以肽為基礎的治療動脈粥樣硬化的免疫療法，和以肽為基礎的用於確定針對氧化低密度...的製作方法

2023-05-11 04:35:01

專利名稱：：以肽為基礎的治療動脈粥樣硬化的免疫療法，和以肽為基礎的用於確定針對氧化低密度...的製作方法
技術領域：
：本發明涉及新肽，特別涉及用於對動脈粥樣硬化進行免疫治療以及用於以肽為基礎的ELISA檢測中的肽，所述ELISA檢測用於確定針對氧化低密度脂蛋白的免疫反應，以及診斷有無動脈粥樣硬化的存在。特別地，本發明包括-1)表1中所列的任一種肽在免疫療法或"抗動脈粥樣硬化疫苗"中的應用，所述肽以天然或經MDA修飾的形式單獨或聯合使用，優選與適當的載體和佐劑同時使用，用於預防和治療缺血性心血管疾病。2)上述肽在ELISA中的應用，用於檢測與缺血性心血管疾病發生危險性升高或降低有關的抗體。
背景技術：
：動脈粥樣硬化是一種引起大、中動脈的最內層(內膜)變厚的慢性疾病。該疾病使得血流速度減慢，可以導致由受影響的血管供血的器官發生缺血和組織損傷。動脈粥樣硬化是心血管疾病發生的主要原因，包括心肌梗塞、中風、外周動脈疾病。該疾病是西方國家的主要死亡原因。預計在二十年內，該疾病將成為全世界的首要死因。該疾病是由脂蛋白在血管的細胞間質累積所引起的，主要是低密度脂蛋白(LDL)。這些LDL顆粒聚集在一起，並經過氧化修飾。氧化後的LDL具有毒性，導致血管損傷。在許多方面，動脈粥樣硬化表現為對所述損傷的一種反應，包括炎症和纖維化。1989年，Palinski及其同事發現人類中存在著抗氧化LDL的循環自身抗體。該發現提示了動脈粥樣硬化可能是一種由抗氧化脂蛋白的免疫反應所引起的自身免疫性疾病。在此期間，有多個實驗室開始尋求抗氧化LDL的抗體滴度與心血管疾病之間的關係。然而，這些研究所提示的結果並不是很清楚。所存在的抗氧化LDL的大量不同抗原決定基的抗體，以及這些抗原決定基的結構並不清楚。因此，術語"氧化LDL抗體"是指尚不知曉的不同抗體的混合物，而不是某一個特定的抗體。T細胞非依賴性IgM抗體比T細胞依賴性IgM抗體更加多一些。心血管疾病的患者以及健康對照人群中均存在著抗氧化LDL的抗體。儘管之前有一些研究報導抗氧化LDL的抗體滴度和心血管疾病之間存在著聯繫，但是其它研究並沒有發現這樣的關係。這些研究的一個重要缺陷在於，它們所採用的確定抗體滴度的ELISA方法中將氧化LDL顆粒作為配體。在不同的個體中，LDL的構成不同，控制和評價氧化修飾的程度較為困難，也不能確定氧化LDL顆粒中針對不同抗原決定基的抗體水平。在一定程度上，由於技術問題，使用現有技術評價抗氧化LDL的抗體的作用是非常困難的。然而，如果使用完整的氧化LDL顆粒，從而產生明確的並可以複製的疫苗組份也不是不可能的事情。研究針對血管壁上氧化LDL的自身免疫反應在動脈粥樣硬化中所起的作用的另一種方法，是用自體氧化LDL免疫動物。該方法所基於的思想是，通過採用經典的免疫技術，如果抗氧化LDL的自身免疫反應得到了增強，那麼，其將導致血管炎症加劇以及進行性的動脈粥樣硬化。為了驗證該假設，用同源氧化LDL免疫兔子，然後給所述動物餵食3個月的高膽固醇飲食從而誘導動脈粥樣硬化。然而，與原有假設相反的是，用氧化LDL進行免疫具有保護性效應，使動脈粥樣硬化減少了50%左右。在隨後的實驗中，我們給予動物高膽固醇飲食以及血管氣球損傷從而導致更嚴重的斑塊形成，但是，我們觀察到了與上述類似的結果。與我們的研究相一致的是，其它多個實驗室也報導了類似的觀察結果。結合現有資料清楚地表明，存在有防止動脈粥樣硬化形成和發展的免疫反應，這些反應中包括抗氧化LDL的自身免疫反應。上述觀察結果同時還提示了在人類中有可能研究出治療由動脈粥樣硬化所引起的心血管疾病的免疫療法或"疫苗"。其中一種方法就是將個體自身的LDL先暴露於例如銅等物質進行氧化，然後用該氧化了的自身LDL免疫所述個體。然而，該方法還存在這樣一個問題，那就是目前仍然不知道是何種氧化LDL結構誘導了保護性的免疫反應，以及氧化LDL是否也含有抗原決定基，從而會引起不良的免疫反應。確定氧化LDL的抗原決定基是非常重要的，其原因如下首先，一個或多個上述抗原決定基可能是激活抗動脈粥樣化免疫反應的原因，在用氧化LDL免疫的動物中觀察到了該免疫反應。因此，含有這些抗原決6定基的肽意味著在人類中研究出免疫療法或"動脈粥樣硬化疫苗"的可能性。進一步地，這些肽可以用於治療人類的動脈粥樣硬化。其次，含有經確定的抗原決定基的肽可以用於ELISA方法中，所述ELISA方法能夠檢測出抗氧化LDL的特定結構的抗體。所述ELISA方法比現有的將氧化LDL顆粒作為抗原的ELISA方法更加準確和可靠。同時，該方法還可以對抗氧化LDL的不同抗原決定基的免疫反應進行分析，其中所述免疫反應與心血管疾病有關。美國專利US5972890涉及肽在診斷動脈粥樣硬化中的應用。該美國專利所公開的技術主要是一种放射物理診斷方法。對一肽序列進行放射性標記，然後將其注入血流中。如果該肽序列與載脂蛋白B的序列一致，則該肽序列將結合到具有載脂蛋白B受體的組織上。在血管中，該序列將位於所有動脈粥樣硬化斑塊的上面。然後通過例如Y照相機等方法確定血管壁的放射性濃度。因此，該技術是一种放射物理診斷方法，其基於的原理是，放射性標記的肽序列結合於動脈粥樣硬化斑塊中正常組織的受體上，然後通過外部放射性分析的方法進行檢測。該方法是一種確定動脈粥樣硬化斑塊的直接分析方法。在該方法中，病人需要注射放射性混合物。本發明的技術基於不同的原理和方法。與權利要求11相一致，本發明涉及用於免疫抗心血管疾病的載脂蛋白B的片段，以及一種診斷針對載脂蛋白B的肽序列的免疫反應的方法。在具有嚴重動脈粥樣硬化的個體中顯示，上述免疫反應得到了增強。本發明基於將肽序列附著於聚合物小孔的底部。當將血樣加入小孔中時，所述肽將與這些序列的特異性抗體相結合，從而可以通過一種免疫方法/技術確定所結合的抗體的量。與上述美國專利的技術相比，本發明的技術並不是一種直接確定和定位動脈粥樣硬化斑塊的方法，而是確定與動脈粥樣硬化的程度和範圍具有高度協同變異的免疫反應。因此，本發明的基本原理與上述專利申請完全不同，後者所依賴的基礎為肽序列與發生動脈粥樣硬化的組織中的正常脂蛋白受體相結合，而前者的基礎在於發現了存在有針對肽序列的免疫反應，並確定抗這些肽序列的抗體。已經公開的研究(Palinski等，以及George等，1998)表明，抗氧化LDL的免疫反應減少了動脈粥樣硬化的發生。其提示了，抗氧化LDL的免疫反應總體上具有保護作用。然而令人驚奇的是，本文的研究結果表明，並不總是如上所述。例如，用肽#10，45,154，199，240的混合物進行免疫會增加動脈粥樣硬化的發生。用其他肽序列進行免疫，例如肽序列#1，30—34，對動脈粥樣硬化的發生總體上沒有什麼效應。上述結果令人非常吃驚，因為其為以下事實提供了依據，即根據所針對的氧化LDL的結構，所述抗氧化LDL的免疫反應可以防止、促進動脈粥樣硬化的發生、或者沒有任何效應。這些發現使研究出單獨激活保護性免疫反應的免疫方法成為可能。進一步地，這些發現表明，當使用完整的氧化LDL進行免疫時，如果所使用的顆粒含有大量的引起動脈粥樣化免疫反應的結構時，可能會產生不良效果。W09908109涉及一組單克隆鼠抗體的應用，其中所述抗體結合氧化LDL顆粒，從而確定血清和血漿中是否存在氧化LDL。其與本發明中所公開的確定抗氧化LDL抗體的方法完全不同。美國專利US4970144涉及一種通過肽序列進行免疫從而製備抗體的方法，其中所述抗體可以通過ELISA方法確定載脂蛋白。因此，該申請也與本發明不同。美國專利US5861276中描述了一種針對正常狀態的載脂蛋白B的重組抗體。該抗體用於確定血清和血漿中是否存在正常的載脂蛋白B，並通過降低循環中正常LDL顆粒的量從而治療動脈粥樣硬化。因此，本發明描述了抗體在治療動脈粥樣硬化中的應用。然而，與美國專利US5861276相比，這些抗體針對的是氧化LDL顆粒的結構，而不是正常LDL顆粒的結構。其優點是，氧化LDL被認為可以導致動脈粥樣硬化的發生。在上述美國申請中沒有描述抗氧化LDL特定結構的抗體的應用。本發明的簡要概述目前認為，動脈血管壁上的載脂蛋白發生氧化，主要是LDL,是動脈粥樣硬化發生的一個重要因素。LDL氧化過程中的產物對血管細胞具有毒性，導致炎症以及斑塊的形成。免疫系統識別氧化LDL的抗原決定基，並產生抗體。動物實驗表明，上述免疫反fe中有一些是起保護作用的，防止動脈粥樣硬化的發生和發展。抗體幾乎專門針對以肽為基礎的結構。通過採用含有LDL中唯一存在的蛋白質一載脂蛋白B的完整序列的多肽庫，確定了氧化LDL中導致人類產生抗體的抗原決定基。這些肽一抗原決定基可以用於ELISA方法中，研究抗氧化LDL的免疫反應與心血管疾病之間的關係，以及研究出預防和治療缺血性心血管疾病的免疫療法或抗動脈粥樣硬化的"疫苗"。本發明的詳細描述對氧化LDL的抗原決定基的分子特徵進行了研究，所述抗原決定基在人類中導致依賴抗體的免疫反應。所使用的方法利用了這樣一個事實，也就是，免疫反應幾乎總是專門針對具有5到6個胺基酸長度的肽序列。LDL只含有一個蛋白質，即具有4563個胺基酸長度的載脂蛋白B。在氧化過程中，載脂蛋白B發生分裂，醛加合物連接至帶有正電荷的胺基酸上，特別是賴氨酸。這就意味著，免疫細胞能夠接近在正常情況下由於載脂蛋白的B三維結構而不暴露於免疫系統的肽序列，和/或正常狀態下暴露的肽序列結合了醛使其半抗原化，從而具備了免疫原性。因此，下列肽，不論天然形式或為MDA衍生物，應具備足夠的量從而產生免疫反應，這些肽是FLDTVYGNCSTHFTVKTRKGPQCSTHILQWLKRVHANPLLVISIP歸EARSEILA冊SKLVKEALKESQLPTVMD卿LKFVTQAEGAKQTEATMTFKDGSLRHKFLDSNIKFSHVEKKGTYGLSCQRDPNTGRLNGERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLTSTS歸GI麗ASLKTASLKYENYELTLKSDTNGKDMTFS,LLRSEYQA鵬MKVKIIRTIDQMQNSELQWPIALDDAKINFNEKLSQLQTYKTTKQSFDLSVKAQYKKNKHEEEMLENVSLVCPKDATRFKGSTSHHLVSRKSISAALEHKIENIDFNKSGSSTASWIQNVIREVTQRLNGEIQALELPQKE麗LTKYSQPEDSLIPFFEHTFLIYITELLKKLQSTTVMLLDIANYLMEQIQDDCTGDECTGDEDYTYKIKRVIGNMGQGNMGQTMEQLTPELKSSILKSSILKCVQSTKPSLMIQKAAIQKAAIQALRKMEPKDKDQERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLNSHGLELNADILGTDKINWIQNVDTKYQIRIQIQEKLQTYISDWWTLAAKNLTDFAEQEATLQRIYSLWEHSTKNHLQALLVPPETEEAKQVLFLDTVIEIGLEGKGFEPTLEALFGKSGASMKLTTNGRFREHNAKFNLIGDFEVAEKINAFRAKVHGHSVLTAKGMALFGEGKAEFFKSSVITLNTNAELFNQSDIFPDLGQEVALNANTKNQKIR,以及不產生抗體的肽ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS或上述一個或多個肽的一個活性位點。材料與方法為了確定由於LDL氧化而導致載脂蛋白B的哪一部分具備了免疫原性，我們製備了包含人類載脂蛋白B的完整序列的多肽庫，每個肽具有20個胺基酸長度。在斷裂點處，用一個具有5個胺基酸長度的重疊序列製備所述肽，從而覆蓋了所有序列。可以採用天然形態的肽，或將肽結合於磷酯脂質體之後，或將肽在暴露於銅進行氧化之後，或用丙二醛(MDA)進行修飾之後，使用所得到的肽。上述經銅氧化或MDA修飾是模擬在LDL氧化過程中可能發生的不同形式的胺基酸修飾。肽相應於人類載脂蛋白B的全部胺基酸序列，合成了302個肽。(Euro-DiagnosticaAB,Malmo,瑞典，以及KjRossPetersenAS，Horsholra，丹麥)，並將它們用於ELISA檢測中。在37。C下，用0.5MMDA(Sigma-AldrichSwedenAB，斯德哥爾摩，瑞典)處理所述經合成的肽3小時，從而對每個經合成的肽的一部分進行修飾，或在37。C下，用5uMCuCl2(Sigma)處理18小時。在4°C下，用含有ImMEDTA的PBS溶液對經MDA修飾的肽進行透析18小時，中間更換PBS溶液數次。在適於分離肽的變性聚丙烯醯胺凝膠(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)上檢測經修飾的肽。在蛋白質的N末端起對肽進行編號，為1至302。在製備衍生物的過程中也可以使用其它的醛類，例如，羥基壬烯醛及其它。脂質體將摩爾比為9:l的卵磷脂(EPC)(Sigma)和磷脂醯絲氨酸(PS)(Sigma)的氯仿溶液，與濃度為3mM的磷酯(PL)溶液進行混合，並在玻璃容器中用緩慢的氬氣流進行吹乾。然後，將容器放在真空狀態下3小時。取5ml含有0.ImM肽、經無菌過濾的PH為7.4的10mMHEPES緩衝液、45mMNaCl、0.003%疊氮鈉的溶液加入EPC/PS乾燥層中，並在50°C下孵化15分鐘。在室溫下，輕微振蕩所述混合物，然後將其放於冰水中，用振幅為7.5微米的微波進行超聲降解3x3分鐘(Sonypr印150MSESanyo,Tamro-medlab，瑞典)，每次間隔1分鐘。將所述PL—肽混合物貯存於玻璃小瓶中，並位於氬氣下面，瓶的外周用鋁箔包裹，在4。C下貯存，並在l周內使用。所述PL—肽混合物是天然形式，或是用0.5MMDA在37°C下進行處理3小時，或是用M01(212在37°C下處理了18小時。在貯存前，所述經MDA修飾的混合物需要在4°C下用含有lmMEDTA的PBS溶液對其進行透析18小時，中間需要更換PBS溶液數次。在適於分離肽的變性聚丙烯醯胺凝膠(Bio-RadLaboratoriesAB,Sundbyberg，瑞典)上檢測所述經修飾的混合物。血漿樣品從10名心血管疾病(AHP)的患者中採集血漿樣品，並從正常血液供體(NHP)中收集50份血漿樣品，其中25名為男性，25名為女性。將收集到的兩種血漿樣品池進行分裝，並在-80。C保存。ELISA不論有無脂質體，用PH7.4(20yg/ml)的PBS溶液稀釋天然或經修飾的合成肽，然後加入微孔滴定板的小孔中(NuncMaxisorp，Nunc,Roskilde，丹麥)，在4'C下孵化過夜。作為參考，在每塊板上都加入其中一種肽(P6)。用含有0.05%Tween-20的PBS溶液清洗滴定板，然後在室溫下，用含有S叩erblock的TBS溶液(Pierce,Rockfor,IL)封閉所述經包被的板5分鐘，隨後孵化人類血漿樣品，用含有0.05%Tween-20的TBS(TBS-T)以1:100的比例稀釋所收集到的人血漿樣品，AHP或NHP血漿，並將其加入反應板中，在室溫下孵化2小時，然後在4。C下孵化過夜。洗板後，用生物素標記的兔抗鼠Ig抗體(DakoA/S，Glostr叩,丹麥)檢測沉積的抗所述肽的抗體，所述兔抗鼠抗體用TBS—T溶液進行適當地稀釋，在室溫下，繼續孵化2小時；然後，洗板，用鹼性磷酸酶結合的抗生蛋白鏈菌素(Sigma)檢測結合的生物素標記的抗體，在室溫下孵化2小時。用磷酸酶底物試劑盒(Pierce)進行顯色反應，在室溫下孵化1小12時後，在405nm處測量吸光度。將不同肽的吸光度值除以P6的吸光度值，進行比較。由人類血漿中的抗體所識別的脂蛋白B序列參見後面序列表中序列號1-37的序列。AHP和NHP中均含有針對大量不同肽的抗體。我們確定了抗天然形式和經修飾的肽的抗體。總體來說，抗MDA修飾的肽的抗體滴度高於或等於抗天然肽的抗體的滴度。比較天然肽，經MDA修飾的肽、以及被銅氧化的肽，顯示它們之間具有高度的相關性，在經MDA修飾的肽中檢測到了滴度最高的抗體。使用結合於脂質體的肽並沒有導致抗體水平的升高。IgM亞型的抗體多於IgG亞型的抗體。針對所檢測到的具有最高抗體水平的肽可以分為六組，這六組之間具有共同的特徵(表l)(A)高水平的抗經MDA修飾的肽的IgG抗體(n=3);(B)高水平的IgM抗體，但是在天然和經MDA修飾的肽之間沒有差異(n=9);(C)高水平的IgG抗體，但是在天然和經MDA修飾的肽之間沒有差異(n=2);(D)高水平的抗經MDA修飾的肽的IgG抗體，在NHP樣品池中的抗體水平至少是AHP樣品池中抗體的兩倍(n=5);(E)高水平的抗經MDA修飾的肽的IgM抗體，在NHP樣品池中的抗體水平至少是AHP樣品池中抗體的兩倍(n=ll);(F)高水平的IgG抗體，但是在完整的和經MDA修飾的肽之間沒有差異，在AHP樣品池中的抗體水平至少是NHP樣品池中抗體的兩倍(n=7);(G)沒有IgG或IgM抗體。表lA.高IgG，有MDA差異P11.FLDTVYGNCSTHFTVKTRKGP25.PQCSTH歸LKRV腳PLLP74.VISIPRLQAEARSEILAHWSB.高IgM，沒有MDA差異P40.KLVKEALKESQLPTVMDFRKP68.LKFVTQAEGAKQTEATMTFKP94.DGSLRHKFLDSNIKFSHVEKP99.KGTYGLSCQRDPNTG腳GEPI00.RLNGESNLRFNSSYLQGTNQP102.SLTSTSDLQSGIIKNTASLKPI03.TASLKYENYELTLKSDTNGKPI05.DMTFSKQNALLRSEYQADYEPI77.MKVKIIRTIDQMQNSELQWPC.高IgG，沒有MDA差異P143.IALDDAKINFNEKLSQLQTYP210.KTTKQSFDLSVKAQYKKNKHD.NHS/AHP,IgG-ak〉2，有MDA差異P1.EEEMLENVSLVCPKDATRFKP129.GSTSHHLVSRKSISAALEHKPI48.IENIDFNKSGSSTASWIQNVPI62.IREVTQRLNGEIQALELPQKP252.EVDVLTKYSQPEDSLIPFFEE.NHS/AHP,IgM-ak>2，有MDA差異P301.HTFLIYITELLKKLQSTTVMP30.LLDIANYLMEQIQDDCTGDEP31.CTGDEDYTYKIKRVIG濯GQP32.G隨GQTMEQLTPELKSSILK14P33.SSIL謂STKPSLMIQKAAP34.IQKAAIQALRKMEPKDKDQEP100.RLNGESNLRFNSSYLQGTNQPI07.SLNSHGLELNADILGTDKINP149.WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQPI69.TYISDWWTLAAKNLTDFAEQP236.EATLQRIYSLWEHSTKNHLQF.NHS/AHP,IgG-ak〈0.5，沒有MDA差異P10.ALLVPPETEEAKQVLFLDTVP45.IEIGLEGKGFEPTLEALFGKPill.SGASMKLTTNGRFREHNAKFPI54.NLIGDFEVAEKINAFRAKVHP199.GHSVLTAKGMALFGEGKAEFP222.FKSSVITLNTNAELFNQSDIP240.FPDLGQEVALNANTKNQKIRG.P2.ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS所有上述的38個肽序列均代表了免疫反應的靶目標，所述免疫反應在動脈粥樣硬化和缺血性心血管疾病的發生中可能起著重要的作用。因此，這些肽可以用於ELISA檢測中，以確定抗體水平與發生心血管疾病的危險之間的關係，其中所述抗體針對載脂蛋白B中經MDA修飾的確定的胺基酸序列。同時，這些肽還代表了保護性免疫反應中的可能介質，所述保護性免疫反應是在用氧化LDL對實驗動物進行免疫時觀察到的。而且，在研^抗動脈粥樣硬化的免疫療法或"疫苗"的過程，這些肽可以進一步用於檢測。因此，我們己經證實了人類載脂蛋白B的38個不同序列可以使人體產生顯著的免疫反應。這些抗原決定基有可能代表了之前所描述的抗氧化LDL的抗體。由於大多數免疫反應是針對肽序列的，載脂蛋白B為LDL中唯一的蛋白質，在該課題中所採用的方法應該可以用於確定幾乎所有抗氧化LDL顆粒的抗體的特異性抗原決定基。我們已經描述了包括抗心磷脂抗體在內的、與氧化LDL反應的磷脂特異性抗體家族，但是這些抗體的特徵和作用仍然有待進一步的研究和確認。在很多情況下，經MDA修飾的多肽的抗體滴度高於天然多肽序列的抗體滴度。如果檢測到抗經MDA修飾的肽序列的抗體，則該抗體幾乎總是與天然序列的抗體同時存在。該現象的一種可能解釋是，機體對載脂蛋白B中經MDA修飾的胺基酸序列的免疫反應(由於LDL氧化而導致MDA修飾)導致機體終止了對天然序列的免疫耐受。對於其它序列，抗經MDA修飾的肽序列的抗體與抗天然序列的抗體滴度之間沒有差異。其表明了，所述免疫反應針對的是天然序列。機體對正常暴露於免疫系統的蛋白中的胺基酸序列應該不產生免疫反應。在天然LDL顆粒中，載脂蛋白B的大部分隱藏在LDL的脂質層裡面，因此，免疫系統不能接近該載脂蛋白。在LDL的氧化過程中，載脂蛋白B的胺基酸鏈斷裂導致其三維構象發生改變。這就有可能導致其肽序列暴露於正常狀態下不接近該肽序列的免疫系統，產生了針對這些序列的抗體，從而可以解釋所觀察到的存在有抗天然載脂蛋白B序列的抗體。另外一種解釋，免疫反應實際上是針對經MDA修飾的序列，但是其與天然序列之間存在著顯著的交叉反應，導致它們在結合率方面沒有差異。表2研究了78名受試者中不同肽的抗體與頸動脈中動脈粥樣硬化之間的關係，其中用血管內膜/中膜的厚度評價頸動脈的動脈粥樣硬化(78名受試者中，有26名受試者在此之後發生了心肌梗塞，26名受試者為健康對照，26名為無疾病的高危個體)。肽IgGIgM天然經MDA修飾天然經MDA修飾30116tableseeoriginaldocumentpage17驗在參與Malm6飲食癌症研究的受試者中進行的，所述飲食癌症研究為一群體研究，在1989年至1993年，該研究共招募了30000多名受試者。其中26名受試者在隨後的隨訪調査期間發生了急性心肌梗塞，選取了26名在年齡、性別以及吸菸方面相匹配的健康個體作為對照，測定了上述受試者基線血漿樣品中的抗體值，這些抗體是表1所列38個肽中的24個肽的抗體。另外，還選擇了26名LDL膽固醇水平均高於5.0mmo1/1、在年齡、性別以及吸菸方面相匹配的受試者，這些受試者作為未患有心血管疾病的高危組，並對他們的抗體水平進行研究。對於所分析的24個肽中的19個肽，經MDA修飾的肽的IgM抗體水平與頸動脈(內膜/中膜厚度)中動脈粥樣硬化的嚴重程度顯著相關，也就是說，抗體水平越高，動脈粥樣硬化越嚴重。其中，通過對頸總動脈進行超聲檢査以評價動脈粥樣硬化的嚴重程度(表2)。同時，這些肽中有多個肽的抗天然肽抗體水平和頸動脈內膜/中膜的厚度也具有顯著的相關性。只有4個肽顯示出其IgG抗體與頸動脈內膜/中膜的厚度之間存在顯著的相關性。這些觀察結果提示，用這些經MDA修飾的肽(單獨使用或聯合使用)的ELISA方法可以用於確定具有嚴重動脈粥樣硬化的受試者。在所檢測的肽中，有4個肽的抗體水平不僅與動脈粥樣硬化的嚴重程度有關，而且在以後發生心肌梗塞的受試組中其抗體水平也顯著升高(表2)。圖7中為其中一個肽(肽240)的資料。這些觀察結果同樣證明了基於肽的ELISA方法還可以用來識別發生心肌梗塞的危險性較高的受試者。在之後發生心肌梗塞的受試者組中，天然肽103、162、199,以及經修飾的肽102的IgG抗體水平顯著升高。但是，抗這些肽的IgG抗體與頸動脈中的動脈粥樣硬化之間並沒有顯著的相關。在抗經MDA修飾的肽210的抗體方面，還觀察到了一個非常有趣的結果，其中在健康對照組和高危組aDL膽固醇高於5.0mmo1/1)中，其IgM抗體水平顯著高於以後發生心肌梗塞的受試者組的抗體水平。因此，抗經MDA修飾的肽210的抗體可以作為一種標誌物，用於確認那些發生心肌梗塞的危險性較低的個體。目前己經證實，在實驗動物中(NordinFredrikson,S6derberg等'Chyu等)，用天然的以及經MDA修飾的apoB—100肽序列進行免疫，抑制了動脈粥樣硬化。但是，這些具有動脈保護作用的免疫反應的機制仍然有待進一步的研究。然而，其中一種可能的解釋是所述動脈保護的效應是由針對這些肽序列的抗體介導的。例如，這些抗體可以通過巨噬細胞的Fc受體促進對受到氧化受損的LDL顆粒的清除。巨噬細胞清除受體只識別受到廣泛氧化損傷的LDL(9)。最近的研究已經確定了循環氧化LDL的存在(10,11)。這些顆粒只受到了極小的氧化損傷，因此不能被清除受體識別。抗體結合於這些循環氧化LDL顆粒上可以有助於在這些顆粒聚集到細胞組織之前。將這些顆粒從循環中清除出去(12)。已經有幾個研究報導了抗體在抗動脈粥樣硬化中的作用。在經脾切除的apoE裸鼠中，B細胞重建抑制了動脈粥樣硬化的發生。在RAG-1小鼠中，頸動脈受損後，B細胞重建還抑制了動脈內膜的再生(我們實驗室所觀察到的結果，但是仍未發表)。而且，實驗表明，對apoE裸鼠重複注射免疫球蛋白減少了動脈粥樣硬化的發生。如上所述，用合成的肽進行主動免疫，可以產生針對經MDA修飾的即oB一100肽序列的抗體。該過程需要2-3周的時間才能達到產生抗體的最大效果。在某些情況下，可能需要更加快速的效果。其中一個例子就是動脈粥樣硬化斑塊不穩定的情況，此時，氧化LDL有可能會導致炎症、產生細胞毒性以及存在斑塊破裂的危險。在這些情況下，通過注射純化的或重組生產的、針對天然以及經MDA修飾的序列的抗體進行被動免疫，可以達到較為快速的效果。通過注射純化的或重組生成的抗體進行被動免疫從而起效用的另一種情況是老年人發生的冠心病。我們的研究表明，人的年齡越大，針對載脂蛋白B肽序列的抗體水平將減少，而且抗體水平的減少與血漿中氧化LDL水平的升高相關(NordinFredrikson,Hedblad等)。這就提示了，產生針對氧化LDL中抗原的抗體的免疫細胞的衰老使氧化受損的LDL顆粒沒有完全從循環中清除出去。因此，在這些受試者中，通過注入純化的或重組生成的抗體進行被動免疫，比用載脂蛋白B—100肽序列進行主動免疫的效果要好。下列所使用的合成天然肽(Euro-DiagnosticaAB，Malmo,瑞典)為初次篩選出的多肽庫中的肽1,2，和301。我們發現，在肽1(胺基酸序列，19EEEMLENVSLVCPKDATRFK，n=10)和肽301(胺基酸序列，HTFLIYITELLKKLQSTTVM,n=10)中，它們各自的針對經MDA修飾形式的IgG或IgM抗體反應高於天然肽，而且在健康受試者中兩種抗體滴度均較高。選擇這些肽的原因基於這樣一個假設，即針對這些肽的抗體反應可能會起到抗動脈粥樣硬化的保護作用。在初次的抗體篩選中，肽2(胺基酸序列,ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS，n=10)並沒有引發抗體反應，因此，將該肽選擇作為對照肽。接受明礬的小鼠作為對照組(11=9-)。在6至7周周齡時，對載脂蛋白E(V-)小鼠進行皮下注射從而進行初次免疫，3周後，進行腹膜內注射以加強免疫。從免疫一開始，就持續給予小鼠高膽固醇飲食，直到25周被處死。在處死小鼠時，4組小鼠的各組之間在體重上沒有顯著區別。同時，用市售的試劑盒(Sigma)檢測4組小鼠血清中的膽固醇，各組之間在統計學上沒有顯著性差異。各組平均血清膽固醇水平均高於715mg/dl。用油紅0染色後，測量前位標本中降主動脈中被動脈粥樣硬化斑塊覆蓋的面積。與對照組相比，用肽2和肽301進行免疫的小鼠，其動脈粥樣硬化顯著減少(圖2)。與對照組相比，用肽1進行免疫的小鼠，動脈粥樣硬化並沒有顯著地減小。與降主動脈相反，主動脈根部和主動脈弓部的動脈粥樣硬化的範圍和程度在4個實驗組之間並沒有差別。在主動脈竇處，斑塊的大小以及脂質含量在4個實驗組之間並沒有差異(表A)。在主動脈弓部，斑塊的平均尺寸在4組小鼠之間也沒有差異。然而，在經油紅O染色的降主動脈和腹主動脈中，對斑塊大小進行前位評價，其結果表明，對照組和給予肽No.1的實驗組具有相似數量的動脈粥樣硬化斑塊，而在給予肽No.2和肽No.9的實驗組中，其主動脈上的動脈粥樣硬化斑塊顯著減少(表A)。該觀察結果表明，用肽進行免疫並不影響主動脈竇或主動脈弓部的斑塊大小，但是卻減少了降主動脈處的斑塊，該結果非常有意思。同時，觀察結果還提示了用肽進行免疫可以減少新斑塊的形成，但是不影響斑塊的進展。我們還進一步檢驗了用肽進行免疫是否可以調節動脈粥樣硬化的表型。對主動脈竇處的斑塊的冷凍切片用單核細胞/巨噬細胞抗體(M0MA-2，Serotec)進行免疫組化染色。與前位觀察的結果一致，肽No.2顯著減少了巨噬細胞進入斑塊內(圖1)。三色染色法顯示，給予肽No.2的實驗組中，主動脈竇的斑塊中平均膠原含量為40.0土7.7%;在給予明礬的對照組，肽No.l組，肽No.9組中的平均膠原含量分別為32.3±5.3%，35.6±8.5%,29.4±9.6%。我們檢測了每個實驗組中針對免疫肽的抗體反應。在肽No.l組中，抗體滴度在免疫後增加了6.1±3.1倍，肽No.2組增加了2.4士1.0倍，肽No.9組增加了1.8±0.6倍；而明礬組的抗體滴度相對於肽No.1組增加了3.9±2.7倍，相對於肽2組增加了2.0±0.5倍，相對於肽9組增加了2.0±0.9倍。令人吃驚的是，在進行免疫的實驗組以及給予明礬的實驗組中，抗免疫肽的抗體滴度平行升高。其意味著以下幾種可能性1)除了體液免疫反應之外(例如細胞免疫反應)，動脈粥樣硬化的調節還涉及到其它機制；或者2)抗體水平的升高是隨著時間的變化機體對高膽固醇血症的一個副反應。儘管目前對為何用肽進行免疫可以減少動脈粥樣硬化和/或調節斑塊的表型這個問題仍然沒有一個清楚的理論機制，但是該發明的新穎性在於其將LDL肽作為免疫原的理念，以及其作為免疫調節策略的可行性。這種基於肽的免疫策略對動脈粥樣硬化斑塊進行調節。研究表明，將同源性氧化LDL或天然LDL作為抗原進行免疫減少了斑塊的大小卜3,但是，同源人LDL的可得性，生產，感染以及安全性使得該方法在臨床應用中並不具備吸引力。儘管我們所得到的最終結果與最初的假設不一樣，本文中證實了基於肽的免疫療法是可行的。我們的最初假設是在正常的受試者中使用肽進行免疫以產生較高的IgM或IgG抗體反應，可以防止實驗動物發生嚴重的動脈粥樣硬化斑塊。在最初的人群篩選中，肽No.2並沒有引起任何的抗體反應，然而，在研究中我們驚奇地發現，用肽No.2進行免疫可以防止動物的降主動脈發生新的動脈粥樣硬化損傷，並減少了巨噬細胞的進入，同時斑快中的膠原含量也較高。其可能的原因是，(a)肽No.2可能是人類載脂蛋白B-100結構的一部分，其並不暴露於免疫系統。因此沒有抗體產生，在健康人群的血清樣品中也檢測不到抗體；(b)肽No.2的胺基酸序列對於小鼠來說是外來的，因此小鼠產生了抗這種肽的抗體，從而減少了新的動脈粥樣化損傷的形成以及其表型。在評價主動脈不同部位的斑塊大小時，用同源LDL進行免疫的效果不一樣。例如，Ameli等人研究表明，在患有高膽固醇血症的兔子中，用天然LDL進行免疫導致主動脈上斑塊形成減少、而Freigang等人研究表明，主動脈竇上的斑塊變小，而不是位於主動脈上的斑塊變小。結合他們的研究結果以及現有的研究結果，我們認為用肽進行免疫不僅調節斑塊的大小還調節斑塊的構成。我們只在降主動脈處觀察到了斑塊減少。眾所周知，在單個動物的不同發育階段，載脂蛋白E(-/-)小鼠可以發生動脈粥樣硬化損傷，特別是給予高膽固醇飲食。在年幼的動物中，動脈粥樣硬化損傷最初出現在主動脈竇上6'7，在15周以後，高脂高膽固醇飲食可以導致主動脈竇處的損傷發展成為晚期的斑塊；而此時在降主動脈為動脈粥樣硬化的早期6。由於斑塊成熟需要一定的時間過程，而且降主動脈上的斑塊發展慢於主動脈竇上的斑塊發展，免疫作用可以減小降主動脈上的損傷大小而不降低主動脈竇上的損傷，該發現提示免疫作用影響動脈粥樣硬化形成的早期階段。一種可能是，當動物逐漸衰老時，以及當血清膽固醇的水平高於其生理狀態下的水平時，高膽固醇血症的毒性作用超過了免疫作用的降低斑塊效應。另外一種可能是，由於主動脈竇斑塊成熟比較早，在25周處死動物太晚了，從而不能檢測到斑塊大小的區別。儘管主動脈竇處的損傷大小不能被減小，但是用肽進行免疫確實可以調節斑塊的構成。目前實驗設計不能研究降主動脈上的斑塊在形成的早期階段時，其斑塊的構成。實驗研究結果突出表明了，使用與LDL相關的載脂蛋白B-100的肽序列作為免疫原作為防止動脈粥樣硬化的一種新方法的可行性，或者儘管具有嚴重的高脂血症，其也可以有利地調節斑塊的表型。與將同源性氧化LDL或天然LDL作為抗原相比，該基於肽的免疫策略具有優勢，這是因為該策略不需要分離和製備同源LDL,也沒有隨之而來的發生汙染的危險性。用肽No.2和No.301進行免疫，只在降主動脈處觀察到了減小斑塊的作用。這些研究結果與之前的有關報導是一致的，這些報導表明，其他治療幹預措施在降主動脈處的效果要好於主動脈弓部的效果14—17，其可能是因為，主動脈根部和弓部的損傷比降主動脈處的損傷發展地快，從而在主動脈根部和弓部進行幹預的機會要小15'16'18'19。由於斑塊成熟需要一定的時間過程，而且降主動脈上的斑塊發展慢於主動脈竇上的斑塊發展，免疫作用可以減小降主動脈上的損傷大小而不降低主動脈竇上的損傷，該發現提示免疫作用影響動脈粥樣硬化形成的早期階段。一種可能是，當動物逐漸衰老時，以及當血清膽固醇的水平高於其生理狀態下的水平時，高膽固醇血症的毒性作用超過了免疫作用的降低斑塊效應。儘管主動脈竇或主動脈弓部的損傷大小不能被減小，但是用肽No.2進行免疫確實可以調節斑塊的構成，使其向有利地方向發展，使斑塊表型更加穩定，同時減少了巨噬細胞的進入，並增加了膠原的含量。總之，在鼠動物模型中證實了一種新的、以肽為基礎的抑制動脈粥樣硬化的免疫介導方法。綜上所述，本發明顯示了一種新的、以肽為基礎的免疫介導方法，用於調節動脈粥樣硬化的斑塊。儘管在我們的模型中，動脈粥樣硬化形成的改變是非常小的，但是這種以肽為基礎的免疫方法為研究、預防或治療動脈粥樣硬化提供了另外一種手段。方法肽的製備使用ImjectSuperCarrierEDC(Pierce,Rockford,IL)，根據生產商的說明並進行細微的調整，製備肽。將行有lmg肽的500ul共軛緩衝液與含有2mg載體的200ul去離子水混合。然後，加入lmg共軛試劑(EDC,1一乙基一3—[3—二甲基氨丙基]碳二亞銨鹽酸)，在室溫下孵化2小時。然後，用PH7.2，含有0.083M磷酸鈉和0.9M氯化鈉的溶液進行透析，在4°C下孵化過夜。透析後的共軛物用Imject乾式混合純化緩衝液進行稀釋使其終體積達到1.5毫升。將明礬作為免疫佐劑，並與肽共軛物以1:1的比例混合。每次進行免疫注射的肽用量為33ug/100ul。動物方案在6-7周周齡時，給予Jackson實驗室(BarHarbor,Me)ApoE(-/-)小鼠皮下注射進行初次免疫。3周後，進行腹膜內注射以加強免疫。在進行免疫的一開始，就持續給予小鼠高膽固醇飲食，直至25周時處死小鼠。加強免疫後的2周，以及處死小鼠時採集小鼠的血樣。對照組小鼠給予明磯。實驗方案得到了Cedars-Sinai醫學中心的社會機構動物監護和使用委員會(theInstitutionalAnimalCareandUseCommitteeofCedars-SinaiMedicalCenter)的同意和批准。所有的動物都詞養在經美國實驗動物監護鑑定協會(AmericanAssociationofAccreditationofLabioratoryAnimalCare)所鑑定的動物實驗室中，並以12小時白天/黑夜為周期進行飼養。所有動物都可以自由地飲水和飲食。在處死動物時，給動物吸入安氟醚進行麻醉。在處死前，進行眼眶後取血。採集組織並進行切片為了評價用肽進行免疫對動脈粥樣硬化形成的影響，對主動脈竇、主動脈弓部以及降主動脈和腹主動脈處的斑塊大小進行評價。用生理鹽水灌注心臟和主動脈樹，切除心臟和近主動脈，並包埋在OCT複合物中(Tissue-Tek)，然後進行冷凍切片。從至少出現兩個主動脈瓣的地方直至主動脈瓣葉片消失的地方進行一系列的切片，切片厚度為6um,以評價主動脈竇處的斑塊。通常，一個載玻片上有3個連續切片，一隻小鼠共採集25-30張載玻片，每50張載玻片為一組進行染色。同時也對升主動脈，朝向左鎖骨下動脈的主動脈弓部進行切片，並進行相似的處理。單獨對降主動脈和腹主動脈進行處理，油紅0染色後對斑塊的構成進行前位評價。製備前位的降主動脈和腹主動脈的標本。將濃度為0.8g/ml的雞蛋白蛋白(Sigma)水溶液與甘油以1:1的比例相混合。然後，加入疊氮鈉，使疊氮鈉的最終濃度達到0.2%。將降主動脈和腹主動脈周圍的組織和脂肪清除乾淨後，將左鎖骨下動脈至腎主動脈的動脈部分小心地切除下來，然後在Hisochoice(Amresco)中進行固定，過夜。然後，小心地縱向打開動脈，將有空腔的一面放在用雞蛋白蛋白溶液進行新鮮塗覆的載玻片上。當白蛋白溶液變幹後，用油紅0對動脈進行染色，然後用計算機輔助的組織形態測定技術評價動脈粥樣硬化的程度。免疫組織化學和組織形態學主動脈竇的切片用M0MA-2抗體(Serotec)按照標準程序進行免疫組織化學染色。用三色染色法評價膠原含量，用油紅0染色評價斑塊的大小，用標準的染色程序評價脂質含量。進行計算機輔助的形態測定分析從而進行如前所述的組織形態學測定8。抗體滴度的測量為了測定用肽進行免疫後的抗體反應，進行了ELISA檢測。對加強免疫後兩周的血樣以及處死時血樣進行了檢測，測定了其中的抗免疫肽的抗體滴度。同時，對給予明礬的對照組也測定了相同時間點的抗3個肽的抗體反應。簡而言之，用PH7.4的PBS(20ug/ml)稀釋合成的天然肽，然後將其加入微孔滴定板的小孔中(Nunc,MaxiSorp，Nunc,Roskilde，丹麥)進行包被，在4。C下孵化過夜。用含有0.05%Tween-20的PBS(PBS-T)洗板，然後在室溫下，用含有S叩erblock的TBS溶液(Pierce,Rockfor,IL)封閉所述經包被的板5分鐘，隨後加入用含有0.05。/。Tween-20的TBS(TBS-T)以1:100的比例稀釋所收集到的人血漿池，並加入反應板中，在室溫下孵化2小時,然後在4。C下孵化過夜。洗板後，用生物素標記的兔抗鼠Ig抗體(DakoA/S,Glostr叩,丹麥)檢測沉積的針對所述肽的抗體，所述兔抗鼠抗體用TBS—T進行適當地稀釋，在室溫下，繼續孵化2小時；然後，洗板，用鹼性磷酸酶結合的抗生蛋白鏈菌素(Sigma)檢測結合的生物素標記的抗體，在室溫下孵化2小時。用磷酸酶底物試劑盒(Pierce)進行顯色反應，在室溫下孵化1小時後，在405nm處測量吸光度。減去背景值，然後計算出平均值。當然也可以採用其它的檢測方法，包括檢測抗體的免疫檢測方法，例如，放射免疫檢測法，Western雜交，Southern雜交，以及檢測結合於肽的抗體，酶電極和其它分析方法。統計所有的結果以平均值士std的形式表示。所使用的統計方法見正文，表或。p〈0.05為具有統計學顯著性。表A主動脈竇處的斑塊大小和脂質含量，主動脈弓部的斑塊大小，降主動脈處斑塊的百分數主動脈竇處總油紅o染色主動脈弓部斑主動脈的斑塊百的斑塊大小為(+)的塊的大小(mm2)分數(脂肪百分(mm2)面積(主動數)脈竇處的斑塊百分數)明碸0.49±0.1321.7±4.40.057±0.04020±4.7肽l0.48±0.1432.0±8.10.054±0.02717±4.3肽20.52±0.1223.9±3.50.0780±.0226.3±1.9*肽3010.46±0.1623.8±4.10.050±0.0248.9±2.2**顯著區別於給予明礬的對照組。統計方法採用了Tukey—Kramer檢驗方法，並採用了AN0VA分析。用載脂蛋白B_100的肽序列對剔除載脂蛋白E的小鼠進行免疫後，其對25動脈粥樣硬化的影響的資料見表B表B用載脂蛋白B—100的肽序列對剔除載脂蛋白E的小鼠進行免疫後，其對動脈粥樣硬化的影響的資料見表B用/1'種肽序列的混合物講行免疫對主動脈的動脈粥樣硬化的影響1.肽序列143和210-64.6%2.肽序列ll，25和74-59.6%3.肽序列129，148和167-56.8%4.肽序列99，100，102,103和105-40.1%5.肽序列30，31，32，33和34+6.6%6.肽序列10，45，154，199和240+17.8%用單個肽序列講行免疫1.肽序列2-67.7%2.肽序列210-57.9%3.肽序列301-55.3%4.肽序列45-47.4%5.肽序列74-31.0%6.肽序列l-15.4%7.肽序列2400%通常，通過注射的方法給予肽，例如皮下注射，靜脈內注射，肌肉注射或腹膜內注射。根據每個病人的體重，年齡以及其它物理和醫療條件確定第一次免疫用的劑量，其劑量為1-lOOrag。在特殊情況下，也可以通過導管向冠狀血管中局部給予含有一種或多種肽的溶液。也可以口服含有所述肽的製劑，但是，必須考慮到一些特殊情況以使口服製劑能夠吸收進入血流。一次注射用劑量可以含有重量百分比為0.5%—99.5%的本發明中所述的一種或多種片段或肽。通常，將所述肽連接於陽離子牛血清白蛋白上，並同時給予，將白蛋白氫氧化物作為佐劑。也可以使用本領域所公知的其它佐劑。用於給予所述肽的溶液不能含有任何的EDTA或抗氧化劑。對於已經患有動脈粥樣硬化的病人，所述肽也可以作為治療劑。因此，可以採用任何一種適當的給藥途徑添加本發明的一種或多種片段或肽。最初一些研究的重點是確定肽的何種氧化修飾可以導致其被人類血漿中的抗體識別。在這些研究中使用了肽No.l—5以及No.297-302。在LDL氧化的過程中，磷酯中的多不飽和脂肪酸以及膽固醇酯經歷了預氧化，從而形成了具有高反應性的斷裂產物，例如丙二醛(MDA)。MDA可以與印oB-100中的賴氨酸和組氨酸殘基形成共價加合物，從而使它們具有高度的免疫原性。LDL氧化還導致apoB-100分裂，從而使正常狀態下不能被免疫系統接近的肽序列暴露於免疫系統中。在這些實驗中，採用了肽的天然形態，或經過MDA修飾，或者在用銅氧化或MDA修飾後結合於磷酯脂質體上。在上述研究中，檢測了針對天然肽、經MDA修飾的肽以及結合於脂質體上的氧化肽的IgM抗體，它們的抗體滴度分別為經MDA修飾的肽〉經MDA修飾的脂質體肽〉結合於脂質體的氧化肽〉天然肽。特異性試驗表明MDA—LDL以及經銅氧化的LDL競爭性結合於針對經MDA修飾的肽的抗體。然後，我們將天然形態的和經MDA修飾的肽作為抗原，用從健康對照受試者中收集來的血漿樣品，對完整的肽庫進行篩選。確定了針對apoB-100上多個位點的抗體。將對照的背景吸光度的兩倍作為陽性滴度的判定值，檢測了構成完整apo-100肽序列庫的302個肽中的102個肽的抗體。IgM的結合率明顯高於IgG的結合率。總體上來說，抗體與經MDA修飾的肽的結合率高於與相應的天然肽序列的結合率，但是兩者之間有著顯著的相關性。經MDA修飾的LDL和經銅氧化的LDL與天然形式的肽序列和經MDA修飾的肽序列競爭性結合於抗體，伹是，天然LDL並不參與所述的競爭性結合。這些觀察結果表明，針對apoB-100中經MDA修飾的肽序列的免疫反應與天然序列之間存在著交叉反應性。天然LDL不競爭結合於結合天然apoB-100肽序列的抗體的現象是非常有趣的，但是，其可能提示了，只有經過LDL氧化，導致即oB-100發生了蛋白分解，此時這些肽序列才暴露出來。所述肽分子的親水和厭水部分被抗體識別。用從具有冠心病臨床症狀[CHD，急性心肌梗塞(AMI)、不穩定心絞痛；r^l0]的受試者中所收集的血漿樣品，對apoB-100肽庫進行第二次篩選。所收集的CHD血漿中的抗體與健康對照受試者血漿中的抗體結合於同樣的肽序列，而且其分布也與健康對照受試者血漿中的抗體分布一致。然而，在CHD受試者的血槳中，針對幾種肽(編號為l,30-34，100，107，148，149，162，236，252以及301)的抗體滴度至少是健康對照受試者血漿中抗體滴度的兩倍，此外，CHD患者血漿中還有幾種肽(編號為10，45,111，154，199，222以及240)的抗體滴度高於對照組。然後，我們進行了一項前瞻性臨床研究，以調查針對apoB-100中經MDA修飾的肽序列的抗體水平能否用於預測發生CHD的危險。採用嵌套式病例對照研究設計，我們從Malmo飲食癌症研究項目中選擇了78名冠狀動脈出現重大病變的受試者(AMI或死於CHD)，以及149名對照人群。病例組和對照組中的受試者之前均沒有發生MI或中風的病史。在病例組中，從採集血樣到發生急性冠狀動脈疾病的中位數時間為2.8年(範圍為O.1-5.9年)。測定加入抗氧化劑的基線血漿樣品中的抗體水平。採用超聲波檢査法評價了頸動脈內膜-中膜的基線厚度(IMT),我們同時還分析了抗體濃度和所存在的血管疾病的嚴重程度之間的關係。我們研究了8個在初次篩選研究中與血漿中高抗體水平相關(編號為74，102以及210),和/或對照組血漿池與CHD血槳池之間存在明顯差異(編號為32，45，129，162以及240)的經MDA修飾的肽序列。我們發現，對照組中針對經MDA修飾的肽74的IgM抗體水平較高(對照組0.258，吸光度範圍為0-1.123;病例組0.178，吸光度範圍為0-0.732，p<0.05)，而對於其它的肽，病例組和對照組之間的抗體水平沒有差異。我們觀察到了，在病例組中，IMT和針對經MDA修飾的肽No.102，129以及162的IgM抗體之間存在著相關性(r分別為0.233，0,232，0.234，p〈0.05)'在對照組中，IMT與針對經MDA修飾的肽45的IgM抗體之間也存在著相關性(r=0.18，p〈0.05)。針對經MDA修飾的肽129的抗體以及總膽固醇和LDL膽固醇之間存在著微弱的相關性(r分別等於0.19，0.19，p<0.01)，其它肽的抗體水平與總的血漿膽固醇，LDL膽固醇，HDL膽固醇或血漿甘油三酯之間沒有表現出相關性。針對不同肽的抗體水平之間存在著顯著的協相關(r值範圍0.6-0.9)。其中只有一個例外，那就是經MDA修飾的肽74的抗體與其它肽的抗體之間存在著微弱的相關性或不具有相關性。在病例組中，除了經MDA修飾的肽74,所有肽序列的抗體與年齡存在著負相關(r值範圍0.38-0.58，p〈0.01，0.001)，但是在對照組中不存在這種負相關。相反的是，血漿中氧化LDL的水平隨著年齡的增長而升高。而且，這種相關性在病例組中比對照組中更加顯著。為了研究針對經MDA修飾的肽序列的免疫反應與心血管疾病之間的關係在不同的年齡組中是否不同，我們對病例組和對照組進行了年齡分組分析，分為年齡中位數(61歲)以下和以上兩組。在年齡較小的組中，與對照組相比，病例組中肽32和45的抗體水平較高，肽74的抗體水平較低，但是在高年齡組中沒有觀察到差異。在年齡較小的組中，除了肽74，所有經MDA修飾的肽序列的抗體均與IMT具有顯著的相關性，而在高年齡組中不存在上述情況。(表)這些研究確定了apoB-100中存在的多個被人類抗體所識別的經MDA修飾的肽序列。由於LDL氧化所導致的apoB-100的MDA修飾表明這些抗體屬於上文所描述的抗氧化LDL的自身抗體家族。該結論同樣得到了以下觀察結果的支持，即結合於經MDA修飾的apoB-100肽的抗體也被氧化LDL競爭性結合。與Horkko等人所確定的氧化磷脂一起，這些經MDA修飾的肽序列有可能構成了氧化LDL的絕大部分具有抗原性的結構。與氧化LDL的抗磷脂抗體類似，經MDA修飾的apoB-100序列的抗體類型為IgM型。這就提示了，後者抗體也可能屬於T15自然產生的抗體家族。T15抗體在抗細菌感染的T細胞非依賴性免疫反應中起著重要的作用，同樣在清除凋落細胞中也起著非常重要的作用。但是，我們仍需要進一步確定本文所描述的經MDA修飾的肽的抗體是否也具有類似功能。此外，我們還檢測了多個天然apoB-100序列的抗體。然而，天然肽的抗體和經MDA修飾的肽的抗體之間所存在的顯著共變性提示了，這些抗體同樣也是在針對LDL氧化的免疫反應中形成的。此外還存在這樣的可能，那就是經MDA修飾的肽序列的抗體與相應的天然肽序列之間存在著交叉反應性。如果抗天然apoB-100序列的抗體同樣結合於天然LDL顆粒，這就有可能對LDL的代謝產生重大影響。然而，發現表明天然LDL並不競爭性結合於抗天然apoB-100序列的抗體，而且抗天然apoB-100序列的抗體與LDL膽固醇水平之間缺乏相關性，從而否定了上述現象的存在。在病例組中，經MDA修飾的肽序列的抗體水平隨著年齡的增長而進行性地下降，但是在對照組中不存在這種現象。在年齡較小的組中(62歲以下)，除了經MM修飾的肽74，經MDA修飾的肽的IgM抗體與頸動脈IMT之間存在著顯著的相關性，但是在年齡較大的組中不存在這種相關性。這些發現表明，在50歲到70歲之間，免疫系統和動脈粥樣硬化血管壁之間的相互作用發生了顯著的變化。其中一種可能性是，在較年輕的個體中，動脈粥樣硬化疾病的過程處於一個較為活躍的階段，其中免疫細胞顯著地參與該過程。另一種可能性是，在年老的個體中，經MDA修飾的肽序列的抗體水平下降反映了參與動脈粥樣硬化過程的免疫細胞也衰老了。有人認為，免疫衰老所引起的免疫細胞功能損傷導致了老年人感染和癌症的易感性升高。有趣的是，抗氧化劑可以抑制免疫衰老，其提示了免疫衰老過程中涉及了氧化因素。尤其是，與氧化LDL的抗原決定基之間具有相互作用的免疫細胞有可能暴露於氧化因素中。由於在年幼的時候，氧化LDL就已經存在於動脈中，因此，免疫反應一直被持續激發了數十年，從而進一步加劇了免疫衰老的發生。我們發現，針對apoB-100中兩個位點的抗體可以用於預測年齡在62歲以下的受試者中發生心肌梗塞和冠狀動脈死亡的危險性。針對這兩個位點的抗體之間具有高度的共變性，其提示了，這些抗體是針對同一潛在的病理過程的反應所產生的。從採集血樣至發生重大冠狀動脈病變的中位數時間僅僅為2.8年的事實表明，這些特別受關注的抗體可以作為CHD危險升高的標記物。經MDA修飾的apoB肽序列的抗體水平與其它的CHD危險因素之間沒有表現出相關性，例如高脂血症、高血壓、糖尿病，其表明這些抗體是獨立的患有CHD危險的標記物。在本研究中，CHD病例並不是具有極高危險性的個體，他們只代表了普通的CHD患者。結果表明，經MDA修飾的apoB肽序列的IgM抗體可以預測個體在短期內發生急性冠狀動脈病變的危險，通過對目前所確定的危險因素進行篩選並沒有確定所述個體為高危人群，這就提示了，經MDA修飾的apoB-100肽序列的IgM抗體可以成為確定那些需要進行積極預防治療的個體的一種重要的手段。然而，在完全確定針對經MDA修飾的apoB-100肽序列的抗體的臨床值之前，需要更多的、更大規模的、進行多因素分析的前瞻性研究。本發明中的臨床研究的另一個不足是，我們僅僅分析了針對apoB-100中一小部分抗原位點的抗體，可能針對其它位點的抗體滴度可以更好地作為發生心血管疾病危險的標記物。在年齡60歲以下的受試者中，針對apoB-100中大量經MDA修飾的位點的抗體與所存在的血管疾病的範圍和程度之間具有相關型，所述血管疾病的範圍和程度是通過頸動脈IMT進行評價的。IgM抗體與頸動脈IMT的關係比IgG抗體更加密切。儘管將頸動脈IMT用於評價總體動脈粥樣硬化的程度具有明顯的局限性，但是這些研究結果仍然提示了，測定針對apoB-100中經MDA修飾的肽序列的IgM抗體可以作為評價所存在的動脈粥樣硬化嚴重程度的一種方法。這些觀察結果與在此之前的其它幾個研究一致，這些研究報導了冠狀動脈疾病、頸動脈疾病以及抗氧化LDL的IgM抗體之間的關聯。抗肽74的抗體在很多方面不同於其它apoB-100肽的抗體。在對照組中抗肽74的抗體高於病例組，隨著年齡的增長這些抗體並不減少，這些抗體與頸動脈疾病的程度之間沒有聯繫。因此，抗該肽序列的抗體可以作為具有動脈保護效應的免疫反應的候選物質。一種非常重要的問題是為何存在這樣的聯繫。這些聯繫清楚地表明，針對經MDA修飾的apoB-100位點的免疫反應在一定程度上參與了動脈粥樣硬化疾病的病程。由於高抗體水平與較為嚴重的動脈粥樣硬化，以及發生急性冠狀動脈疾病的高危險性有關，一個顯而易見的可能性就是，這些免疫反應促進了動脈粥樣化。有研究表明，針對例如HSP65等熱休克蛋白的免疫反應促進動脈粥樣化，這些研究支持了上述觀點。然而，實驗動物研究表明，用氧化LDL進行疫具有保護動脈的作用。對切除脾的apoE裸鼠進行B細胞重建導致動脈粥樣硬化降低。對apoE裸鼠進行反覆注射免疫球蛋白也觀察到了動脈粥樣硬化的減少。本發明中的觀察結果並不足以反駁針對氧化LDL的免疫反應所具有的動脈保護作用。這些免疫反應是由促進動脈粥樣化的過程所激發的，例如，LDL氧化。因此，這些免疫反應同樣有可能與上述疾病的嚴重程度之間具有一定的比例關係，可以作為疾病嚴重程度和發生CHD危險的標記物，但是其並不促使疾病向前發展。在兩篇論文中所報導的研究結果表明，用apoB-100肽序列免疫apoE裸鼠抑制了動脈粥樣硬化的發生和發展，其提示了有可能就是如上所述的情況。實際上，本研究最重要的結果可能是確定了可以作為抗動脈粥樣硬31化疫苗組成部分的結構。研究結果表明，隨著年齡的增長，apoB-100中經MDA修飾肽序列的抗體而水平減少，同時還伴有血漿中氧化LDL水平的升高，其提示了，增加循環中極少量氧化LDL的清除率可能是這些抗體具有防止動脈粥樣硬化的一個機制。方法研究人群本研究的受試者出生於1926-1946年間，為MaliiK)"飲食和癌症(MDC)"研究隊列中的受試者。在1991年11月至1994年2月期間，我們從參與MDC研究的受試值中隨機選取了50%的受試則，參與頸動脈疾病的流行病學研究。在進行健康檢查之後，確定了有關發病率和致死率等方面的信息，以及傳統危險因素的定義，並對確定的方法和定義進行了報導。確定了有85例急性冠狀動脈性心臟疾病，也就是，致死性或非致死性的心肌梗塞(MI)或由冠心病(CHD)所導致的死亡。具有心肌梗塞或中風(n=6)病史的參與者為不合格者，不能參加本研究。對於每個病例，選取兩個在年齡、性別，吸菸習慣、有無高血壓、參與篩選檢查的月份、隨訪的時間等方面相匹配的對照者，所述對照者沒有心肌梗塞或中風的病史。由於後勤方面的原因(血樣量不夠，不足以對肽進行測定)，有7名病例只有一個對照者，有l名病例沒有對照者。分析時，剔除了該名病例。因此，本研究人群包括227名受試者，其中有78名病例，149名對照，在進入研究時，他們的基線年齡在49-67歲之間(年齡中位數為61歲)。實驗室分析採集過夜禁食後的血樣，檢測血清中總膽固醇、甘油三酯、HDL膽固醇、LDL膽固醇和全血血糖的濃度。根據Friedwald公式計算LDL膽固醇濃度，其單位是咖o1/1。用ELISA方法(Mercordia)檢測氧化LDL。B型超聲血管檢測用具有兆赫茲傳感器的Acuson128計算機斷層系統(CT)(Acuson,32MountainView,加利福尼亞)對右頸動脈的頸動脈斑塊進行評價，如上文所述。用ELISA方法檢測apoB-100肽序列合成302個對應於人類載脂蛋白B完整胺基酸序列的肽(Euro-DiagnosticaAB,瑞典，以及KJRosePetersenAS,Horsholm,丹麥)，並將它們用於ELISA分析中。在37°C下，用0.5MMDA(Sigma-AldrichSwedenAB，斯德哥爾摩，瑞典)處理所述合成肽3小時，對每個經合成的肽的一部分進行修飾，或在脂質體存在的情況下，用0.5MMDA在37°C下處理3小時，或在37°C下,用5raMCuCl2(Sigma)處理18小時。然後在4°C下，用含有ImMEDTA的PBS溶液對所述經MDA修飾的肽進行透析18小時，中間更換PBS溶液數次。在適於分離肽的變性聚丙烯醯胺凝膠(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)上檢測經修飾的肽。將摩爾比為9:1的卵磷脂(EPC)(Sigma)和磷脂醯絲氨酸(PS)(Sigma)的氯仿溶液，與濃度為3mM的磷酯(PL)溶液進行混合，然後，在玻璃容器中用緩慢的氬氣流進行吹乾。然後，將容器放在真空狀態下3小時。取5ml含有0.lmM肽、經無菌過濾的PH為7.4的10mMHEPES緩衝液、45mMNaCl、0.003^疊氮鈉的溶液加入EPC/PS乾燥層，並在50°C下孵化15分鐘。在室溫下，輕微振蕩所述混合物，然後將其放於冰水中，用振幅為7.5微米的微波進行超聲降解3x3分鐘(Sonypr印150MSESanyo,Tamro-medlab,瑞典)，每次間隔1分鐘。將所述PL—肽混合物貯存於玻璃小瓶中，並位於氬氣下面，瓶的外周用鋁箔包裹，在4°C下貯存，並在1周內使用。所述PL—肽混合物為天然形態，或是用0.5MMDA在37°C下進行處理3小時，或是用5mM0^12在37°C下處理18小時。在貯存前，所述經MDA修飾的混合物需要在4°C下用含有ImMEDTA的PBS對其進行透析18小時，中間更換PBS溶液數次。在適於分離肽的變性聚丙烯醯胺凝膠(Bio-RadLaboratoriesAB,Sundbyberg，瑞典)上檢測所述經修飾的混合物。不論有無脂質體，用PH為7.4的PBS(20leg/ml)溶液稀釋天然或經修飾的合成肽，並用其包被微孔滴定板的小孔(NuncMaxiSorp,Nunc,Roskide，丹麥)，在4°C下孵化過夜。作為對照，在每塊板上都加入其中的一個肽(P6)。用含有0.05%Tween-20的PBS(PBS-T)溶液洗板，然後在室溫下，用含有S叩erblock的TBS溶液(Pierce,Rockfor,IL)封閉所述經包被的板5分鐘，用含有0.05%Tween-20的TBS(TBS-T)溶液以100:1的比例稀釋所收集到的人血槳樣品，並將稀釋後的血樣加入反應板中，在室溫下孵化2小時，然後在4。C下孵化過夜。洗板後，用生物素標記的兔抗鼠Ig抗體(DakoA/S，Glostrup,丹麥)檢測沉積的針對所述肽的抗體，所述兔抗鼠抗體用TBS—T溶液進行適當地稀釋，在室溫下，繼續孵化2小時；然後，洗板，用鹼性磷酸酶結合的抗生蛋白鏈菌素(Sigma)檢測結合的生物素標記的抗體，在室溫下孵化2小時。用磷酸酶底物試劑盒(Pierce)進行顯色反應，在室溫下孵化1小時後，在405nm處測量吸光度。將每個肽的吸光度值除以P6的吸光度值，進行比較。統計用SPSS進行統計分析。所得結果以中位數和範圍表示，適當的時候用比例表示。用框圖或散點圖解釋病例組和對照組中年齡和所選擇的肽之間的關係。此外，分別在對照組和病例組中，用相應的圖形解釋基線年齡在中位數(61歲)之下和之上的亞組之間年齡和所選擇的肽之間的關係，並單獨地用相應圖形解釋病例組和對照組中年齡在中位數以下時年齡和所選擇的肽之間的關係。單獨計算病例組和對照組中所選擇的肽和血脂水平，以及頸總動脈IMT之間的、經年齡和性別調整後的偏相關係數。同時，對病例組和對照組中年齡在中位數(61歲)之下和之上的亞組，計算頸總動脈IMT和所選擇的肽之間的經年齡和性別調整後的偏相關係數。對符合正態分布的連續變量，用獨立樣本t檢驗進行統計分析，用卡方(x2)檢驗比較病例組和對照組之間的比例。用非參數檢驗的方法(Mann-Whitney)評價病例組和對照組之間不符合正態分布的連續變量之間的差異。所有的P值都是雙向的。表患有心肌梗塞的病例組以及相應的在年齡、性別、吸菸、.高血壓方面相匹配的對照組在年齡較小組(49-61歲)和年齡較大組(62-67歲)中基線MDA-肽和頸動脈內膜-中膜厚度之間經年齡和性別調整後的偏相關係數肽病例組加對照組年齡在49-61歲，n=116病例組加對照組年齡在62-67歲，n=lllIgMMDA320.235t-0.101MDA450.366$-O.030MDA740.1780.063MM1020.255$-O.039MDA1290.330$-O.009MDA1620.24510.001MDA2100.2540.013MDA2400.284$0.006MDA2150.119一O.059IgGP<0.05;$/x0.01參考文獻1.AmellSetal.EffectofimmunizationwithhomologousLDLandoxidizedU)Lonearlyatherosclerosisinhypercholesterolemicrabbits.2.FreigangS，HorkkoS,MillerE，WitztumJ丄&PalinskiW.ImmunizationofLDLreceptor-deficientmicewithhomologousmalondialdehyde-niodifiedandnativeU)Lreducesprogressionofatheroscelrosisbymechanismsotherthaninductionofhightitiersofantibodiestooxidativeneoepitopes.3.GeorgeJ"etal.Hyperimmunizationofapo-E-deficientmicewithhomologousmalondialdehydelow-densitylipoproteinsuppressesearlyOTtherogenesis.Atherosclerosis138,147-152(1998)4.AlvingC.R'.etal.Immunizationwithcholesterol-richliposomesinducesanticholesterolantibodiesandreduceshypercholestgerolemiaandplaqueformation.J.Lab.Clin.Med.127,40-49(1996).5.HouX,CaligiuriG，HamstenA，LefvertA.K&HanssonG.K.LDLimmunizationinducesT—cell—dependentantibodyformationandprotection35againstatherosclerosis.ArteriosclerThrombVaseBiol.21，108-144(2001)6.NakashimaY,PlumpA.S.，RainesE.W.,BreslowRossR.Apo-E-deficientmicedeveloplesionsofallphasesofatherosclerosisthroughoutthearterialtree.ArteriosclerThromb14,133-140(1994)7.ReddickR.L，ZhangS.H.&MaedaN.AtherosclerosisinmicelackingapoE.Evaluationoflesionaldevelopmentandprogression.ArteriosclerThromb14,141-147(1994)8.ShahP.K.etal.EffectsofrecombinantapolipoproteinA-I(Milano)onaorticatherosclerosisinapolipoproteinE-deficientmice.Circulation97,780-785(1998)9.Glass,C.K.&Witztum，J丄Atherosclerosis.Theroadahead.Cell104,503-16(2001)10.Holvoet,P.,Vanhaecke，J.,Janssens,S.,VandeWerf,F.&Collen,D.OxidizedLDLandmalondialdehyde-modifiedLDLinpatientswithacutecoronarysyndromesandstablecoronaryarterydisease.Circulation98,1487-94(1998)11.Ehara，S.etal.Elevatedlevelsofoxidizedlowdensitylipoproteinshowapositiverelationshipwiththeseverityofacutecoronarysyndromes.Circulation103，1955-60(2001)12.Krych-Goldberg，M.&Atkinson,J.P.Structure-functionrelationshipofcomplementreceptortypel.ImmunolRev180,112-22(2001)13.Nicoletti,A.，Caligiuri,G.，Paulsson,G.&Hansson,G.K.Functionalityofspecificimmunityinatherosclerosis.AmHeartJ"138,5438-43(1999)16.Chobanian,A.V.Haudenschild,C.C.,Nickerson,C.&Drago,R.AntiatherogeniceffectofcaptoprilintheWatanabeHeritablehyperlipidemicrabbit.Hypertension15，327-32(1990)17.Inoue,I.etal.MacrophagecolonystimulatingfactorpreventstheprogressionofatherosclerosisintheWatanabeHeritablehyperlipidemicrabbit.Atherosclerosis93,245-54(1992)18.Bourassa,P.A.,Milos，P.M.,Gaynor,B.j.,Breslow,J丄&Aiello，R.J.EstrogenreducesatheroscleroticlesiondevelopmentinapolipoproteinE_deficientmice.ProcNatlAcadSciUSA93，10022-7(1996)19.Sparrow,C.P.etal.Simvastatinhasanti-inflammatoryandantiatheroscleroticactivitiesindependentofplasmacholesterollowering.ArteriosclerThrombVaseBiol21,115-21(2001)20Nakashima,Y.,Plump,A.S.,Raines,E.W.,Breslow,_J.L&Ross,R.ApoE-deficientmicedeveloplesionsofallphasesofatherosclerosisthroughoutthearterialtree.ArteriosclerThromb14,133-40(1994)21Palinski,W.etal,ApoE-deficientmiceareamodeloflipoproteinoxidationinatherogenesis.Demonstrationofoxidation-specificepitopesinlesionsandhightitersofautoantibodiestomalondialdehyde-lysineinserum.ArteriosclerThromb14,605-16(1994)附圖1-6表示針對本發明中所製備的不同肽的抗體反應。本發明的特徵參照下列帶編號的段落，進一步對本發明進行描述1.用於對包括人類在內的哺乳動物中缺血性心血管疾病進行免疫或治療的載脂蛋白B的片段，其具有免疫原性或具有抗缺血性心血管疾病的治療特性，和/或用於診斷與缺血性心血管疾病發病危險升高或降低有關的抗體的存在與否。2.根據第l段所述的片段，其中所述片段為醛半抗原。3.根據第2段所述的片段，其中用丙二醛或羥基壬烯醛修飾所述片段。4.根據第1-3段所述片段的肽，不論天然形式的肽或是醛衍生物，包括FLDTVYGNCSTHFTVKTRKGPQCSTHILQWLKRVHANPLLVISIPRLQAEARSEILAHWSKLVKEALKESQLPTVMDFRKLKFVTQAEGAKQTEATMTFKDGSLRHKFLDSNIKFSHVEKKGTYGLSCQRDPNTGRLNGERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLTSTSDLQSGIIKNTASLKTASLKYENYELTLKSDTNGKDMTFSKQNALLRSEYQADYEMKVKIIRTIDQMQNSELQWPIALDDAKINFNEKLSQLQTYKTTKQSFDLSV國YK醒HEEEMLENVSLVCPKDATRFKGSTS冊LVSRKSISAALEHKIENIDFNKSGSSTASWIQNVIREVTQRLNGEIQALELPQKEVDVLTKYSQPEDSLIPFFEHTFLIYITELLKKLQSTTVMLLDIANYLMEQIQDDCTGDECTGDEDYTYKIKRVIGNMGQG陋GQTMEQLTPELKSSILKSSILKCVQSTKPSLMIQKAAIQKAAIQAL麗EPKDKDQERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLNSHGLELNADILGTDKINWIQNVDTKYQIRIQIQEKLQTYISDWWTLAA脂LTDFAEQEATLQRIYSLWEHSTKNHLQALLVPPETEEAKQVLFLDTVIEIGLEGKGFEPTLEALFGKSGASMKLTTNGRFR朋NAKFNLIGDFEVAEKINAFRAKVHGHSVLTAKGMALFGEGKAEFFKSSVITLNTNAELFNQSDIFPDLGQEVALNANTKNQKIRATRFKHLRKYTYNYQAQSSS，或者上述一個或多個肽的活性位點。5.根據第3段所述的肽，其選自HTFLIYITELLKKLQSTTVMALLVPPETEEAKQVLFLDTVFLDTVYGNCSTHFTVKTRKPQCSTHILQWLKRVHANPLLLLDIANYLMEQIQDDCTGDECTGDEDYTYKIKRVIGNMGQG陋GQTMEQLTPELKSSILKSSILKCVQSTKPSLMIQKAAIQKAAIQAL函EPKDKDQEIEIGLEGKGFEPTLEALFGKVISIP,EARSEILAHWSKGTYGLSCQRDPNTGRLNGERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLTSTSDLQSGIIKNTASLKTASLKYE訓LTLKS翻GKDMTFSKQNALLRSEYQADYEGSTSHHLVSRKSISAALEHKIALDDAKINFNEKLSQLQTYIENIDFNKSGSSTASWQNVNLIGDFEVAEKINAFRAKVHIREVTQRLNGEIQALELPQKGHSVLTAKGMALFGEGKAEFKTTKQSFDLSV國YKK隨FPDLGQEVALNANTKNQKIRATRFKHLRKYTYNYQAQSSS，或者上述一個或多個肽的一個活性位點。6.根據第4-5段所述的肽，其為天然形式。7.根據第4-5段所述的肽，其為氧化形式。8.根據第7段所述的肽，其中所述肽是經銅進行氧化過的。9.根據第4-5段所述的肽，其中所述肽結合於磷脂脂質體。10.根據第4-5段所述的肽，其中所述肽為丙二醛(MDA)衍生物形式。11.根據第4-5段所述的肽，其中所述肽為羥基壬烯酸衍生物形式。12.如第1-11段所述天然形式或MDA衍生物形式或羥基壬烯醛衍生物形式的一個或多個片段/肽在製備對缺血性心血管疾病進行免疫治療或治療的藥物組合物中的應用，所述片段/肽可以選擇性地與佐劑結合使用。13.根據第12段所述的應用，其中所述片段/肽的免疫治療劑量為l-100mg。14.含有治療有效劑量的如第1-11段所述一個或多個片段/肽的藥物製劑，40所述製劑可選擇性地與一種或多種藥理上無害的填料，和/或佐劑結合使用。15.根據第14段所述的藥物製劑，其中，所述片段/肽連接於陽離子牛血清白蛋白，並使用氫氧化鋁作為佐劑。16.根據第15段所述的藥物組合物，其中，所述組合物為可注射的藥物組合物。17.用於對包括人類在內的哺乳動物進行免疫，以抗缺血性心血管疾病的疫苗，該疫苗含有如第1-11段所述一個或多個片段/肽，可選擇性地與佐劑聯合使用。18.用於對包括人類在內的哺乳動物進行免疫，以抗缺血性心血管疾病的疫苗，該疫苗含有治療有效劑量的、經純化或重組的抗體，所述抗體為如第1-11段所述一個或多個天然和/或經MDA修飾的序列的抗體。19.根據第17段所述的進行免疫用的疫苗，其中，所述免疫用的片段/肽連接於陽離子牛血清白蛋白，並使用氫氧化鋁作為佐劑。20.用於預防或治療包括人類在內的哺乳動物患有動脈粥樣硬化或具有發生缺血性心血管疾病危險的方法，給予所述哺乳動物治療有效劑量的、天然形式或丙二醛衍生物形式或羥基壬烯醛衍生物形式的一個或多個如第1-11段所述的片段和/或肽，所述哺乳動物患有動脈粥樣硬化或具有發生缺血性心血管疾病危險，特別是心肌梗塞。21.用於預防或治療包括人類在內的哺乳動物患有動脈粥樣硬化或具有發生缺血性心血管疾病危險的方法，給予所述哺乳動物治療有效劑量的、經純化或重組的一種或多種抗體從而進行被動免疫，所述抗體為天然的和經MDA修飾的序列的抗體。22.根據第20段所述的方法，其中所述的狀況是一個或多個不穩定的動脈粥樣硬化斑塊，其中氧化LDL有可能導致炎症，具有細胞毒性和發生斑塊破裂的危險，以及導致老年人患有冠心病。23.與發生缺血性心血管疾病的危險升高或降低有^^的抗體的存在與否的診斷方法，其中在檢測方法中使用一個或多個如第1-11段所述的片段和/或肽。24.根據第23段所述的方法，其中所述檢測方法為一種免疫檢測方法。25.根據第24段所述的方法，其中所述的免疫檢測方法為ELISA，RIA，41Western雜交，Southern雜交。序列表Seq.IDNO1來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性FLDTVYGNCSTHFTVKTRKG序列表Seq.IDNO2來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性PQCSTHILQWLKRVHANPLL序列表Seq.IDNO3來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性VISIPRLQAEARSEILAHWS序列表Seq.IDNO4來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性KLVKEALKESQLPTVMDFRK序列表Seq.IDNO5來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性LKFVTQAEGAKQTEATMTFK序列表Seq.IDNO6來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性DGSLRHKFLDSNIKFSHVEK序列表Seq.IDNO7來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性KGTYGLSCQRDPNTGRLNGE序列表Seq.IDNO8來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ序列表Seq.IDNO9來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性SLTSTSDLQSGIIKNTASLK45序列表Seq.IDNO10來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性TASLKYENYELTLKSDTNGK序列表Seq.IDNO11來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性DMTFSKQNALLRSEYQADYE序列表Seq.IDNO12來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性MKVKIIRTIDQMQNSELQWP序列表Seq.IDNO13來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性IALDMKINFNEKLSQLQTY序列表Seq.IDNO14來源載脂蛋白B的片段長度20類型.胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性KTTKQSFDLSVKAQYKKNKH序列表Seq.IDNO15來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性EEEMLENVSLVCPKDATRFK序列表Seq.IDNO16來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性GSTSHHLVSRKSISAALEHK序列表Seq.IDNO17來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性IENIDFNKSGSSTASWIQNV序列表Seq.IDNO18來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性IREVTQRLNGEIQALELPQK序列表Seq.IDNO19來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性EVDVLTKYSQPEDSLIPFFE序列表Seq.IDNO20來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性HTFLIYITELLKKLQSTTVM序列表Seq.IDNO21來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性LLDIANYLMEQIQDDCTGDE49序列表Seq.IDNO22來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性CTGDEDYTYKIKRVIGNMGQ序列表Seq.IDNO23來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性GNMGQTMEQLTPELKSSILK序列表Seq.IDNO24來源載脂蛋白B的片段長度20類型氮基酸肽鏈單鏈拓撲線性SSILKCVQSTKPSLMIQKAA50序列表Seq.IDNO25來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性IQKAAIQALRKMEPKDKDQE序列表Seq.IDNO26來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性RLNGESNLRFNSSYLQGTNQ序列表Seq.IDNO27來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性SLNSHGLELNADILGTDKIN序列表Seq.IDNO28來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性WIQNVDTKYQIRIQIQEKLQ序列表Seq.IDNO29來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性TYISDWWTLAAKNLTDFAEQ序列表Seq.IDNO30來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性EATLQRIYSLWEHSTKNHLQ序列表Seq.IDNO31來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性ALLVPPETEEAKQVLFLDTV序列表Seq.IDNO32來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性IEIGLEGKGFEPTLEALFGK序列表Seq.IDNO33來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性SGASMKLTTNGRFREHNAKF序列表Seq.IDNO34來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性NLIGDFEVAEKINAFRAKVH序列表Seq.IDNO35來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性GHSVLTA腿ALFGEGKAEF序列表Seq.IDNO36來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性FKSSVITLNTNAELFNQSDI54序列表Seq.IDNO37來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽'鏈單鏈拓撲線性FPDLGQEVALNANTKNQKIR序列表Seq.IDNO38來源載脂蛋白B的片段長度20類型胺基酸肽鏈單鏈拓撲線性讚FKHLRKYTY歸QSSS權利要求1.一種經純化或重組產生的抗體，所述抗體為載脂蛋白B的一個或多個片段的抗體，其中所述的一個或多個片段選自IEIGLEGKGFEPTLEALFGKFLDTVYGNCSTHFTVKTRKGPQCSTHILQWLKRVHANPLLVISIPRLQAEARSEILAHWSKLVKEALKESQLPTVMDFRKLKFVTQAEGAKQTEATMTFKDGSLRHKFLDSNIKFSHVEKKGTYGLSCQRDPNTGRLNGERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLTSTSDLQSGIIKNTASLKTASLKYENYELTLKSDTNGKDMTFSKQNALLRSEYQADYEMKVKIIRTIDQMQNSELQWPIALDDAKINFNEKLSQLQTYKTTKQSFDLSVKAQYKKNKHEEEMLENVSLVCPKDATRFKGSTSHHLVSRKSISAALEHKIENIDFNKSGSSTASWIQNVIREVTQRLNGEIQALELPQKEVDVLTKYSQPEDSLIPFFEHTFLIYITELLKKLQSTTVMLLDIANYLMEQIQDDCTGDECTGDEDYTYKIKRVIGNMGQGNMGQTMEQLTPELKSSILKSSILKCVQSTKPSLMIQKAAIQKAAIQALRKMEPKDKDQERLNGESNLRFNSSYLQGTNQSLNSHGLELNADILGTDKINWIQNVDTKYQIRIQIQEKLQTYISDWWTLAAKNLTDFAEQEATLQRIYSLWEHSTKNHLQALLVPPETEEAKQVLFLDTVSGASMKLTTNGRFREHNAKFNLIGDFEVAEKINAFRAKVHGHSVLTAKGMALFGEGKAEFFKSSVITLNTNAELFNQSDIFPDLGQEVALNANTKNQKIR，以及ATRFKHLRKYTYNYQAQSSS或者上述肽的一個活性位點。2.如權利要求l所述的抗體，其中所述的抗體用於預防或治療包括人類在內的哺乳動物中缺血性心血管疾病。3.如權利要求1-2中任一所述的抗體，其中所述的一個或多個片段為天然形式或氧化形式。4.如權利要求3所述的抗體，其中所述的一個或多個片段為醛衍生物。5.如權利要求4所述的抗體，其中，用丙二醛或羥基壬烯醛修飾所述的一個或多個片段。6.如權利要求4-5中任一所述的抗體，其中所述的一個或多個片段為醛半抗原。7.如權利要求3所述的抗體，其中所述的一個或多個片段是經銅進行氧化過的。8.如上述權利要求中任一所述的抗體，其中所述的一個或多個片段結合於磷脂脂質體。9.用於預防或治療包括人類在內的哺乳動物中缺血性心血管疾病的藥物製劑，所述藥物製劑含有治療有效劑量的如權利要求1-8所述的一種或多種經純化或重組產生的抗體。10.如權利要求1-8中任一所述的抗體在製備預防或治療包括人類在內的哺乳動物中缺血性心血管疾病的藥物組合物中的應用。11.用於預防或治療包括人類在內的哺乳動物患有動脈粥樣硬化或面臨發生缺血性心血管疾病危險的方法，其中，給藥一治療有效劑量的如權利要求1-8中任一所述的一種或多種經純化或重組產生的抗體。全文摘要本發明涉及載脂蛋白B的片段，特別是由所述片段確定的肽，用於免疫治療或治療包括人類在內的哺乳動物所發生的缺血性心血管疾病，以及在ELISA(酶聯免疫吸附試驗)中使用一種或多種所述肽以確定是否存在與缺血性心血管疾病發生危險性升高或降低有關的抗體。文檔編號C07K16/18GK101486766SQ20091000956公開日2009年7月22日申請日期2002年4月5日優先權日2001年4月5日發明者揚·尼爾森,普裡迪曼·K·沙赫申請人:南方佛斯卡專利公司;賽達斯西奈醫療中心