含多羥基苯化合物的製作方法

2023-06-02 08:39:51 2

專利名稱：含多羥基苯化合物的製作方法
相關申請的交互參考依據35USC§119(e)，本申請要求優先權，美國臨時申請第60/183,668號，2000年2月18日提出。
關於聯邦資助研究的聲明本發明的完成有部分是由國家健康協會(補助金DK41070與CA58073)所資助。因此，在本發明中美國政府可以有某種程度的權利。
背景技術：
在東方文化中，長久以來即被廣泛的相信，茶在預防與處理許多疾病中具有藥效。然而茶在科學及醫學的評價，卻是只有最近才開始。茶是否為具有醫學上的療效，在早期流行病學的研究產生不確定的跡象。綠茶被發現含有含多羥基苯化合物。因此，這些化合物或衍生物將被探究是否它們是有益於健康的。
發明概述本發明的一方面涉及一種使受治療者減少食物吸收的方法。該方法包括給予受治療者所需要的有效量的下式(I)化合物 A是C1-14烴、氧、硫、或氮。該烴選自烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳香基、及雜芳香基。每一個所談到的部分(moieties)是任意地被以烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、芳香基羰氧基、芳香氧基羰基、烷基羰基、芳香基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、芳香基氨基羰基、或芳香基羰基氨基所取代。每一個Ra、Rb、Rc及Rd各自獨立地代表氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳香基、雜芳香基、芳香基烷基、雜芳香基烷基、烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、氨基烷基、硫基、硫化烷基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、或如下式(II)的部份 L是-L1-L2-L3-，L2是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R』)-、-CO-、-N(R』)-CO-、-CO-N(R』)-、-N(R』)-SO2-、-SO2-N(R』)-、-O-CO-、-CO-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、或刪除。每一個L1及L2各自獨立地代表-(CR』＝CR」)n-、-(C≡C)n-、-(C(R』)(R」))n-、或刪除。每一個R』及R」各自獨立地代表氫、烷基、烷氧基、羥基烷基、羥基、氨基、硝基、氰基、滷素、或滷化烷基，且n代表1、2、或3，每一個R1、R2、R3、R4及R5各自獨立地代表氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、氨基羰氧基、或烷氧基羰基氨基。注意，當A是氧或硫時，Ra及Rb兩者被刪除；且當A是氮時，Ra被刪除。更進一步地，至少一個(例如，二個)Ra、Rb、Rc及Rd是如式(II)的部份，且至少二個R1、R2、R3、R4及R5是羥基、烷氧基、或烷基羰氧基，其互相間的關係是間位或鄰位。式(I)化合物也可以導致減少血清營養物，例如，葡萄糖、膽固醇，及甘油三脂的水平。因此，使用式(I)化合物減少該等血清營養物水平的方法，是在本發明的範圍中。注意，此新穎的式(I)化合物及包含一或更多新化合物的組合物，也是在本發明的範圍中。
本發明的另一方面涉及一種在受治療者中減少內分泌水平的方法。該方法包含提供受治療者所需有效量的前述式(I)化合物。內分泌是一種產生在內分泌系統中的化學物質，例如，激素。該內分泌的水平會被式(I)化合物所影響的包括睪丸素、雌二醇、瘦素(leptin)、胰島素、類似胰島素的生長要素、以及黃體激素。藉由提供式(I)化合物來抑制器官例如前列腺、精囊、凝結腺、子宮、以及卵巢生長的方法也是在本發明的範圍中。
本發明的另一方面涉及一種治療有關上面所提到的內分泌或營養物上升水平的失調或疾病的方法。該方法包括提供給受治療者所需有效量的如上所述式(I)的化合物。一些此類的失調或疾病舉例有前列腺增生開始、前列腺癌、皮膚失調(例如，粉刺)、皮脂溢、一般性禿頭、多毛症、汗腺炎化膿、肥胖、乳癌、卵巢癌、第II型糖尿病、心血管疾病、血管增生、糖尿病視網膜病變、風溼性關節炎、炎症、血管瘤，以及牛皮癬。使用式(I)化合物製造藥物以治療上述所提的失調或疾病，也是在本發明的範圍中。
本發明的另一方面涉及一種脂質體(liposomal)製劑，其包括脂質體和截留在其中的前述式(I)化合物。該脂質體可以由脂質例如卵磷脂、磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、心磷脂、磷脂醯肌醇、以及膽固醇硫酸鹽所形成。
下述為一些式(I)化合物的舉例 (EGCG)結構E 結構F 結構G 結構H 結構I 結構J式(I)化合物醫藥可接受的鹽類的形成例如，介於具有一羧基的式(I)化合物與一陽離子的相對離子如一鹼金屬陽離子例如，鈉離子或鉀離子的間；或一銨離子其可被有機基，例如，四甲基銨離子或二異丙基-乙基銨離子所取代。式(I)化合物的鹽類也可以被形成在介於具有一質子化氨基式(I)化合物與一陰離子相對離子的間例如，硫酸根離子、硝酸根離子、磷酸根離子，或醋酸根離子。
可以了解的是該式(I)化合物可以包含對稱性的碳原子。換句話說，它可以含有光學異構物或消旋體異構物。這些異構物全部在本發明的範圍中。
這其中所使用的，烷基包括1到14碳原子的直鏈或支鏈烴。舉例烷基包括但不限制於甲基、乙基、丙基、異丙基、丁基、異丁基、2-丁基、3-丁基、正-戊基、2-甲基己基、3-乙基辛基、及4-乙基癸基。
名詞」烯基」及」炔基」，被當做是直鏈或支鏈烴，各自地包含2到14碳原子以及一或更多(例如，1-7)雙或參鍵。一些烯基及炔基的例子有丙烯基、2-丁烯基、2-戊烯基、2-己烯基、2-丁炔基、2-戊炔基、及2-己炔基。
環烷基的意指為環狀的烷基，含有3到14個碳原子。一些環烷基的例子有環丙基、環戊基、環己基、環庚基、金剛基、及降茨基。雜環烷基是一環烷基，含有1-6個雜原子，例如氮、氧、或硫。雜環烷基的例子包括哌啶基、哌嗪基、四氫吡喃基、四氫呋喃基、及嗎林基。環烯基是一環烷基，含有一個或多個(例如，1-3)雙鍵。此基團的例子包括環戊烯基、1，4-環己-二-烯基、環庚烯基、及環辛烯基。以同樣的說法，雜環烯基是一個雜環烷基、含有一個或多個雙鍵。
此處所稱的，芳香族基是一芳香族基團，含有6-14個環原子，且有時包括稠環，它可以是飽和、不飽和、或芳香族的。芳香族基的例子包括苯基、萘基、聯苯基、菲基、及蒽基。雜芳香基是芳香基含有1-3個雜原子，如氮、氧、或硫，且有時包括稠環。一些雜芳香環的例子為吡啶基、呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、噁唑基、咪唑基、吲哚基、苯並呋喃基、苯並噻唑基。
注意，該氨基可以是未經取代、單取代或雙取代。其可以被取代的基團例如烷基、環烷基、雜環烷基、芳香基、雜芳香基、芳香烷基、或芳香烷基。滷素為氟、氯、溴、或碘。一些單糖的例子為戊糖以及己糖。
本發明的其它特徵或優點將由下述詳細說明，並且也由權利要求書說明。
詳細說明本發明是關於使用一種前述式(I)的含多羥基化苯化合物以減少食物吸收；降低特定內分泌(例如睪丸素、雌二醇、瘦素、胰島素、類似胰島素樣的生長要素-I(IGF-I)，以及黃體激素(LH))與營養物(例如，葡萄糖、膽固醇，及甘油三脂)在血液中的水平；治療或預防任何因為該等內分泌或營養水平上升所引起的不適的失調或疾病；並減緩受治療者特定器官(例如前列腺、子宮以及卵巢)的增長。EGCG或其衍生物可以被以各種的方法提供，包括以形成脂質體製劑提供腹膜內注射或口服給藥。
式(I)化合物可以從自然的來源中獲得。例如(-)表棓兒茶素-3-棓酸鹽(EGCG)及(-)表兒茶素-3-棓酸鹽(ECG)可以被從綠茶(Camelliasinensis)中，根據Liao等人在Biochem.Biophys.Res.Commum 214833-838(1995)中所描述的步驟離析。一些式(I)化合物例如，單寧酸，也可以商業性地買到，從已知的化學品賣主，如Sigma化學公司(St.Louis，MO)。另一方面，式(I)化合物可以被以如下述方法合成製備。
如上所描述的式(I)化合物，含有多羥基苯部分，其經由連接基L被連接到A部分上。參見上述式(II)化合物。式(I)化合物，其中L包含一氨基鍵者可以經由反應一含氨基的A』與一含羥基的Ra』而形成。注意，A』及Ra』為相互反應後可以分別產生A和Ra部分的化合物。請參考如下第一個反應所示的反應流程I化合物A』是棓酸，且化合物Ra』是6-羥基多巴胺。這二種化合物在一般的偶合試劑中例如1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺(EDC)、苯三偶氮-1-基氧基三(二甲基氨基)-鏻六氟磷酸鹽(BOP)，或O-苯三偶氮-1-基-N，N，N』，N』-四甲基糖醛酸六氟磷酸鹽(HBTU)的存在下被偶合以形成化合物X。同樣地，咖啡酸與3-O-甲基多巴胺可以被偶合以形成化合物XII。參見反應流程I的最後反應式，化合物XI，其中L包含一個羰基，可以被以甲基3，4，5-三甲基苯甲酸酯與4-二甲基氨基苯甲醛在鹼性介質中反應製備。參見反應流程I的第二個反應式。
反應流程I 棓酸6-羥基多巴胺 化合物X 3，4，5-三甲基苯甲酸甲酯4-二甲基氨基苯甲醛 化合物XI 咖啡酸 3-O-甲基多巴胺 化合物XIIEDC為1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亞胺下述反應流程II-V描述製備式(I)化合物的方法，其中A是烯基或芳香族基。
反應流程II下列反應流程顯示沒食子酸衍生物複合物，例如可合成化合物K。氧化偶合該3』，4』，5』-三甲氧基乙醯苯(1)的烯醇鹽，得到1，4-二酮(2)，將化合物2施以溴化反應，接著去溴化氫反應而轉化成3。3被以BBr3去甲基化而得到反式-K，它在丙酮溶液中照射光而可被轉變成順式-K。 反應流程III具有四羥基苯化合物，類似化合物J可以被依如下描述的反應流程合成，如被描述在下反應流程中。3』，4』，5』-三甲氧基苯甲醇(1)以四個步驟被轉化成3』，4』，5』-三甲氧基苯基醋酸酯(5)。化合物5被以LDA處理，然後水解以得到1，3-雙(3』，4』，5』-三甲氧基苯基)丙酮(6)。6以低價鈦還原偶合得到相對應的四苯甲基乙烯(7)，它被以BBr3去甲基化得到化合物(結構J)。 反應流程IV進行3』，4』，5』-三甲氧基乙醯苯(1)與乙基3』，4』，5』-三甲氧基苯甲基酯(2)的縮合反應得到1，3-雙(3』，4』，5』-三甲氧基苯基)-1，3-丙烷二酮(3)。加4-苯基三唑啉二酮到3而得到2-尿唑基-1，3-丙烷二酮，其再被以叔丁基次氯酸鹽(t-BuOCl)氧化成相對應的N-苯基三唑啉二酮產生(4)。所產生的(4)被以3的烯醇鹽處理，以得到相對應的四苯甲醯基乙烯(5)，它被去甲基化，以得到化合物J2。 反應流程V將EGC乙醯化，接著進行選擇性地在三倍緩衝劑pH8.2中去乙醯化，得到單乙酸酯2。矽化該苯酚羥基，並隨後去乙醯化，可得到五矽化的表棓兒茶素4。4的十四烯酸酯(MOA)的製備是在DCC(二環己基碳化二亞胺)及DMAP(9-二甲基氨基吡啶)存在下以MOA轉移酯化反應而得到。用三乙基胺三氟化氫去保護5使在令人滿意的產率中得到EGC-MOA6。 依上述合成方法而製備的式(I)化合物可以被快速柱色層、製備型高性能液相色譜、或結晶而純化。
如上述所提起，式(I)化合物，減少食物吸收並抑制器官成長，例如前列腺、精囊、凝結腺、子宮、以及卵巢。它也減少受治療者的特定內分泌或營養物的循環水平。這些內分泌或營養物包括睪丸素、雌二醇、瘦素、胰島素、類似胰島素的生長要素-I、黃體激素、葡萄糖、膽固醇、及甘油三脂。有關上述內分泌或營養物的水平升高的疾病或病症，包括前列腺增生開始、前列腺癌、皮膚失調(例如粉刺)、皮脂溢、一般性禿頭、多毛症、汗腺炎化膿、肥胖、乳癌、卵巢癌、第II型糖尿病、心血管疾病、血管增生、糖尿病視網膜病變、風溼性關節炎、炎症、血管瘤，以及牛皮癬。所有上述這些病症或疾病是能夠提供給受治療者所需要的有效量的式(I)化合物或是它的鹽類而加以治療的。
有效量被定義為給予受治療者所需要的式(I)化合物的量，而可以使該被治療的受治療者產生醫療的效果。該有效量被提供給受治療者的標準是基於身體表面區域、接受實驗者的重量、以及受治療者的情況。劑量對受治療者的關係(以毫克每身體表面積的平方米為基礎)，被Freireich等人在Cancer Chemother.Rep.1966，50，219中描述。身體的表面區域可以被大概的從受治療者的高度與重量決定。參見例如，ScientificTables，Geigy Pharmaceuticals，Ardley，New York，1970，537。式(I)化合物的有效量被用於本發明的實施中，可能的範圍從1毫克/公斤到大約2克/公斤，例如，從大約1毫克/公斤到大約1克/公斤、從大約1毫克/公斤到大約500毫克/公斤，或是從大約1毫克/公斤到大約150毫克/公斤。效果的呈現也將多樣化，以在該技藝中的這些技能被認可，依據提供的途徑、使用的劑型，以及可能共同使用的，其它具療效的治療。
包含式(I)化合物的藥物組合物可以經由非腸胃途徑，包括皮下、腹膜內、肌肉內、以及通過靜脈給藥。腸胃劑型式的例子包括活化劑的水溶液、在等滲壓鹽水中、5％葡萄糖、或其它已知製藥可接受的賦型劑。溶解促進劑如環葡聚糖，或其它在該技藝中這些常見已知的溶解促進劑，有時會被用作製藥的賦型劑以投遞該有療效的化合物。
式(I)化合物有時也會被利用已知的方法配製劑型，以用於其它提供途徑。它們可以被配製例如，在劑量型式中，以膠封、糖漿、膠囊、或片劑用於口服給藥。膠囊可以包含任何已知製藥可接受的物質、例如凝膠或纖維素衍生物。片劑可以依據傳統的步驟以壓縮含有本發明的化合物與固體媒介物以及潤滑油的混合物而配製。固體載體的例子有包含澱粉與糖膠。本發明的類固醇衍生物，也可以被以硬殼藥片或膠囊的型式給藥，含有黏結劑(例如，乳糖或甘露糖醇)以及傳統的填充劑。
式(I)化合物可以經由任何適當的途徑，例如，通過靜脈、動脈內、局部、以注射、腹膜內、肋膜內、口服、皮下、肌肉內、舌下、表皮內、或直腸地而施用。它可以被配製成溶液、懸浮液、栓劑、片劑、顆粒、粉劑、膠囊、軟膏、或乳霜。在這些組合物的配製中，溶劑(例如，水或生理食鹽水)、溶解促進劑(例如，乙醇、聚山梨酸酯，或Cremophor EL7)、用於使穩定的試劑、防腐劑、抗氧化劑、賦型劑(例如，乳糖、澱粉、結晶的纖維素、甘露糖醇、麥芽糖、磷酸氫鈣、輕矽酸酐，或碳酸鈣)、黏結劑(例如，澱粉、聚乙烯吡咯烷酮、羥基丙基纖維素、乙基纖維素、羥基甲基纖維素，或阿拉伯膠)、潤滑劑(例如，硬酯酸鎂、滑石粉，或硬質子油)，或穩定劑(例如，乳糖、甘露糖醇、麥芽糖、聚山梨酸酯、巨膠，或聚氧乙烯硬海狸油)有時會被添加。如果需要，甘油、二甲基醋酸胺、70％乳酸鈉、表面活性劑，或基本的物質例如氫氧化鈉、乙烯二胺、乙醇胺、碳酸氫鈉、精氨酸、甲基葡萄糖胺，或三氨基甲烷有時會被添加。製藥的配製例如溶液、片劑、顆粒，或膠囊可以被用這些成分而形成。
一種以口服給藥式(I)化合物的方法，是以給藥脂質體製劑其含有脂質體和截留在其中的式(I)化合物。脂質體是由脂質雙層囊，在水存在下自然地形成。脂質體可以以各種兩親媒性脂質來製造。卵磷脂是被用於製造微脂球的最普通磷脂，但其它兩親脂質，例如磷脂醯乙醇胺、磷脂醯絲氨酸、心磷脂、磷脂醯肌醇以及膽固醇硫酸鹽也會被使用。脂質體可以使用單一型式的脂質或以組份的混合物來構成而加以備制。舉膽固醇為例(或其它固醇類)是常被加到卵磷脂的脂質體組成中，以使它們在生物的液體中穩定。依據配製所使用的方法，多層及/或單層囊被形成。這些囊的直徑可以是大的(0.1-100毫米)或小的(0.025-0.1毫米)。被使用在此研究項目中的多層脂質體型式，其製備是藉由溶解脂質及非極性藥物在有機溶劑中，然後該混合物在減壓下，被乾燥在玻璃囊的壁上。一水性緩衝溶液含有式(I)化合物例如，EGCG然後被加入，且該混合物被劇烈震蕩以分散該脂質。對脂質因子組合物，此步驟的實施必須高於膠體-液體-結晶相轉移溫度。此溫度依據脂質體的個別成分與在脂質體中磷脂的脂肪酸上而決定。另一方面，脂質體加載所需的化合物其製造是以溶解磷脂及化合物在溶劑中例如丙酮，然後以在溶劑中沉澱它們離析該二者的複合物例如己烷或凍幹或噴幹該成分。當此物質被分散在水溶液中時，脂質體複合物是被自然地形成。式(I)化合物乾燥的脂質體製劑是穩定的，特別是當儲存在真空及低溫下。添加抗氧化劑，例如抗壞血酸或丁基酯羥基甲苯(BHT)，可以允許該製劑在室溫及大氣壓力下儲存。
不需更進一步詳細闡述，相信本領域普通技術人員可以基於上述的揭露以及下面的描述，利用本發明而達到其最完整的範圍。下述實施例，描述式(I)化合物合成、生物活性以及處方，將被理解為，只是說明本領域普通技術人員如何能實施本發明，且並非對所揭露的其餘部份做任何的限制。任何出版物被引證在此揭露中亦合併做為參考文獻。
實施例式(I)化合物由下面描述的方法製備製備N-叔丁基-N，N』-二-2，3，4-三羥基苯甲醯基醯肼將2，3，4-三羥基苯甲酸(10mmol)與亞硫醯氯(20mol)回流3小時。減壓蒸餾過量的亞硫醯氯以後，2，3，4-三羥基苯甲醯氯被以蒸餾純化。將2，3，4-三羥基苯甲醯氯(10mmol)及50％氫氧化鈉(20mmol)水溶液，在冰浴上同時攪拌，同時逐滴加到分散在100毫升的1，4-二噁烷水(2∶1，v/v)中的叔丁基醯肼鹽酸鹽(10mmol)。在室溫下攪拌2天以後，二噁烷在減壓下被除去，且該殘餘物被以乙醚萃取。該有機相被以1N的氫氧化鈉與飽和食鹽水洗一次，然後以無水硫酸鎂乾燥。減壓蒸餾乙醚得到的殘餘物被純化，使用矽膠柱色層用己烷/乙酸乙酯(1∶1，v/v)純化以得到N-叔丁基-N，N』-二-2，3，4-三羥基苯甲醯基醯肼。
製備N，N』-二-乙基-N，N』-二-2，3，4-三羥基苯甲醯基醯肼使用如上面描述的相同步驟，但將叔丁基醯肼鹽酸鹽被取代為二乙基醯肼二鹽酸鹽。
式(I)化合物的活性，(-)表棓兒茶素-3-棓酸鹽(EGCG)，經使用下述物質及方法而可以發現動物。成熟的Sprague-Dawley(SD；Harlan)老鼠(雄性體重170-190克；雌性體重125-145克)與精瘦的及過胖的Zucker(查理斯河實驗室)老鼠(精瘦雄性體重240-260克；過胖雄性體重420-440克)，除非指出，其給予自由進食標準老鼠食物所指定的飲食與水。動物實驗草案經由芝加哥大學動物保護學會及使用委員會認可。老鼠被維持在室溫25℃，在曝光周期12小時亮及12小時暗的條件下。
體內處理。EGCG以及其它的兒茶素(純度大於98％)在我們的實驗室中被從綠茶(Camellia sinensis)中離析，Liao等人描述在Biochem.Biophys.Res.Commum 214833-838(1995)中。兒茶素被溶解在水中以供口服以及在無菌的磷酸鹽緩衝溶液鹽水中供ip注射。在控制群的老鼠中，只接受載體。睪丸素丙酸酯(TP)及5α-二氫睪丸素丙酸酯(DHTP)被溶解在芝麻油中，以及當指出時，4毫克在0.5毫升芝麻油中(16毫克/公斤體重)每天被皮下注射。
食物的限制，雄性SD老鼠每天被給予12克的老鼠食物，大約為每一控制鼠每天消耗量的50％。體重以及食物量與水的消耗量均每天監控。食物消耗量已關在籠子裡的老鼠中，以3到5隻動物為一組，用每24小時秤重食物丸來監控。在最後的日子，老鼠被以甲氧氟烷麻醉，且以心臟穿刺收集血液。血清在離心(在4℃，10,000g進行20分鐘)後被收集作生物化學分析。
生物化學分析。用於生物化學分析，商業上的各种放射性同位素標識免疫檢定法的工具用於IGF-I與睪丸素(Diagnostic Systems Laboratory，Inc)、LH與GH(Amersham)、瘦素與胰島素(Linco Research Inc)、以及皮質固酮(INC)與分析工具用於甘油及甘油三脂(Sigma)與脂肪酸(Roche Molecular Biochemicals)被使用。最近老鼠的組成分析由COVANCE Laboratory(Madison Wisconsin)進行。完整血液計數及血清化學(例如，膽固醇、葡萄糖，以及酶活性)由在芝加哥大學動物來源中心進行。
統計分析。數據被以平均值±標準差表達。該不成對學生的t-試驗被用於檢查介於控制組與EGCG注射組間的差別。變異分析及學生-新人-熟手多種範圍試驗被用於檢驗不同組的差異量。0.05概率水平被用來表示為顯著。
用EGCG治療的受治療者體重。SD雄性與雌性老鼠經EGCG腹膜內注射經治療2到7天內導致體重急遽減少。對於雄性SD老鼠，EGCG在體重上效果是決定於劑量。每天注射EGCG劑量5或10毫克(26及53毫克/公斤體重)在體重減少上比起15毫克(大約85毫克/公斤體重)並不會影響或僅有影響。雄性SD老鼠每天腹膜內注射26及53毫克EGCG/公斤體重，經七天治療之後，相對於它們開始時的身體重量，獲得的體重大約17-24％，但是相對於控制組減少5-9％。反的，雄性SD老鼠每天腹膜內注射85毫克EGCG/公斤體重，經治療七天的後，它們的體重相對於它們開始時的體重減少15-21％以及相對於控制組減少30-40％。控制組老鼠繼續成長，相對於它們開始時的體重，它們增加的體重大約25-34％(見表一)。雌性SD老鼠每天腹膜內注射12.5毫克EGCG(大約92毫克/公斤體重)，經七天的治療後，相對於它們開始時的體重，它們的體重減少10％，以及相對於控制組減少29％。因此，70-92毫克/公斤體重的EGCG劑量被使用在大部分實驗中。
性器官及其它器官的重量改變。EGCG的有效劑量在性器官重量上的影響也被觀察到。對男性激素敏感器官的重量，例如腹面及背面的前列腺、精囊、凝結腺、以及包皮腺，經以EGCG(大約85毫克/公斤身體重量)治療7天以後，被減少大約50-70％。在兒茶素特效藥方法中，這些性器官重量被改變調整。相對於殺死的控制組動物在實驗開始的時候，這些性器官(尤其是包皮腺)，在雄性SD老鼠中，經7天的EGCG治療以後，減少大約30-50％的重量。同樣地，對雌激素敏感器官的重量，例如雌性SD老鼠的子宮及卵巢，經7天的EGCG治療以後，被減少大約50％。每一個肝臟及腎臟的重量也被減少大約20％。在雄性SD及精瘦的Zucker老鼠中，以EGCG治療7-8天，當該脾臟重量被減少大約15-30％，每一個肝臟、腎臟及睪丸的重量被減少大約10-20％。無論如何，所述的這些器官的重量在雄性過胖的Zucker老鼠中，以EGCG治療4天都沒有改變。
性激素、瘦素、IGF-I、胰島素、LH及GH水平的改變。被以EGCG治療的老鼠，在各種內分泌參數中均有顯著的改變。經以EGCG(大約85毫克/公斤體重)治療7天以後，雄性老鼠睪丸素的循環被減少大約75％。同樣地，在雌性經以EGCG治療7天以後，雌性17β-雌二醇的循環水平被減少大約34％。雄性及雌性SD老鼠經7天的EGCG治療，導致顯著減少血液中瘦素、IGF-I、以及胰島素的水平。在雄性SD老鼠血清中的睪丸素、瘦素、IGF-I、以及胰島素水平也觀察到了EGCG的劑量依存效應。如對雄性及雌性SD老鼠以EGCG治療7天後，當它的GH在雄性中增加或在雌性中被減少時，血清中的LH水平仍舊是顯著的減少(40-50％)。無論如何，GH內分泌變動的本質，阻止我們對這些老鼠中的GH循環水平改變做成明確的結論。EGCG的效果在性激素及各種縮氨酸上的調查，不是模仿比EGCG少一個羥基的ECG。
精瘦及過胖的雄性Zucker老鼠以EGCG治療，在該血清中的睪丸素、瘦素、IGF-I、胰島素以及GH水平與前列腺重量也顯示相似的改變。對SD及Zucker老鼠兩者，用每公斤體重為70-92毫克EGCG者也觀察到顯著的效果。
外源性雄激素的作用改變了EGCG在副性器官上的效果。為了決定在副性器官重量的減少是否由於EGCG-誘導而減少雄性激素水平，我們對雄性SD老鼠注射雄性激素及/或EGCG。我們發現EGCG並不會導致每天注射TP或DHTP的雄性老鼠的前列腺重量減少；因此，在這些老鼠中EGCG在前列腺重量上的影響似乎次於EGCG-誘導而減少睪丸素的水平。無論如何，提供雄性激素並不能防止EGCG-誘導而減少體重、食物吸收限制、減少在循環中的瘦素、IGF-I、胰島素、以及LH、並增加在循環中的GH。
在血清營養物及鄰近身體組成中的改變。經EGCG治療的雄性SD老鼠，其血清中蛋白質、脂肪酸、以及甘油並沒有改變，但血清中的葡萄糖(-32％)、瘦素(-15％)、甘油三脂(-46％)、以及膽固醇(-20％)觀察到有顯著減少。在精瘦及過胖的雄性Zucker老鼠中的血清營養物中也觀察到相似的改變。動物鄰近的組成分析顯示，經每天以EGCG治療7天後的SD老鼠，水與蛋白質含量的百分比並沒有改變，而碳水化合物含量(2.5％在控制組，以及1.3％在EGCG治療組)有中度的減少，但在脂肪含量上則有很大的減少(從控制組的4.1％到EGCG治療組的1.4％)。雄性SD及精瘦的Zucker老鼠經EGCG治療的7至8天內，減少皮下脂肪約40-70％及腹部脂肪約20-35％，但在附睪脂肪則無。過胖的雄性Zucker老鼠經以EGCG治療4天內，腹部脂肪減少20％。
EGCG在食物吸收上的效果。我們發現經EGCG治療過的雄性及雌性老鼠所消耗的食物要比控制組老鼠少大約50-60％。在食物吸收上，在過胖的雄性Zucker老鼠亦觀察到相似的EGCG效果。因此，體重損失是由於食物吸收減少。因為食物限制會改變丘腦下部功能，並減少LH與性類固醇的水平，我們限制該SD雄性老鼠(沒有注射EGCG)的食物吸收大約50％為期7天，經與給予自由接近食物的動物相比發現，其血液中睪丸素的水平被確實的減少大約60％，且腹面的前列腺重量被減少大約50％。血清中的瘦素、IGF-I、胰島素、LH、以及GH在限制食物後也減少了。提供雄性激素給雄性SD老鼠並不能阻止EGCG-誘導食物吸收減少。當EGCG以口服給藥為腹膜內給藥時，這些EGCG的效果將被減少或失去。
血液中組成的改變。雄性SD老鼠被以EGCG及ECG治療7天，然後它們的血清及全部血液被分析各種成分。EGCG或相對結構的ECG均不會導致在血清中的總蛋白質、白蛋白、血液尿素氮、肌酸、PO43-、Na+、K+、Ca2+、Cl-、以及酶水平的顯著改變，它們顯示出肝臟及其它器官的嚴重損壞，例如乳酸脫氫酶、丙氨酸氨基轉移酶、天冬氨酸氨基轉移酶、γ-穀氨醯基轉酞酶。無論如何，在血液膽紅素以及鹼性磷酸酶活性物的量上觀察到顯著的改變。經以EGCG治療的老鼠血液中，紅血球以及血紅素濃度增加大約20％，在此同時，白血球、淋巴球、以及單核白血球的濃度分別各自地減少大約10％、31％、以及24％。嗜伊紅血球以及血小板濃度減少約100％。
下述實施例描述形成以及試驗含EGCG脂質體製劑的步驟配製EGCG-醬油卵磷脂(PC)複合物(SPC)。7.6克PC與4.58克EGCG的懸浮物在150毫升的丙酮中被製備。在室溫下混合三小時後，該溶液在真空下被濃縮至30毫升，然後以300毫升的己烷慢慢稀釋。沉澱物在靜置18小時以後形成，經過濾收集、真空下乾燥以及在真空下於-20℃的黑暗中儲存。
使用培養細胞測定EGCG-SPC的生體可用率。EGCG-SPC複合物以12毫克/毫升的濃度(相當於10mmol的EGCG)懸浮在PBS介質中。HEK293表現型式1或2人類的5α-還原酶的HEK293細胞，以濃度為50,000細胞/板，被植入於24平板上。隔天添加各種劑量的EGCG被添加，使EGCG的濃度將相當於0-100μM。一控制組的脂質體被配製，該控制組脂質全是做成將含有SPC而無EGCG，且將被試驗在PC的濃度等於所使用的EGCG-SPC。一小時培養後，[14C]-睪丸素(55mci/mmol)被加入(最後濃度1μM)，且該細胞在37℃下培養1小時。然後培養基被移除，並以乙酸乙酯萃取。濃縮後，該萃取物以使用矽膠板的TLC分離，其使用的溶劑為二氯甲烷/乙酸乙酯/甲醇(85∶15∶3)。然後該板被以分子動力激發磷光影像器/掃描儀做放射性掃描。然後該相對應於T與DHT的即時放射劑量可以被測定。該EGCG-SPC的濃度抑制5α-還原酶活性50％(IC50)活性，可以用圖形定出。
EGCG-SPC對老鼠給藥。
將2毫升(相當於92毫克)濃度為120毫克/毫升懸浮於PBS中的EGCG-SPC，強迫餵食一群35隻(190-200克)雄性Sprague Dawley老鼠群只每一老鼠。而另一群老鼠則接受相同劑量(92毫克)在PBS中的純EGCG做比較。在0、0.5、1、2、3、4，以及5小時時，五隻老鼠先使用甲氧氟烷麻醉再以心臟穿刺抽血。血液被收集到肝素化試管，並將該血漿離心後，混合到0.1體積的20％抗壞血酸，以及-0.05％EDTA。這將降低酸鹼值及螯合鐵但因此也穩定EGCG。如果給藥的劑量與EGCG血中濃度有線性的劑量-反應關係時，則使用不同劑量的EGCG-SPC並重複以上程序以進行測定。
分析老鼠血漿中的EGCG。
血漿在冰上被解凍，取1毫升等分試樣與0.1體積的PSB或含葡萄糖酸酶(2500U)及硫酸酯酶(200U)的0.1體積PSB混合。樣品在37℃下培養1小時，然後以等體積的乙酸乙酯萃取二次。該乙酸乙酯在真空下被移除，然後以等體積的乙酸乙酯萃取二次。該乙酸乙酯在真空下被移除，然後將乾燥的萃取物溶解在100μl的HPLC溶液中，該溶液由乙腈/乙酸乙酯/0.05％磷酸(12∶2∶86)組成。該樣品於C18分析管柱中分離，其在40℃使用等滲壓洗脫，並以UV在273nm偵測。純的EGCG被用於配製標準溶液作為EGCG在血中的定量，以比較標準物與未知物的峰高度。因為EGCG有時會以非酶，並通過在血液中非特定酯酶的活化，被分解成EGC與棓酸鹽，EGCG與EGC峰將被以HPLC監控。
其它實施方案當本發明被描述在相關聯的詳細說明中，它可以了解到上述的詳細說明描述是用於闡明而非限制本發明的範圍，它被以所附的權利要求書限定。其它方面、優點、以及改進都在本發明的範圍內。
權利要求
1.一種用於減少食物在受治療者中吸收的方法，該方法包括給予受治療者所需要的的有效量的下式化合物 其中A為烴、氧、硫、或氮；該烴選自烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳香基以及雜芳香基，其每一個被任意地以烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、氧代、烷基羰氧基、烷氧基羰基、芳香基羰氧基、芳香氧基羰基、烷基羰基、芳香基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、芳香基氨基羰基、或芳香基羰基氨基所取代；以及每一個Ra、Rb、Rc及Rd各自獨立地代表氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳香基、雜芳香基、芳香基烷基、雜芳香基烷基、烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、氨基烷基、硫基、硫化烷基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、或如下式的部分 其中L是-L1-L2-L3-，其中L2是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R』)-、-CO-、-N(R』)-CO-、-CO-N(R』)-、-N(R』)-SO2-、-SO2-N(R』)-、-O-CO-、-CO-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、或刪除，且每一個L1及L3，各自獨立地，代表-(CR』＝CR」)n-、-(C≡C)n-、-(C(R』)(R」))n-、或刪除；每一個R』及R」各自獨立地代表氫、烷基、烷氧基、羥基烷基、羥基、氨基、硝基、氰基、滷素、或滷化烷基，且n代表1、2，或3；以及每一個R1、R2、R3、R4、及R5各自獨立地代表氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、氨基羰氧基、或烷氧基羰基氨基；條件是當A是氧或硫時，Ra及Rb兩者被刪除；且當A是氮時，Ra被刪除；以及進一步地條件是Ra、Rb、Rc及Rd中至少有二個為如下式的部份 其中至少二個R1、R2、R3、R4、及R5是羥基、烷氧基、或烷基羰氧基，而其互相的關係是在間或鄰位；或其醫藥上可接受的鹽類。
2.如權利要求1所述的方法，其中A為環烷基、雜環烷基、芳香基、或雜芳香基。
3.如權利要求2所述的方法，其中A為單糖類。
4.如權利要求2所述的方法，其中Ra及Rb二者皆為下式 且每一個Ra及Rb都鍵結到A互相鄰接的環原子上。
5.如權利要求4所述的方法，其中L是-CO-、-N(R』)-CO-、-O-CO-、或刪除。
6.如權利要求5所述的方法，其中不是R1與R2就是R3與R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
7.如權利要求5所述的方法，其中不是R1與R3就是R2與R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
8.如權利要求5所述的方法，其中R1、R2以及R3；或是R2、R3以及R4；或是R3、R4以及R5，獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
9.如權利要求8所述的方法，其中每一個R2、R3以及R4，獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
10.如權利要求1所述的方法，其中A為烯基。
11.如權利要求10所述的方法，其中Ra及Rb二者皆為下式 且每一個Ra及Rb都鍵結到雙鍵的同一邊。
12.如權利要求11項所述的方法，其中L是-CO-、-N(R』)-CO-、-O-CO-、-CH2-、或刪除。
13.如權利要求12所述的方法，其中不是R1與R2就是R3與R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
14.如權利要求12所述的方法，其中不是R1與R3就是R2與R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
15.如權利要求12所述的方法，其中每一個R1、R2以及R3；或是每一個R2、R3以及R4；或是每一個R3、R4以及R5，獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
16.如權利要求15所述的方法，其中每一個R2、R3以及R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
17.如權利要求1所述的方法，其中A為氮。
18.如權利要求17所述的方法，其中L是-CO-、-N(R』)-CO-、-CH2-、或刪除。
19.如權利要求18所述的方法，其中不是R1與R2就是R3與R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
20.如權利要求19所述的方法，其中不是R1與R3就是R2與R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
21.如權利要求20所述的方法，其中每一個R1、R2以及R3；或是每一個R2、R3以及R4；或是每一個R3、R4以及R5，獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
22.如權利要求21所述的方法，其中每一個R2、R3以及R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
23.如權利要求1所述的方法，其中該化合物為 (EGCG)結構E
24.如權利要求1所述的方法，其中該化合物為 結構F 結構G 結構H 結構I，或 結構J
25.一種用於減少在受治療者中的內分泌水平的方法，該方法包括給予受治療者所需要的有效量的下式化合物 其中A為烴、氧、硫、或氮；該烴選自烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳香基以及雜芳香基，其每一個任意地被以烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、氧代、烷基羰氧基、烷氧基羰基、芳香基羰氧基、芳香氧基羰基、烷基羰基、芳香基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、芳香基氨基羰基、或芳香基羰基氨基所取代；以及每一個Ra、Rb、Rc及Rd獨立地代表氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳香基、雜芳香基、芳香基烷基、雜芳香基烷基、烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、氨基烷基、硫基、硫化烷基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、或如下式的部分 其中L是-L1-L2-L3，其中L2是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R，)-、-CO-、-N(R』)-CO-、-CO-N(R』)-、-N(R』)-SO2-、-SO2-N(R』)-、-O-CO-、-CO-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、或刪除，且每一個L1及L2獨立地代表-(CR』＝CR」)n-、-(C≡C)n-、-(C(R』)(R」))n-、或刪除；每一個R』及R」獨立地代表氫、烷基、烷氧基、羥基烷基、羥基、氨基、硝基、氰基、滷素、或滷化烷基，且n代表1、2、或3；以及每一個R1、R2、R3、R4、及R5，獨立地代表氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、氨基羰氧基、或烷氧基羰基氨基；條件是當A是氧或硫時，Ra及Rb兩者被刪除；且當A是氮時，Ra被刪除；以及進一步地條件是Ra、Rb、Rc及Rd中至少有二個為如下式的部分 其中R1、R2、R3、R4、及R5中至少有二個是羥基、烷氧基或烷基羰氧基，其互相間的關係是間位或鄰位；或其醫藥上可接受的鹽類。
26.如權利要求25所述的方法，其中A為環烷基、雜環烷基、芳香基、或雜芳香基。
27.如權利要求26所述的方法，其中A為單糖類。
28.如權利要求26所述的方法，其中Ra及Rb二者皆為下式 且每一個Ra及Rb都鍵結到A互相鄰接的環原子上。
29.如權利要求28所述的方法，其中L是-CO-、-N(R』)-CO-、-O-CO-、或刪除。
30.如權利要求29所述的方法，其中不是R1與R2就是R3與R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
31.如權利要求29所述的方法，其中不是R1與R3就是R2與R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
32.如權利要求29所述的方法，其中R1、R2以及R3；或是R2、R3以及R4；或是R3、R4以及R5，獨立地代表羥基、烷氧基或烷基羰氧基。
33.如權利要求32所述的方法，其中每一個R2、R3、以及R4獨立地代表羥基、烷氧基或烷基羰氧基。
34.如權利要求25所述的方法，其中A為烯基。
35.如權利要求34所述的方法，其中Ra及Rb二者皆為下式 且每一個Ra及Rb都鍵結到雙鍵的同一邊。
36.如權利要求35所述的方法，其中L是-CO-、-N(R』)-CO-、-O-CO-、-CH2-、或刪除。
37.如權利要求36所述的方法，其中不是R1與R2就是R3與R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
38.如權利要求36所述的方法，其中不是R1與R3就是R2與R4獨立地代表羥基、烷氧基或烷基羰氧基。
39.如權利要求36所述的方法，其中R1、R2、以及R3；或是R2、R3以及R4；或是R3、R4以及R5，獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
40.如權利要求39所述的方法，其中每一個R2、R3、以及R4獨立地代表羥基、烷氧基或烷基羰氧基。
41.如權利要求25所述的方法，其中A為氮。
42.如權利要求41所述的方法，其中L是-CO-、-N(R』)-CO-、-CH2-、或刪除。
43.如權利要求42所述的方法，其中不是R1與R2就是R3與R4獨立地代表羥基、烷氧基、或烷基羰氧基。
44.如權利要求43所述的方法，其中不是R1與R3就是R2與R4獨立地代表羥基、烷氧基或烷基羰氧基。
45.如權利要求44所述的方法，其中每一個R1、R2以及R3；或是每一個R2、R3以及R4；或是每一個R3、R4以及R5，獨立地代表羥基、烷氧基或烷基羰氧基。
46.如權利要求45所述的方法，其中每一個R2、R3以及R4獨立地代表羥基、烷氧基或烷基羰氧基。
47.如權利要求25所述的方法，其中該化合物為 (EGCG)結構E
48.如權利要求25所述的方法，其中該化合物為 結構F 結構G 結構H 結構I，或 結構J
49.一種脂質體製劑，其包括脂質體和截留其中的化合物，該化合物具有下式 其中A為烴、氧、硫、或氮；該烴選自烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳香基、以及雜芳香基，其每一個任意地被以烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、氧代、烷基羰氧基、烷氧基羰基、芳香基羰氧基、芳香氧基羰基、烷基羰基、芳香基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、芳香基氨基羰基、或芳香基羰基氨基取代；以及每一個Ra、Rb、Rc、及Rd各自獨立地，代表氫、烷基、烯基、炔基、環烷基、雜環烷基、環烯基、雜環烯基、芳香基、雜芳香基、芳香基烷基、雜芳香基烷基、烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、氨基烷基、硫基、硫化烷基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、或下式的部分 其中L是-L1-L2-L3-，其中L2是-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-N(R』)-、-CO-、-N(R』)-CO-、-CO-N(R』)-、-N(R』)-SO2-、-SO2-N(R』)-、-O-CO-、-CO-O-、-O-SO2-、-SO2-O-、或刪除，且每一個L1及L3，獨立地代表-(CR』＝CR」)n-、-(C≡C)n-、-(C(R』)(R」))n-、或刪除；每一個R』及R」各自獨立地代表氫、烷基、烷氧基、羥基烷基、羥基、氨基、硝基、氰基、滷素、或滷化烷基，且n代表1、2、或3；以及每一個R1、R2、R3、R4、及R5獨立地代表氫、烷基、烯基、炔基、烷氧基、羥基、羥基烷基、羧基、滷素、滷化烷基、氨基、硫基、硝基、氰基、烷基羰氧基、烷氧基羰基、烷基羰基、甲醯基、氨基羰基、烷基羰基氨基、氨基羰氧基、或烷氧基羰基氨基；條件是當A是氧或硫時，Ra及Rb兩者被刪除；且當A是氮時，Ra被刪除；以及進一步地條件是Ra、Rb、Rc及Rd中至少有二個是如下式的部分 其中至少二個R1、R2、R3、R4及R5中至少有二個是羥基、烷氧基或烷基羰氧基，其互相間的關係是間位或鄰位；或醫藥上可接受的鹽類。
全文摘要
一種用於減少食物在受治療者中吸收的方法，以及一種用於減少在受治療者中的內分泌水平的方法。該方法包括給予受治療者所需要的有效量的下式化合物也揭露一脂質體製劑，其包括一脂質體及一截留在其中的化合物。該被截留的化合物的化學式如上所示。
文檔編號A61K31/045GK1392796SQ01800259
公開日2003年1月22日 申請日期2001年2月15日 優先權日2000年2月18日
發明者廖述宗, 理查·A·西巴卡, 高永旭 申請人:亞其發展公司