他汀類化合物作為防治骨質疏鬆骨折局部用藥物的新用途的製作方法

2023-05-02 01:52:36

專利名稱：他汀類化合物作為防治骨質疏鬆骨折局部用藥物的新用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及醫藥技術領域，更具體地說，涉及HMG-CoA還原酶抑制劑(他汀類化合物)局部施用防治骨質疏鬆骨折，增強骨質疏鬆骨骼內固定強度，促進骨折癒合等新用途，及其局部用組合物。
背景技術：
骨質疏鬆症是一種以低骨量和骨組織微結構破壞為特徵，導致骨骼脆性增加和易發生骨折的全身性疾病。隨著人類壽命的延長，絕經後女性人數的增加，骨質疏鬆症及其合併骨折已成為全球的一個嚴重的公眾健康問題。以危害最嚴重的髖部骨折為例，1990年全球發病例為166萬，預計2050年將達626萬，而其中亞洲約佔51 %。骨質疏鬆雖是全身性系統疾病，但其最大的危害卻是局部脆性骨折。骨質疏鬆性骨折已嚴重威脅老年人的身心健康並影響老年人的生活質量，其致殘率、致死率高。骨質疏鬆患者一旦發生骨折，其它部位的骨折風險大大增加，骨質疏鬆性骨折的臨床治療非常棘手。骨質疏鬆性髖部骨折是老年人致殘致死的重要原因之一，骨質疏鬆髖部骨折一年內死亡率高達20 40%，即使倖存者中也有50%的留有殘疾(Stewart NA，et al.Predictorsof 5 year survival following hip fracture.1njury.2011 ;42 (11):1253-1256.),巨客頁醫療費用也是家庭、社會所不堪負擔的。隨著老齡化社會的到來，問題將更加嚴重。據資料統計，2000年我國60歲以上老年人佔總人口的11 %，到2005年將達到20 %，這一部分人群是發生骨質疏鬆性骨折的高危群體，將面臨嚴峻的挑戰。骨質疏鬆預防和治療的最終目的是避免初次骨折和再次骨折。但目前臨床常用的骨吸收抑制劑如骨化三醇、選擇性雌激素受體調節劑、降鈣素、雙磷酸鹽、雌激素等藥物只能延緩骨量丟失，周期長、見效慢，加之服藥方法和副作用的影響，服藥依從性低。以雙磷酸鹽類藥物為例，雖經劑型的改造，有每周I次，甚至每月I次的雙磷酸鹽類藥物，但只有不到50%的病人能堅持服用雙磷酸鹽I年以上(Gallagher AM, et al.Fracture outcomesrelated to persistence and compliance with oral bisphosphonates.J Bone MinerRes.2008 ；23 (10):1569-1575.)(Cramer JA,et al.A systematic review of persistenceand compliance with bisphosphonates for osteoporosis.0steoporos Int.2007 ；18(8):1023-1031.)。骨質疏鬆引起的脆性骨折治療非常棘手，因為骨骼質量差，內固定的牢固程度差、易鬆動，骨折癒合緩慢，再先進的內固定技術也難以在疏鬆的骨骼上發揮作用。骨骼內固定術後3個月骨量急劇丟失，而口服雙磷酸鹽3個月後內植物周圍的骨丟失才逐步減少(Stadelmann VA, et al.1mplants delivering bisphosphonate locally increaseperiprosthetic bone density in an osteoporotic sheep model.A pilot study.EurCell Mater.2008 ；16:10-16.)。受建築學中危房加固技術的啟發:「對於不能推倒重來的危房不是所有部位都加固，而是在重點部位採用『植筋』、『灌膠』等技術局部重點加固」。骨質疏鬆骨折的好發部位非常集中，46%發生在脊柱(大多集中胸腰段)，30%發生在髖部(BarloW DH.0steoporosis guidelines.Climacteric.2007 ；10 (S2):79_82.)。如果釆取某種措施，強化局部重點部位的骨骼，就會大大減少骨質疏鬆引發的骨折；同時因為局部骨骼的強化，也可以改善局部骨骼質量，提高內固定材料的力學性能，保證骨質疏鬆骨骼的內固定手術效果。有研究發現局部應用雙磷酸鹽可提高其生物利用度，增加局部骨量和假體周圍骨密度(VerronE, et al.1n vivo bone augmentation in an osteoporotic environmentusing bisphosphonate—loaded calcium deficient apatite.Biomaterials.2010 ；31 (30):7776-7784.) o但骨吸收與骨形成是相互偶聯的重建過程，抑制骨吸收的同時也會阻礙骨形成。他汀類藥物作為安全有效的降脂和心腦血管意外的一線預防藥物已在臨床廣泛應用。有研究發現口服他汀類藥物可以增加骨密度，提高骨骼力學性能(Mundy G，et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins.Science.1999 ;286(5446):1946-1949.) (Li X，et al.Simvastatin induces estrogenreceptor-alpha expression in bone，restores bone loss，and decreases ER aexpression and uterine wet weight in ovariectomized rats.J Bone MinerMetab.2011 ；29(4):396-403.)。但對於口服他汀類藥物促進成骨的作用存在分歧(ReidIR，et al.Effect of pravastatin on frequency of fracture in the LIPID study:secondary analysis of a randomised controlled trial.Long-term Interventionwith Pravastatin in Ischaemic Disease.Lancet 2001 ；357:509-512.Patil S，etal.Prospective, double blind， randomized, controlled trial of simvastatin inhuman fracture healing.J Orthop Res 2009;27:281-285)。口服後他汀類藥物的生物利用度低，經肝臟的首過效應後，僅不到5%的進入血液循環,骨骼中濃度更低(SchachterM.Chemical, pharmacokinetic and pharmacodynamic properties of statins:anupdate.Fundam Clin Pharmacol.2005 ; 19 (I):117-125.)，難以發揮有效的成骨作用。其次，臨床上很多的骨質疏鬆患者需要內固定手術治療，但疏鬆的骨骼是手術成功的巨大障礙。無論是骨質疏鬆病人的骨折、脊柱退行性改變、骨性關節炎需要進行內固定手術時，脆弱的骨骼難以保證手術療效；很多的患者在手術前沒有接受骨質疏鬆的治療，而現有的骨質疏鬆治療藥物僅能減緩骨丟失，難以救急。

發明內容
本發明令人驚奇地發現疏鬆骨骼的局部單次應用他汀類化合物在較短時間內起效並可維持長時間地增加骨量、提高骨密度、改善骨組織微結構、增強骨骼力學性能而用於防治骨質疏鬆引起的脆性骨折；並可增強內置物在疏鬆骨骼中的內固定強度。具體地說，本發明提供了他汀類化合物作為防治哺乳動物骨質疏鬆骨折、促進骨折癒合或增強骨骼內植物力學強度的局部用藥物新用途。

本發明提供了他汀類化合物作為預防和治療骨質疏鬆骨折、促進骨折癒合或增強骨骼內植物力學強度的局部用藥物用途，這裡，所述的局部用藥物是由藥理學上有效量的他汀類化合物或其藥學上可接受的鹽與藥學上可接受的輔料組成。在本發明的實施方案中，所述的他汀類化合物選自但不限於辛伐他汀、阿託伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀、西立伐他汀、克伐他汀、達伐他汀、美伐他汀、或替伐他汀等HMG-CoA還原酶抑制劑。他汀類化合物也可以是藥學上可接受鹽的形式，例如但不限於鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、三氟醋酸鹽或乙酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽。在本發明的一種優選的實施方案中，所述的他汀類化合物選自辛伐他汀、阿託伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、或匹伐他汀，而且它們可以是藥學上可接受鹽的形式，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽，更優選地，阿託伐他汀鈣或阿託伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、普伐他汀鈉、瑞舒伐他汀鈣、或匹伐他汀鈣 。在本發明的實施方案中，所述他汀類局部用藥物(或組合物)優選為骨骼內注射或植入給藥，本發明所述的他汀類局部用藥物可以注射劑的形式存在，所述的注射劑包括但不限於注射溶液、注射用混懸液、注射用乳劑、注射用凝膠、注射用固體形式，或者它們的緩釋或控釋形式，或內植物形式。這裡，所述的注射用固體形式是指在使用時與注射用溶媒例如注射用水、注射用生理鹽水或注射用葡萄糖溶液等中一種相混合，以便注射應用。在本發明的實施方案中，所述的他汀類局部用藥物(或組合物)是由他汀類化合物或其藥學上可接受的鹽與藥學上可接受的輔料組成，這裡，所述藥學上接受的輔料選自水溶性溶媒或油性溶媒、分散劑、等滲劑、防腐劑、增溶劑或者穩定劑中的一種或兩種以上，其中，水溶性溶媒可選自蒸餾水、生理鹽水、格林氏溶液或者磷酸鹽緩衝溶液(PBS)等；油溶性溶媒可選自植物油，例如橄欖油、蓖麻油、芝麻油、棉籽油或者玉米油等；分散劑可選自吐溫20或吐溫80、聚乙二醇、羧甲基纖維素、或者海藻酸鈉等；等滲劑可選自氯化鈉、甘油、山梨醇、或者葡萄糖等；增溶劑可選自水楊酸鈉、或者醋酸鈉等；防腐劑可選自尼泊金甲酯、尼泊金丙酯、苯甲醇、氯丁醇、苯甲酸鈉、或者苯酚等；穩定劑可選自白蛋白等，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白等。此外，所述藥學上可接受的輔料還可選自生物可降解的材料，例如聚乳酸、聚丙交酯-乙交酯、聚天冬氨酸等。對於本領域的技術人員而言，可以應用已知的製劑技術來製備本發明的他汀類局部用藥物(或組合物)，例如，將他汀類化合物或其藥學上可接受的鹽與分散劑、和/或等滲劑、和/或防腐劑、和/或增溶劑、和/或穩定劑一起溶解、懸浮或乳化在水溶性溶媒或油性溶媒中(這裡，引入Remington:the science andpractice of pharmacy,第 21 版，Lippincott Williams & Wilkins 出版社，2005 年，作為參考)。在本發明的實施方案中，本發明提供的治骨質疏鬆骨折、預防骨折癒合或增強骨骼內植物力學強度的局部用組合物，其中，所述他汀類化合物或其藥學上可接受的鹽的藥理學上有效量是指，劑量為0.1mg至lOOOmg，優選地為Img至500mg。對於本領域的技術人員而言，可以根據臨床治療效果的需要，調整或者修改給藥的次數和劑量。在本發明的實施方案中，所述局部用藥物(或組合物)優選地為容易發生骨質疏鬆骨折的部位、已發生骨折部位或植入內植物的骨骼內給藥，這裡，所述的骨骼內可任選地選自，但不限於，股骨頸、股骨粗隆、椎體、橈骨遠端、肱骨近端、脛骨平臺、跟骨等任何易於發生骨質疏鬆骨折、已發生骨折部位或植入內植物的骨骼內，更優選地為含骨髓腔的骨骼內注射給藥。在本發明的實施方案中，所述的哺乳動物優選地為人類。經實驗證明，本發明的他汀類局部單次用組合物經骨骼局部給藥可顯著增加骨量、提高骨密度、改善骨組織微結構、增強骨骼力學性能而用於防治骨質疏鬆引起的脆性骨折，促進骨折癒合或增強疏鬆骨骼的內置物固定力學強度，且單次注射即可持續長時間療效，避免了骨質疏鬆其它治療藥物需要每日給藥的問題，增強了用藥的依附性和方便性，作用效果更佳。


圖1表示的是去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內單次局部注射辛伐他汀I月、5個月後骨密度變化。結果顯示股骨髓腔內單次注射辛伐他汀後骨密度顯著增高(與對照組比較，* < 0.05，**p < 0.01)，肉眼即可分辨。5個月後，對照組的骨密度降低，而辛伐他汀單次注射組骨密度增加且明顯高於對照組。圖2表示的是去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內單次局部注射辛伐他汀I個月、5個月後，股骨頸、股骨髁micro-CT掃描及骨小梁的三維重建。結果顯示，皮質骨增厚，骨量增力口，小梁骨增多。圖3分別表示的是骨生物力學試驗操作:a，股骨髁壓縮力學試驗；b，股骨頸懸臂垂直壓縮力學試驗；c，椎體垂直壓縮力學試驗。圖4表示 的是去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內單次局部注射辛伐他汀I月、5個月後股骨髁壓縮力學實驗結果。辛伐他汀注射組的力學性能顯著提高(與對照組比較，*
<0.05，**p < 0.01)，且至少維持5個月時間:伴隨著時間的延長，對照組的力學性能持續下降，而辛伐他汀單次注射以後股骨髁的力學性能在5個月以後仍然持續增高(與I個月組比較，# < 0.05，##p < 0.01)。圖5表示的是去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內單次局部注射辛伐他汀I月、5個月後股骨頸懸臂垂直壓縮力學實驗結果。辛伐他汀注射組的力學性能顯著增高(與對照組比較，* < 0.05，#p < 0.01)，且至少持續5個月(與I個月組比較，# < 0.05,##p < 0.01)。圖6表示的是去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內單次局部注射辛伐他汀I月、5個月後組織學變化。辛伐他汀治療組的骨量顯著增高，骨小梁明顯增加，骨皮質增厚，且至少持續5個月。圖7表示的是去卵巢骨質疏鬆大鼠尾骨的辛伐他汀注射12天，24天的micro-CT掃描結果。結果顯示辛伐他汀注射12天後，骨量即顯著增加，椎體皮質骨增厚，骨小梁致圖8表示的是去卵巢骨質疏鬆大鼠尾骨的辛伐他汀注射12天，24天的尾骨垂直壓縮力學實驗結果，結果顯示辛伐他汀注射12天後力學性能即顯著提高。圖9表示的是去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髁內植入鈦釘並同時在髓腔內注射辛伐他汀4周後，辛伐他汀注射組內植物周邊的骨密度顯著增加(與對照組比較，* < 0.05)。圖10表示的是去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髁內植入鈦釘並同時在股骨髓腔內注射辛伐他汀4周後micro-CT掃描結果。結果顯示，辛伐他汀注射組的骨小梁顯著增加。圖11表示的是去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髁內植入鈦釘並同時在股骨髓腔內注射辛伐他汀4周後，不脫鈣骨組織形態學觀察。結果顯示單次注射辛伐他汀可顯著增加骨量，骨小梁更加緻密，內植物鈦合金螺釘周邊骨整合明顯增高。圖12表示的是植入螺釘的push-1n力學試驗操作。圖13表示的是內固定螺釘力學強度試驗結果。去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髁內植入鈦釘並同時在股骨髓腔內注射辛伐他汀4周後，植入鈦釘的內固定強度顯著增加(與對照組比較，*< 0.05)。圖14表示的是骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內注射氟伐他汀骨密度顯著增加，且持續至少5個月。圖15表示的是股骨髁壓縮力學試驗結果。骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內注射氟伐他汀後骨強度顯著提高，且至少維持5個月時間。圖16表示的是股骨頸懸臂垂直壓縮試驗結果。骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內注射氟伐他汀後骨強度顯著增高，且至少持續5個月。圖17表示的是骨密度結果。骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內注射阿託伐他汀骨密度顯著增加，且持續至少5個月。圖18表示的是股骨髁壓縮力學試驗結果。骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內注射阿託伐他汀骨強度顯著提高，且至少維持5個月。圖19表示的是股骨頸懸臂垂直壓縮試驗結果。骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內注射阿託伐他汀骨強度顯著增高，且至少持續5個月。圖20表示的是骨密度結果。骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內注射瑞舒伐他汀骨密度顯著增加，且持續至少5個月。圖21表示的是股骨髁壓縮力學試驗結果。骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內注射瑞舒伐他汀骨強度顯著提高，且至少維持5個月。圖22表示的是股骨頸懸臂垂直壓縮試驗結果。骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內注射瑞舒伐他汀骨強度顯著增高，且至少持續5個月。
具體實施例方式下面通過實施例和試驗例來進一步說明本發明的可實施性，對於本領域的技術人員而言，根據現有技術的教導，在本發明實施方案的指導下，對其中的技術特徵進行等同性修改或替換是顯而易見的，仍然屬於本發明請求保護的範圍內。藥物組合物的製備實施例1辛伐他汀局部用注射劑製備將辛伐他汀IOOOmg溶解於PBS磷酸鹽緩衝液IOml (購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，PBS溶液中含2%的二甲基亞碸(Dimethyl Sulfoxide，DMS0，購自Sigma公司)和0.1%牛血清白蛋白(Bo vine Serum Albumin, BSA,購自Sigma公司)，將所得到溶液均質，即得。實施例2普伐他汀局部用注射劑製備將普伐他汀鈉IOOOmg混懸於脂肪乳(英脫利匹特)10ml，將得到的溶液均質即得。
實施例3氟伐他汀局部用注射劑製備將氟伐他汀鈉IOOOmg溶解於含3 %帕洛沙姆188 (德國BSF公司)的生理鹽水10ml，將得到的溶液均質即得。實施例4阿託伐他汀局部用注射劑製備將阿託伐他汀鈣IOOOmg溶解於PBS磷酸鹽緩衝液IOml (購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，內含2 %的DMSO ( 二甲基亞碸)，0.1 % BSA (牛血清白蛋白，同上PBS)以利於辛伐他汀溶解使得溶液均質便於局部注射給藥。實施例5瑞舒伐他汀局部用注射劑製備 將瑞舒伐他汀鈣IOOO mg溶解於含3 %帕洛沙姆188 (德國BSF公司)的生理鹽水10ml，將得到的溶液均質即得。實施例6辛伐他汀局部用注射劑製備將辛伐他汀Img混懸於脂肪乳(英脫利匹特)10ml，將得到的溶液均質即得。實施例7替伐他汀局部用注射劑製備將替伐他汀SOOOmg溶解於PBS磷酸鹽緩衝液IOml (購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，內含2%的DMSO(二甲基亞碸)，0.1% BSA(牛血清白蛋白)以利於辛伐他汀溶解使得溶液均質便於局部注射給藥。實施例8匹伐他汀局部用注射劑製備將匹伐他汀200mg溶解於含3%帕洛沙姆188 (德國BSF公司)的生理鹽水10ml，將得到的溶液均質即得。藥物製劑的骨質疏鬆局部治療藥理活性實驗試驗例I去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內局部單次注射辛伐他汀按照標準操作程序，3月齡雌性SD大鼠全身麻醉(10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，3ml/kg)下，在動物背部左右兩側小切口暴露雙側卵巢，切除雙側卵巢，逐層縫合傷口 ；3個月後隨機分為3組，每組12隻。無菌條件下左側股骨大轉子下0.5cm切口暴露股骨,在股骨外側骨穿針(直徑Imm)穿透骨皮質，根據藥物組合物的製備中實施例1所述的辛伐他汀注射液製備方法，用微量注射器分別注射辛伐他汀5mg，10mg，對照組單純注射載體。骨蠟封閉穿刺針孔。分別在股骨髓腔內注射I個月、5個月後10%水合氯醛腹腔內注射過量麻醉致死，取大鼠股骨待檢測。試驗例2骨密度測定利用雙能X 線吸收儀(DXA) (XR-36DXA system ；Norland Medical Systems)檢測大鼠股骨的骨密度，測定區域(The size of regions of interest, ROI)為股骨中段0.5mmX0.5mm區域，每個標本對齊擺放以確保掃描的一致性(Tsujio M, et al.Bonemineral analysis through dual energy X-ray absorptiometry in laboratoryanimals.J Vet Med Sc1.2009 ；71(11):1493-1497.)。結果如圖1。試驗例3Micro-CT掃描計算骨骼形態學參數Inveon Research Workplace(Version3.0, Siemens Medical Solutions USA,Inc.,IL, USA)進行micro-CT檢測，對骨組織微結構進行三維重建，並根據研究工作站自帶的軟體進行骨小梁體積(total bone volume/total tissue volume, BV/TV),皮質骨厚度(cortical wall thickness, CWT)，骨小梁厚度(trabecular thickness, TbTh),骨小梁數目(trabecular number, TbN),骨小梁間隙(trabecular spacing, TbSp)等參數進行自動計算。結果如圖2、表I。試驗例4骨生物力學測定按照標準操作程序，進行股骨媒壓縮力學試驗(Stiirmer EK, et al.Standardizedbending and breaking test for the normal and osteoporotic metaphyseal tibias ofthe rat:effect of estradiol, testosterone,and raloxifene.J Bone Miner Res.2006 ；21(1):89-96.)。標本置於招合金底座,使用力學測試系統(Landmark,MTS Systems Corp.,MN, USA)，壓力傳感器壓頭2mm/min速度下壓，直至股骨髁骨折，記錄應力-應變曲線，分析最大載荷。操作見圖3，結果如圖4。按照標準操作程序，進行股骨頸懸臂垂直壓縮實驗(JamsS T，et al.Femoralneck strength of mouse in two loading configurations:method evaluationandfracture characteristics.J Biomech.1998 ；31 (8):723-729.)(Zhang G, et al.Acomparative study between axial compression and lateral fall configurationtested in a rat proximal femur model.Clin Biomech.2005 ;20 (7):729-735.),股骨幹垂直置於固定裝置，壓力傳感器壓頭以2mm/min速度下壓股骨頭，直至股骨頸骨折，記錄應力-應變曲線，分析最大載荷。操作見圖3，結果如圖5。
試驗例5脫鈣骨組織的形態學檢測取股骨常規行4%多聚甲醛PBS緩衝液固定，10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣、石蠟包埋，5um厚度切片，HE染色，普通光鏡下觀察組織形態變化，結果見圖6。試驗例6去卵巢骨質疏鬆大鼠尾椎骨局部單次注射辛伐他汀按照標準操作程序，3月齡雌性SD大鼠(體重200 250g)麻醉(10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，3ml/kg)下，在動物背部左右兩側小切口暴露雙側卵巢，切除雙側卵巢，逐層縫合傷口。去雙側卵巢3月後，大鼠被隨機分為3組，每組12隻。無菌條件下大鼠尾巴後正中切口，顯露第5 7尾椎骨，自終板穿刺至椎體，根據藥物組合物的製備中的實施例1的辛伐他汀注射液製備方法，用微量注射器分別將辛伐他汀0，l，2mg注射到第5，6，7尾椎骨，骨蠟封閉穿刺孔，逐層縫合。
分別在尾椎骨注射12天、24天後10%水合氯醛腹腔內注射過量麻醉致死，取大鼠尾椎骨待檢測。試驗例7
Micro-CT掃描計算骨骼形態學參數Inveon Research Workplace(Version3.0, Siemens Medical Solutions USA,Inc.,IL, USA)進行micro-CT檢測，對骨組織微結構進行三維重建，並根據研究工作站自帶的軟體進行骨小梁體積(total bone volume/total tissue volume, BV/TV),皮質骨厚度(cortical wall thickness, CWT)，骨小梁厚度(trabecular thickness, TbTh),骨小梁數目(trabecular number,TbN),骨小梁間隙(trabecular spacing,TbSp)等參數進行計算。結果如圖7、表2。試驗例8骨生物力學測定按照標準操作程序，低速骨鋸修理椎體上下端終板，使得椎體上下兩個面平行，垂直放置椎體，壓力傳感器壓頭以2mm/min速度垂直下壓椎體，直至椎體骨折，記錄應力-應變曲線，分析最大載荷。操作見圖3，結果如圖8。試驗例9骨質疏鬆骨骼植入鈦合金螺釘後局部注射單次注射辛伐他汀按照標準操作程序，3月齡雌性SD大鼠全身麻醉(10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，3ml/kg)下，在動物背部左右兩側小切口暴露雙側卵巢，切除雙側卵巢，逐層縫合傷口 ；3個月後隨機分為3組(對照組，辛伐他汀5mg組，辛伐他汀IOmg組)，每組12隻，麻醉(10%水合氯醒腹腔內注射麻醉，3ml/kg)。10%水合氯醛(3.3ml/kg)腹腔注射全身麻醉後，無菌條件下鈍性分離股骨遠端，暴露股骨髁雙側皮質骨。使用配備2.8mm鑽頭的手足外科鑽頭鑽透雙側皮質骨，使孔道與股骨幹長軸垂直並沿此孔道，使用專屬配套儀器植入直徑3_，長6_的鈦合金螺釘(威高骨科材料有限公司)。根據藥物組合物製備中實施例1所述方法製備辛伐他汀注射液，用配備20號針頭的微量注射器從髁間窩部位向髓腔內注射分別注射辛伐他汀5mg，10mg，對照單純注射載體。骨蠟封閉穿刺針孔，逐層關閉縫合切口。試驗例10骨質疏鬆骨骼局部注射辛伐他汀對內植物周邊骨密度的影響利用雙能X 線吸收儀(DXA) (XR-36DXA system ；Norland Medical Systems)檢測大鼠股骨的骨密度，測定區域(The size ofregions of interest, R0I)為股骨中段0.5mmX0.5mm區域，每個標本對齊擺放以確保掃描的一致性(Tsujio M, et al.Bonemineral analysis through dual energy X-ray absorptiometry in laboratoryanimals.J Vet Med Sc1.2009 ;71 (11): 1493-1497.)。結果如圖 9。試驗例11Micro-CT掃描計算內固定周邊骨組織形態學參數Inveon Research Workplace(Version3.0, Siemens Medical Solutions USA,Inc.，IL, USA)進行micro-CT檢測，對骨組織微結構進行三維重建，並根據研究工作站自帶的軟體進行骨小梁體積(total bone volume/total tissue volume, BV/TV),骨小梁厚度(trabecular thickness, TbTh),骨小梁數目(trabecular number, TbN),骨小梁間隙(trabecular spacing, TbSp),種植體周骨結合率(percentage of osseointegration, %
01)、骨連接密度(connective density,Conn.D)等參數進行自動計算。結果如圖10、表3。試驗例12不脫鈣骨組織的形態學檢測取植入螺釘的股骨常規行10%福馬林PBS緩中液固定，聚甲基丙烯酸甲酯不脫鈣骨組織包埋，垂直於內植物螺釘利用艾卡特切磨系統(艾卡特切磨系統，德國艾卡特公司)切片厚度30um，常規甲苯胺藍染色，普通光鏡下觀察骨組織形態結構及內植物周邊骨整合情況，結果見圖11。試驗例13骨質疏鬆骨骼局部注射辛伐他汀對內植物固定強度的影響按照標準操作程序，進行植入鈦釘push-1n力學試驗。仔細剔除大鼠股骨周圍肌腱及軟組織，甲基丙烯酸甲酯樹脂包埋，暴露鈦合金釘兩端，使得植入鈦釘與包埋平面垂直，生物力學試驗機(MTS Landmark System, USA)壓力傳感器壓頭以2mm/min速度垂直下壓鈦釘尾部，直至屈服，記錄應力-應變曲線，分析最大載荷。操作見圖12，結果如圖13。試驗例14去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內局部單次注射氟伐他汀按照標準操作程序，3月齡雌性SD大鼠全身麻醉(10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，3ml/kg)下，在動物背部左右兩側小切口暴露雙側卵巢，切除雙側卵巢，逐層縫合傷口 ；3個月後隨機分為2組，每組12隻。根據藥物組合物的製備實施例3所述方法製備氟伐他汀注射液，無菌條件下暴露左側股骨髁，用配備20號針頭的微量注射器從髁間窩部位向髓腔內注射注射氟伐他汀8mg，對照組單純注射載體。骨蠟封閉穿刺針孔。分別在股骨髓腔內注射I個月、5個月後10%水合氯醛腹腔內注射過量麻醉致死，取大鼠股骨待檢測。試驗例15骨密度測定利用雙能X 線吸收儀(DXA) (XR-36DXA system ；Norland Medical Systems)檢測大鼠股骨的骨密度，測定區域(The size of regions of interest, ROI)為股骨中段0.5mmX0.5mm區域，每個標本對齊擺放以確保掃描的一致性(Tsujio M, et al.Bonemineral analysis through dual energy X-ray absorptiometry in laboratoryanimals.J Vet Med Sc1.2009 ;71 (11):1493-1497.)。結果如圖 14。試驗例16骨生物力學測定按照標準操作程序，進行股骨媒壓縮力學試驗(Stiirmer EK, et al.Standardizedbending and breaking test for the normal and osteoporotic metaphyseal tibias ofthe rat:effect of estradiol,testosterone,and raloxifene.J Bone Miner Res.2006 ；21(1):89-96.),使用力學測試系統(Landmark, MTS Systems Corp.，MN，USA)，標本置於鋁合金底座，壓力傳感器壓頭以 2mm/min速度下壓，直至股骨髁骨折，記錄應力-應變曲線，分析最大載荷。結果如圖15。
按照標準操作程序，進行股骨頸懸臂垂直壓縮實驗(Jamsa T，et al.Femoralneck strength of mouse in two loading configurations:method evaluation andfracture characteristics.J Biomech.1998 ；31 (8):723-729.)(Zhang G, et al.Acomparative study between axial compression and lateral fall configurationtested in a rat proximal femur model.Clin Biomech.2005 ;20 (7):729-735.),股骨幹垂直置於固定裝置，壓力傳感器壓頭以2mm/min速度下壓股骨頭，直至股骨頸骨折，記錄應力-應變曲線，分析最大載荷。結果如圖16。試驗例17去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內局部單次注射阿託伐他汀按照標準操作程序，3月齡雌性SD大鼠全身麻醉(10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，3ml/kg)下，在動物背部左右兩側小切口暴露雙側卵巢，切除雙側卵巢，逐層縫合傷口 ；3個月後隨機分為2組，每組10隻。根據藥物組合物的製備實施例4所述方法製備阿託伐他汀注射液。無菌條件下暴露左側股骨髁，用配備20號針頭的微量注射器從髁間窩部位向髓腔內注射注射阿託伐他汀注射液4mg，對照組單純注射載體。骨蠟封閉穿刺針孔。分別在股骨髓腔內注射I個月、5個月後10%水合氯醛腹腔內注射過量麻醉致死，取大鼠股骨待檢測。試驗例18骨密度測定

利用雙能X 線吸收儀(DXA) (XR-36DXA system ；Norland Medical Systems)檢測大鼠股骨的骨密度，測定區域(The size of regions of interest, ROI)為股骨中段0.5mmX0.5mm區域，每個標本對齊擺放以確保掃描的一致性(Tsujio M, et al.Bonemineral analysis through dual energy X-ray absorptiometry in laboratoryanimals.J Vet Med Sc1.2009 ;71 (11):1493-1497.)。結果如圖 17。試驗例19骨生物力學測定按照標準操作程序，進行股骨媒壓縮力學試驗(Stiirmer EK, et al.Standardizedbending and breaking test for the normal and osteoporotic metaphyseal tibias ofthe rat:effect of estradiol, testosterone,and raloxifene.J Bone Miner Res.2006 ；21(1):89-96.),使用力學測試系統(Landmark, MTS Systems Corp.，MN，USA)，標本置於鋁合金底座，壓力傳感器壓頭以2mm/min速度下壓，直至股骨髁骨折，記錄應力-應變曲線，分析最大載荷。結果如圖18。按照標準操作程序,進行股骨頸懸臂垂直壓縮實驗(JamsS T, et al.Femoralneck strength of mouse in two loading configurations:method evaluation andfracture characteristics.J Biomech.1998 ；31 (8):723-729.)(Zhang G, et al.Acomparative study between axial compression and lateral fall configurationtested in a rat proximal femur model.Clin Biomech.2005 ;20 (7):729-735.),股骨幹垂直置於固定裝置，壓力傳感器壓頭以2mm/min速度下壓股骨頭，直至股骨頸骨折，記錄應力-應變曲線，分析最大載荷。結果如圖19。試驗例19
去卵巢骨質疏鬆大鼠股骨髓腔內局部單次注射瑞舒伐他汀按照標準操作程序，3月齡雌性SD大鼠全身麻醉(10%水合氯醛腹腔內注射麻醉，3ml/kg)下，在動物背部左右兩側小切口暴露雙側卵巢，切除雙側卵巢，逐層縫合傷口 ；3個月後隨機分為2組，每組12隻。根據藥物組合物的製備實施例4所述方法製備瑞舒伐他汀注射液。無菌條件下暴露左側股骨髁，用配備20號針頭的微量注射器從髁間窩部位向髓腔內注射注射瑞舒伐他汀注射液2mg，對照組單純注射載體。骨蠟封閉穿刺針孔。分別在股骨髓腔內注射I個月、5個月後10%水合氯醛腹腔內注射過量麻醉致死，取大鼠股骨待檢測。試驗例20骨密度測定利用雙能X 線吸收儀(DXA) (XR-36DXA system ；Norland Medical Systems)檢測大鼠股骨的骨密度，測定區域(The size of regions of interest, ROI)為股骨中段0.5mmX0.5mm區域，每個標本對齊擺放以確保掃描的一致性(Tsujio M, et al.Bonemineral analysis through dual energy X-ray absorptiometry in laboratoryanimals.J Vet Med Sc1.2009 ;71 (11):1493-1497.)。結果如圖 20。試驗例17`
骨生物力學測定按照標準操作程序，進行股骨媒壓縮力學試驗(Stiirmer EK, et al.Standardizedbending and breaking test for the normal and osteoporotic metaphyseal tibias ofthe rat:effect of estradiol,testosterone,and raloxifene.J Bone Miner Res.2006 ；21(1):89-96.),使用力學測試系統(Landmark, MTS Systems Corp.，MN，USA)，標本置於鋁合金底座，壓力傳感器壓頭以2mm/min速度下壓，直至股骨髁骨折屈服，記錄應力-應變曲線，分析最大載荷。結果如圖21。按照標準操作程序,進行股骨頸懸臂垂直壓縮實驗(JSmsS T, et al.Femoralneck strength of mouse in two loading configurations:method evaluation andfracture characteristics.J Biomech.1998 ；31 (8):723-729.)(Zhang G, et al.Acomparative study between axial compression and lateral fallconfigurationtested in a rat proximal femur model.Clin Biomech.2005 ;20 (7):729-735.),股骨幹垂直置於固定裝置，壓力傳感器壓頭以2mm/min速度下壓股骨頭，直至股骨頸骨折屈服，記錄應力-應變曲線，分析最大載荷。結果如圖22。
權利要求
1.他汀類化合物在製備預防或治療哺乳動物骨質疏鬆骨折、促進骨折癒合或者增強骨質疏鬆骨骼內固定固定強度的局部用藥物中的用途，這裡，所述的局部用藥物是由他汀類化合物或其藥學上可接受的鹽與藥學上可接受的輔料組成。
2.根據權利要求1所述的用途，其中，所述的他汀類化合物選自但不限於辛伐他汀、阿託伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、瑞舒伐他汀、匹伐他汀、柏伐他汀、西立伐他汀、克伐他汀、達伐他汀、美伐他汀、或替伐他汀。
3.根據權利要求1所述的用途，其中，所述藥學上可接受鹽的形式，選自鹽酸鹽、氫溴酸鹽、氫碘酸鹽、硫酸鹽、硝酸鹽、磷酸鹽、檸檬酸鹽、甲磺酸鹽、三氟醋酸鹽或乙酸鹽、鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽或鎂鹽。
4.根據權利要求1所述的用途，其中，他汀類化合物或其藥學上可接受的鹽選自辛伐他汀、阿託伐他汀鈣或阿託伐他汀鈉、氟伐他汀鈉、普伐他汀鈉、瑞舒伐他汀鈣、或匹伐他汀。
5.根據權利要求1所述的用途，其中，所述的哺乳動物為人類。
6.根據權利要求1所述的用途，其中，所述的局部用藥物為注射劑，經骨骼局部給藥。
7.根據權利要求6所述的用途，其中，所述局部用藥物為注射劑，經含骨髓腔的骨骼內給藥。
8.根據權利要求權利 要求1至7任一權利要求所述的用途，其中，所述局部用藥物的單位製劑中他汀類化合物含量為0.1mg至lOOOmg。
9.根據權利要求8所述的用途，其中，單位製劑中他汀類化合物含量優選地為Img至500mgo
10.根據權利要求9所述的用途，其中，單位製劑中他汀類化合物含量，更優選地為2mg至 200mg。
全文摘要
本發明公開了他汀類化合物作為防治骨質疏鬆性骨折、增強疏鬆骨骼內植物強度局部用藥物的新用途，特別是，公開了骨骼局部施用他汀類組合物增加骨量、提高骨密度、改善骨組織微結構、增強骨骼力學性能而用於防治骨質疏鬆性骨折、增強疏鬆骨骼內植物強度。
文檔編號A61K31/40GK103169972SQ20121059603
公開日2013年6月26日 申請日期2012年12月24日 優先權日2011年12月23日
發明者宋純理, 楊寧, 徐迎勝, 黨耕町 申請人:北京大學第三醫院