分泌的aP2及其抑制方法與流程

2023-04-27 16:03:07 1

本申請為國際申請pct/us2010/026305進入中國國家階段的中國專利申請(申請號為201080019800.8，申請日為2010年3月5日，發明名稱為「分泌的ap2及其抑制方法」)的分案申請。

政府權益聲明

本發明是在政府的支持下完成的，國立衛生研究院授權號為dk064360何dk071507。政府具有本發明的某些權利。

背景技術：

代謝綜合症或者代謝疾病是一種術語，它定義為新陳代謝的危險因素的集合，這些危險因素集中到單一個體中並且誘致糖尿病和心血管疾病。代謝綜合症的主要特徵包括胰島素抗性，高血壓(高血壓症)，膽固醇異常，和增加的結塊風險。胰島素抑制性指的是細胞對胰島素促進葡萄糖從血運輸進肌肉及其他組織中的作用的響應能力的減少。帶有這種危險因素簇的患者幾乎經常是超重的或者肥胖的。

發明概述

本發明基於一種發現，即血清ap2調節全身性胰島素敏感性和葡萄糖代謝。因此,一種減少代謝疾病症狀的方法是通過給予患者一種組合物，這種組合物結合循環中的ap2並阻遏循環中的ap2(例如，血或血清ap2)，所述方法通過給予一種結合到並減少循環中ap2蛋白質的量的組合物，或通過給予一種由細胞分泌的ap2的抑制劑來進行。例如，葡萄糖不耐性要減少這種抑制劑接下來的給藥。典型的組合物包括抗體或它們的特定的抗原片段，結合到ap2的那些小分子，以及那些通過一種脂肪細胞或巨噬細胞抑制ap2的分泌的組合物。

阻止或減少代謝疾病的嚴重程度的一種方法涉及給予患者一種減少血清ap2濃度的組合物。在某些實施方案中，本方法包含鑑別與正常的、健康的、相應的年齡、相應的性別對照的患者(或患者庫)相比較患者有血清ap2水平升高的特徵的患者。例如，一種對照患者是瘦的並且特徵為血清ap2水平20μg/l，一種需要介入治療的患者的特點在於ap2的水平是升高的。待治療的患者是超重的，肥胖的，和/或包含血清ap2水平大於20μg/l(例如，血清中25，28，30，32，35,40或更多μg/lap2)。患者是隨意地確定具有正常重量(bmi18.5-24.9)，超重的(bmi25-29.9)，或肥胖的(bmi30或更大)。

在此描述的每一個治療的方法中，與治療前血清ap2濃度相比血清ap2濃度減少了至少10％，25％，50％，75％，2倍，5倍，10倍或更多。在一個實例中，減少血清ap2濃度的組合物是一種ap2特異性抗體。該抗體是一種純化了的單克隆的或多克隆的抗體。例如，結合到抗體可達到的ap2的抗原表位的那些抗體，例如，圖⒊中那些加亮部分。這種抗體結合到如結晶的模型(圖3)所示的溶液(例如，血和血清中)中蛋白質的三維結構露出的表面上的ap2的抗原表位。一種不連續的抗原表位，它的胺基酸處於大約接近蛋白質的三維結構(摺疊的)，但是當展開時距離遠的位置。優選地，本抗體是一種單克隆抗體，它的結合專一性包含一種結構的抗原表位，這種抗原表位當存在於一種身體的流質例如血，血清，或血漿中的ap2分子上表面容易接近。例如，該抗原表位包含至少一種人類ap2蛋白質的下列部分的一種：seqidno：4的殘基1-5,殘基22，殘基36-37，殘基46-47，殘基57，殘基59-60，殘基78，殘基80，殘基89，殘基97-101，殘基110-112，殘基122。當它們暴露於溶液中的ap2蛋白質表面上時該抗體隨意地結合兩個或更多抗原表位(殘基或殘基串)。在某些例子中，該抗體沒有結合到變性的ap2或沒有結合到ap2的線型的抗原表位。

本發明不但包含一種完整的單克隆抗體和它們的用法，而且包含一種有效的免疫抗體片段，例如，fab或(fab)2片段；一種設計的單鏈fv分子；或者一種嵌合的分子，例如，一種抗體，它包含一種抗體的結合專一性例如，鼠的起端，和另一個抗體殘存的部分，例如，人類起端的。

同樣包括在本發明中的是一種鑑別ap2分泌的抑制劑的方法。為了鑑別這種化合物一種分泌的ap2細胞例如脂肪細胞或巨噬細胞與待選擇的化合物接觸並且檢測細胞外的ap2水平。與該化合物不存在時相比在該化合物存在下細胞外ap2的減少表明該化合物抑制ap2的分泌。例如，細胞外的ap2的水平減少至少10％，25％，50％，75％，2倍，5倍，10倍或更多。

ap2分泌的抑制劑的篩選在不同的脂肪細胞中進行，它在體外和體內大量地表達ap2以及在它們響應激素及其他生物刺激中大約接近脂肪組織。例如，兩個步驟用於進行高通量篩選。首先，使用腺病毒調節基因傳遞在脂肪細胞中表達一種gfp標記的ap2。抑制劑用於在96孔板中細胞的種子並且通過測量狀況良好的培養基的螢光強度來測定ap2的分泌。第二，帶有標記的ap2的互補dna和ha雙重的標記在脂肪細胞中表達。抑制劑治療後ap2的分泌是通過使用一種酶聯免疫吸附系統來檢測的。標記用來俘獲板上的ap2並且共軛hrp的ha抗體將用於檢測ap2。

本方法和組合物能夠有效的治療或者減少那些以不正常升高的分泌的ap2水平為特徵的臨床疾病的嚴重程度，所述不正常升高的分泌的ap2水平例如，血或者血清中升高的ap2水平。這種情形包括代謝綜合症，葡萄糖不耐性，肥胖，糖尿病，脂肪肝疾病，動脈粥樣硬化，和哮喘(ap2在該病狀的發生中起到直接作用的情況)。增加的血清ap2也與慢性的血液透析作用(圓二色性)，引起阻塞的睡眠呼吸暫停(一種與肥胖有關係的病症)，感染愛滋病病毒的病人中脂肪代謝障礙，和脂肪分解有關，使用在此描述的方法和組合物治療或者減少這些情形。本方法也對治療或者減少病理狀態例如高血壓，中風，和神經變性的疾病有用處，在這些疾病中ap2是間接地涉及。

抑制劑用來治療人類及其他動物,例如，貓、狗的糖尿病。例如，給予那些已經診斷有或者發展為ii型糖尿病風險的患者本抑制劑。

這裡引用的所有出版物、美國專利和申請、基因庫(genbank)/ncbi序列號以及其他所有的參考文獻通過引證在此全部併入本文。

僅出於舉例的目的，本發明包括但不限於如下技術方案：

技術方案1：一種治療或者減少ap2調節的疾病嚴重程度的方法，包含給予患者一種分泌的ap2抑制劑或者一種ap2分泌的抑制劑。

技術方案2：根據技術方案1所述的方法，在這裡所說的患者確定為是包含循環的ap2水平升高。

技術方案3：根據技術方案1所述的方法，在這裡所說的疾病選自由代謝綜合症，肥胖，糖尿病，脂肪肝疾病，葡萄糖不耐性，動脈粥樣硬化，哮喘，高血壓，中風，神經變性的疾病，慢性的血液透析作用(cd)，引起阻塞的睡眠呼吸暫停，感染愛滋病病毒病人中脂肪代謝障礙，和脂解組成的組中。

技術方案4：根據技術方案1所述的方法，其中，分泌的ap2抑制劑包含一種可溶解的ap2封堵劑。

技術方案5：根據技術方案4所述的方法，其中，封堵劑是一種ap2特異性抗體或者它們的ap2結合片段。

技術方案6：一種預防或者減少代謝疾病的嚴重程度的方法，包含給予患者一種減少血清ap2濃度的組合物。

技術方案7：根據技術方案6所述的方法，其中，所述血清ap2濃度減少了至少10％。

技術方案8：根據技術方案6所述的方法，其中，所述組合物是一種ap2特異性抗體。

技術方案9：根據技術方案6所述的方法，其中，所述的組合物是一種結合到ap2的不連續的抗原表位的抗體。

技術方案10：根據技術方案9所述的方法，其中，所述的抗原表位是溶液中ap2的三維的結構上露出來的表面。

技術方案11：根據技術方案9所述的方法，包含至少一種以下序列：seqidno：4的殘基1-5,殘基22，殘基36-37，殘基46-47，殘基57，殘基59-60，殘基78，殘基80，殘基89，殘基97-101，殘基110-112，殘基122。

技術方案12：一種減少代謝疾病症狀的方法，包含給予患者一種細胞分泌的ap2的抑制劑。

技術方案13：根據技術方案12所述的方法，在這裡所說的症狀是葡萄糖不耐性。

技術方案14：根據技術方案12所述的方法，在這裡所說的細胞是一種脂肪細胞。

技術方案15：一種治療糖尿病的方法，包含給予診斷為有或者擴大的ii型糖尿病風險的患者一種ap2分泌的抑制劑。

技術方案16：一種鑑別ap2分泌的抑制劑的方法，包含分泌的ap2細胞與待選擇的化合物接觸並且檢測細胞外的ap2水平，其中，存在所述化合物時的細胞外的ap2與不存在所述化合物時相比減少表明所述的化合物抑制ap2分泌。

技術方案17：根據技術方案16所述的方法，其中，所說的細胞是一種脂肪細胞或者一種巨噬細胞。

圖表的簡要說明

圖1a是一種電泳的凝膠圖片，它顯示了脂肪細胞中ap2的分泌。使用抗ap2，mal1，caveolin或者akt抗體吸掉來自不同的wt或者fabp缺乏的(dk)脂肪細胞的全部細胞裂解物(wcl)和條件培養基(cm)。

圖1b是柱狀圖表，它顯示了wt，ap2-/-(ap2ko),mal1-/-(mal1ko)和ap2-mal1-/-(dko)老鼠的血清ap2濃度。用如實驗過程描述的ap2酶聯免疫吸附方法測定ap2水平。

圖1c是一種柱狀圖表，它顯示了老鼠(ob)中瘦的(wt正常的食譜，rd)，飲食多脂(wt高脂肪食譜)或者致輕素缺乏的的遺傳的肥胖中血清ap2濃度。

圖1d是一種柱狀圖表，它顯示了那些進行骨髓移植的老鼠中血清ap2濃度。骨髓移植在wt和fabp缺乏的(dko)老鼠之間進行並且使用ap2酶聯免疫吸附測定血清ap2。來自帶有對照或者ap2質粒轉染的巨噬細胞的條件培養基的插入物，ap2吸取。

圖2a是一種電泳的凝膠圖片，它顯示了使用一種ap2特異性抗體的蛋白質印跡的結果。使用對照兔免疫免疫球蛋白g，預免疫血清或者ap2抗體吸取從wt或者fabp缺乏的脂肪細胞一種細胞裂解物。

圖2b是一種柱狀圖表，它顯示了ap2抗體給藥前後老鼠中血清ap2濃度。那些維持高脂肪食譜並且用對照和ap2抗體注射兩個星期的老鼠中血清ap2用酶聯免疫吸附ap2的方法分析。

圖2c是一種柱狀圖表，它顯示了減少的血清ap2的老鼠中葡萄糖水平。給維持高脂肪食譜的wt老鼠注射對照免疫免疫球蛋白g或者ap2抗體兩個星期並且測定注射前後的身體重量。

圖2d是一種線形圖，它顯示了給葡糖耐量試驗的老鼠注射對照或者ap2抗體兩個星期的結果。

圖2e是一種線形圖，它顯示了給胰島素耐量試驗注射對照或者重組ap2兩個星期的結果。

圖2f是一種柱狀圖表，它顯示了在高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究過程中注射了對照或者ap2抗體的老鼠中基本的鉗夾肝葡萄糖生產率(chgp)。

圖2g是一種柱狀圖表，它顯示了在高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究過程中注射了對照或者ap2抗體的老鼠中基本的基本的肝葡萄糖生產率(bhgp)。

圖2h是一種線形圖，它顯示了在高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究過程中那些灌輸了對照蛋白質或者重組ap2的fabp缺乏的老鼠中基本的肝的葡萄糖生產率(bhgp)。

圖3是使用軟體工具discotope基於ap2晶體結構的不連續的抗原表位的簡圖。目標抗原表位在結構上加亮，並且那些組成這些抗原表位的殘基通過如下表顯示的胺基酸序列中的方框殘基標明並且在seqidno：4(表3，如下)中強調。

圖4a是一種電泳的凝膠圖片，它顯示了脂聯素抗體細胞中的ap2分泌。使用抗ap2，caveolin，akt或者脂聯素抗體吸掉來自不同的wt或者ap2-mal1-/-(dko)脂肪細胞的全部細胞裂解物(wcl)和條件培養基(cm)。

圖4b是一種電泳的凝膠圖片，它顯示了人胚腎293細胞中ap2的分泌。使用抗性標記的抗體吸取來自帶有akt標記，gfp-ap2標記或者gfp標記的質粒轉染的人胚腎293細胞的全部細胞裂解物(wcl)或者免疫析出的條件培養基(cm)。

圖4c是一種電泳的凝膠圖片，它顯示了因為培養基變化在標明的時間點從wt或者ap2-/-脂肪細胞中收集條件培養基。該培養基用帶有sds-page分辨並且用考馬斯亮藍染色檢查所有的存在於本培養基中的大量的蛋白質。

圖4d是一種柱狀圖表，它顯示了用酶聯免疫吸附ap2方法檢測的ap2水平。

圖4e是一種柱狀圖表，它顯示了瘦(wt正常的食譜，rd)，飲食多脂(wt高脂肪飲食，hfd)或者致輕素缺乏的遺傳的多脂(ob/ob)的老鼠中血清ap2。*,p<0.05。

圖4f是一種柱狀圖表，它顯示了那些進行骨髓移植的老鼠中血清ap2。骨髓移植在wt和ap2-mal1-/-(dko)老鼠之間進行並且使用ap2酶聯免疫吸附測定血清ap2。

圖5a是一種柱狀圖表，它顯示了無限制的餵養(0)，晝夜的禁食(24)或者晝夜的禁食後四小時重複餵養(28)。*,p<0.05。

圖5b是一種電泳的凝膠圖片，它顯示了用imbx/dbcamp(i/c)和胰島素(ins)處理的脂肪細胞的條件培養基(cm)或者全部細胞裂解物(wcl)中的ap2。

圖5c是一種電泳的凝膠圖片，它顯示了用佛司可林(fsk)或者ibmx處理的脂肪外植體的條件培養基(cm)或者全部細胞裂解物(wcl)中的ap2。

圖5d是一種柱狀圖表，它顯示了同它們的最初的ap2水平相比用鹽水(對照)或者異丙基腎上腺素注射來誘導脂肪分解的老鼠的血清ap2水平。

圖5e是一種電泳的凝膠圖片，它顯示了用棕櫚酸(c16)或者硬脂酸鹽(c18)處理的脂肪外植體的條件培養基(cm)或者全部細胞裂解物(wcl)中的ap2。

圖5f一種顯微照片，它顯示了前成脂肪細胞表達的gfp-ap2在正常的培養基(對照)或者包含0.5mm棕櫚酸的培養基中培養整夜。

圖5g一種電泳的凝膠圖片，它顯示了用ibmx/dbcamp(i/c)或者deup處理的脂肪外植體的條件培養基(cm)或者全部細胞裂解物(wcl)中的ap2。

圖5h是一種柱狀圖表，它顯示了灌輸鹽水(對照)或者內脂/肝素(脂質)五小時的老鼠中血清ap2。這些圖表證實ap2分泌是通過脂肪分解釋放的脂肪酸來活化的。

圖6a是一種柱狀圖表，它顯示了注射ap2抗體前後老鼠中中血清ap2。頂部面板，那些維持高脂肪食譜並且被注射預免疫的(對照)或者ap2抗體兩個星期的老鼠中血清ap2。血清ap2水平用酶聯免疫吸附ap2方法測定。*,p<0.05。底部面板，使用抗ap2抗體免疫印跡從那些維持高脂肪食譜並且被注射預免疫的(對照)或者ap2抗體兩個星期的老鼠的脂肪組織中萃取的總蛋白。

圖6b是一種柱狀圖表，它顯示了帶有減少的血清ap2的肥胖的老鼠中葡萄糖水平。維持高脂肪食譜的wt老鼠被注射預免疫的(對照)或者ap2抗體兩個星期然後食物戒除6小時後測定葡萄糖水平。*,p<0.05。

圖6c是一種線形圖，它顯示了那些注射了預免疫的(對照)或者ap2抗體兩個星期的維持高脂肪食譜的老鼠的葡糖耐量試驗。*,p<0.05。

圖6d是一種線形圖，它顯示了那些注射了預免疫的(對照)或者ap2抗體三個星期的維持高脂肪食譜的老鼠的胰島素耐量試驗。*,p<0.05。

圖6e是一種柱狀圖表，它顯示了在高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究過程中注射了預免疫的(對照)或者ap2抗體的維持高脂肪食譜的老鼠中基本的肝葡萄糖生產率(bhgp)。*,p<0.05。

圖6f是一種柱狀圖表,它顯示了在高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究過程中注射了預免疫的(對照)或者ap2抗體的維持高脂肪食譜的老鼠中基本的鉗夾肝葡萄糖生產率(chgp)。*,p<0.05。

圖6g是一種柱狀圖表,它顯示了在高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究過程中注射了預免疫的(對照)或者ap2抗體的維持高脂肪食譜的老鼠中葡萄糖液輸注速率(gir)。*,p<0.05。

圖6h是一種柱狀圖表,它顯示了在高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究過程中注射了預免疫的(對照)或者ap2抗體的維持高脂肪食譜的老鼠中全身葡萄糖代謝(rd)。

圖6i是一種線形圖，它顯示了正常的食譜基礎上注射對照gus蛋白質或者重組ap2兩個星期的老鼠的葡糖耐量試驗。*,p<0.05。

圖6j是一種柱狀圖表，它顯示了在高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究過程中那些灌輸了對照gus蛋白質或者重組ap2的ap2-mal1-/-老鼠的基本的肝的葡萄糖生產率(bhgp)。*,p<0.05。

圖6k是一種柱狀圖表，它顯示了灌輸了對照蛋白質或者重組ap2(頂部面板)wt老鼠或者注射了對照或者ap2抗體(底部面板)的hfd上老鼠的肝中基因表達。肝組織中pepck和葡糖-6-磷酸用定量的實時pcr測定。*,p<0.05。這些圖標證實了通過血清ap2全身性葡萄糖體內平衡的調節。

圖7a是一種電泳凝膠的圖片，它顯示了ap2非經典的分泌。使用抗ap2或者脂聯素抗體印跡來自用對照，布雷菲德菌素a(brefa)或者莫能菌素(mon)處理的脂肪細胞的條件培養基。使用抗ap2抗體也印跡全部細胞裂解物(wcl)。

圖7b是一種電泳凝膠的圖片，它顯示了ap2至外來體的定位。使用抗ap2或者mfg-e8抗體印跡來自不同的脂肪細胞的全部細胞裂解物(wcl)，條件培養基(cm)和外來體部份(exo)。

圖7c是一系列簡圖，它顯示了wt和突變的ap2的結構和表面電荷。頂部面板：wt和兩個ap2突變株的三維結構，底部面板：wt和兩個ap2突變株的靜電位。這些透視圖是用pymol製作的(http://pymol.sourceforge.net/)並且wtap2基於過去描述的三維結構(pdbid:1lie)。

圖7d是一種電泳凝膠的圖片，它顯示了使用抗性標記抗體印跡wt或者變異的ap2轉染的來自人胚腎293細胞的全部細胞裂解物(wcl)，外來體部份和免疫沉澱的條件培養基。

圖7e是一種使用抗ap2或者mfg-e8抗體印跡蛋白質印跡外來體的圖片，這些外來體從來自對照脂肪細胞或者佛司可林,ibmx,或者棕櫚酸鹽處理的脂肪細胞中分離得到。

圖7f是一種使用抗ap2或者mfg-e8抗體印跡蛋白質印跡外來體的圖片，這些外來體從來自ap2-/-的wt老鼠或者維持高脂肪食譜的wt老鼠的血中分離得到。

圖7g是一種簡圖，它顯示了ap2分泌的機制。通過禁食或者β-腎上腺素功能藥物刺激的脂解作用的活化，ap2改變位置到脂滴的表面，在那它可以結合到脂解作用釋放的脂肪酸。脂肪酸結合觸發信號，該信號把ap2靶向到外來體，在外來體上它釋放進細胞間隙和血流中。然後ap2傳播到肝臟然後調節葡糖異生作用。這些圖表證實了依賴外來體的ap2的分泌。

圖8.是一種免疫印跡，它顯示了來自wt和ob/ob老鼠的脂肪外植體的ap2分泌。瘦和肥胖的老鼠的脂肪外植體中ap2分泌。從維持正常的食譜的wt老鼠或者ob/ob老鼠收集脂肪外植體然後徹底地洗滌。加入新鮮的培養基然後培養過夜，然後收集用於使用抗ap2或者脂聯素抗體的免疫印跡分析。

圖9是一系列免疫印跡，它顯示了ap2抗體的專一性。用sds-page分辨來自wt或者ap2-/-脂肪細胞的細胞裂解物然後使用純化的預免疫的免疫免疫球蛋白g或者抗ap2免疫免疫球蛋白g免疫印跡。

圖10a和b是柱狀圖表，它顯示了ap2抗體處理的老鼠的體重和血清游離脂肪酸。在抗體給藥的0和14天記錄用預免疫的(對照)或者ap2抗體處理的老鼠的體重。血清游離脂肪酸使用一種商品化的試劑盒(wako化學試劑，美國，有限公司)來檢測。

圖11是一種柱狀圖表，它顯示了注射重組ap2後wt老鼠中血清ap2。在注射ap2後指明的時點收集老鼠的血清樣品然後用ap2酶聯免疫吸附測定ap2水平。

圖12a-b是柱狀圖表，它顯示了注射重組ap2的老鼠的體重和血清游離脂肪酸。用對照或者重組ap2蛋白質注射的老鼠的體重在蛋白質給藥的0和14天記錄。

a收集注射了對照或者重組ap2蛋白質的老鼠的血清，蛋白質給藥的0和14天記錄。使用一種商品化的試劑盒(wako化學試劑，美國，有限公司)測定血清游離脂肪酸。

圖13是一種線形圖，它顯示了在ap2輸注過程中fabp缺乏的(dko)老鼠中血清ap2。在指明的時間點輸注ap2的過程中從fabp缺乏的老鼠收集血清樣品。用ap2酶聯免疫吸附方法測定ap2水平。

具體實施方式

ap2作為脂肪細胞脂肪酸結合蛋白(afabp),脂肪酸結合蛋白-4(fabp-4)和脂肪細胞脂質結合蛋白(albp)也為人所熟知。在本發明之前，ap2被認為是一種細胞溶質蛋白質。分泌的脂肪的脂質伴侶，ap2，現在發現能調節肝的葡萄糖新陳代謝。ap2被發現是一種老鼠及其他哺乳動物例如人的細胞中分泌的似脂肪的蛋白質。

血清ap2調節全身性葡萄糖代謝。一種減少一種以異常升高的ap2循環為特徵的臨床病症的症狀的方法通過給患者一種通過細胞分泌的ap2的抑制劑或者給一種ap2阻抑劑來進行。例如，按照這種抑制劑或者藥劑給藥葡萄糖不耐性會減少。組合物抑制通過一種脂肪細胞或者巨噬細胞分泌的ap2。做為選擇，典型的組合物例如結合到循環的ap2的抗體，由此減少了血或者血清中ap2的水平或者活性。鼠和人ap2的核酸和胺基酸序列的描述見下面。

表1：鼠ap2互補dna

表2:人ap2互補dna

表3：人ap2的胺基酸序列

mcdafvgtwklvssenfddymkevgvgfatrkvagmakpnmiisvngdvitiksestfknteisfilgqefdevtaddrkvkstitldggvlvhvqkwdgksttikrkreddklvvecvmkgvtstrvyera(seqidno:4)

表4：鼠ap2的胺基酸序列

mcdafvgtwklvssenfddymkevgvgfatrkvagmakpnmiisvngdlvtirsestfknteisfklgvefdeitaddrkvksiitldggalvqvqkwdgksttikrkrdgdklvvecvmkgvtstrvyera(seqidno:5)

ap2分泌的調節

為了證實ap2被釋放進入細胞表面，由於存在的ap2在蛋白質印跡中分析來自wt或者fabp缺乏的脂肪細胞的條件培養基和細胞裂解物(圖1a)。發現ap2大量地存在於條件培養基中同時兩個脂肪細胞，caveolin和akt中細胞溶液蛋白質在相同情況下是不可檢測的的(圖1a)。mal1，脂肪細胞中fabp的一種次要的同工型，它們與ap2有高度的同源性，也被釋放進入條件培養基(圖1a)。總起來說，兩個脂肪的fabp是從不同的脂肪細胞分泌的。

為了探查老鼠中血清ap2然後用ap2酶聯免疫吸附系統進行研究。ap2以可觀的數量(200至300ng/ml)存在於wt和mal1-/-老鼠中，但是從ap2-/-或者ap2-mal1-/-老鼠的血清中是不可檢測的得的(圖1b)。血清ap2的量比肥胖因子，瘦素(10ng/ml)多20倍並且比肥胖因子，脂聯素(2-5mg/ml)稍低。為了探究有關代謝疾病背景中長期的血清ap2調節，將那些通過高脂肪食譜餵養或者瘦素缺乏來誘導的瘦的和肥胖的老鼠的血清作比較(圖1c)。兩個肥胖模型(圖1c)血清ap2都深深地增加，表明那些分泌的ap2可能是功能性的和在病理學的條件下改變代謝調節有關係的。在兩個脂肪細胞和巨噬細胞中都表達ap2並且從發展的代謝疾病的任何一個位點保護的老鼠中ap2的功能突變損失(furuhashi等，2008，jclininvest.118:2640-50；maedaetal.,2005,cellmetab1,107-119.)

也發現ap2通過巨噬細胞分泌(圖1d插入物)。肥胖的老鼠在脂肪組織中積聚巨噬細胞，它捐獻了胰島素抗性。所以，增加的血清ap2是從任何一個細胞表型解除增加的ap2的結果。為了測定哪個位點引起肥胖的血清ap2增加，將骨髓移植到wt和fabp缺乏的老鼠之間。這些老鼠中血清ap2被檢驗。在fabp缺乏的的老鼠中從wt老鼠中衍生的骨髓細胞不能持續有可檢測的血清ap2水平(圖1d)，表明代替造血細胞的那些脂肪細胞，是老鼠中血清ap2的主要貢獻者。

血清ap2調節全身性的葡萄糖代謝

脂肪細胞分泌的激素(也就是，肥胖因子)在葡萄糖和脂類代謝中起作用(rosenetal.,2006,nature444:847-853)。因為在肥胖和糖尿病情況下ap2是增加的，如果增加的ap2在如肥胖中所示的改變葡萄糖代謝中起作用，進行實驗來測定肥胖中血清ap2是否減少將改善甘油對照。為了有效地耗盡血清ap2，開發了一種特定的識別ap2的抗體。使用該抗體的研究證實它以非常高的靈敏性精確地檢測ap2(圖2a)。將這些抗體注入到肥胖的老鼠中。通過高脂肪餵養16星期促使這些老鼠肥胖。ap2抗體有效地的給藥並且迅速地壓制血清ap2濃度(圖2b)。該ap2抗體治療沒有改變這些老鼠的體重但是在給藥兩周後引起了一種顯著減少的血糖水平(圖2c)。用ap2抗體注射的老鼠也有顯著地改善的葡萄糖消除速率和改善的胰島素應答，葡萄糖消除速率和胰島素應答通過葡萄糖和胰島素耐量試驗(圖2d和2e)測定。事實上，ap2抗體治療實質上消除了與這些老鼠中肥胖的飲食有關的葡萄糖不耐性，表明減少的血清ap2給予了一種對於那些遭受ii型糖尿病的臨床的益處。

為了測定ap2體內作用的位點，進行了高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究。發現接受ap2抗體注射的老鼠有減少的肝的葡萄糖生產率(圖2g)，表明肝是ap2抗體的葡萄糖下降效果的一個主要的目標。

測定增加的血清ap2的代謝輸出的相應的實驗中，純化的重組ap2被生產出來並注射到有意識的fabp缺乏的老鼠中。然後進行高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究來監測這些老鼠全身的葡萄糖代謝。輸入ap2的fabp-/-老鼠有顯著地增加的基本的肝葡萄糖生產速率(bhgp)(圖2g)。考慮這些老鼠已經在bhgp檢測到後灌輸ap2僅僅4小時這是一個深刻的效果。

為了進一步地研究增加的血清ap2的效果，腹膜注射重組ap2到wt老鼠維持正常的食物食譜。ap2給藥沒有改變該老鼠的體重但另外的瘦的和健康的老鼠，如接受ap2注射兩個星期後通過葡糖耐量試驗測定所示，發展成葡萄糖不耐性(圖2h)。這些觀測表明血清ap2調節全身性葡萄糖代謝並且在一個短周期中單獨增加的血清ap2可以引起不依賴體重變化和飲食的影響的削弱的葡萄糖消除。

脂肪組織和代謝紊亂

最近15年積累的證據已經建立脂肪組織作為擔負代謝調節的最大的內分泌器官的一種。脂肪組織在全身性能量體內平衡的效果通過各種各樣的激素來調節。肥胖的患者中脂肪組織也有表現為生產一個生長的炎性細胞因子表，並且慢性的脂肪發炎作為一種與肥胖連接的和有關的代謝紊亂的重要的特徵。因此，在生理學的和病理的環境中，脂肪組織代表了一個關鍵位點，在該位點營養的和內生的信號分子相互作用和結合，最終產生能量體內平衡的全身性調節。作為身體的主要的脂質存儲位置，在禁食期間脂肪組織也是關鍵的能源供應者。脂肪的脂解作用貢獻了大部分對於血清的脂肪酸，它在肌肉中被認購併氧化以及在肝中激活葡萄糖生產。升高的肝葡萄糖生產率相關的脂解作用是為大家所熟知的肥胖中失調的一個關鍵的自我平衡的現象。在本發明之前，該機制沒有完全弄明白，通過這個機制這個過程在脂肪組織和肝之間發出信號。

較早的研究表明脂肪組織脂質侶伴蛋白，和特別地ap2中，是帶有代謝和發炎的應答的脂質信號的重要的結合體。這些侶伴蛋白中老鼠缺乏的，通常所說的脂肪酸結合蛋白(fabp)，顯示出與肥胖有關許多的代謝異常的標記保護措施，這些代謝異常包括胰島素抗性，2型糖尿病，肝細胞脂肪變，和動脈粥樣硬化。脂肪組織中fabp缺乏的效果是全身性，如通過代謝途徑中全局變換和肝，肌肉及其他組織的應答作為證據。

可以調節fabp缺乏的脂肪組織的有益的效果的分泌脂肪分子研究中，一個脂肪酸，c16:1n7-棕櫚酸被發現。這個脂肪酸有力地增加了肌肉胰島素作用，同時壓制肝的脂肪浸潤。另一方面，fabp缺乏中肽類激素的角色是較少清楚的。無效的fabp老鼠有改變的瘦素和脂聯素的水平，但是詳細研究證實兩者都不引起fabp缺乏的老鼠改善的葡萄糖和脂類代謝。

ap2本身已經在人類血清中鑑別，這提高了血清ap2可能涉及肥胖中代謝調節的可能性。如果這個分子以一種調節的方式從脂肪細胞中分泌，fabp缺乏的老鼠中改善的葡萄糖代謝作為血清ap2損失的結果可以至少部分地存在。

下列材料和方法用於產生在此描述的數據。

動物

ap2和mal1中帶有同型接合的無效的突變的老鼠逆代雜交超過12世代到c57bl/6j遺傳背景。老鼠在四周齡維持正常的食物食譜(rd)或者置於高脂肪食譜(研究食譜,有限公司)20星期以誘導飲食的肥胖。從傑克遜實驗室購買瘦素缺乏的(ob/ob)老鼠。所有的老鼠維持12小時光照和黑夜的循環。使用標準方法進行葡萄糖和胰島素耐量試驗。

血清ap2的定量

戒除食物6小時後通過尾部放血從老鼠收集血然後在離心分離機中13000rpm離心30分鐘。血清ap2用elisa系統(biovendor公司)檢測。為了監測血清ap2營養的調節，在老鼠沒有食物置於籠中後黑暗循環開始之前立即從老鼠中收集血樣。晝夜的禁食後，收集第二套血樣然後提供食物。最後的採血在恢復餵養後4小時進行。在脂解作用的期間測定ap2水平在基本的水平下從12隻老鼠收集血。此後給6隻老鼠注射異丙基腎上腺素(10mg/kg體重)然後另外6隻接受輸入對照。注射後15分鐘收集血樣用於ap2測定。

骨髓移植

用為了最小化輻射毒性通過四小時間隔分開銫輻射源的兩個5gy劑量(總的10gy)照射六周齡接受的老鼠。通過用gibcorpmi1640培養基(invitrogen,卡爾斯巴德，加拿大)衝洗股骨和脛骨從六個相應的供體老鼠(6-8周齡)收集骨髓。第二次照射後的四小時，0.2毫升培養基中5x106骨髓細胞注射到眼眶後的靜脈叢中。一星期之前開始然後骨髓移植後四星期，加入100mg/l新黴素和10mg/l硫酸多粘菌素b到酸化的水中。

生產，純化以及重組ap2和ap2抗體的給藥

重組ap2或帶有6xhis標籤的對照的gus蛋白在e.coli中生產並用b-per6x旋轉純化試劑盒(pierce技術有限公司)純化。通過使用商業系統(lonza有限公司)除去內毒素進一步純化蛋白。將100μg的對照或者ap2蛋白注射到wt鼠中，這些老鼠在兩星期中維持每天兩次餵食。使用重組的全長的ap2蛋白生產抗鼠ap2的兔多克隆抗體並使用nabtm旋轉系統(pierce技術有限公司)從最後的血的血清中純化得到抗體。採用同樣的方法純化預免疫的血清並用作對照。純化後的抗體在鹽水中稀釋到1μg/μl並注射到鼠中，這些老鼠維持劑量在50mg/kg的高脂肪食物(研究食物有限公司)

載體構建和轉染

標籤標記的gfp(質粒編號10825)和akt(質粒編號9021)從addgene獲得。標籤標記全長和較少部分的ap2從pegfp-c1中克隆得到。ap2k22，59i變株用快速誘變系統(stratagene)製得。使用lipofectamine2000(invitrogen公司)用需要的載體轉染hek293細胞。

細胞培養

人胚腎293細胞在帶有10％胎牛血清的dmem中培養。fabp缺乏的細胞系按照過去描述的方法建立。cao,h.etal.identificationofalipokine,alipidhormonelinkingadiposetissuetosystemicmetabolism.cell134,933-944(2008).makowski,l.etal.lackofmacrophagefatty-acid-bindingproteinap2protectsmicedeficientinapolipoproteineagainstatherosclerosis.natmed7,699-705(2001).。預脂肪細胞在帶有10％牛的小牛血清中培養然後使用標準分化方案在帶有10％加強型胎牛血清的dmem中分化成脂肪細胞。為了誘導脂解作用，不同的脂肪細胞用20nm佛司可林，或者1mmibmx/1mm雙丁醯camp處理1個小時。對於脂質治療，0.25mm棕櫚酸鹽或者硬脂酸鹽溶於帶有10％ccs的dmem中然後加入到12孔板的脂肪細胞中培養。在一個小時結束時，該培養基被替換為相同包含脂質的培養基，然後再一個小時以後收集條件培養基。為了收集脂肪外植體，從老鼠解剖到附睪的脂肪組織貯藏庫然後在pbs中漂洗兩次。然後將脂肪組織樣品轉移到帶有10％ccs的dmem中並粉碎到平均直徑1到2毫米大小。用dmem廣泛地洗滌組織外植體然後在包含10％ccs的dmem中培養。如脂肪細胞相同的方式誘導脂解作用。

螢光顯微鏡方法

細胞在蓋片的6孔板中培養並在4％多聚甲醛中固定。細胞核用dapi染色，用蓋玻片蓋上帶有延長黃金抗螢光淬滅封片試劑的載玻片(invitrogen公司)。在蔡司觀測器z1螢光顯微鏡進行拍照。

外來體的分離

為了從脂肪細胞分離外來體，收集條件培養基然後在1,200g離心10分鐘。然後用0.45μm過濾器過濾培養基，在20％蔗糖梯度負載上10,000g離心30分鐘兩次。通過在100,000g下150分鐘離心作用將外來體部份壓成丸。為了從血清分離外來體，收集老鼠的血然後在微型離心機中以最高速度離心30分鐘來收集血漿。以等體積的pbs稀釋血漿然後負載20％蔗糖梯度並且通過200,000g下90分鐘的離心作用將外來體壓成丸。

rna提取和實時定量pcr分析

使用trizol試劑(invitrogen)從肝組織分離總的rna。用帶有一個上標的前導串互補dna合成系統(應用生物系統公司)進行反轉錄。在一個pcr熱循環控制裝置(應用生物系統公司)上使用1μg的rna.進行定量的，實時rt-pcr。該pcr程序是：95℃酶活化2分30秒，95℃15秒，58℃30秒，和72℃1分這樣的40次循環用於擴增。進行解鏈曲線分析來證實實時pcr產物。所有的定量歸一化到18srrna。使用的引物序列如下：pepck，前端：ctgcataacggtctggacttc(seqidno：6)，反向：cagcaactgcccgtactcc(seqidno：7)；葡糖-6-磷酸，前端：cgactcgctatctccaagtga(seqidno:8)，反向：gttgaaccagtctccgacca(seqidno：9)。

卡馬斯亮藍染色，免疫沉澱和免疫印跡

來自脂肪細胞的組織蛋白裂解物和條件培養基在sds-page上分離然後用考馬斯亮藍染色(biorad實驗室)，或者使用以下抗體免疫印跡來檢測，這些抗體包括：來自santacruz生物技術的脂聯素，來自calbiochem的mfg-e8，來自bd生物科學的caveolin-1，來自細胞信號技術的akt。用30微升標記瓊脂糖珠(sigma)4℃過夜培養後使用從轉染的人胚腎293細胞的4毫升條件培養基免疫沉澱標記標記的ap2。結合到瓊脂糖珠的蛋白質用帶有sds上樣緩衝液洗脫然後用sds-page分辨開。

脂肪乳劑和ap2輸注

實驗前四天，向腹膜內注射開他敏(90毫克/公斤體重)和甲苯噻嗪(10毫克/公斤體重)使老鼠麻醉。用pe-10聚乙烯管(內外直徑分別為，0.28毫米和0.61毫米；bectondickinson，富蘭克林湖，nj)在他們的右側頸靜脈插入導管，管中充滿肝素溶液(100uspu/ml)。導管的頂端深入皮下，具體的在肩胛間的區域，然後打結對於固定。在實驗之前整夜緊縛該老鼠然後按3ml/kg/h(abbott)輸注脂肪乳劑和肝素(6u/h)五小時。以8μg/kg/min的速度輸注重組ap2五小時。

高胰島素-正葡萄糖鉗夾研究

如上所述給老鼠插上導管。通過步驟15報告的一個改良法進行高胰島素-正葡萄糖鉗夾。在一整夜的緊縛後，在2小時基本的時期內注入高效液體色譜純化[3-3h]-葡萄糖(0.05μci/min；perkinelmer生命和分析科學波士頓，ma)，然後在最後收集血樣來評價基本的肝葡萄糖生產速率。在該基本的時期之後，按12.5mu/kg/min的速度連續灌注人類胰島素(律草素r；elililly,印第安納波利斯，印度)來實施一個120分鐘的高胰島素-正葡萄糖鉗夾。每隔20分鐘收集血樣用於快速檢測血漿葡萄糖濃度，然後以變化的速率注入25％葡萄糖來保持血漿葡萄糖在一個基本的濃度。通過鉗夾連續的輸注[3-3h]葡萄糖(0.1μci/min)來評價胰島素刺激的全身的葡萄糖翻轉。所有的輸注使用流動對照的微量滲析泵進行(cma/微量滲析，北切姆斯福德，ma)。在鉗夾開始後80，85，90，100，110，和120分鐘取血樣用於檢測血漿[3-3h]-葡萄糖，和3h2o濃度。在鉗夾末端，動物是犧牲的。5分鐘內，收穫肝組織然後儲存在-80℃用於進一步地分析。

從體外脂肪細胞分泌ap2

因為它的初始識別，ap2已經被認為是細胞質基質蛋白但是最近在不同的3t3-l1脂肪細胞的表面的和隨後人類血清中通過蛋白質組學篩選鑑別出來。進行研究來測定ap2是否通過脂肪細胞特別地分泌或者在細胞翻轉期間釋放。從野生型(wt)或者fabp缺乏的脂肪細胞收集的條件培養基和細胞裂解物ap2水平的檢測顯示wt細胞的條件培養基中大量的存在這種蛋白質(圖4a)。相比之下，脂肪細胞中兩種大量的細胞質基質蛋白質，caveolin和akt，在相同的條件下是不可檢測的，顯示了主動分泌可能性(圖4a)。然而，作為一種脂肪細胞中最大量的細胞質基質蛋白質，條件培養基中ap2的存在仍然可以歸因於由細胞死亡和/或溶菌作用引起的非特異性釋放。為了定性ap2從細胞中出來，將標記標記的ap2轉染進入人胚腎293細胞以及同樣地標記gfp和akt作為對照然後小心地滴定每個質粒的數值以保證所有的蛋白質在細胞內部以相似的水平表達(圖4b)。這些數據表明ap2是積極地分泌的並且它存在與條件培養基中並不是因為非特異性細胞裂解或死亡。為了研究所有的脂肪細胞分泌的蛋白質間的ap2的相對豐度，通過一維電泳分解從脂肪細胞的條件培養基。這些數據顯示ap2是來自脂肪細胞的大量分泌的蛋白質的一種(圖4c)，它有與脂聯素比得上的水平，並且表明ap2在細胞外有重要的生物機能。

體內ap2分泌的調節

為了檢驗ap2分泌的調節，通過應用酶聯免疫吸附系統檢驗老鼠中ap2的血清水平在wt和mal1-/-老鼠，血清中ap2存在一個相當可觀的水平(100到300ng/ml)，但是在ap2-/-和ap2-mal1-/-對照中是探測不到的(圖4d)。血清ap2比瘦素(大約12.5ng/ml)多10到30倍，但是仍然顯著的低於脂聯素的水平(5-10μg/ml)。為了探究代謝疾病環境中血清ap2的調節，比較了瘦的老鼠血清分布以及遺傳的和食譜誘導的肥胖的老鼠模型。在兩個肥胖模型中血清ap2顯著地增加(～四倍)(圖4e)，表明在病理學的條件下ap2可能與改變代謝調節有關係。一致地，增加的循環ap2水平已報導與人類的肥胖有關。

在肥胖的過程中增加的ap2水平可能是由於升高的ap2表達，擴展的脂肪質量或者增加的ap2分泌。雖然大家都知道肥胖對總的ap2表達沒有巨大的影響，進行研究來區別增加的大量脂肪質量或者一種分泌失調是否引起肥胖的老鼠中觀察到的血清ap2水平升高。從瘦的和肥胖的老鼠(ob/ob)收集脂肪外植體並且外植體培養中自體內釋放ap2被檢測到。來自肥胖的老鼠的脂肪外植體的平均的質量的ap2的分泌顯著地高於那些來自瘦的對照，表明那些肥胖的老鼠ap2分泌失調(圖8)。在肥胖的外植體中脂聯素分泌顯著地減少，證實脂肪組織的分泌腺輪廓中這些系統的保真度(圖8)。

在脂肪細胞和巨噬細胞兩者中表達ap2並且在任何一個細胞表型中ap2的功能突變的損失可以有助於改善老鼠中的代謝應答。因為肥胖的老鼠在脂肪組織中積累巨噬細胞，一種作用是有助於胰島素抗性，血清中和脂肪外植體中增加的ap2可能是由於從脂肪組織巨噬細胞增加的ap2釋放。為了檢驗細胞表型引起的肥胖的環境中增加的血清ap2，在wt和fabp缺乏的老鼠之間進行骨髓移植。血清的檢驗顯示來自wt老鼠的骨髓衍生的細胞在fabp缺乏的老鼠中不能持續有可檢測出的的血清ap2水平。(圖4f)。這個發現支持脂肪細胞而不是造血細胞，是老鼠中血清ap2的主要的貢獻者，和ap2是一種新的肥胖因子用來肥胖中改變血清分布。

通過脂解作用釋放脂肪酸調節ap2的分泌

進行研究評價從脂肪細胞分泌的代謝有活性的蛋白質是否將通過代謝狀態和營養的波動來調節。這種調節可以在病理學的條件下失調的機制上闡明。因此，進行實驗來測定血清ap2水平在響應禁食和恢復餵養中的變化。禁食24小時的老鼠中循環ap2水平與無限制餵養期間相比顯著地增加，但是在4小時的恢復餵養後很快地被壓制(圖5a)。所以，養分和可以調節血清ap2水平，反過來它表明ap2可能是調節能量體內平衡的全身性程序中的一部分。

能量體內平衡中脂肪組織的主要功能是在禁食期間對於其他的組織經由脂解作用提供脂肪酸。為了研究ap2分泌是否與脂解作用相聯繫，預脂肪細胞被分化並且刺激細胞中脂解作用。異丁基甲基黃嘌呤(ibmx)和dbcamp治療在一個小時內從脂肪細胞的ap2分泌穩固的增加(圖5b)。當用胰島素輔助處理細胞來壓制脂解作用，ap2分泌被壓制(圖5b)。為了進一步地研究組織環境中來自脂肪細胞的ap2分泌，收穫脂肪外植體然後自體內培養。在基本的條件下或者當脂解作用.的刺激時檢驗ap2分泌。ibmx或者佛司可林治療引起ap2分泌大幅度增加(圖5c)證實這個過程與脂解作用緊密的聯繫到一起。為了探究體內ap2分泌上的脂解作用的影響，給老鼠注射異丙基腎上腺素，一個-腎上腺素能受體促效藥，它強烈地激活脂解作用。接受異丙基腎上腺素的老鼠顯示與用載體處理的對照動物相比血清ap2水平急速地增長(圖5d)，這表明通過體內脂解作用調節ap2分泌而且在禁食期間老鼠中血清ap2升高是由脂肪組織中增加的分解脂肪的能力所引起的。

為了進一步地研究是否通過釋放的脂肪酸調節ap2分泌，用棕櫚酸鹽和硬脂酸鹽處理脂肪細胞。兩種脂質顯著地增加ap2分泌(圖5e)。脂肪酸治療也引起對於脂類小滴的gfp標記的ap2的易位(圖5f)，這表明脂質也調節ap2的細胞定位並且將其靶向到分泌的途徑。

脂解作用是一個涉及多重信號途徑的複雜的過程，許多這些多重信號途徑可能地調節ap2分泌。為了測定脂解作用誘導的ap2分泌中脂肪酸的有效性，用二乙基傘形酮醯磷酸鹽(deup)，一個甘油三酸酯水解酶抑制劑，按照脂解作用的誘導來阻止脂肪酸從甘油三酸酯(tg)儲備重釋放，來處理脂肪細胞。deup治療完全阻斷脂解作用誘導的ap2分泌，表明脂肪酸釋放是需要ap2分泌的(圖5g)。

為了測試體內ap2分泌上脂肪酸的效果，向生存有意識的老鼠輸注一種脂肪乳劑/肝素。通過脂肪乳劑輸注增加的血清脂肪酸也誘導ap2分泌(圖5h)，這表明脂肪酸刺激體內ap2分泌。

血清ap2精密的調節老鼠中肝的葡萄糖代謝

缺乏fabp的老鼠被代謝綜合症，特別地2型糖尿病重複的元件保護。人類升高的血清ap2也報導與糖尿病，心血管疾病及其他代謝病症相聯繫。然而在本發明之前，循環ap2和脂質和/或碳水化合物代謝之間的因果關係還沒有建立。ap2分泌緊密結合到脂解作用表明血清ap2可能在脂肪酸中的波動引起的代謝調節上有協同效應。

在肥胖期間脂解作用升高的水平釋放過量的脂肪酸到血清中。這些脂肪酸引起胰島素抗性並且通過激活糖原異生程序增加肝葡萄糖生產率。所以，循環ap2代表調節這種效果的目標。代謝調節的fabp缺乏的有益的效果可以通過血清中ap2的功能的損失被調節，至少部分地調節，它的水平在肥胖中顯著地升高。為了研究這種假設，開發了一種中和抗體來減少血清ap2。本抗體帶有很高的靈敏性特別地檢測ap2(圖9)。把這種抗體注入到肥胖的老鼠中餵以高脂肪食譜，結果證實ap2抗體有效地並迅速地耗盡血清ap2到脂肪組織中沒有改變的ap2水平的瘦的對照中可見的水平(圖6a)。抗體給藥沒有改變身體重量或者這種老鼠的血清游離脂肪酸水平(圖10)，但是引起兩周治療內血糖水平顯著的減少(圖6b)。在一個葡糖耐量試驗中，老鼠接受ap2抗體與對照動物相比顯示出顯著地改善的葡萄糖消除曲線(圖6c)。帶有減少的血清ap2的肥胖的老鼠當通過胰島素耐量試驗測定時也顯示出增強的全身性胰島素應答(圖6d)。這些結果表明升高的血清ap2代表對於肥胖誘導的胰島素抗性和葡萄糖不耐性的一個要求的元件，而且壓制的循環的ap2作為阻礙與肥胖有關的代謝衰退的方法是有用的。

總體葡萄糖通量和抗體調節ap2減少的組織特異的效果通過在用ap2抗體或者載體治療的老鼠中使用高胰島素正葡萄糖鉗夾研究來檢測。肥胖的老鼠中血清ap2的減少導致顯著地減少的基本的和夾緊的肝的葡萄糖生產率(圖6e，f)，這表明肝是調節葡萄糖代謝中循環ap2的主要目標。在鉗夾的研究期間，給肥胖的老鼠注射要求一種顯著地增加的葡萄糖液輸注速率以保持血糖正常，但是與對照相比葡萄糖代謝的它們的速率中顯示無變化(圖6g，h)。這些結果表明這些動物中升高的葡萄糖液輸注速率主要通過減少的肝的葡萄糖生產率驅動。這些數據和全身fabp敲除保持一致，它也以在遺傳的和飲食的肥胖中顯著地減少的肝的葡萄糖生產率為特徵。所以，肝的葡萄糖代謝上的ap2的效果主要地通過這些蛋白質的分泌形式來調節。

循環ap2調節肝葡萄糖生產

為了直接確立升高的血清ap2是否有一種陰性的葡萄糖代謝影響，創造了在另外的代謝正常的老鼠中升高的血清ap2的條件。把重組ap2注入到老鼠餵以一種正常的食物食譜。重組ap2的單一劑量給藥到老鼠中導致血清ap2的水平增加，這要持續好幾個小時(圖11)。每天注射兩次重組ap2以保證老鼠每個24小時時間周期的大部分期間在流通中維持升高的ap2。在這個周期內重組ap2給藥沒有改變身體重量或者老鼠的血清游離脂肪酸水平(圖12)。瘦的健康的動物，然而，在接受重組ap2兩周顯示了輕度的葡萄糖不耐性，其檢測採用一種葡糖耐量試驗(圖6i)。即使沒有任何飲食的影響和身體重量的變化，這個觀測表明血清ap2調節葡萄糖代謝和單獨增加的血清ap2可以引起葡萄糖代謝削弱。將重組ap2注入到有意識的fabp缺乏的老鼠並檢驗帶有高胰島素-正葡萄糖鉗夾的葡萄糖代謝上的ap2的急性效應。在這個背景中，ap2輸注引起老鼠中血清ap2水平快速增加並且在持續到實驗結束的一小時後建立高穩態的血清水平(圖13)。在鉗夾研究期間，老鼠接受ap2顯示顯著地增加的基本的肝葡萄糖生產速率(bhgp)(圖6j)。考慮到這些老鼠僅僅接受一種ap2這是一個深刻的效果，當檢驗肝的葡萄糖生產率時輸注ap2四小時。這些發現和葡萄糖代謝速率中不存在變化進一步地支持肝是血清ap2的主要目標的假設。ap2輸注和減少實驗中檢查調節肝的葡萄糖生產率的基因的表達。葡糖異生作用途徑中兩個主要基因，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(pepck)和葡萄糖-6-磷酸酯酶(g6p)，與那些輸注ap2作為比較的對照在老鼠中都顯著地高調(圖6k頂部面板)。這些數據表明血清ap2調節肝中的葡糖異生作用和肥胖中血清ap2的升高的水平有助於增加的肝的葡萄糖生產率經常在低於糖尿病患者條件下觀測到。

外來體有關的體外和體內的ap2分泌

為了更透徹地了解ap2分泌如何聯繫到並且通過脂解作用調節，試驗了ap2的分子機制。首先，用經典的分泌的途徑的抑制劑處理不同的脂肪細胞並且在條件培養基中檢驗分泌的蛋白質。同時布雷菲德菌素a和莫能菌素治療有效地阻斷脂聯素分泌，兩者在ap2釋放上都沒有抑制效果(圖7a)，表明ap2是經由一種非經典的途徑分泌的。這個發現與ap2缺乏信號肽序列的事實一致。過去描述非經典的分泌的各種各樣的機制的一種是外來體依賴的途徑。為了測定ap2分泌是否利用這個途徑，從脂肪細胞條件培養基中分離外來體；在這些片段中檢測ap2的存在。富集ap2並且以類似於乳脂小球-egf因子8(mfg-e8)的方式然後胞外體部份容易檢測，表明ap2實際上經由脂肪細胞中外來體分泌，mfg-e8是一種確定的外來體標記(圖7b)。

調節脂肪組織脂質侶伴蛋白連接脂解作用到肝的葡萄糖生產的胞外體分泌

膜靶向是調節外來體分泌的主要步驟。當ap2大部分定位在胞液中，已經發現ap2短暫地影響磷脂膜。ap2的三維結構由一個10串帶有兩個頂部的α螺旋充當脂肪酸入口25的入口的β-桶組成(圖7c，左側的面板)。ap2蛋白質的兩個成分已經建議有助於它的薄膜關聯：(1)穩固的陽性表面電位的脊，通過賴氨酸殘基貢獻，它調節帶負電的磷脂的靜電相互作用並且(2)，直接對薄膜有影響的入口區域。為了探究可能從下面支撐ap2移位進入外來體的機制，創造了ap2突變型，它帶有兩個臨界表面殘基，賴氨酸22和59，轉變為異亮氨酸，(圖7c，中間的面板)或者帶有入口區域完全的刪除部分(圖7c，右側的面板)。這些的突變沒有改變ap2的總的倍數但是都阻斷了ap2從細胞中分泌(圖7d)，表明與磷脂薄膜關聯的ap2對於它的分泌是絕對需要的。上面描述的損失了分泌的容量的ap2突變型，也有顯著地減少的外來體的定位(圖7d)，表明對於ap2分泌外來體靶向是一個主要的步驟。

通過脂解作用觀測到ap2分泌的誘導，在脂解作用或者暴露於脂肪酸期間檢驗ap2移位進入外來體。在兩個條件下，一個外來體中ap2純的富集(圖7e)是可見到的，表明在脂解作用的期間增加的ap2靶向到外來體導致它的分泌升高。在血中已鑑別像外來體的微泡，但是造血細胞通常被認為是這些載體的來源。為了研究ap2關聯的外來體是否也存在於環流中，分離來自老鼠的血漿的外來體部份並且對ap2印跡。ap2關聯的外來體存在於wt而不是ap2敲除的老鼠的環流中(圖7f)，表明脂肪細胞可能分泌外來體到與其他的器官聯繫。結果顯示肥胖的老鼠的循環的外來體中顯著地增加的ap2水平，表明ap2關聯的外來體可能和肥胖的代謝失調有牽連(圖7f)。

這些數據提供了證據，ap2是一種通過營養狀況和肥胖調節新的肥胖因子。脂肪細胞中，通過脂質和脂解作用激活以及通過外來體關聯的分泌的途徑調節ap2分泌(圖7g)。老鼠中，血清ap2全部來源於帶有一個飲食的或者遺傳的肥胖模型以及體內脂解作用中標記的增加的脂肪細胞。肥胖的老鼠中血清ap2的減少壓制肝的葡萄糖生產率的升高，當瘦的老鼠中ap2相反的增加導致增強肝的葡萄糖生產率。這些結果表明分泌的ap2是脂肪肝的通信系統連接脂解作用到肝葡萄糖生產的關鍵部分(圖7g)。

游離脂肪酸表示在禁食期間關鍵的能源，但是它也認為升高的脂解作用和血清脂肪酸與全身性葡萄糖體內平衡的失調有關係和並且表示肥胖誘導的代謝疾病的關鍵性的支撐原因。過量脂肪酸分別引起肌肉中胰島素抗性和肝葡萄糖利用減少和稀釋的胰島素調節抑制葡萄糖生產率。利用胰腺鉗夾的對照孔的激素的條件，同時也顯示脂肪酸不依賴胰島素或者胰高血糖素作用直接增加肝葡萄糖生產率。這些效果歸因於通過脂肪酸的葡糖異生作用途徑的活化。一些老鼠模型和條件，已經顯示肝葡萄糖生產與增加的血清脂肪酸分開，這表明其他的因子在連接脂解作用和脂肪酸到肝的葡糖異生作用時需要的。在此提供的發現確定ap2作為一種分泌的脂肪細胞蛋白質和這些因子的一種。

作為一種肥胖因子的ap2的識別提供對脂肪組織的內分泌功能的幾個了解視角。這個蛋白質是獨特的，在於它直接結合到脂質並在脂解作用的響應中分泌的能力。因此它充當脂肪組織的脂質狀態的傳感器或者作為其他的代謝器官響應代謝調節或者飲食的變化的信號。另外，脂解作用刺激的，外來體關聯的ap2分泌可能幫助解釋脂肪細胞如何持續一個驚人的分泌的容量，儘管大量的脂類小滴和內質網上利用的限制。ap2，當通過脂肪酸激活時，移位到脂類小滴或者脂質體。脂質體作為一個交通的膜細胞器起作用，並且某些脂質體固有的蛋白質，例如perilipina，鑑別它經由外來體分泌。然後有可能，ap2分泌的那些機制傳遞脂質和細胞外的蛋白質讓脂肪細胞有效的滿足需要(圖7g)。

對於脂肪的脂解作用ap2分泌和血清水平緊密結合表明ap2代表分解脂肪的應答的生理學的和/或病理生理的結果的一種新的部分。為了完全地激活肝葡糖異生作用對於脂肪酸作為血清成分的ap2的表觀的需要說明肥胖誘導的高hyper-ap2-酶倍增免疫測定可能從下面支撐升高的肝的葡萄糖生產率，也就是說帶有二型糖尿病的患者中高血糖的標誌。

證據指向不但在實驗的模型中而且人類中代謝疾病的ap2的中心角色。當ap2抑制的治療的值是一個臨床的目標，在組織中瞄準的它的化學試劑已經被激發。在此描述的數據表明當與肥胖有關的血清ap2水平增加時使用一種中和抗體歸一化，伴隨脂肪組織ap2水平中沒有任何變化葡萄糖代謝是非常強的。血清ap2水平與人類和禁食中與代謝疾病風險相關聯，與增加的禁食的游離脂肪酸相比流通的ap2更強烈地與代謝風險有關係。為了中和血清ap2組合物的給藥是一種治療代謝失調有效的途徑，尤其是二型糖尿病。

其他的實施方式在下列權利要求中。