向延伸的足夠互補性的兩個亞區，以在嚴格條件下特異性雜交，從而形成莖區域，而形成髮夾結構。在基本上互相互補的區域之間插入非互補的序列，其不發生分子內雜交，因此作為單鏈環形結構，緊接著形成雙鏈莖區域。選擇環區域中核苷酸的數量和鹼基組成，以允許互相互補的莖亞區雜交。例如，環區域設計成避免與莖區域的任一鏈基本互補，而且典型地具有3到20個核苷酸，更典型地3到10個核苷酸，最典型地5到8個核苷酸。如上文所述，選擇莖區域中核苷酸的數量和鹼基組成，為以相反的方向延伸的兩個區域基本互補，以便在嚴格雜交條件下形成所需的相對穩定的雙鏈雜種。一般，莖區域典型地具有14到46個核苷酸(也即，莖的每條鏈具有7-23個核苷酸)，更典型地16到40個核苷酸(也即，莖的每條鏈具有8-20個核苷酸)，最典型地20到32個核苷酸(也即，莖的每條鏈具有10-16個核苷酸)。
靶結合區域不與髮夾區域相重疊，而且典型地長度為至少3或至少6個核苷酸，更典型地至少10個核苷酸，甚至更典型地至少14或至少17個核苷酸，更加典型地至少25或至少30個核苷酸。在長度大於20個鹼基的一段序列內具有互補序列的靶結合區域通常是優選的。靶結合區域的長度和鹼基組成通常選擇為不妨礙連接的髮夾結構的形成，而且它本身不形成具有相等或更大熱穩定性的莖-環結構，在雜交條件下該標記的莖-環結構適於對靶核酸進行特異性檢測。
靶結合區域的核苷酸序列可以是，例如，預先確定的，隨機的或簡併的。例如，預定的靶結合區域可以設計成，與預先確定的多核苷酸如，例如，與傳染物相關的核酸(例如，病毒核酸如，例如，HIV或EBV核酸)基本互補。在隨機靶結合區域的情況中，具有隨機區段的探針可以例如，來自髮夾標記探針的隨機文庫。例如，具有隨機靶結合區域的標記寡核苷酸的文庫可包括具有代表長度N的所有可能序列(其中N是正整數)，或所有可能序列的子集的靶結合區域的那些寡核苷酸。在某些實施方案中，隨機靶結合區段的長度為3-10個核苷酸。類似地，對於簡併靶結合區域，探針可以例如，來自髮夾標記寡核苷酸的文庫，其具有代表給定肽或多肽的所有可能編碼序列的靶結合區域。
在本發明的某些實施方案中，標記的寡核苷酸可進一步包括插入髮夾與靶結合區域之間，而且與髮夾和靶結合區域相鄰的接頭。接頭一般為一個或多個核苷酸，包括非天然的或衍生的核苷酸。選擇核苷酸接頭的鹼基數量和組成，以不妨礙髮夾結構的形成或靶結合區域與其靶的雜交。核苷酸接頭的長度典型地為1-20個核苷酸，更典型地為1-10個，甚至更典型地為1-5個核苷酸。可選擇地，可使用各種不同長度的非核苷酸接頭。合適的非核苷酸接頭是本領域已知的，包括例如，間隔亞磷醯胺C3，9和18(Glenn Research，分別為#10-1913，10-1909或10-1918)。
在髮夾結構內對寡核苷酸進行內標記，使莖-環區域內的兩個或多個核苷酸與可檢測標記連接。在髮夾結構內進行標記，可引入多個標記到寡核苷酸中，而不包括參與與靶核酸形成雜種的核苷酸。在某些實施方案中，對髮夾結構內的至少5個或至少8個核苷酸進行標記；在一個示例性的實施方案中，具有可檢測標記的核苷酸數目為9。標記的核苷酸可以是相鄰的或不相鄰的。典型地，標記的核苷酸是不相鄰的，而且在整個髮夾結構中是間隔的。在間接標記的情況中，例如，標記的間隔程度設計成能使標記與次級試劑(例如，生物素和抗生蛋白鏈菌素)的配體-配體結合伴侶相互作用的位阻最小化。在典型的實施方案中，標記的核苷酸相隔至少2個，至少4個，至少6個或至少8個核苷酸。而且，標記核苷酸的間隔可隨髮夾結構而改變。在某些實施方案中，間隔分別為2或3個核苷酸到4，6，8或更多個核苷酸。更進一步地，仍然在其它的實施方案中，對環區域中的至少一個核苷酸，莖區域中的至少一個核苷酸，或每個環和莖區域中的至少一個核苷酸進行標記。
可檢測標記可以是直接的或間接的。根據本發明，適於使用的標記是本領域已知的，而且通常包括任何分子，其由於它的化學性質，而且通過直接或間接方法，提供了一種允許探針檢測的可識別信號。優選的直接標記包括螢光團如，例如，螢光素，羅丹明，德克薩斯紅，藻紅蛋白和酞菁染料(例如，Cy3或Cy5)。其它的直接標記可包括，例如，放射性核素和酶如，例如，鹼性磷酸酶，辣根過氧化物酶或β-半乳糖苷酶。可選擇地，可使用間接標記。例如，間接標記可以是生物素，其可使用，例如，標記的抗生蛋白鏈菌素(例如，與螢光素綴合的抗生蛋白鏈菌素)進行檢測。在其它的實施方案中，間接標記是半抗原，其可使用抗半抗原抗體進行檢測。根據本發明，適合使用的典型的半抗原包括，例如，生物素，地高辛配基，二硝基苯酚(DNP)和螢光素。
可檢測標記可以使用已知的方法摻入到髮夾結構中。典型地，標記在化學合成期間，使用例如，標記的核苷酸或其衍生物如標記的亞磷醯胺核苷酸，摻入到寡核苷酸中。例如，可以使用與螢光素染料(例如，6-FAMTM，HEXTM或TETTM)連接的生物素亞磷醯胺或亞磷醯胺。可選擇地，標記可以通過核苷酸或其衍生物上的接頭部分連接。例如，可在合成期間使用具有用於連接標記的接頭部分的核苷酸衍生物(例如，亞磷醯胺)，接著進行把標記賦予接頭部分的標記反應。可選擇地，具有用於連接標記的接頭部分的非核苷酸單體可以在合成期間摻入到寡核苷酸中(描述用於核苷酸探針的非核苷酸連接試劑，參見，例如，美國專利No.5,585,481)。接頭部分可以是保護的或非保護的，而且可以在聚合物合成之前或之後連接可檢測標記(例如，在對接頭部分進行脫保護之後)。更進一步地，接頭部分可以設計用於連接任何類型的化學結構，包括，例如，生物分子如，例如，多肽，肽，碳水化合物，脂類，等等。用於連接的生物分子或其它的化學結構可以是，例如，直接或間接標記(例如，螢光團，酶，或具有特異性結合特性的分子，該特性使該分子可用作這裡提供的方法的間接標記如，例如，半抗原，生物素，或對特定的受體或其它的配體結合伴侶具有特異性的另一種配體)。可選擇地，與接頭部分連接的化學結構本身可以進行可檢測標記。例如，用例如，螢光團或生物素標記的肽可連接到接頭部分上。
一般，標記或接頭連接的位點不局限於任何特定位置。例如，標記可以連接到核苷酸或其衍生物的任何位置，其依照要求不妨礙檢測或髮夾結構的形成。有用標記試劑的鹼基部分可包括天然存在的，或以不妨礙使用該鹼基的目的的方式進行修飾的那些鹼基。修飾的鹼基包括，例如，7-脫氮A和G，7-脫氮-8-氮A和G，以及其它雜環部分。
在螢光標記的情況中，螢光團不局限於單種有機分子，而是包括無機分子，有機和/或無機分子的多分子混合物，晶體，雜聚物，等等。例如，可以很容易地衍生包封到矽石殼中的CdSe-CdS核心殼納米晶體，用於偶聯生物分子(Bruchez et al.，Science，2812013-2016，1998)。類似地，高度螢光量子點(硫化鋅-加帽的硒化鎘)與用於超靈敏生物檢測的生物分子共價偶聯(Warren and Nie，Sciefzce，2812016-2018，1998)。
在本發明的某些實施方案中，寡核苷酸的兩個末端都具有髮夾結構，而且每個髮夾結構中至少一個核苷酸具有可檢測標記。在優選的實施方案中，每個髮夾中兩個或多個核苷酸被標記，更優選每個髮夾中至少5個，而且甚至更優選至少8個核苷酸被標記。在某些實施方案中，末端核苷酸(5′和3′)沒有進行可檢測標記。
樹枝狀聚合體探針在另一個方面，雜交探針是樹枝狀聚合體。術語「樹枝狀聚合體」指具有聚合「臂」的分支大分子，其發源於一個核心分子。因此，本發明的樹枝狀聚合體雜交探針具有與中心分支分子連接的兩個或多個髮夾-標記的寡核苷酸臂。製備「寡核苷酸樹枝狀聚合體」的方法一般是本領域已知的。(參見，例如，美國專利No.6,455,071；美國專利6,274,723；Azhayeva et al.，Nucleic Acids Res.231170-1176，1995；Horn and Urdea，Nucleic Acids Res.176959-6967，1989.)「分支分子」可以是單體的或聚合的，而且與分支分子的連接可通過共價或非共價相互作用。因此，本發明的樹枝狀聚合體可包括，例如，許多與分支分子共價連接的寡核苷酸如，例如，核苷衍生物(如，例如Azhayeva et al.，上文；Horn and Urdea，上文中所述的)或亞磷醯胺合成單體(參見，例如，Shchepinov et al.，Nucleic AcidsRes.254447-4454，1997)。在其它的實施方案中，寡核苷酸與分支分子如，例如，核酸聚合物通過，例如，基本上互補區域的雜交而非共價連接。例如，分支分子可以是兩個部分單鏈核酸的二聚體，其在內部區域通過互補鹼基配對連接，而且具有可用於與髮夾標記的寡核苷酸連接的4個單鏈區域(參見，例如，美國專利No.6,274,723)。
一般，每個寡核苷酸分支的髮夾結構具有至少一個可檢測標記。在優選的實施方案中，每個髮夾結構具有兩個或多個標記，每個髮夾中更優選具有至少5個，甚至更優選至少8個核苷酸。
髮夾標記的生物分子另一個方面，本發明提供了一種標記的生物分子，其包括(1)標記的寡核苷酸，其形成包含莖區域和環區域的髮夾結構，而且該髮夾結構具有與可檢測分子連接的兩個或多個核苷酸，和(2)連接寡核苷酸和生物分子的接頭。與生物分子連接的標記的髮夾結構基本上如上文所述。「生物分子」指存在於生物系統中的和/或能夠在生物系統中產生的分子種類，以及來源於這種分子的結構。合適的生物分子典型地包括，例如，肽，多肽，糖類，脂肪酸，甾類化合物，嘌呤，嘧啶，及其衍生物，結構類似物或其組合。在典型的實施方案中，標記的生物分子是非核酸生物分子如，例如，肽，多肽，碳水化合物或脂類。
而且，在典型的實施方案中，該生物分子能通過非共價相互作用如，例如，通過氫鍵，離子鍵，範德瓦爾斯引力或疏水作用，而與結合伴侶(「靶分子」)特異性地相互作用。因此，標記的生物分子可用於，例如，檢測與生物分子具有特異性結合親合力的特定靶分子。「靶分子」可包括，例如，可溶性蛋白，細胞因子，趨化因子，細胞膜蛋白，細胞受體，糖蛋白或其它的大分子。靶分子可以位於，例如，細胞溶質內，細胞表面上，分離的亞細胞器表面上，溶液中或細胞外間隙中。例如，標記的抗體或凝集素可用於分別在例如，組織樣品中，或在細胞如，例如腫瘤相關抗原表面上檢測抗原或碳水化合物的存在。具有髮夾結構的兩個或多個可檢測標記的存在使檢測的靈敏度增強，從而允許檢測低水平的靶分子如，例如，在相對少的細胞上存在腫瘤相關抗原。
連接寡核苷酸與生物分子的接頭可以是核苷酸或非核苷酸接頭，而且基本上可以是任何長度和組成的，其不妨礙髮夾結構的形成或生物分子與靶分子的相互作用。接頭可以與寡核苷酸髮夾結構的5』或3』末端連接，或可選擇地，與內部核苷酸連接。核苷酸接頭可包括用於連接生物分子的接頭部分。例如，寡核苷酸可包括具有聚醯胺主鏈的組成鹼基(參見，例如，Nielsen et al.)，其可通過肽鍵與肽或多肽連接。(參見，例如，Awasthi and Nielsen，Methods Mol.Biol.20843-52，2002；Awasthi and Nielsen，Comb.Chem.HighThroughput Screen 5253-9，2002；Balasundaram et al.，Bioorg.Med.Chem.91115-21，2001；Good et al.，Nat.Biotechnol.19360-4，2001.)可選擇地，也可使用其它的核苷酸衍生物，其中磷酸二酯基團已經被置換(例如，亞磷醯胺衍生物)。非核苷酸接頭的例子包括多糖，肽，多肽，和缺乏能與核酸進行氫鍵結合的核苷酸含氮鹼基的糖磷酸核苷酸主鏈。美國專利No.5,585,481和5,696,251(二者均屬於Arnold，Jr.et al.)中提供了其它的非核苷酸接頭的例子。
III.靶核酸的檢測在本發明的另一個方面，提供了用於在樣品中檢測靶核酸的方法。該方法包括以下步驟(1)使樣品與具有一個或多個髮夾結構，而且在該髮夾結構內具有一個或多個可檢測標記的核苷酸的雜交探針接觸；(2)在允許探針與樣品內的靶核酸雜交的條件下，孵育樣品與探針；和(3)檢測雜交的探針上的標記，以檢測靶核酸。
雜交探針用於這裡提供的方法的探針包括上文第II部分(髮夾標記的探針)中所述的髮夾標記的雜交探針，其包括在一個或兩個末端具有標記的髮夾結構的寡核苷酸和具有一個或多個髮夾標記的寡核苷酸分支的樹枝狀聚合體。而且，探針還可以包括通過如下面的第IV部分(髮夾標記的寡核苷酸的引物延伸)所述的髮夾標記的寡核苷酸的引物延伸(例如，通過PCR或隨機引發)而產生的髮夾標記的核酸探針。
一組探針對於靶結合區域而言可以是均一的。可選擇地，一組探針可以包含具有不同的靶結合區域的兩種或多種探針。在某些實施方案中，使用大量不同的探針。如果使用了兩種或多種不同的探針(也即，具有不同的靶結合區域的探針)，則該不同的探針可以具有不同的可檢測標記。
在典型的實施方案中，探針用於在染色體，細胞，組織，核酸的無細胞混合物等等中檢測核酸。探針的靶結合區域可以是，例如，簡併的，如取決於感興趣蛋白質的部分胺基酸序列。在其它的典型實施方案中，靶結合區域是預先確定的(也即，根據預先確定的核酸如，例如，靶核酸或與靶具有基本同一性的核酸)。例如，靶結合區域可以設計成與特定組織或細胞相關，或與感興趣的生理條件(例如，與細胞功能如，例如，增殖，細胞程序死亡，細胞間相互作用，蛋白質的分泌，等等；與細胞內或細胞外信號途徑；與疾病或病症，包括，例如，癌症，免疫學或炎性疾病，神經變性疾病，與病毒感染相關的疾病等等；)相關的核酸基本互補。靶核酸可包括DNA或RNA，而且可以包括，例如，與生理條件下的異常(例如，增加或降低)表達(例如，異常表達的RNA)；與傳染物(例如，病毒核酸如，例如，HIV或EBV核酸)；與突變如與疾病或病症相關的那些突變(例如，突變細胞基因或染色體)相關的核酸；等等。
樣品按照這裡提供的方法使用的樣品包括懷疑包含靶核酸的任何樣品。樣品可包括，例如，包含細胞，細胞器(例如，細胞核)，線粒體和葉綠體；染色體及其區段；以及病毒的那些樣品。樣品可以來自於任何物種包括，例如，哺乳動物，魚類，兩棲動物，鳥類，昆蟲，原生動物，細菌，真細菌和植物。優選的哺乳動物包括靈長類(包括，例如，人類)，牛類和嚙齒類(例如，小鼠，大鼠，兔和豚鼠)。在某些方法中，分析之前，可以合併多個樣品(例如，來自超過一個受試者的樣品)。此外，來自初生組織的細胞可以，例如，直接分析靶核酸的存在或在分析之前進行繁殖。在其它的實施方案中，樣品來自於均一細胞系。仍然在其它的實施方案中，樣品獲自人類受試者的組織。
在某些實施方案中，分離的核酸固定於固相支持物(也即，固體基質或「基體」)上。固相支持物可包括能有效而且均勻地結合DNA，同時留下功能性而且可使用的表面結合DNA的任何材料。一般，合適的固相支持物是化學上惰性的；允許DNA的高密度，穩定的結合，而且，用於檢測螢光標記的探針，具有低的內在螢光同時提供寬的動態範圍的強信號強度。適於與這裡提供的方法一起使用的固體基質包括，例如，玻璃和薄膜濾器。例如，塗有胺或醛表面化學物質的載玻片可獲自Corning Microarray Technology(CMT)，Cel和TeleChemInternational。塗有胺的載玻片也可以通過用聚賴氨酸處理載玻片而自己製造；製備聚賴氨酸載玻片的細節可獲自Brown Laboratory網址。此外，也可以使用多孔膜材料(例如，硝酸纖維，尼龍，丙烯醯胺，等等)。
在某些實施方案中，來自不同組織或細胞類型的分離核酸可以點樣到固相支持物上作為陣列，從而可以進行靶核酸的組織或細胞類型特異性分析的分析。例如，存在於一組組織或細胞樣品中的對應於mRNA的cDNA可以使用已知的方法進行定量擴增(例如，定量PCR)，然後點樣到固體基質上。得到的斑點定量表現了各個樣品內基因的相對分布和表達，而且陣列可以分析，例如，組織或細胞中的差異表達。組織或細胞可以是，例如，不同類型的組織或細胞(例如，腎、脾、胸腺或肺)或相同類型的組織或細胞，但是暴露於不同的生理條件(例如，存在不同的藥理學試劑)。
仍然在其它的實施方案中，組織樣品點樣到固相支持物上。組織樣品可以，例如，點樣到固相支持物上作為組織樣品的陣列。這種組織陣列尤其可用於，例如，高通量表達研究，組織類型特異性研究和動物模型分析。對組織樣品點樣以構建組織陣列的方法是本領域已知的。例如，組織陣列可以點樣到直徑為0.6-2mm的標準載玻片上，其包含，例如，30-120個點樣的組織樣品。陣列可以用，例如福馬林固定的或鋅固定的石蠟包埋組織製備。用於構建陣列的組織可以，例如，是分離的正常動物，遺傳修飾的動物(例如，轉基因學如基因剔除)，或處於另外的異常生理條件如，例如，動物疾病模型中的動物，和/或用不同的藥理學試劑處理的動物。
雜交條件適合用於這裡所述的檢測探針的雜交條件是本領域已知的。(參見，例如，Sambrook et al.，上文；Ausubel et al.，上文。也可參見Tijssen，Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology，Vol.24Hybridization with Nucleic AcidProbes(Elsevier，NY 1993)。在嚴格條件下，其允許形成核酸的基本互補鏈的穩定而且特異性結合，和能除去探針的非特異性結合的任何洗滌條件下，進行雜交。通常，嚴格發生在低於探針的解鏈溫度(Tm)大約5℃到低於Tm大約20℃-25℃的範圍內。可以增加或降低嚴格度，以特異性地檢測100％互補的靶核酸，或檢測小於100％互補的相關核苷酸序列。在某些方法中，選擇非常嚴格的條件為等於特定探針的Tm。如序列的長度和性質(DNA，RNA，鹼基組成)，靶的性質(DNA，RNA，鹼基組成，存在於溶液中或固定)，以及鹽和其它組分(例如，存在或缺乏甲醯胺，葡聚糖硫酸酯和/或聚乙二醇)的濃度等因素被考慮，而且可以改變雜交溶液以產生低，中等，或者高嚴格條件。洗滌條件一般為室溫到60℃。
例如，高嚴格條件可包括，例如，大約45℃在6xNaCl/檸檬酸鈉(SSC)中進行的雜交步驟，接著於50℃用2xSSC進行洗滌；或者，可選擇地，例如，42℃在5xSSC，20mM NaPO4，pH 6.8，50％甲醯胺中進行雜交，接著於42℃用0.2xSSC進行洗滌。這些條件可以根據核苷酸鹼基的組成和長度以及使用的環境，或者經驗主義地或根據測定這種變化的公式而改變(參見，例如，Sambrook et al.，上文；Ausubel et al.，上文)。取決於靶核酸的鹼基組成，來源和濃度，可使用其它的嚴格條件，包括，例如，低嚴格條件(例如，37-45℃於4-6xSSC/0.1-0.5％w/v SDS中進行2-3小時)，或中等嚴格條件(例如，45℃於1-4xSSC/0.25-0.5％w/v SDS中進行2-3小時)。
一般，在雜交特異性(嚴格度)與信號強度之間權衡。在某些實施方案中，雜交的樣品可以接著在更高嚴格度的溶液中進行洗滌，並在每次洗滌之間讀數。對由此產生的數據組進行分析，顯示洗滌嚴格度，高於該洗滌嚴格度時雜交模式沒有可測量的改變，而且該洗滌嚴格度為感興趣的特定探針提供了足夠的信號。
雜交探針的檢測雜交之後，使用適於按照髮夾結構中存在的可檢測標記類型的任何方法，對探針-靶雜種進行檢測。如上述第II部分中所述，標記可以是直接的或者間接的。典型的直接標記包括螢光團如，例如，螢光素，羅丹明，德克薩斯紅，藻紅蛋白，Cy3和Cy5。間接法利用結合伴侶相互作用進行檢測。寡核苷酸探針通常用與次級試劑具有親合力的分子進行標記。例如，生物素和半抗原如，例如，地高辛配基(DIG)，DNP，或螢光素是典型的標記，其可通過與作為次級試劑的抗生蛋白鏈菌素(在生物素的情況中)或抗體的相互作用進行檢測。雜交步驟之後，可通過使用，例如，直接標記的抗生蛋白鏈菌素或抗體對靶-探針雜種進行檢測。可選擇地，未標記的次級試劑可直接與能特異性結合次級試劑的標記的「三級」試劑一起使用(例如，可使用未標記的抗DIG抗體，其可利用對初級抗體種類和類別具有特異性的標記的次級抗體進行檢測)。用於次級試劑的標記一般是非同位素標記，雖然放射性同位素標記也可以使用。典型的非同位素標記包括，例如，酶和螢光團，其可與次級或三級試劑綴合。通常用於DNA診斷學的酶包括，例如，辣根過氧化物酶和鹼性磷酸酶。
探針標記的檢測可使用適於特定標記的任何方法進行。例如，可使用本領域已知的用於檢測使用的特定螢光團的發射波長的任何合適的方法，對螢光團標記進行檢測。用於檢測螢光信號的典型方法包括，例如，分光螢光測定法，共焦顯微術和流式細胞術分析。螢光標記通常優選用於檢測低水平的靶核酸，因為它們提供了非常強的信號，以及低背景值。並且，它可以通過快速的掃描程序，以高解析度和靈敏度進行光學檢測，而且具有不同發射波長的螢光團(例如，螢光素和羅丹明)的不同雜交探針可用於單個樣品。
此外，對於酶標記，例如可通過著色或染料沉積(例如，用於鹼性磷酸酶的磷酸對硝基苯酯或5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸酯/氮藍四唑，和用於辣根過氧化物酶的3，3′-二氨基聯苯胺-NiCI.sub.2)，螢光(例如，用於鹼性磷酸酶的4-甲基umbelliferyl磷酸酯)或化學發光(例如，來自Lumigen Inc.，Detroit Mich.的鹼性磷酸酶二氧丁環(dioxetane)底物LumiPhos 530或來自Tropix，Inc.的AMPPD和CSPD)進行檢測。化學發光檢測可利用X射線或Polaroid膠片或使用單光子計數光度計進行。這是一種用於鹼性磷酸酶標記探針的典型檢測形式。
在該方法的某些實施方案中，檢測分析是液相分析。例如，懸浮的細胞(例如，血細胞)內靶核酸可與螢光標記的探針原位雜交。然後可以使用流式細胞儀(例如，FACScan單雷射流式細胞儀)，對各個細胞中的原位雜交信號進行分析，分析靶核酸的存在。
IV.髮夾標記的寡核苷酸的引物延伸本發明的另一個方面，提供了引物延伸的髮夾標記探針，以及用於髮夾標記探針的引物延伸方法。引物延伸的方法通常包括，如上文第II部分(髮夾標記的探針)所述，使靶核酸與寡核苷酸髮夾標記探針接觸，其中在允許靶核酸作為模板用於髮夾標記探針的引物延伸的條件下，使髮夾結構位於靶結合區段的5′端。
適於引物延伸的條件通常是本領域已知的。(參見，例如，Sambrook et al.，上文；Ausubel et al.，上文。)使髮夾標記探針(引物)退火，也即與靶核酸雜交，以形成引物-模板複合物。引物-模板複合物然後暴露於熱穩定的聚合劑(例如，DNA聚合酶)，或者相反，以及處於合適環境中的核苷酸或其衍生物，以容許添加一個或多個核苷酸或核苷酸衍生物到髮夾標記引物的3』末端，從而產生與靶核酸互補的延伸引物。引物延伸反應可以使用升高的溫度，以使雙鏈多核苷酸變性(如在PCR引物延伸反應中)。
在一些實施方案中，引物延伸在存在4種未標記的游離核苷酸時進行。在其它的實施方案中，一種或多種游離核苷酸被標記。如上文所述，標記可以是直接的或間接的。
在某些實施方案中，靶核酸進行隨機引發。(參見，例如，Feinberg and Vogelstein，Anal.Biochem.137266-7，1984；Glickand Pasternak，Molecular BiotechnologyPrinciples andApplications of Recombinant DNA(ASM Press，2d ed.1998)。也參見圖3B。)對於這些方法，髮夾標記引物的靶結合區域一般是隨機區段，如例如，長度為3-10個核苷酸的隨機區段(例如，隨機六聚物(參見，例如，Feinberg and Vogelstein，上文))。例如，把具有隨機靶結合區域的髮夾標記引物添加到變性DNA樣品中，連同全部4種核苷酸以及DNA聚合酶(例如，Klenow區段)。根據隨機靶結合區域中核苷酸位置的數目，使用隨機六聚物導致4096種可能的六聚物種類，其隨機與靶核酸的基本互補區域結合。一旦結合，DNA聚合酶結合互補核苷酸以產生延伸的引物。
在某些實施方案中，引物延伸的方法更進一步地包括，在允許靶核酸作為模板用於擴增的條件下，使靶核酸與具有與延伸引物區段基本互補的區域的第二引物接觸。(參見，圖3A。)適於使用引物對(也即，一個5』上遊引物和一個3』下遊引物)對靶核酸進行擴增的條件是本領域已知的(例如，PCR擴增方法)。(參見，例如，Sambrooket al.，上文；Ausubel et al.；上文；PCR ApplicationsProtocols for Functional Genomics(Innis et al.eds.，AcademicPress 1999)；Glick and Pasternak，上文。)一個或兩個引物可以是髮夾標記的；因此擴增產物的一個或兩個鏈可以分別是髮夾標記的。
使用上述方法，可生產具有延伸的靶結合區域的髮夾標記探針(這裡為「引物延伸的髮夾標記探針」)。引物延伸的髮夾標記探針，包括髮夾標記的擴增產物，以及在上文所述的檢測方法中使用這些探針的方法，也包含在本發明中。
V.用於雜交檢測分析或引物延伸的試劑盒還提供了一種試劑盒，其用於在靶核酸檢測中使用本發明的雜交探針，或可選擇地，用於引物延伸。一般，為了便於使用而把試劑盒隔開，而且其包含提供如這裡所述的寡核苷酸或樹枝狀聚合體探針的至少一個第一容器。該試劑盒還包括另外的容器，其提供用於檢測髮夾標記的寡核苷酸或樹枝狀聚合體探針，和/或用於髮夾標記的寡核苷酸引物的引物延伸的試劑。這種另外的容器可以包括根據這裡提供的方法，本領域技術人員識別可用於雜交檢測分析或引物延伸方法的任何試劑或其它成分。例如，在可檢測標記是間接標記(例如，生物素)的實施方案中，可包括至少一個提供用於檢測該間接標記的次級試劑的容器(例如，一個提供用螢光團標記的抗生蛋白鏈菌素的容器)。並且，用於引物延伸的試劑盒還可以包括至少一個提供聚合劑的容器(例如，DNA聚合酶如，例如，Klenow區段)；至少一個提供合適的緩衝液的容器(也即，適於引物延伸的緩衝液)；至少一個提供標記的或未標記的游離核苷酸的容器；和/或至少一個提供第二引物的容器(例如，用於靶核酸的PCR擴增的第二髮夾標記的寡核苷酸引物)。
在特定的實施方案中，用於檢測靶核酸的試劑盒可用於診斷與特定的靶核酸相關的疾病或病症。例如，可用於診斷的靶核酸可包括異常表達的基因；與傳染物如，例如，HIV或EBV相關的核酸；突變體細胞基因或染色體；多餘的或缺失的基因或染色體；等等。
具體實施例方式
參考列舉了示例性實施方案的下列描述，將獲得對本發明更進一步地理解。
實施例1使用髮夾標記的寡核苷酸對EBV EBER-1 RNA進行檢測除非另有說明，所有的試劑都獲自Sigma-Aldrich Chemical，St.Louis，MO。也可以使用來自除了這裡所列的以外的來源的等效試劑。
細胞系和細胞培養條件EBV陽性的人類RAJI細胞和EBV陰性的人類RL和HL-60細胞系獲自ATCC(Rockville，MD)，並培養於補充有2.0-4.5g/l葡萄糖，2mM L-穀氨醯胺和10％-15％胎牛血清的RPMI 1640培養基中。使用PCR分析，我們證實RL和HL-60系都是無EBV的。Raji細胞含有大約50個拷貝的游離型EBV，並表達EBER-1 RNA(Stevenset al.J.Clin.Microbiol.372852-2857，1999)。
細胞固定細胞固定要求保持細胞結構，而且保留靶核酸。細胞固定劑，如HistoChoice-MB已經設計用於分子生物學應用如螢光原位雜交(FISH)，而且是商業可獲得的(Amresco Inc.，Solon，OH)。可通過離心(200xg)收穫細胞，在PBS中洗滌一次，而且在HistoChoice-MB固定劑中重懸。細胞進行處理立即用於雜交，或者4℃儲存。
探針和探針標記高拷貝數的EBER小核RNA存在於EBV潛伏感染的細胞中(每個細胞～106個拷貝，Clemens，Mol.Biol.Reports 1781-92，1993；Crouch et al.，Cytometry 2950-57，1997)，而且代表很合乎需要的雜交靶。在相關的研究中，使用在5′和3′末端生物素化的單一寡核苷酸探針，已經成功地在EBV-裝載的細胞中檢測到了EBER-1 RNA(圖6C)。生物素化的30個鹼基隨機序列(randomer)和rDNA有義鏈(rDNA-有義)寡核苷酸(例如，5′-ACGCTCATCAGACCCCAGAAAAGGT-3′)用作陰性對照。前面討論的ITS-1反義前核糖體RNA寡核苷酸探針用作陽性對照。圖6中圖示的寡核苷酸探針獲自Oligo等等(Wilsonville，OR)。
Cytospin載玻片製備和原位雜交將固定細胞(2.5×105細胞)使用CytospinTMIII細胞離心機(ThermoShandon Corp.，Pittsburgh，PA)，以100xg進行細胞離心5分鐘到載玻片上。風乾以後，細胞在2xSSC中簡短洗滌，然後在70％和95％乙醇中脫水。將3-5μl常規的或髮夾標記的探針溶液(25-250nmol探針溶於2xSSC/5％w/v聚乙二醇8000MW/10％-50％甲醯胺/0.5％w/v牛血清白蛋白[BSA]/5％v/v氧釩基核糖核苷複合物[VRC]/2000nmol未標記的隨機30-聚體寡核苷酸)移液到進行細胞離心的細胞斑點中，用ParafilmTM覆蓋，並於37℃在溼潤室中孵育30分鐘。雜交之後，除去ParafilmTM，細胞斑點於室溫用100μl Cy3-綴合的抗生蛋白鏈菌素(10μg/ml溶於4xSSC/0.5％w/vBSA/0.025％ Triton X-100)覆蓋20分鐘。載玻片在4xSSC/0.5％Triton X-100，2xSSC和PBS中進行簡短洗滌。總DNA使用DAPI(二脒基苯基吲哚；2μg/ml溶於PBS)進行復染色30秒鐘，在PBS中漂洗，而且使用抗褪色封固劑對玻璃蓋玻片進行封固。如下所述，載玻片使用載玻片掃描細胞計量術進行分析。
液相原位雜交將固定細胞(1.0×106細胞)以400xg離心進行沉澱，通過在2xSSC中重懸進行洗滌，而且通過離心回收。為了雜交，將細胞沉澱重懸於50μl常規的或髮夾標記的探針溶液中(25-250nmol探針溶於2xSSC/5％w/v聚乙二醇8000MW/10％-50％甲醯胺/0.5％w/v牛血清白蛋白[BSA]/5％v/v氧釩基核糖核苷複合物[VRC]/2000nmol未標記的隨機30-聚體寡核苷酸)，並於37℃在振動熱混合器中孵育1小時。孵育以後，細胞如上進行沉澱和洗滌。將細胞沉澱重懸於250μl Cy3-綴合的抗生蛋白鏈菌素中(10μg/ml溶於4xSSC/0.5％w/v BSA/0.025％ Triton X-100)，並室溫孵育20分鐘。細胞在4xSSC/0.5％ Triton X-100，2xSSC中洗滌兩次，然後重懸於PBS。樣品通過如下所述的流式細胞術進行分析。
載玻片分析，圖象掃描細胞計量術和流式細胞術使用IPLab光譜軟體(Scanalytics，Inc.，Fairfax，VA)，在為表面螢光配備的Nikon E600顯微鏡上進行數字成像。為了進行流式細胞術分析，使用FACScan單雷射流式細胞儀，使用CellQuest獲取和分析軟體(Becton Dickinson Immunocytometry Systems，SanJose，CA；ver.3.2.1)，對樣品進行分析。使用FL3通道獲得Cy3-標記樣品的信號，而且陽性和陰性樣品的點繪圖分析用於確定結果閘門。
EBV EBER-1 RNA的原位檢測如同所示，使用流式細胞術液相原位雜交和基於載玻片的雜交方法，成功地檢測到了EBV EBEN-1 RNA(圖4，5)。由於它們的豐度，EBER-1 RNA是優選用於檢測EBV的雜交靶；在潛伏感染的細胞中(Clemens，上文；Crouch et al.，上文，Stowe et al.，J.Vir.Meth.7583-91，1998)，而且實際上在淋巴組織增生疾病的所有感染的B細胞中(Baumforth et al.，Mol.Pathol.52307-322，1999)，高達1×107拷貝/細胞。因而，它是用於評估新探針設計的合適模型系統，以及臨床意義的真正的靶。使用流式細胞術，在陰性細胞的背景中檢測到了EBV陽性細胞，而且陽性和陰性細胞之間能清楚的區分(圖4)。基於常規載玻片的FISH，結合圖象掃描細胞計量術，也用於檢測EBV陽性細胞(圖5)。由於其高靶拷貝數，能進行陽性細胞的明確檢測(圖5)。快速載玻片掃描是分析大量細胞數的細胞的關鍵要求。如果使用較短的圖象獲取時間，可獲得比這裡使用的顯著增加的掃描速率。這可使用髮夾標記的寡核苷酸探針，通過增強雜交信號強度而實現。
使用髮夾標記的寡核苷酸探針進行原位雜交為了確定髮夾標記的寡核苷酸探針能否成功地用於RNA的原位雜交檢測，合成了能識別核糖體RNA的內部轉錄序列-1(ITS-1)區域的環形標記探針。為了比較的目的，相同的序列使用常規的3′，5′-生物素化進行標記。接著在相同條件下進行雜交，使用基於載玻片的和液相雜交方法，然後使用Cy3綴合的抗生蛋白鏈菌素進行檢測，使用常規的表面螢光顯微鏡法和流式細胞術，確定雜交的信號強度和特異性。如同所示，兩種探針的雜交信號特異性是相同的，而且只限於細胞核，核糖體基因轉錄證實的位點(圖4A，4B)。雜交之前，通過RNA酶處理，和在存在大量摩爾過量的未標記的相同序列寡核苷酸時通過雜交，它們是兩種用於證實雜交特異性的主要方法，來完全除去雜交信號(數據未顯示)。相較於常規標記的探針(圖4A)，髮夾標記探針的雜交信號強度顯著地更亮(圖4B)。使用液相雜交的流式細胞術分析，清楚地證明相較於使用常規探針(圖5；直方圖C)，使用髮夾標記的探針進行的雜交顯示了增強的螢光強度(圖5；直方圖D)。
實施例2使用髮夾標記的寡核苷酸對HIV RNA進行檢測材料和方法除非另作說明，所有的試劑都獲自Sigma-Aldrich Chemical，St.Louis，MO。也可以使用來自除了這裡所列的以外的來源的等效試劑。
細胞潛伏感染了HIV-1的OM10.1細胞，用於檢測細胞中表達的HIV-RNA。HL-60，用於產生OM10.1細胞的人類早幼粒細胞性白血病細胞，用作對照細胞。用20U/ml TNFα在OM10.1細胞中誘導16小時，誘導HIV RNA的表達。使用Ficoll-Paque Plus(AmershamBiosciences)密度梯度，從收集於K3EDTA或檸檬酸鹽Vacutainer(Becton and Dickinson)試管中的人血液分離外周血單核細胞。來自HIV感染的人類的血液獲自Massachusetts General Hospital(Boston，MA)或Research Sample Bank(Pompano Beach，FL)。如果不使用新鮮血液，可使用RosetteSepTM(StemCell Technologies)方法幫助完全除去粒細胞，其依賴於應用四聚複合物使粒細胞與紅血細胞交聯。因為來自密度梯度分離的PBMC產量只有40-60％，HIV感染的細胞在該方法期間會優先丟失。因此，在紅血細胞的選擇性裂解之後，還要對使用的全血進行檢驗。添加100μl抗CD4或CD14的螢光素標記的抗體到1ml全血中，渦旋之後，混合物於室溫保持15分鐘。然後，添加1ml溶於PBS的4％低聚甲醛，15分鐘以後，添加10ml含有0.1ml核糖核苷氧釩基複合物(RVC，New England Biolabs，Beverly，MA)的PBS到血液中。混合以後，血細胞通過以300xg離心5分鐘進行沉澱。棄去上清液，細胞用10ml PBS洗滌兩次。洗滌步驟之後，添加2ml含有0.1％皂苷的PBS和20μl RVC到沉澱的血細胞中。白血細胞(WBC)進行透化，而紅血細胞(RBC)在該10分鐘步驟中裂解。通過離心，和使用包含RVC的PBS的兩個洗滌步驟，使透化的WBC與裂解的RBC分離。沉澱的細胞立即用於原位雜交。
探針為了檢測HIV RNA，使用了覆蓋HIV基因組的gag和pol區域的下列髮夾生物素標記的寡核苷酸探針的混合物HIV-1 5′ctc tgg tct gct ctg aag aaa tgg tg 3′HIV-2 5′ggt cgt tgc caa aga gtg atc tga g 3′HIV-3 5′cat ttc ttc tag tgt agc tgc tgg tcc 3′HIV-4 5′ctg cca gtt cta gct ctg ctt ctt c 3′HIV-5 5′cta gct gcc cca tct aca tag aac g 3′HIV-6 5′ctg cta tgt cac ttc ccc ttg gtt ctc 3′HIV-7 5′gct ccc tgc ttg ccc ata cta tat g 3′HIV-8 5′cta ata gag ctt cct tta gtt gcc ccc 3′HIV-9 5′gca tca ccc aca tcc agt act gtt ac 3′使用了連接有HIV-1探針的4種不同的髮夾結構，如圖7所述。
在溶液中進行原位雜交細胞用4％低聚甲醛固定30分鐘，並使用血細胞計數器進行定量。2×106個細胞用於分析。細胞在包含0.1％皂苷和100U/ml SUPER酶(RNA酶抑制劑，來自AMBION，Austin，TX)的PBS中透化並在包含0.2μg/ml溶於2xSSC的探針混合物，10mM MES pH 6.7，1％牛血清白蛋白，25％甲醯胺，1mg/ml小牛胸腺DNA和tRNA以及0.1％pluronic酸的溶液中雜交。48℃雜交1小時以後，細胞進行沉澱，並於2xSSC，25％甲醯胺，0.1％pluronic酸中洗滌一次，在4xSSC，0.5％牛血清白蛋白中洗滌一次，在分散於後面的溶液中的抗生蛋白鏈菌素-藻紅蛋白(2μg/ml，Molecular Probes，Eugene，OR)中染色15分鐘。洗滌之後，細胞DNA用DRAQ5(20μM)染色。
免疫分型(Immunotyping)在臨床血樣分析期間，外周血細胞用螢光素標記的抗CD4或CD14的抗體(Beckman-Coulter，Miami，FL)進行免疫分型，該抗體溶於包含0.5％牛血清白蛋白和0.1％疊氮化鈉的PBS中。染色15分鐘之後，細胞用該溶液洗滌，並用4％低聚甲醛固定。細胞在0.15M包含0.1％ Pluronic酸的硫酸銨(溶液封閉了游離的醛基)中貯存至少15分鐘，直到進行原位雜交。
流式細胞術分析原位雜交中，使用配備有CellQuest獲取和分析軟體(BectonDickinson Immunocytometry Systems，San Jose，CA)的FACScan單雷射流式細胞儀分析各個細胞中的信號。進行合適的補償以後，分別在FL1和FL2通道中收集CD4或CD14信號和HIV RNA。在FL3通道中收集DNA信號。我們已經確定FL2(藻紅蛋白)與FL3(DRAQ5)通道之間的補償不是必要的。使用泊松統計，對於10％的置信水平，應該獲得100個陽性事件。假定包含HIV RNA細胞的亞群為0.02％，統計學上有意義的分析需要分析大約1×106個事件。
提供前面的實施例是為了舉例說明，而不是為了限制要求保護的發明的範圍。本發明的其它變體對本領域的普通技術人員是顯而易見的，而且包括在附加的權利要求內。這裡引用的所有的出版物，專利，專利申請，及其它參考文獻都引入這裡作為參考。
權利要求
1.一種標記的寡核苷酸，其包含基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段；和包含莖區域與環區域的髮夾結構，其中髮夾結構內的許多核苷酸具有可檢測標記。
2.權利要求1的標記的寡核苷酸，進一步包含靶結合區段與髮夾結構之間的接頭。
3.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中環區域中的至少一個核苷酸具有可檢測標記。
4.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中莖區域中的至少一個核苷酸具有可檢測標記。
5.權利要求4的標記的寡核苷酸，其中環區域中的至少一個核苷酸具有可檢測標記。
6.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中具有可檢測標記的許多核苷酸為至少5個。
7.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中具有可檢測標記的許多核苷酸為9個。
8.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中標記的寡核苷酸具有至多60個核苷酸。
9.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中標記的寡核苷酸具有至多100個核苷酸。
10.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中標記的寡核苷酸具有至多150個核苷酸。
11.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中環區域具有3-10個核苷酸。
12.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中莖區域具有16-40個核苷酸。
13.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中具有可檢測標記的至少兩個核苷酸是相鄰的。
14.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中具有可檢測標記的核苷酸相隔至少兩個核苷酸。
15.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中具有可檢測標記的核苷酸相隔2-6個核苷酸。
16.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中靶結合區段是預先確定的區段。
17.權利要求16的標記的寡核苷酸，其中靶核酸是病毒核酸。
18.權利要求17的標記的寡核苷酸，其中該病毒核酸是HIV或EBV核酸。
19.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中靶結合區段是隨機區段。
20.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中靶結合區段是簡併區段。
21.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中可檢測標記是間接標記。
22.權利要求21的標記的寡核苷酸，其中該間接標記是生物素。
23.權利要求21的標記的寡核苷酸，其中該間接標記是半抗原。
24.權利要求23的標記的寡核苷酸，其中該半抗原選自地高辛配基，二硝基苯酚(DNP)，生物素和螢光素。
25.權利要求1的標記的寡核苷酸，其中可檢測標記是直接標記。
26.權利要求25的標記的寡核苷酸，其中該直接標記是螢光團。
27.權利要求26的標記的寡核苷酸，其中該螢光團選自螢光素，羅丹明，德克薩斯紅，藻紅蛋白，Cy3和Cy5。
28.權利要求1的標記的寡核苷酸，進一步包含包含第二莖區域和第二環區域的第二髮夾結構，其中第二髮夾結構內的至少一個核苷酸具有可檢測標記；而且其中該髮夾結構與靶結合區段的相對末端連接。
29.一種標記的寡核苷酸，其包含基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段；包含第一莖區域和第一環區域的第一髮夾結構；和包含第二莖區域和第二環區域的第二髮夾結構；其中第一髮夾結構內的至少一個核苷酸和第二髮夾結構內的至少一個核苷酸具有可檢測標記；而且其中這些髮夾結構與靶結合區段的相對末端連接。
30.一種樹枝狀聚合體探針，其包含權利要求1的許多標記的寡核苷酸；和連接該寡核苷酸的分支分子。
31.一種標記的生物分子，其包含形成包含莖區域和環區域的髮夾結構的寡核苷酸，其中髮夾結構內的許多核苷酸具有可檢測標記；和連接寡核苷酸與生物分子的接頭。
32.一種用於在樣品中檢測靶核酸的方法，該方法包括
1)使樣品與寡核苷酸探針接觸，該寡核苷酸探針包含a)基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段；和b)包含莖區域和環區域的髮夾結構，其中該髮夾結構內的許多核苷酸具有可檢測標記；
2)在足以允許靶結合區段與靶核酸雜交的條件下，孵育樣品和寡核苷酸探針；和
3)檢測雜交的寡核苷酸探針上的標記，以檢測靶核酸。
33.權利要求32的方法，進一步包括在檢測標記之前除去未雜交的寡核苷酸探針。
34.權利要求32的方法，其中該寡核苷酸探針進一步包含靶結合區段與髮夾結構之間的接頭。
35.權利要求32的方法，其中環區域中的至少一個核苷酸具有可檢測標記。
36.權利要求32的方法，其中莖區域中的至少一個核苷酸具有可檢測標記。
37.權利要求36的方法，其中環區域中的至少一個核苷酸具有可檢測標記。
38.權利要求32的方法，其中具有可檢測標記的許多核苷酸為至少5個。
39.權利要求32的方法，其中具有可檢測標記的許多核苷酸為9個。
40.權利要求32的方法，其中寡核苷酸探針具有至多60個核苷酸。
41.權利要求32的方法，其中寡核苷酸探針具有至多100個核苷酸。
42.權利要求32的方法，其中寡核苷酸探針具有至多150個核苷酸。
43.權利要求32的方法，其中環區域具有3-10個核苷酸。
44.權利要求32的方法，其中莖區域具有16-40個核苷酸。
45.權利要求32的方法，其中具有可檢測標記的核苷酸相隔至少兩個核苷酸。
46.權利要求32的方法，其中具有可檢測標記的至少兩個核苷酸是相鄰的。
47.權利要求32的方法，其中具有可檢測標記的核苷酸相隔2-6個核苷酸。
48.權利要求32的方法，其中靶結合區段是預先確定的區段。
49.權利要求48的方法，其中預先確定的核酸是病毒核酸。
50.權利要求49的方法，其中該病毒核酸是HIV或EBV核酸。
51.權利要求32的方法，其中靶結合區段是簡併區段。
52.權利要求32的方法，其中該可檢測標記是間接標記，而且檢測包括使該間接標記與次級標記接觸。
53.權利要求52的方法，其中該間接標記是生物素。
54.權利要求53的方法，其中該次級標記是標記的抗生蛋白鏈菌素。
55.權利要求52的方法，其中該間接標記是半抗原。
56.權利要求55的方法，其中該半抗原選自地高辛配基，二硝基苯酚(DNP)，生物素和螢光素。
57.權利要求55的方法，其中該次級標記是標記的抗半抗原抗體。
58.權利要求32的方法，其中可檢測標記是直接標記。
59.權利要求58的方法，其中該直接標記是螢光團。
60.權利要求59的方法，其中該螢光團選自螢光素，羅丹明，德克薩斯紅，藻紅蛋白，Cy3和Cy5。
61.權利要求32的方法，其中該寡核苷酸探針進一步包含包含第二莖區域和第二環區域的第二髮夾結構，其中第二髮夾結構內的至少一個核苷酸具有可檢測標記；而且其中該髮夾結構與靶結合區段的相對末端連接。
62.權利要求32的方法，其中靶核酸固定於固體基質上。
63.權利要求32的方法，其中靶核酸處於細胞或組織樣品內，而且標記的寡核苷酸與靶核酸進行原位雜交。
64.權利要求63的方法，其中雜交的寡核苷酸探針上的標記的檢測包括液相分析。
65.權利要求64的方法，其中液相分析包括流式細胞術。
66.一種用於在樣品中檢測靶核酸的方法，該方法包括1)使樣品與寡核苷酸探針接觸，該寡核苷酸探針包含a)基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段；和b)包含第一莖區域與第一環區域的第一髮夾結構；c)包含第二莖區域與第二環區域的第二髮夾結構，其中第一髮夾結構內的至少一個核苷酸和第二髮夾結構內的至少一個核苷酸具有可檢測標記；而且這些髮夾結構與靶結合區段的相對末端連接；和2)在足以允許靶結合區段與靶核酸雜交的條件下，孵育樣品與寡核苷酸探針；和3)檢測雜交的寡核苷酸探針上的標記，以檢測靶核酸。
67.一種用於在樣品中檢測靶核酸的方法，該方法包括使樣品與權利要求30的樹枝狀聚合體探針接觸；2)在足以允許靶結合區段與靶核酸雜交的條件下，孵育樣品與樹枝狀聚合體探針；和3)檢測雜交的樹枝狀聚合體探針上的標記，以檢測靶核酸。
68.一種用於進行引物延伸的方法，其包括使靶核酸與權利要求1的寡核苷酸引物接觸，其中髮夾結構位於靶結合區段的5′端，在此條件下靶核酸用作模板，用於從引物延伸以產生延伸的引物。
69.權利要求68的方法，進一步包括使靶核酸與第二引物接觸，所述的第二引物包含基本上與延伸的引物互補的引發區段，在此條件下靶核酸用作模板，用於從寡核苷酸引物和第二引物擴增，以產生擴增產物。
70.權利要求68的方法，其中在存在未標記的游離核苷酸時進行擴增。
71.權利要求68的方法，其中靶結合區段是隨機的。
72.權利要求71的方法，其中隨機的靶結合區段由3-10個核苷酸組成。
73.權利要求68的方法，其中第二寡核苷酸引物進一步包含，位於引發區段5′端的包含第二莖區域和第二環區域的第二髮夾結構，其中第二髮夾結構內的至少一個核苷酸具有可檢測標記。
74.一種用於產生核酸擴增產物的方法，該方法包括使靶核酸與以下物質接觸a)第一寡核苷酸引物，其包含i)基本上與靶核酸互補的單鏈靶結合區段；和ii)位於靶結合區段的5′端的，包含第一莖區域和第一環區域的第一髮夾結構；其中第一髮夾結構內的至少一個核苷酸具有可檢測標記；所述的接觸包括在此條件下靶核酸用作模板，用於從第一引物延伸以產生延伸的引物；和b)第二寡核苷酸引物，其包含i)基本上與延伸的引物互補的引發區段；和ii)位於引發區段的5′端的，包含第二莖區域與第二環區域的第二髮夾結構；其中第二髮夾結構內的至少一個核苷酸具有可檢測標記；所述的接觸進一步包括在此條件下靶核酸用作模板，用於從第一和第二寡核苷酸引物擴增以產生擴增產物。
75.一種用於檢測靶核酸的試劑盒，其包含提供權利要求1的標記的寡核苷酸，或權利要求30的樹枝狀聚合體探針的至少一個第一容器。
76.權利要求75的試劑盒，其中可檢測標記是間接標記，而且進一步包含提供用於檢測間接標記的次級試劑的至少一個第二容器。
77.一種用於寡核苷酸引物的引物延伸的試劑盒，其包含提供權利要求1的標記的寡核苷酸引物的至少一個第一容器，其中髮夾結構位於靶結合區段的5′端。
78.權利要求77的試劑盒，進一步包含提供第二引物的至少一個第二容器，所述的第二引物包含基本上與產生的延伸引物互補的引發區段，在此條件下靶核酸用作模板，用於從標記的寡核苷酸引物延伸。
79.權利要求78的試劑盒，進一步包含提供標記的或未標記的游離核苷酸的至少一個第三容器，提供聚合劑的至少一個第四容器，和提供適於引物延伸的緩衝液的至少一個第五容器。
全文摘要
本發明提供了核酸雜交探針，其具有靶結合區域，和位於探針的至少一個末端的標記的髮夾結構。髮夾標記的探針包括寡核苷酸，樹枝狀聚合體和引物延伸的核酸。探針可用於所公開的檢測靶核酸的方法。而且，寡核苷酸探針可用於所公開的引物延伸的方法，包括，例如，隨機引發和PCR擴增，以產生引物延伸的髮夾標記探針。還公開了包含髮夾標記的寡核苷酸和樹枝狀聚合體探針的試劑盒。此外，本發明提供了通過與標記的髮夾結構連接而被標記的生物分子(例如，肽，多肽，碳水化合物，脂類，等等)。
文檔編號C12P19/34GK1836050SQ200480023560
公開日2006年9月20日 申請日期2004年7月7日 優先權日2003年7月7日
發明者P·T·小莫恩, J·特諾夫斯基 申請人:單細胞系統公司