一種生物誘導型人工硬腦膜及其製備方法與流程

2023-05-21 11:07:17

本發明屬於生物醫用材料領域，具體涉及一種生物誘導型人工硬腦膜及其製備方法。

背景技術：

硬腦膜是一層緊貼在顱骨內側和腦組織之間的堅硬膜性組織，由膠原纖維網和纏繞其中的成纖維細胞所組成，緊貼顱骨內側，主要作用是保護大腦。當人患顱內腫瘤，硬腦膜組織容易受到侵蝕破壞；此外，因手術、外傷等原因也可能造成硬膜缺損。硬腦膜缺損可引起腦醫源性損傷、腦脊液滲漏、顱內感染、繼發性癲癇等一系列併發症。為預防腦、脊髓與周圍組織發生粘連，防治腦脊液漏和感染，並為神經組織提供容納和保護作用，必須進行及時有效的硬膜修補術。據資料統計，有10％—30％的腦外科手術都需要實施硬腦膜修補。

目前臨床上應用的腦膜替代材料有三類:自體組織修補材料、異種生物材料和人工合成材料。自體組織修補材料雖然免疫反應低，但屬於「以傷治傷」，造成患者的二次痛苦。異種生物材料具有良好的生物相容性，國內臨床上常使用牛心包、羊心包、牛腹膜、豬腹膜、腸繫膜以及牛跟腱膠原等，人工合成材料包括膨體聚四氟乙烯(ePTFE)和聚已內酯納米纖維等，大量調查資料表明這些已有的硬腦膜材料存在排斥反應，腦膜粘連，腦脊液滲漏，不可降解或降解速度過慢，降解產物有一定毒性，原材料來源有限，以及手術過程中不便於操作等其它缺陷。

大量研究資料表明，理想的硬腦膜修補材料需具備以下特點：(1)原料來源豐富，價廉易得，工藝簡單；(2)化學性質穩定，無急性炎性反應，不發生腦膜-腦粘連；(3)組織相容性好，無毒副作用，無免疫反應；(4)安全，無致癌致畸作用，不傳播病毒；(5)合適的物理機械性能；(6)緻密無滲漏；(7)合適的生物降解性(8)貯運方便；(9)術前準備及操作方便；(10)經濟適用，價格適中等。

人體真皮組織的主要成分包括成纖維細胞、血管內皮細胞等細胞成分和細胞外基質蛋白、膠原等非細胞成分等。皮膚移植中，主要是細胞免疫引起的排斥，當除去了具有較強免疫原性的細胞成分之後，脫細胞真皮(ADM)只留有很低的抗原性,而同種脫細胞真皮基質則幾乎不會引起宿主的排異反應,在宿主體內可以長期存留，最終材料被正常組織吸收、改建。脫細胞真皮(ADM)的細胞成分及Ⅰ、Ⅱ型細胞相容性抗原已經被完全清除掉,因而免疫活性很低,故而它不會誘發針對異體組織移植所產生的特異性細胞免疫反應,也不會誘發非特異性異物反應。這樣，既消除了應用其它同種異體材料時可見的免疫反應，又因為分子超微結構的存在成為一個模板，誘導組織內皮細胞和血管內皮細胞再生形成新的腦膜，並且有較長的保存期。Warren等用無細胞(人)真皮修補硬腦膜缺損200例，傷口感染率為2％，與未應用或自體移植物的病人之間沒有明顯差異。無細胞人體真皮已經在牙周病和整形重建外科中使用超過5.5萬例，到目前為止尚無傳遞疾病的報導。但這種材料是皮膚的衍生物，天然皮膚存在毛孔、汗腺、血管以及膠原纖維間隙等，存在天然的孔隙結構，某些製品孔隙較大，可 能導致腦脊液滲漏。

總而言之，目前的硬腦膜修補材料中，絲素蛋白膜在製作工藝上仍有待進一步改進；羊膜在取材方法與交聯劑的選擇方面值得進一步探究；高分子聚合材料的生物學毒性及理化性能也有待長期試驗的確證；細菌纖維素膜在硬腦膜領域的研究尚未見文獻報導；現有的膠原膜、膠原海綿等還存在降解速度不容易控制等問題，以致材料降解後新腦膜還未形成、材料較硬、容易破碎，縫合時容易撕裂，引起腦脊液滲漏。因此，新材料與新技術的各種優點相互融合，製備具有誘導組織再生功能的新型硬腦膜替代材料將成為開發和應用的必然趨勢。

技術實現要素：

本發明的目的在於針對現有各類硬腦膜修復材料存在的問題，從目標材料的原料選擇、結構設計入手，綜合運用系統工程、、再生醫學、仿生學和生物設計(Bio-Design)的原理和方法，提供一種具有誘導組織再生功能的膠原基複合硬腦膜；該方法製備的膠原基人工硬腦膜兼具膠原的優異的生物相容性和脫細胞豬真皮良好的力學性能。且具備合適的孔隙結構，能有效防止腦黏粘，能夠承受較高的顱內高壓，促進硬膜化進程，可在腦部組織癒合的過程中可控降解，並可任意裁剪成所需形狀，存儲方便，臨床應用操作簡便易行。產品具有良好的抗張強度和力學性能，可使用圓形針進行無明顯損傷的縫合；在幹態下可裁剪成任意所需形狀，在使用之前易水化。比起其他硬腦膜材料，它有更好的撕裂強度和操縱特性，因此在手術操作過程中，能很好的適應溼法處理和鉗操縱過程。

本發明的另一目的是提供一種製備上述硬腦膜的方法。

本發明通過以下技術方案實現上述目的：

一種基於表面封閉處理技術的工藝穩定的膠原基複合結構的人工硬腦膜。設計目標材料由雙層結構組成：以脫細胞豬真皮支架為基底，將生物相容性優良的複合膠均勻塗敷其上，形成有效防止腦脊液滲漏的薄膜。膠原纖維支架既保留了天然基質的三維結構，又最大程度的保留了其發揮生物誘導作用的結構基礎——三股螺旋結構，保證了生物活性。該方法製備的膠原基人工硬腦膜兼具膠原的優異的生物相容性和脫細胞豬真皮良好的力學性能。

(1)脫細胞豬真皮基質的製備：將生態豬皮剖層，採用消毒、表面清洗等技術去除原材料熱源；使用平平加、乙醇等試劑進行脫脂處理；採用複合酶脫細胞工藝和曲拉通100清洗工藝相結合的方法，去除細胞成分；使用酸鹼結合法進一步對所得脫細胞豬真皮基質進行去除熱源處理；凍幹備用；

(2)聚乙二醇和丙三醇進行共聚交聯反應得到一種複合膠。採用水平流涎和水平噴塗等方法將其塗敷在脫細胞真皮基質上，控制壓力、噴塗距離、噴塗速率等工藝參數，使塗層均勻分布，通過室溫晾乾，恆溫乾燥固化，即可在脫細胞豬真皮表面形成一層均勻的封閉膜，得到可有效防止腦脊液滲漏的膠原基複合硬腦膜

(3)配製洗脫液，將上述所得膠原基複合膜層，通過去離子水，去離子水與乙醇的互配物浸泡洗滌，以去除殘留物質，再經冷凍乾燥成型，即得可有效防止腦脊液滲漏的雙層複合結構之膠原基硬腦膜；

(4)通過上述方法製備的膠原基硬腦膜經過滅菌、包裝後儲存；

所述步驟(1)中的膠原基硬腦膜的製備方法，其特徵在於所述的採用過氧化氫滅活病毒，該步驟在恆溫超聲波清洗器或其他可震蕩的設備中進行，其中過氧化氫的質量濃度為0.05-3.0％，滅活時間為1h-3h，溫度範圍為10-40℃。

所述步驟(1)中的膠原基硬腦膜的製備方法，其特徵在於所述的採用過氧化氫滅活病毒，該步驟在恆溫超聲波清洗器或其他可震蕩的設備中進行，其中過氧化氫的質量濃度為0.05-3.0％，滅活時間為1h-3h，溫度範圍為10-40℃。

所述步驟(1)中採用生物酶脫細胞工藝和Triton-100清洗工藝相結合的方法，去除細胞成分。其中生物酶的質量濃度為0.01％-5％，Triton-100的質量濃度為0.25-5％。

所述步驟(1)中使用酸鹼結合法對所得脫細胞豬真皮基質進行去除熱源處理。其中使用的酸為鹽酸，鹼為氫氧化鈉。

所述步驟(4)中的滅菌方式為低溫環氧乙烷滅菌，或採用鈷-60進行輻照滅菌，滅菌劑量為25～50kGy；

採用上述方法製備得到的具有複合結構的膠原基硬腦膜，其關鍵性能符合以下要求：

1.外觀：膠原基硬腦膜應為白色薄片狀，幹態具有一定硬度，溼態柔順、不易破裂。

2.尺寸：膠原基硬腦膜長度和寬度分別為25mm-100mm，厚度0.3～0.7mm。

3.吸收力：每克試樣的液體吸收量應不小於3g。

4.抗牽拉強度：持續15S施加10N拉力時不斷裂。

5.縫合強度：耐縫性不小於0.3N/mm。

6.灰分：灰分應小於2％。

7.重金屬：重金屬含量≤10μg/g(m/m)

8.水分：水分含量≤10％。

9.酸鹼度：膠原基硬腦膜檢驗液與空白對照液的PH值之差應不超過1.0。

10.無菌：產品應無菌。

11.細菌內毒素含量：細菌內毒素含量應小於20EU/套。

12.細胞毒性：細胞毒性應不大於1級。

13.遲髮型超敏反應：產品應無遲髮型超敏反應。

14.AMES試驗：結果應為陰性。

15.小鼠淋巴瘤試驗：結果應為陰性。

16.染色體畸變試驗：結果應為陰性。

17.植入：皮下植入60天，顯微鏡下植入部位可見少量巨噬細胞和淋

巴細胞浸潤，可見膠原纖維和纖維細胞，未見異常反應。皮下植入120天，組織相容性良好，樣品全部被吸收。

18.降解：皮下植入120天，樣品應完全被降解吸收。

與現有技術相比，本發明具有以下顯著優點和效果：

1.綜合運用系統工程、再生醫學、仿生學和生物設計(Bio-Design)的原理和方法；

2.產品具有良好的抗張強度和力學性能，可使用圓形針進行無明顯損傷的縫合；在幹態下可裁剪成任意所需形狀，在使用之前易水化。比起其他硬腦膜材料，它有更好的撕裂強度和操縱特性，因此在手術操作過程中，能很好的適應溼法處理和鉗操縱過程；

3.在製備技術上，利用固定化酶純化技術與Triton-100清洗工藝和酸鹼法相結合的技術體系，製備清除抗原物質和去除熱原的硬腦膜基質材料—脫細胞豬皮膠原纖維；

4.在結構設計上，本項目所製備的膠原基硬腦膜，面向大腦皮層一面為具有優良生物相容性的聚乙二醇-丙三醇交聯共聚複合膠原液形成的膠原複合膠封閉膜，能有效防止黏粘效應，同時背向大腦皮層一面為脫細胞豬真皮或高孔隙度的膠原膜，具有發達的多孔網狀結構，使該產品迅速的血管化，與自身組織一體化，有效防止腦脊液的滲漏。

附圖說明

圖1所示的是膠原基硬腦膜的樣圖；

圖2所示的是本發明實施例2中的光學顯微鏡圖。

具體實施方式

以下結合實施例對本發明作進一步具體描述，但不局限於此。

實施例1：

(1)脫細胞豬真皮的製備：將生態豬皮剖層，採用消毒、表面清洗等技術去除原材料熱源；使用平平加、乙醇等試劑進行脫脂處理；採用複合酶脫細胞工藝和Triton-100清洗工藝相結合的方法，去除細胞成分；使用酸鹼結合法進一步對所得脫細胞豬真皮基質進行去除熱源處理；凍幹備用；

(2)聚乙二醇和丙三醇進行共聚交聯反應得到一種複合膠。採用水平流涎和水平噴塗等方法將其塗敷在脫細胞真皮基質上，控制壓力、噴塗距離、噴塗速率等工藝參數，使塗層均勻分布，通過室溫晾乾，恆溫乾燥固化，即可在脫細胞豬真皮表面形成一層均勻的封閉膜，得到可有效防止腦脊液滲漏的膠原基複合硬腦膜；

(3)配製洗脫液，將上述所得膠原基複合膜層，通過去離子水，去離子水與乙醇的互配物浸泡洗滌，以去除殘留物質，再經冷凍乾燥成型，即得可有效防止腦脊液滲漏的雙層複合結構之膠原基硬腦膜；

(4)將冷凍乾燥後的膠原基硬腦膜無菌封裝在醫用包裝袋內，低溫環氧乙烷滅菌。

實施例2：

1.對製備的材料進行物理性能檢測

(1)外觀：目力觀察和實際操作，膠原基硬腦膜為白色薄片狀，幹態具有一定硬度，溼態柔順、不易破裂。。

(2)尺寸：以通用量具測量，膠原基硬腦膜長度和寬度分別為25mm-100mm，厚度0.3～0.7mm。。

(3)吸收力：按YY/T0471.1-2004中3.2的方法進行試驗時，每克試樣的

液體吸收量大於3g。

4)縫合強度檢測：方法：用4-0的外科縫線縫合在腦膜補片一端邊緣內3毫米處，將縫線與硬腦膜補片的另一端固定在拉力儀上，用AI-7000S電子拉力機進行拉伸，直到縫合點被撕裂，記錄下縫合點被撕裂時的拉力。縫合強度大於或等於50.34N。

5)抗張強度檢測方法：方法：使用拉伸(壓縮)試驗機，將修補片裁剪成試樣，將試樣兩端固定在拉伸試驗機的夾頭上,向外拉伸直到試樣斷裂。抗張強度大於7Mpa。

2.化學性能檢測

1)灰分：方法：按照《中華人民共和國藥典》2010版灰分的檢測方法進行檢測，灰分含量小於2％。

2)重金屬：方法：按照《中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄VIII H第二法測定，重金屬含量小於10μg/g。

3)酸鹼度檢測：按照《中華人民共和國藥典》(2010年版)二部附錄VI H規定的方法進行測定，膠原基硬腦膜檢驗液與空白對照液的PH值之差不超過1.0。

3.生物學性能檢測

1)內毒素：按GB/T 14233.2規定方法進行檢測，內毒素含量小於10EU/g。

2)細胞毒性：按3g樣品加15ml浸提介質比例，37±1℃，24±2hr製備試驗液，浸提介質：MEM培養基。取實驗液按照GB/T 16886.5規定的試驗法進行，細胞毒性不大於1級。

4.組織學檢測

1)光學顯微鏡觀察：方法：石蠟包埋後的材料用蘇木精—伊紅染色，倒置相差顯微鏡觀察。結果：無細胞和細胞碎片殘留，膠原纖維連續無斷裂，如圖2所示。

本發明的上述實施例是對本發明的說明而不能用於限制本發明，與本發明的權利要求書相當的含義和範圍內的任何改變，都應認為是包括在權利要求書的範圍內。