用於治療神經疾病的人抗體及其診斷和治療用途

2023-04-27 20:26:06

用於治療神經疾病的人抗體及其診斷和治療用途
【專利摘要】提供能夠結合併識別CNS中的神經元並引起CNS神經元反應的特異性結合成員、特別是人抗體、特別是重組抗體及其片段。所述抗體可用於神經保護和與神經損害、損傷或變性有關的病況和神經變性疾病的診斷和治療。本發明的抗體、其可變區或其CDR結構域序列及其片段還可用於與化學療法、免疫調節劑或神經活性劑和/或與其它抗體或其片段的聯合療法。抗體通過本文提供其序列的抗體IgM12和IgM42舉例說明。
【專利說明】用於治療神經疾病的人抗體及其診斷和治療用途
[0001]政府支持聲明
[0002]本文所述發明全部或部分受國立衛生研究院(National Institutes of Health)(資助號 ROl NS 24180,ROl NS 32129,ROl CA104996、R01CA096859)及全國多發性硬化協會(National Multiple Sclerosis Society)(資助號 CA 1011 A8-3)的支持。美國政府在本發明中享有一定權利。
發明領域
[0003]本發明涉及能夠結合併識別CNS中的神經元並能夠引起CNS神經元反應的抗體，特別是人天然抗體、來源天然抗體的重組抗體及其片段。這些抗體可用於診斷和治療與神經損害、損傷或變性有關的病況、神經變性疾病、慢性神經損傷或損害和突發性神經損傷或損害。本發明的抗體、其可變區或其CDR結構域序列及其片段還可用於與化學療法、免疫調節劑或神經活性劑和/或與其它抗體或其片段組合的療法中。本發明總的來說涉及中樞神經系統中的神經生長的調節，更具體地說涉及用於改善CNS神經生長的方法和相關作用齊U、構建體和組合物。
發明背景
[0004]神經再生是指神經組織、細胞或細胞產物的再生長或修復。這類機制可包括髓鞘再生、新的神經元、神經膠質、軸突、髓磷脂或突觸的產生。神經再生因所涉及的兩種功能機制以及再生程度和速度而在周圍神經系統(PNS)和中樞神經系統(CNS)間有所不同。
[0005]在損傷後成熟哺 乳動物中樞神經系統(CNS)中的軸突再生非常有限。因此，在脊髓損傷(SCI)、創傷性腦損傷、中風和涉及軸突斷裂的相關病況之後功能缺陷持續存在。這種情形不同於哺乳動物周圍神經系統(PNS)中的情況，周圍神經系統中長距離軸突再生和實質性功能恢復可發生在成體中。神經元的胞外分子和內在生長能力兩者影響再生的成功。
[0006]成年哺乳動物中，中樞神經系統(CNS)軸突在損傷後不會自發地再生。相比之下，周圍神經系統(PNS)軸突容易再生，允許在周圍神經損害後恢復功能。Aguayo與同事證實，至少一些成熟CNS神經元當提供有允許的周圍神經移植物時保持再生的能力(Richardson PM,McGuinness UM,Aguayo AJ (1980)Nature 284:264-265 ;Richardson PM,Issa VM,Aguayo AJ(1984)J Neurocytol 13:165-182 ;David S,Aguayo AJ(1981)Science214:931-933 ；Benfey M, Aguayo AJ(1982)Nature 296:150-152)。該研究表明對於軸突生長，PNS環境是刺激性的和/或CNS環境是抑制性的。隨後的研究鑑定出PNS中的生長促進因子和CNS中的生長抑制因子兩者。再生的抑制劑包括CNS髓磷脂中的特定蛋白質和與星形膠質瘢痕有關的分子。另外，CNS中相對於PNS的較慢的碎片清除可妨礙軸突再生。了解影響軸突生長的因素對開發促進CNS再生的治療劑至關重要。
[0007]在周圍神經損傷後，軸突容易再生。與胞體斷開的軸突的遠端部分進行沃勒變性。這種活性過程導致軸突斷裂和分解。碎片被神經膠質細胞(主要為巨噬細胞)除去。近端軸突然後可再生，並且使其目標重新受神經支配，使得功能恢復。
[0008]CNS再生抑制劑的兩個主要類別是髓磷脂相關抑制劑(MAI)和硫酸軟骨素蛋白聚糖(CSPG)。這些分子限制軸突再生，並且通過幹擾其功能，在成體CNS中實現某種程度的生長。細胞自主性因子也是CNS再生失敗的重要決定因素。CNS神經元不會增量調節生長相關基因至與PNS神經元相同的程度。因此甚至在沒有抑制劑時，其再生能力也受到限制。提高神經元的內在生長能力允許CNS內適度的軸突再生(Bomze HM等(2001)NatNeurosci4:38-43 ；NeumannS, WoolfCJ (1999) Neuron23:83-91)。
[0009]作為CNS髓磷脂的組分，MAI是由少突膠質細胞表達的蛋白質。MAI體外削弱神經突增生，被認為在CNS損傷後體內限制軸突生長。MAI包括Nogo-A(Chen MS等(2000)Nature403:434-439 ;GrandPreT 等(2000)Nature 403:439-44)、髓憐脂相關糖蛋白(MAG)(McKerracher L 等(1994) Neuron 13:805-811)、少突膠質細胞髓憐脂糖蛋白(OMgp)(Kottis V 等(2002) J Neurochem82:1566-1569)、肝配蛋白-B3 (Benson MD 等(2005) ProcNat Acad Sci USA102:10694-10699)和腦信號蛋白 4D(Sema4D) (Moreau-FauvarqueC 等(2003) JNeurosci23:9229-9239)。這些中的 3 種(Nogo_A、MAG 和 OMgp)與神經元 Nogo-66受體I(NgRl)相互作用從而限制軸突生長。這3種在結構上不相關的配體還對第二種軸突生長抑制性受體(配對免疫球蛋白樣受體B(PirB))顯示親和力(Atwal JK等(2008)Science322:967-970)。
[0010]已鑑定出幾種識別分子，其充當構成促進和/或抑制神經突生長的基礎的分子線索。在神經突增生促進性識別分子中，神經細胞粘附分子LI在介導神經突增生中起突出作用(Schachner M (1990) Seminars in the Neurosciences2:497-507)。LI 依賴性神經突增生受嗜同性(homophilic)相互作用介導。LI促進表達LI的神經突和施萬細胞及LI轉染的成纖維細胞中的神經突增生(B ixby 等(1982) Proc Natl Acad.Sc1.U.S.A.84:2555-2559 ；Chang 等(1987) JCell Biol 104:355-362 ;Lagenaur 等(1987)Proc Natl Acad SciUSA84:7753-7757 ;Seilheimer 等(1988)J Cell Bioll07:341_351;Kadmon 等(1990)JCell BiolllO:193-208 ;Williams 等(1992)J Cell Biol 119:883-892)。
[0011]神經系統損傷每年影響90，000多人，如果包括腦血管事件例如中風，則人數大更多。據估計，僅脊髓損傷每年就影響10，000人。由於神經損傷這種高的發生率，神經再生和修復(神經組織工程學的分支學科)，正成為致力於發現損傷後恢復神經功能的新方法的快速發展的領域。神經系統被分成兩部分:由腦和脊髓組成的中樞神經系統及由腦神經和脊神經連同其相關神經節組成的周圍神經系統。雖然周圍神經系統具有修復和再生的內在能力，但是相比之下，且就絕大多數而言，中樞神經系統在其自我修復和再生能力方面受到限制。目前還沒有可接受並獲得批准的在中樞神經系統損傷後恢復人神經功能的治療法。
[0012]在脊髓損傷(SCI)後，軸突保護和修復作為防止運動神經元損失和永久失能的有效策略仍具有巨大潛力。使用防止損害和促進損傷後軸突修復的靶向營養因子已實現了神經元保護。這些分子主要採用基於體外系統(其集中於靶向特異性小分子神經營養因子)的選擇策略而鑑定。雖然這些分子在臨床前模型中顯示神經保護結果，但是臨床試驗的結果不太有利。
[0013]使用損傷和疾病的多個模型，證實了天然自體反應性單克隆抗體在CNS細胞中的有益生物功能。使用小鼠單克隆IgM，IN-1，體內證實了神經元存活、軸突再生和功能恢復的抗體介導的促進(Bregman BS 等(1995) Nature378 (6556): 498-501 ；Caroni P, SchwabME(1988)Neuron I (I):85-96)。在CNS損傷前使用脊髓勻漿物(SCH)免疫，獲得類似結果(Ellezam B, Bertrand J, Dergham P, McKerracher L(2003)Neurobiol Disl2 (I):1-10 ；Huang DW 等(1999)Neuron24(3):639-647)。
[0014]多發性硬化(MS)是一種慢性、頻繁進行性、炎性中樞神經系統(CNS)疾病，其病理學特徵在於原發性脫髓鞘，通常沒有最初的軸突損傷。MS的病因和發病機制未知。MS的幾個免疫學特徵及其與某些主要組織相容性複合體等位基因適度相關，引起了 MS是免疫介導的疾病的推測。自身免疫假設得到實驗性自身免疫(變應性)腦脊髓炎(EAE)模型的支持，其中將某些髓磷脂組分注射給遺傳易感動物導致T細胞介導的CNS脫髓鞘。然而，在MS患者的CNS中未明確鑑定出特異性自身抗原和致病性髓磷脂反應性T細胞，MS也不與其它自身免疫疾病有關。基於流行病學數據的備擇假設是環境因素，或許是未鑑定的病毒促成了 CNS中的炎症反應，其導致直接或間接(「旁路對象(bystander)」)的髓磷脂破壞，可能伴有受誘導的自身免疫組分。這種假設得到以下證據的支持:在人和動物兩者中若干天然存在的病毒感染可引起脫髓鞘。一個普遍應用的實驗性病毒模型由泰勒氏(Theiler's)鼠腦脊髓炎病毒(TMEV)誘導(Dal Canto, M.C.和 Lipton, H.L., Am.J.Path.，88:497-500(1977))。
[0015]MS和其它脫髓鞘或神經變性疾病的現有療法的有限功效激起了對改善這些疾病的新療法的興趣。然而，由於這些疾病顯然複雜的發病機理，可能涉及環境和自身免疫兩種因素，因此仍存在對這些脫髓鞘病症有效治療的需要。
[0016]在MS的情況下，脫髓鞘最終導致神經細胞死亡。然而，脫髓鞘後的軸突死亡不是即時的。如果提供合適的支持分子或細胞，神經系統則具有明顯的修復能力。保護CNS的軸突有希望成為限制存活軸突的喪失和防止永久失能的有效策略。可通過調節損傷中的潛在神經毒性炎性環境來實現神經保護。正在研究設計以限制興奮性毒性、抑制一氧化氮或阻斷離 子通道的試劑作為保護處於危險中的軸突的方法(Pitt，D.，P.Werner 和 C.S.Raine(2000)Nat Med6:67-70 ;0kuda，Y 等(1997)Journal ofneuroimmunology73:107-116 ；ffaxman, S.G.(2002) J Rehabil Res Dev39:233-242)。這些試劑中的許多是具有已經證實的毒性並全身作用於所有細胞的小分子。
[0017]已鑑定出人單克隆自身抗體，其在中樞神經系統中顯示活性，並且與刺激髓鞘再生特別有關。將合乎需要的是，鑑定、表徵和開發在CNS中具有活性且具有促進神經再生和/或保護神經元免受疾病、損傷、損害和/或死亡的能力的人單克隆抗體，特別是具有這些活性的重組抗體。本發明針對的正是該目標的完成。
[0018]本文參考文獻的引用不應解釋為承認所述文獻是本發明的現有技術。
[0019]發明概述
[0020]本發明涉及在CNS中具有特定有效性的神經調節劑，所述調節劑包含選自IgM亞型的抗體、其活性片段、其單體、其激動劑及其組合的物質。本發明的神經調節劑或抗體具有以下一個或多個特徵:它們保護和/或穩定神經元；它們靶向CNS或神經細胞損害、受損(compromise)或損傷的部位；它們減少或阻止細胞死亡，例如過氧化氫誘導的細胞死亡。
[0021]本發明提供神經元結合單克隆抗體，其具有促進神經突延伸、在神經再生中起作用和/或保護神經元免受損害以用於中樞神經系統的診斷和治療目的的能力。具體地講，提供特異性重組抗體，其中所述抗體識別並能夠結合神經元，包括皮質神經元、海馬神經元、小腦顆粒細胞和視網膜神經節細胞。本文提供重組完全人抗體。本發明的抗體在與神經受損、損害或損傷有關的病況或疾病中具有診斷和治療用途。
[0022]從總體方面來看，本發明提供針對或能夠結合神經元上的一個或多個表位的抗體，所述神經元包括皮質神經元、海馬神經元、小腦顆粒細胞和視網膜神經節細胞。從大的方面來看，本發明提供分離的特異性結合成員(binding member),特別是抗體或其片段，包括識別、結合和/或靶向神經元的重組人抗體。本發明提供特異性結合神經元和保護神經元免於細胞死亡並且不會促進髓鞘再生的抗體，特別是人抗體，特別是IgM抗體。本發明的抗體應用於治療或改善其中神經受損、損傷或損害或處於受損、損傷或損害風險的哺乳動物的疾病或病況，包括應用於脊髓損傷(SCI)、創傷性腦損傷(TBI)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、多發 性硬化(MS)、阿爾茨海默病(Alzheimer』 s disease)、中風、帕金森病(Parkinson’s disease)、亨廷頓舞蹈病(Huntington’s disease)、產前缺氧/圍產期缺血、大腦性麻痺、腦病、脊髓病或運動神經元疾病，並且特別應用於神經元和這些疾病中神經能力的保護、存活或維持。在一個具體方面，本發明提供抗體或其片段，其是抗體12或42，特別是血清來源的或重組的IgM12或IgM42。
[0023]在本發明的一個方面，提供包含圖5和/或圖6中給出的可變區⑶R序列的重組或合成神經元結合抗體。抗體12包含圖5中給出的重鏈⑶R序列⑶R1GGSVSLYY(SEQ IDN0:31)、CDR2GYIYSSGST(SEQ ID NO:32)和 CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO:33)及輕鏈 CDR序列 CDRl QSISSY(SEQ ID N0:34)、CDR2 AAS (SEQ ID NO:35)和 CDR3 QQSYHTPff(SEQ IDNO:36)。抗體 42 包含圖 6 中給出的重鏈 CDR 序列 CDRl GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37)、CDR2INVGGVTT (SEQ ID NO: 38)和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39)及輕鏈 CDR 序列 CDRlQGIG(SEQ ID NO:40)、CDR2TTS(SEQ ID N0:41)和 CDR3QKYNSAPRT(SEQ ID NO:42) ? 因此，以本文鑑定的抗體的CDR為基礎的重組抗體可用於靶向和保護神經元，特別是疾病或癌症中的易感、受損、損傷或損害的神經元。
[0024]本發明因此提供特異性結合神經元和保護神經元免於細胞死亡並且不會促進髓鞘再生的分離的人IgM抗體或其片段，其中抗體或片段包含:(a)圖5給出的可變重鏈胺基酸 CDR 結構域序列 CDR1GGSVSLYY(SEQ ID NO:31)、CDR2GYIYSSGST(SEQ ID NO:32)CDR3 ARSASIRGWFD(SEQ ID NO:33)及輕鏈 CDR 序列 CDR1QSISSY(SEQ ID N0:34)、CDR2AAS(SEQ ID NO:35)和 CDR3QQSYHTPW(SEQ ID NO:36);或(b)圖 6 給出的可變重鏈胺基酸 CDR 結構域序列 CDRl GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37)、CDR2INVGGVTT (SEQ ID NO:38)和 CDR3VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39)和輕鏈 CDR序列 CDRl QGIG (SEQ ID NO: 40)、CDR2TTS (SEQID N0:41)和⑶R3QKYNSAPRT(SEQ ID N0:42)，以用於治療或改善其中神經受損、損傷或損害或處於受損、損傷或損害風險的哺乳動物的疾病或病況。
[0025]在更具體的方面，本發明的抗體包含包括圖5和/或圖6給出的抗體12或42的胺基酸序列。本發明的重組抗體IgM12包含圖5給出的可變重鏈序列(SEQ ID NO:1)和輕鏈序列(SEQ ID NO: 11)。本發明的重組抗體IgM42包含圖6給出的可變重鏈序列(SEQ IDNO: 17)和輕鏈序列(SEQ ID NO:27)。在本發明的具體方面，重組抗體是包含人重鏈可變區、恆定區和人J鏈的完全人重組抗體。本文提供完全人重組IgM12抗體，其包含圖5給出的人免疫球蛋白重鏈(包含可變區(SEQ ID NO:1)或其CDR)、人恆定區、特別是κ序列(SEQID Ν0:3、5、7 和 9)和人 J 鏈(SEQ ID NO: 15)。
[0026]在又一方面，本發明提供分離抗體或其能夠結合抗原的片段，其中所述抗體或其片段包含含有基本如本文或圖6中給出的胺基酸序列的多肽結合結構域。本發明提供能夠結合神經元的分離人抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區(SEQ IDNO: 17)或其⑶R和輕鏈可變區(SEQ ID NO: 27)或其⑶R，或包含基本如本文或圖6中給出的胺基酸序列。
[0027]在又一方面，本發明提供分離的完全人抗體或其能夠結合抗原的片段，其中所述抗體或其片段包含含有基本如本文和圖5中給出的胺基酸序列的多肽結合結構域。本發明提供能夠結合神經元的分離的完全人抗體或其片段，其中所述抗體或其片段包含重鏈可變區(SEQ ID NO:1)或其CDR及輕鏈可變區(SEQ ID NO: 11)或其CDR，或包含基本如本文和圖5中給出的胺基酸序列。本發明特別提供分離的人IgM抗體或其活性片段，其包含圖5給出的可變重鏈胺基酸 CDR 結構域序列 CDRl GGSVSLYY (SEQ ID NO: 31)、CDR2GYIYSSGST (SEQID N0:32)和 CDR3 ARSASIRGWFD(SEQ ID NO:33)及輕鏈 CDR 序列 CDRl QSISSY(SEQ IDNO:34) ,CDR2AAS(SEQ ID NO:35)和 CDR3QQSYHTPW(SEQ ID NO: 36)。在一個具體方面，本發明提供分離的完全人重組IgM抗體或其活性片段，其包含可變重鏈胺基酸⑶R結構域序列CDRl GGSVSLYY(SEQ ID N0:31)、CDR2 GYIYSSGST(SEQ ID N0:32)和CDR3 ARSASIRGffFD(SEQID NO:33)及輕鏈CDR序列CDRl QSISSY(SEQ ID N0:34)、CDR2 AAS(SEQ ID N0:35)和CDR3QQSYHTPff (SEQ ID NO: 36)、人恆定區和SEQ ID NO: 15所示的人J鏈序列。
[0028]在其它方面，本發明提供包含編碼上述神經元結合多肽或抗體的序列的分離核酸和製備本發明的多肽或抗體的方法，所述方法包括在引起所述多肽或抗體表達的條件下表達所述核酸，並回收多肽或抗體。在一個這樣的方面，提供編碼具有圖5或圖6給出的胺基酸序列的抗體可變區序列的核酸或提供具有圖5或圖6給出的CDR結構域序列的抗體。一方面，提供包含圖5或圖6的核酸序列的核酸。在又一方面，提供編碼圖5或圖6給出的重鏈可變區VH或輕鏈可 變區VL的核酸。本發明還涉及編碼本發明抗體的重組DNA分子或克隆基因或其簡併變體；優選核酸分子，特別是編碼抗體VH和VL、特別是CDR區序列的重組DNA分子或克隆基因，其具有圖5或圖6所示序列或能夠編碼圖5或圖6所示序列。在優選的方面，本發明提供編碼IgM12的重鏈(SEQ ID NO:2)和輕鏈可變區序列(SEQ IDNO: 12)的核酸，以及編碼IgM42的重鏈(SEQ ID NO: 18)和輕鏈可變區序列(SEQ ID NO: 28)的核酸。在本發明的一個方面，提供核酸，其編碼包含可變重鏈胺基酸CDR結構域序列CDR1GGSVSLYY(SEQ ID NO:31)、CDR2GYIYSSGST(SEQ ID NO:32)和 CDR3 ARSASIRGWFD(SEQID NO: 33)及輕鏈 CDR 序列 CDRl QSISSY(SEQ ID NO: 34), CDR2 AAS (SEQ ID NO: 35)
⑶R3 QQSYHTPff(SEQ ID NO:36)的抗體或其片段。在又一方面，核酸還編碼人恆定區和人J鏈，特別是SEQ ID N0:15的J鏈。在本發明的一個方面，提供核酸，其編碼包含可變重鏈胺基酸 CDR 結構域序列 CDRl GFTFSTYA (SEQ ID NO: 37), CDR2INVGGVTT (SEQ ID NO: 38)和CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39)及輕鏈 CDR 序列 CDRl QGIG (SEQ ID N0:40)、CDR2TTS (SEQ ID N0:41)和 CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO:42)的抗體或其片段。在又一方面，核酸還編碼人恆定區和人J鏈，特別是SEQ ID NO: 15的J鏈。
[0029]包含本發明的可變區序列的抗體、其片段和重組抗體可用於治療、預防或診斷人或動物體的方法，例如哺乳動物中的神經保護方法，所述方法包括給予所述哺乳動物有效量的本發明的抗體、其片段和重組抗體。包含本發明的⑶R結構域序列的重組抗體或其片段可用於哺乳動物中的神經保護方法，所述方法包括給予所述哺乳動物有效量的本發明的抗體、其片段和重組抗體。
[0030]本發明的作用劑，特別是重組抗體或其片段可在預防、治療或改善能夠、可能或的確導致CNS損傷的神經損傷、損害或受損和併發症的方法中用作神經保護劑。當涉及或關聯神經元的結構、功能或存活喪失(包括腦損傷或創傷、脊髓損傷(SCI)、神經損傷、頭損傷、其中腦供血減少或受損的病況、腦感染性疾病、神經變性疾病)時，本發明的治療或預防方法是可適用的。按照本發明的方法治療、預防或改善的示例性的這類疾病或病況包括脊髓損傷(SCI)、創傷性腦損傷(TBI)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、多發性硬化(MS)、阿爾茨海默病、中風、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、產前缺氧/圍產期缺血和/或大腦性麻痺、腦病、脊髓病和運動神經元疾病。本發明因此涉及治療或改善其中神經受損、損傷或損害或者其中神經或神經元易於受損、損傷或損害或者有受損、損傷或損害風險的哺乳動物的疾病或病況的方法，所述方法包括給予選自IgM12和IgM42的重組抗體或完全人抗體或其片段。
[0031 ] 在本發明的一個方面，在其中神經受損、損傷或損害情況的疾病或病況下或者在其中神經或神經元易於受損、損傷或損害或者有受損、損傷或損害風險的情況下，包含本發明的可變區序列的抗體、其片段和重組抗體可用於方法中或以組合物給予以改進或穩定神經功能或運動功能。在一個具體方面，抗體或其片段在疾病或病況的早期或初始階段使用或給予，或在疾病或病況的進程或持續時間內重複，以利於或維持神經系統功能或運動功能的改進或穩定，包括或選自運動(例如步行)或認知功能(例如回憶或再認)。
[0032]本發明的方法可包括給予不止一種抗體或片段，包括抗體IgM12和42的組合。在本發明的一個方面，提供包括給予一種或多種抗體或其片段的方法，其中抗體包含(a)可變重鏈胺基酸 CDR 結構域序列 CDRl GGSVSLYY (SEQ ID N0:31)、CDR2 GYIYSSGST (SEQID NO:32)和 CDR3 ARSASIRGWFD (SEQ ID NO: 33)及輕鏈 CDR 序列 CDRl QSISSY (SEQ IDN0:34)、CDR2 AAS (SEQ I D NO: 35)和 CDR3QQSYHTPW(SEQ ID NO: 36)，或(b)可變重鏈胺基酸 CDR 結構域序列 CDRl GFTFSTYA (SEQ ID N0:37)、CDR2 INVGGVTT (SEQ ID NO:38)和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39)及輕鏈 CDR 序列 CDRl QGIG (SEQ ID NO: 40)、CDR2 TTS (SEQ ID N0:41)和 CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO:42) ? 在又一個這類方法中，抗體IgM12和/或抗體IgM42的一種或多種可與另一種CNS活性抗體組合，特別包括抗體rHIgM22和/或rHIgM46的一種或多種。rHIgM22抗體包含SEQ ID NO:43和44所示胺基酸序列，或這些SEQ ID的⑶R。rHIgM46抗體包含SEQ ID NO:45和46所示胺基酸序列，或這些SEQ ID的⑶R。因此，抗體IgM12和/或抗體IgM42的一種或多種可與一種或多種包含以下的髓鞘再生抗體組合:(a)包含⑶Rl序列SSGMH、⑶R2序列V(I) ISYDGSRKYYADSVKG和CDR3序列GVTGSPTLDY的重鏈可變區CDR及包含CDRl序列SGSSSNIGNNFVS、CDR2序列DITKRPS 和 CDR3 序列 G (E) TWDSSLSAVV 的輕鏈可變區 CDR ;或(b)包含 CDRl 序列 SGFTFSSYW、CDR2序列IKKDGSEK和CDR3序列ARPNCGGDCYLPWYFD的重鏈可變區CDR及包含CDRl序列QSVLYSSNNKNY、CDR2序列YWAS和CDR3序列QQYYNTPQA的輕鏈可變區CDR。抗體的組合可在不同的時間和以不同的量或濃度共同或連續給予。可使用雙特異性或多特異性抗體。在一個具體的這樣的方面，通過聯合給藥或通過相隔短的持續時間或較長持續時間(包括數小時、數天或數周)的連續給藥，將抗體12和/或42與抗體22和/或46和/或具有IgM22或IgM46的⑶R區⑶R1XDR2和⑶R3序列的抗體組合給予。在一個這樣的具體方面，通過聯合或連續給藥，將抗體12和/或42與抗體22和/或46組合給予用於治療或改善涉及神經變性的疾病或病況，特別包括脫髓鞘。在又一個這樣的方面，通過聯合或連續給藥，將抗體12和/或42與抗體22和/或46組合給予用於治療或改善脫髓鞘疾病或病況。在一個具體方面，通過聯合或連續給藥，將抗體12和/或42與抗體22和/或46組合給予用於治療或改善多發性硬化。在一個這樣的方面，在MS疾病的可測量臨床方面，實現髓鞘再生和神經保護的聯合作用，包括協同作用。
[0033]鑑於本發明作用劑的神經保護和/或神經變性能力，本發明還涉及產生和刺激神經元增殖的體外方法，包括皮質神經元、海馬神經元、小腦顆粒細胞和視網膜神經節細胞的增殖。這類增殖的神經元可適於移植和神經細胞治療方案和方法。
[0034]本發明的診斷效用延伸到本發明的抗體在表徵CNS神經損傷或損害或者篩查或評價涉及神經損傷、損害或死亡(包括壞死性或凋亡性死亡)的疾病或病況中的測定法和方法中的用途，包括體外和體內診斷和成像測定法。在免疫測定中，可製備控制量的抗體等，並用酶、特異性結合配偶體、配體、染料、螢光標籤和/或放射性元素標記抗體，然後可弓I入細胞樣品中。在標記材料或其結合配偶體有機會與樣品中的部位起反應後，所得質量可通過已知技術檢查，這隨所連接的標記的性質而變化。在體內診斷或成像應用中，可製備抗體或其神經元結合片段，並用酶、特異性結合配偶體、配體、染料、螢光標籤和/或放射性元素標記所述抗體或其神經元結合片段，然後可引入動物中。在標記材料或其結合配偶體有機會與動物內的部位起反應後，可通過已知技術檢查動物，這隨所連接的標記的性質而變化。
[0035]放射性標記的特異性結合成員，特別是抗體及其片段，可用於體外診斷技術和體內放射性成像技術。在本發明的又一個方面，放射性標記的特異性結合成員，特別是抗體及其片段，特別是放射性免疫綴合物，可用於放射性免疫療法，特別作為用於神經損傷修復、神經變性恢復、癌症或CNS腫瘤療法的放射性標記的抗體，或在某些情況下備選地用於受損害神經組織或神經元的切 除。在體內方面，抗體或其神經元結合片段是標記的，並在手術或手術技術(包括立體定位術或最小侵入性技術)之前、期間或之後給予動物，用於定位神經損傷或評價其餘受損害或受損傷的神經組織的目的。在一個這樣的方面，放射性標記的特異性結合成員，特別是抗體及其片段，可用於放射免疫導向手術技術，其中它們可在靶向、鑑定或除去這類細胞的手術之前、期間或之後，鑑定和表明受損、受損害、受損傷或瀕死神經細胞或神經元或神經組織的存在情況和/或位置。
[0036]免疫綴合物或抗體融合蛋白包括在本發明中，其中本發明的特異性結合成員，特別是抗體及其片段，與其它分子或作用劑綴合或連接，所述其它分子或作用劑還包括但不限於與神經活性藥物、化學消融劑、毒素、免疫調節劑、細胞因子、細胞毒性劑、化療劑或藥物綴合的結合成員。
[0037]本發明包括可以試驗試劑盒的形式製備的測定系統用於定量分析例如受損害、受損或受損傷神經元的存在程度或定量測定樣品中的神經元。系統或試驗試劑盒可包括通過本文所述的放射性技術和/或酶技術之一，使標記與抗體偶聯而製備的標記組分，以及一種或多種其它的免疫化學試劑，任選其中至少一種是游離或固定的組分或其結合配偶體。[0038]可在藥物組合物中製備本發明的抗體，且在一個具體的實施方案中為包含本文圖5和圖6提供的重鏈和/或輕鏈序列的重組抗體，或其活性片段和來源於其中、特別包含圖5和圖6所述CDR區序列的單鏈、重組或合成抗體，所述藥物組合物包括合適的溶媒、載體或稀釋劑，用於在其中療法是適宜的情況下給予，以例如治療或改善涉及神經元受損、損害、損傷或死亡的病況或疾病。這類藥物組合物還可包括通過本領域已知方法(例如聚乙二醇化)調節抗體或片段的半衰期的方法。這類藥物組合物還可包含其它抗體或治療劑。
[0039]本發明還包括與其它分子或作用劑共價連接或否則締合的抗體及其片段。這些其它分子或作用劑包括但不限於具有截然不同的識別特徵的分子(包括抗體或抗體片段)、毒素、配體、神經活性劑和化療劑。另一方面，本發明的抗體或片段可用來靶向或導向治療分子或其它作用劑，例如使分子或作用劑靶向神經元，例如靶向皮質神經元、海馬神經元、視網膜神經節細胞或小腦顆粒細胞，包括傷口部位、缺血部位、腫瘤部位、炎症區域或神經變性病灶。
[0040]從接下來的參照下列說明性附圖和隨附權利要求書進行的詳述來看，其它目的和優勢對本領域技術人員而言將是顯而易見的。 附圖簡述
[0041]圖1:與多種類型的神經元表面結合的人IgM。sHIgM42(A)和rHIgM12(C)與共表達神經絲(NF) (B和D)的活的皮質神經元表面結合。在培養基中與lOyg/mllgM溫育10分鐘時間內，將細胞保持在冰上。將細胞固定，洗滌，用抗人μ鏈Fab』2-FITC第二 Ab檢測人IgM。內部NF以特有的節段模式存在。使皮質細胞在聚鳥氨酸包被的蓋玻片上的神經基礎B27培養基中生長6天。並非所有的皮質神經元均表達NF，但是IgM與培養物中的所有神經元結合。rHIgM12(E綠色)和sHIgM42 (F綠色)與共表達神經絲(NF，紅色)的活的小鼠海馬神經元表面結合。使海馬神經元在聚賴氨酸包被塑料上的神經基礎B27培養基中生長I周。使自人顳葉切除而分離的細胞在DMEM/F12/N2/B27中生長21天。rHIgM12與也是β III微管蛋白陽性(F，得自PiOmega的抗β III)的細胞表面結合(G)。
[0042]圖2.人IgM以截然不同的模式標記小腦顆粒細胞表面。使在培養I天的大鼠小腦顆粒細胞與IOy g/ml人血清來源的IgM、sHIgM12或sHIgM42在培養基中在冰上活著溫育15分鐘。在用4%低聚甲醛洗滌和固定後，使細胞在室溫下與FITC綴合的抗人μ鏈抗體一起溫育，並使用免疫螢光顯微鏡成像。使用這兩種抗體的神經元膜標記的模式不同。神經突膜的短區被sHIgM12結合，導致清楚的點狀模式。神經突膜的較大區被sHIgM42結合，導致節段模式。放大倍數為400x。
[0043]圖3.神經元結合性人IgM、rHIgM12和sHIgM42保護培養中的皮質神經元免於過氧化物誘導的細胞死亡。培養3天的小鼠神經元用含或不含10 μ g/ml人IgM的500nMH202或鹽水處理30分鐘。細胞用新鮮的神經基礎B27培養基洗滌，24小時後，使用FLICA胱天蛋白酶-3測定試劑盒(Immunochemistry Technologies935),檢測一式三份處理的96孔中胱天蛋白酶-3的表達。條形柱表示免於胱天蛋白酶3活化的保護％。
[0044]圖4表示用於產生重組抗體的可擴增載體。這是用於產生基於sHIgM22(rHIgM22)的重組抗體的載體圖，該載體經修飾以產生重組IgM12和IgM42。對於在CHO細胞中表達，VH啟動子用ElA啟動子置換。CX輕鏈恆定區用K輕鏈恆定區C K置換。[0045]圖5表示重組載體中的IgM12抗體胺基酸和核酸序列。重鏈胺基酸序列和編碼核酸序列呈灰色，提供並標出Vh的每一個和恆定區序列CH1、CH2、CH3和CH4。輕鏈胺基酸序列和編碼核酸序列呈紫色，標出可變VL和恆定CL(K)序列。注釋了重鏈和輕鏈可變區的CDR區序列。在胺基酸和核酸序列中標示了人J鏈。
[0046]圖6表示重組載體中的IgM42抗體胺基酸和核酸序列。重鏈胺基酸序列和編碼核酸序列呈灰色，提供並標出Vh的每一個和恆定區序列CH1、CH2、CH3和CH4。輕鏈胺基酸序列和編碼核酸序列呈紫色，標出了可變VL和恆定CL(K)序列兩者。注釋了重鏈和輕鏈可變區的⑶R區序列。
[0047]圖7.重組rHIgM12改進患TMEV誘導性疾病的小鼠中的缺陷。在100 μ gsHIgM12的單一 1.p.劑量後3周，平均每小時自發性夜間活動(當小鼠有正常活動性時)改變。在TMEV感染後90天各組5隻SJL小鼠用rHIgM12 (紅色條形柱)或對照人IgM (黑色條形柱)治療，在AccuScan活動監測箱中按組每周監測3天。將3個夜間時段內的每小時夜間水平活動的平均值土SEM與IgM治療前3個夜晚的夜間活動進行比較。在單劑量的rHIgM12治療後3周-7周存在與治療前水平相比夜間活動增加(P〈0.01)，但用對照治療後無增加。對未感染年齡匹配小鼠的運動水平作圖用於比較(綠色條形柱)。
[0048]圖8.在小鼠腦幹採集的MRS光譜。上組圖表示從中採集信號的三維像素。定位該目標區域使用解剖界標。極短MRI掃描用來獲取3個正交平面的圖像以定位腦幹內的2.5mm3立方體(上組圖)。小鼠腦幹的300MHz，IH光譜(下組圖)。容易鑑定出膽鹼(Cho)、肌酸(Cr)和N-乙醯基-天冬氨酸(NAA)峰。光譜參照水(4.7ppm)。
[0049]圖9.腦幹NAA水平降低與軸突喪失增加有關。用TMEV感染後0_270天，對10隻SJL小鼠進行了前瞻性研究。獲得每隻小鼠腦幹的MRS，並測定NAA濃度(上)。在病毒感染後90天(通過橫切面的直接計數顯示大軸突喪失的點)，在達到統計顯著性下降的所有小鼠中記錄到NAA逐漸降低(2)。在疾病持續期間，NAA水平保持低下。未感染小鼠(黑色條形柱)、感染後90天(灰色) 和270天(白色)以T6水平統計的絕對軸突(下)。
[0050]圖10.在單劑量的人IgM後腦幹中的NAA。TMEV感染後90天，當NAA水平開始下降，且可檢出大軸突喪失時，1.P.給予各組10-15隻SJL小鼠單次100 μ g劑量的sHIgM12、sHIgM42、對照人IgM或鹽水(PBS)。在治療前和治療後5周和10周，收集腦幹的MRS。由這些光譜計算NAA水平。在sHIgMl2和sHIgM42治療組中，與治療前水平相比，NAA在5周後(P=0.005，P=0.029)和在10周(Ρ〈0.001，P=0.037)增加。在用對照試劑治療的各組小鼠中是穩定的或趨於向下。該圖表示腦幹三維像素NAA水平的平均值+/-SEM。
[0051]圖11.與神經元結合的人IgM不改變脫髓鞘、髓鞘再生或炎症。各組5隻慢性TMEV感染小鼠用單次100 μ g劑量的人IgM治療。在治療後10周，所有組包括相同程度的脊髓炎症(黑色條形柱)和脫髓鞘(紅色條形柱)。如所預期的一樣，用少突膠質細胞結合性IgM、rHIgM22治療的小鼠，顯示較多髓鞘再生(綠色條形柱)。sHIgM12和sHIgM42不促進脊髓髓鞘再生。這表明體內有保護軸突的多種方式。
[0052]圖12.靜脈內注射後⑶-1小鼠循環中的神經元結合性人IgM的血清半衰期。夾心ELISA用來定量測定48小時內小鼠血清的人μ鏈的衰變。鹼性磷酸酶底物(Sigmal04)的0D405平均值獲自該方法。繪製每組3隻小鼠的血清和標準誤差。
[0053]圖13.35S標記的rHIgM12進入TMEV感染和未感染SJL小鼠的腦和脊髓。將35S標記的rHIgM121.p.給予5個月TMEV感染的和年齡匹配的未感染SJL小鼠。4小時後，一對小鼠用鹽水灌注，急速收穫組織，稱重，用剃刀切碎，並與IOml閃爍液(Ultima Gold LSC)混合。在24小時時重複相同步驟。48小時後，使組織增溶，將小瓶在Beckman閃爍計數器中計數I分鐘。對每隻小鼠的全腦和脊髓總計數繪圖。小瓶中無組織的背景計數為12個計數。
[0054]圖14.神經元結合性人IgM體內靶向脊髓病變。腹膜內給予患慢性TMEV誘導的脊髓脫髓鞘的小鼠1.0mg sHIgM42(A)、rHIgM12(B)或對照人單克隆IgM(C)。4小時後，小鼠用4%低聚甲醛灌注，取出脊髓，冷凍切片，使用針對人μ鏈的FITC綴合的Fab』 2片段(Jackson Immnoresearch)免疫標記。來自接受sHIgM42或rHIgM12的小鼠的脊髓在病變中含有人IgM。病變中幾乎未發現對照人IgM。下組圖為Η/E染色以顯現炎性細胞和病變。我們得出的結論是，在TMEV模型中某些人IgM可穿過BBB。
[0055]圖15.神經元結合性人IgM定位於脊髓病變中神經絲(NF)軸突。腹膜內給予患慢性TMEV誘導的脊髓脫髓鞘的小鼠l.0mg IgM，4小時後處死。將脊髓縱向冷凍切片，用FITC綴合的抗人μ鏈Fab』 2片段(綠色)和抗-NF (SM1-32和34，紅色)免疫標記，接著用TRICT綴合的第二抗體免疫標記。合併的共焦圖像證實sHIgM42(A)與長NF+纖維(B)共定位，在(C)中合併。rHIgM12(D，綠色)也與NF+結構(D，紅色)例如橫切軸突纖維束共定位。
[0056]圖16.rHIgM12和sHIgM42不會使EAE臨床評分變差。1.V.給予患MOG肽誘導的EAE的各組10隻C57BL6小鼠單次100 μ g劑量的rHIgM12、sHIgM42、對照人IgM或鹽水，在每隻小鼠達到I的臨床評分(尾無力)時，每隔一天進行監測直到免疫後28天。圖為每個治療組的平均臨床評分的平均值+/-SEM。平均臨床評分的秩ANOVA ο (ANOVA on ranks)表明組間無差異(P=0.14)。
[0057]圖17.rHIgM12和sHIgM42不加重EAE脊髓病理。在圖13的研究結束時，取出脊髓，切成Imm塊,從每3個的連續 塊中切取橫切面,用erichrome染色以顯現病理。不知情地對10個橫切面/小鼠(40象限(quadrant))進行分級。炎症(P=0.825)或脫髓鞘(P=0.766)
在組間無差異。
[0058]圖18.rHIgM12促進神經突增生
[0059]使E15海馬神經元在聚-D-賴氨酸(PDL) (A)或rHIgM12 (B)硝化纖維包被的蓋玻片上生長。接種(plating)細胞後12小時，將這些神經元固定，並用β3_微管蛋白抗體(Al和BI，綠色)和德克薩期紅鬼筆環肽(Α2和Β2)染色。Α3-Β3是Α1-Α2和Β1-Β2的重疊，其中核用DAPI (藍色)染色。C、D和E顯示總的(C，p=0.0056)、最長(D，p〈0.0001)和次最長(E，p=0.0782)神經突長度的測量值。與具有多個對稱神經突的接種在對照PDL基質上神經元相比(72%與18%)，在rHIgM12上生長的神經元帶有較少神經突(F，p〈0.0001),且大多數為3期神經元(G)。統計分析顯示平均值土 SEM(非配對t檢驗)。
[0060]圖19.rHIgM12驅動軸突形成
[0061]海馬神經元在接種在PDL(A)、H)L+層粘連蛋白(B)或rHIgM12(C)的基質上後12小時用Taul (Al-Cl，綠色)或MAP2(A2-C2，藍色)染色。A3-C3是Al-Cl和2-C2的重疊，將F-肌動蛋白(紅色)用德克薩期紅鬼筆環肽標記。D-F顯示在通過短劃線標示的Al-Cl中，沿自胞體到生長錐的最長神經突的相對Taul強度。Taul染色不對稱地富集在於rHIgM12和層粘連蛋白基質兩者中生長的3期神經元中的最長神經突遠部。
[0062]圖20.rHIgM12結合識別神經元膜
[0063]在固定後，將DIV3海馬神經元用rHIgM12、霍亂毒素B(CTB，Alexa Fluor 594)和非律平三重染色(A)。rHIgM12(Al)均勻地標記神經元表面，其模式類似於分別用CTB或非律平標記的GMl (A2)或膽固醇(A3)的模式。然而，用rHIgM12在37°C下處理30分鐘後，膜結合的rHIgM12在神經元表面聚集(Bl-Cl)。用rHIgM12處理導致膽固醇(B2)和GMl (C2)兩者的群聚，其與聚集的rHIgM12共定位(B3-C3)。B和C底部的下組圖是方框標示區域的更高放大倍數，表明生長錐區中聚集的rHIgM12(綠色)與群聚的膽固醇(藍色)或GMl (紅色)共定位。
[0064]圖21.rHIgM12與神經元膜微域中的GMl共定位
[0065]A.DIVl海馬神經元首先用4%低聚甲醛固定，然後經rHIgM12染色。rHIgM12標記較小的點結構(punctum structure)。B.將活的DIVl海馬神經元冷卻到4°C達30分鐘,然後用rHIgM12標記，接著用抗β-1I1-微管蛋白抗體染色(在固定後)。rHIgM12使神經元表面上大得多的點結構染 色。C.活的DIV3海馬神經元用甲基-β-環糊精在37°C下處理30分鐘以消耗膽固醇，然後冷卻至4°C。固定的神經元然後用rHIgM12(綠色)和霍亂毒素B (紅色)染色。rHIgM12與較大的點(其與由霍亂毒素B標記的GMl共定位)結合。下組圖顯示方框標示區域的更高放大倍數。
[0066]圖22.rHIgM12與脂筏結合
[0067]使活的DIV7皮質神經元在4°C下與rHIgM12或對照IgM抗體結合30分鐘。A.神經元在抗體結合後洗滌3次，在含有0.5%NP-40的緩衝液中裂解。裂解液通過在4°C下微量離心分離，上清液和沉澱兩者用抗人IgM第二抗體進行印跡法。與不與神經元結合併洗掉的對照IgM抗體相比，rHIgM12在沉澱和上清液兩者中均有分布。下組圖顯示加載等量的蛋白質的各個考馬斯染色凝膠。B.在含有l%TritonX-100的緩衝液中裂解的神經元在4°C下以蔗糖梯度通過超速離心分級分離。相繼針對rHIgM12、窖蛋白-1、運鐵蛋白受體、β 3-微管蛋白(B3-Tub)和β-肌動蛋白，用特異性抗體對所得流分進行印跡法。rHIgM12對位於含有窖蛋白-1和β 3-微管蛋白的低密度流分。較高密度流分含有運鐵蛋白受體、β 3-微管蛋白和肌動蛋白。一些rHIgM12定位於去汙劑不溶性沉澱，所述沉澱主要由微管蛋白中富含的細胞骨架蛋白組成。大部分肌動蛋白進入去汙劑可溶性較高密度流分。
[0068]圖23.rHIgM12與微管締合
[0069]A.首先將DIVl海馬神經元在37°C下用rHIgM12處理30分鐘，然後用含有4%低聚甲醛和0.l%TritonX-100的緩衝液同時固定並提取，接著針對rHIgM12 (綠色)、β 3-微管蛋白(藍色)和F-肌動蛋白(紅色)進行染色。rHIgM12結合去汙劑不溶性分子，所述去汙劑不溶性分子與沿神經突幹(neurite shaft) (A2和4)和在生長錐中心域的束狀微管共定位，但不與位於生長錐周圍的F-肌動蛋白共定位(A3和4)。B.使DIV7皮質神經元先結合rHIgM12，然後在0.5%NP-40中裂解。對上清液進行免疫共沉澱。rHIgM12和β 3-微管蛋白兩者彼此免疫共沉澱。
[0070]圖24.提出的rHIgM12促進軸突形成的機制
[0071]A.神經元膜含有後微域(raft microdomain)和非後微域(nonraftmicrodomain)兩種。在神經元膜均勻分布的筏微域分隔成兩個庫。它們之一與微管締合。B.rHIgM12的結合誘導筏微域群聚，這促進了微管穩定並錨定神經元膜。C.在神經突增生期間，通過與rHIgM12相互作用，生長錐探測環境，而筏微域群聚。結果，微管穩定於rHIgM12接觸部位並錨定神經元膜，這促進圖3和圖6中觀察的生長錐周圍至中心域轉換，其中施用bath的rHIgM12在生長錐中心域聚集。
[0072]圖25.rHIgM12不與微管蛋白直接締合
[0073]A.N2A成神經細胞瘤細胞用rHIgM12(Al，綠色)和β3_微管蛋白(Α2，紅色)染色。核用DAPI (A3，藍色)標記。Ν2Α細胞是rHIgM12染色陰性的，但表達β3-微管蛋白。B.將Ν2Α細胞裂解液的上清液與rHIgM12 —起溫育，與rHIgM12締合的分子被蛋白質-L瓊脂糖拉下(pulled down),並進行蛋白質印跡法。rHIgM12不與沉澱締合。β3_微管蛋白不被rHIgM12拉下，但在上清液中檢出。
[0074]圖26.rHIgM12拉下肌動蛋白，但不與F-肌動蛋白共定位
[0075]A.在固定後，先將DIVl活的海馬神經元在4°C下用rHIgM12(Al，綠色)染色，將F-肌動蛋白(A2，紅色)用德克薩期紅鬼筆環肽標記。在生長錐區，F-肌動蛋白收縮，且在中心域富集，而rHIgM12使生長錐表面上點結構均勻染色，這就標記了生長錐的最邊緣。B.少量肌動蛋白被rHIgM12拉下，3種所測的抗肌動蛋白抗體無一在免疫沉澱反應中起作用。位於與β 3-微管蛋白類似位置的條帶是用空心箭頭標示的IgG重鏈。
[0076]圖27 (a)細胞膜將在有數千納米孔(大小為200nm)穿孔的薄金膜上重構。(b)懸浮金膜與兩側的緩衝溶液接觸。
[0077]圖28.與神經元結合的人抗體促進神經突延伸。將神經元接種在用人IgM包被的基質上，使之生長24小時後，用抗神經絲進行免疫標記。與非許可性人IgM(B)相比，sHIgM42誘導增生(A)。
[0078]圖29.與神經元結合的人抗體使膜域群聚。在(TC下進行體細胞(soma)和軸突上的均勻免疫標記(A)。當細胞升溫至15°C達15分鐘時，sHIgM42定位在軸突細胞表面上更多的分散斑塊上(B)。
[0079]圖30.促進神經突延伸的人抗體體內靶向損傷部位。將抗體1.p.給予患有慢性SCI的小鼠，4小時後取出脊髓，在脊髓橫切面中檢測人IgM。來自給予抗體的小鼠的脊髓受損區顯示結合帶螢光標籤的抗人IgM的平行纖維(A)。來自給予對照人IgM的小鼠的脊髓受損區不含人IgM(B)。
[0080]圖31.脊髓擠壓傷。顯微照片顯示來自對照小鼠(A)或SgFejota夾壓迫後30天小鼠(B)的H&E染色脊髓的典型外觀。壓傷與廣泛炎性細胞浸潤、運動神經元喪失有關。
[0081]圖32.TMEV感染小鼠自發性夜間活動的實例。A)在64天時間內水平活動原始完整記錄。多夜間活動和少晝間活動易於理解。因為小鼠正常在夜間活動，因此我們選擇夜間活動用於分析^PM-6AM)。然而，通過目視檢查水平(B)或垂直(C)活動中的未過濾壓縮記錄，可能難以鑑定真實的長期改變。
[0082]圖33.單次1.p.劑量的神經元結合抗體(rHIgM12)改善慢性感染SJL小鼠的水平活動。在90dpi將3組(5隻SJL小鼠)放入AccuScan活動監測箱。在8天時間內收集基線測量。在治療後，在8周內連接監測小鼠。組圖A、C和E相當於水平活動，B、D和F相當於垂直活動。A、B)作為每天的箱(bins)提供的平均夜間活動，表明僅在rHIgM12治療組的水平活動有改善；C)高斯濾波(GB=2天)和E)標準化Z值的6階多項式擬合得出rHIgM12治療小鼠中清楚明顯的改善。B、D和F)垂直活動不受任何治療影響。活動(垂直標度)是每小時光束中斷次數。參數GB可解釋為半高時濾波器半寬的值(單位:天)。隨著GB值增加，標準差降低。給出每天的逐點95%置信帶。
[0083]圖34.通過使用預測模型值在90dpi進行3種治療的比較。在治療之前和之後每天進行統計分析。與對照IgM治療和鹽水治療小鼠相比,在治療後第7天(p=0.045)和第11天(p=0.042)，rHIgM12治療小鼠的水平夜間活動分別顯著偏離/改善(用黑色箭頭標示)。給出每天的逐點95%置信帶。
[0084]圖35.當在疾病早期給予時rHIgM12改善SJL小鼠的水平和垂直兩種活動。在45dpi將5隻SJL小鼠3組放置在AccuScan活動監測箱中。在8天時間內收集基線測量。在治療後，在8周內連接監測小鼠。組圖A、C、E和G相當於水平活動，B、D、F和H相當於垂直活動。A、B)水平和垂直活動的原始未濾過記錄；C、D)作為每天的箱(bins)提供的平均夜間活動；E、F)高斯濾波(GB=2天)；和G、H)標準化Z值的6階多項式擬合顯示rHIgM12治療組中水平和垂直兩種活動皆改善。對照IgM治療組和鹽水治療組顯示整個研究中運動活動水平相似。給出每天的逐點95%置信帶。
[0085]圖36.通過使用預測模型值在45dpi進行3種治療的比較。在治療之前和之後每天進行統計分析。A、C)與對照IgM治療和鹽水治療小鼠相比，治療後第13天(p=0.015)和第9天(p=0.036)，rHIgM12治療小鼠的水平夜間活動分別顯著偏離。B、D)治療後第14天(p=0.019)和第6天(p=0.037)，rHIgM12治療小鼠的垂直(直立)活動分別偏離/改善。黑色箭頭表示開始顯著改善的日期。給出每天的逐點95%置信帶。
[0086]圖37.正常未感染SJL小鼠具有不受任何治療影響的高度可變的自發活動。將5隻未感染SJL小鼠3組放入AccuScan活動監測箱。在8天時間內收集基線測量。在治療後，在8周內連接監測小鼠。任何治療都不引起水平(A、C、E和G)或垂直(B、D、F和H)活動改變。給出每天的逐點95%置信帶。
[0087]圖38.單劑量的人抗體延長S0D1G86R突變型轉基因小鼠的存活。在55日齡時，小鼠用單劑量的rHIgM12或PBS治療。一些小鼠則未治療。跟蹤小鼠直到漸死，然後處死用於病理學。一些小鼠死於疾病。所有小鼠在死亡前都有極度的體重減輕。使用Kaplan-Meir曲線繪製存活率，使用非參數Mantel-Cox檢驗確定統計顯著性。與PBS治療或未治療小鼠相比，用rHIgM12治療的小鼠中存活率提高，P=0.008。所有分析和治療以不知情方式進行，使得做出處死小鼠決定的研究人員不了解治療組。在該分析中研究了共45隻小鼠。同窩野生型SOD+/+小鼠具有正常的存活率且無體重減輕(數據未顯示)。
[0088]圖39表示在50日齡時給予單次200 μ g劑量的rHIgM12的小鼠與給予PBS的對照小鼠中，G86R SODl小鼠的體重減輕隨時間而變化。給予rHIgM12的小鼠顯示在單次抗體注射後，在60天時間內較少體重減輕。
[0089]圖40.S0D1G86R突變型轉基因小鼠中單劑量的人抗體減少脊髓軸突變性。在55日齡時，小鼠用單次250μ g劑量的rHIgM12或PBS治療。一些小鼠則未治療。在位於胸正中水平的脊髓中，統計變性軸突特有的髓磷脂螺環(whorl)的數目。與PBS治療(P=0.003，T檢驗)和未治療小鼠相比，用rHIgM12治療的SODl突變型小鼠的變性軸突數減少。注意，與SODl+/+突變體小鼠相比，野生型SOD-/-小鼠脊髓中的變性軸突數最少。在處死時，小鼠用Trump固定液(4%甲醒,0.1%戍二醒(gluataraldehyde))灌注,將脊髓切成Imm塊。將骨髓塊包埋在Araldite塑料中，來自T6水平的I微米切片用對苯二胺染色以顯現髓磷脂環繞(wrapping)。顯示野生型SOD-/-(右上)和SODl+/+突變型(右下)的脊髓切片。
[0090]圖41.單劑量的人抗體保護S0D1G86R突變型轉基因小鼠脊髓中的前角和后角神經元兩者。在55日齡時，小鼠用rHIgM12或PBS治療。一些小鼠則未治療。在胸中正水平處脊髓的石蠟切片中，統計用特異性標記神經元的抗NeuN抗體染色的前角和后角細胞數目。rHIgM12治療小鼠中前角和后角細胞的數目比用PBS治療的小鼠或未治療小鼠顯著較多(P=0.0025和P=0.018，通過T檢驗)。用rHgM12治療的SOD突變體小鼠的前角和后角細胞的數目與野生型SOD-/-小鼠中觀察到的數目類似。
[0091]圖42.重組人抗體rHIgM12與各物種的神經元結合。
[0092]小鼠皮質神經元(A、B、C、D)、小鼠海馬神經元(E、F)和人皮質神經元(G、H)用rHIgM12(A、C、E和G)活染，相同細胞用抗神經絲抗體(B、D)或β微管蛋白(F、G)共標記。rHIgM12用帶螢光標籤的第二抗體檢測。
[0093]發明詳沭
[0094]按照本發明，可採用技術人員所掌握的常規分子生物學、微生物學和重組DNA技術。這類技術在文獻中有完整解釋。參見例如Sambrook等，"Molecular Cloning:ALaboratory Manual"(1989) ;〃Current Protocols in Molecular Biology^ 第 1-1II卷[Ausube I, R.M.主編(1994)] ;"Cell Biology:A Laboratory Handbook"第 1-1II 卷[J.E.Celis 主編(1994)) ] ,Current Protocols in Immunology〃第 1-1II 卷[Coligan, J.E.主編(1994)] ;"Oligonucleotide Synthesis"(M.J.Gait 主編.1984) ,NucleicAcid Hybridization^[B.D.Hames 和 S.J.Higgins 主編(1985)] ,Transcription AndTranslation"[B.D.Hames 和 S.J.Higgins 主編(1984)] ;"Animal Cell Culture^[R.1.Freshney 主編(1986)] !"Immobilized Cells And Enzymes"[IRLPress, (1986)]；B.Perbal, 〃APractical Guide To Molecular Cloning"(1984)。
[0095]因此，下列術語如果在本文中出現，則將具有如下給出的定義。
[0096]A.術語
[0097]術語「特異性結合成員」描述了彼此具有結合特異性的一對分子的成員。特異性結合對的成員可以是天然來源的或者完全或部分合成產生的。該分子對的一個成員在其表面上具有區域或腔，或其表面上具有組分，與分子對的另一個成員的特定空間和極性組構特異性結合，因此與分子對的另一個成員的特定空間和極性組構互補。因此該對的成員具有彼此特異性結合的性質。特異性結合對的類型的實例為抗原-抗體、生物素-抗生物素蛋白、激素-激素受體、受體-配體、酶-底物。本申請涉及抗原-抗體型反應。
[0098]術語「抗體」描述了不管是天然的還是部分或完全合成產生的免疫球蛋白。該術語還涵蓋具有結合結構域的任何多肽或蛋白質，所述結合結構域是抗體結合結構域或與抗體結合結構域同源。該術語還考慮CDR移植抗體。「抗體」是任何免疫球蛋白，包括結合特定表位的抗體及其片段。該術語包括多克隆、單克隆和嵌合抗體，最後提及的更詳細描述於美國專利號4，816，397和4，816，567。該術語「抗體」包括野生型免疫球蛋白(Ig)分子，一般包含4條全長多肽鏈，2條重(H)鏈和2條輕(L)鏈，或其等同的Ig同源物(例如只包含重鏈的駱騎(cameI id)納米抗體)；包括其保持Ig分子的基本表位結合特徵的全長功能性突變體、變體或衍生物，並且包括雙重特異性抗體、雙特異性抗體、多特異性抗體和雙重可變結構域抗體；免疫球蛋白分子可為任何類別(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)或亞類(例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl和IgA2)。還包括在術語「抗體」含義內的有任何「抗體片段」。
[0099]「抗體片段」意指包含至少一個不是全長的多肽鏈的分子，包括(i)Fab片段，其是由可變輕鏈(VL)、可變重鏈(VH)、恆定輕鏈(CL)和恆定重鏈I(CHl)結構域組成的單價片段；(ii)F(ab』)2片段，其是包含在鉸鏈區通過二硫橋連接的2個Fab片段的二價片段；(iii)Fab (Fd)片段的重鏈部分，其由VH和CHl結構域組成；(iv)可變片段(Fv)片段，其由抗體單臂的VL和VH結構域組成，(V)結構域抗體(dAb)片段，其包含單一可變結構域(Ward, E.S.等，Nature341, 544-546 (1989)) ； (vi)駱馬它抗體；(vii)分離的互補決定區(OTR) ; (viii)其中VH結構域和VL結構域通過肽接頭連接的單鏈Fv片段，所述接頭允許兩個結構域締合形成抗原結合部位(Bird等，Science, 242,423-426,1988 ；Huston等，PNASUSA，85，5879-5883，1988) ； (ix)雙鏈抗體，其是二價雙特異性抗體，其中VH和VL結構域在單一多肽鏈上表達，但是使用太短的接頭使得在相同鏈上的兩個結構域之間無法配對，從而迫使結構域與另一條鏈的互補性結構域配對，並產生兩個抗原結合部位(W094/13804 ；P.Holliger 等 Proc.Natl.Acad.Sc1.USA906444-6448，(1993));和(x)線性抗體，其包含串聯Fv區段對(VH-CH1-VH-CH1)，它與互補性輕鏈多肽一起形成抗原結合區對；(xi)多價抗體片段(scFv 二聚體、三聚體和/或四聚體(Power和Hudson, JImmunol.Methods242:193-2049(2000));以及(xii)單獨或以任何組合的重鏈和/或輕鏈的其它非全長部分或其突變體、變體或衍生物。
[0100]因為抗體可以多種方式修飾，因此術語「抗體」應解釋為涵蓋任何特異性結合成員或具備具有所需特異性的結合結構域的物質。因此，該術語涵蓋抗體片段、衍生物、抗體的功能性等同物和同源物，包括包含不論是天然還是完全或部分合成的免疫球蛋白結合結構域的任何多肽。因此包括包含與另一多肽融合的免疫球蛋白結合結構域或等同物的嵌合分子。嵌合抗體的克隆和表達描述於EP-A-0120694和EP-A-0125023和美國專利號4，816，397和 4，816，567。
[0101]「抗體結合部位」 是由輕鏈或重鏈和特異性結合抗原的輕鏈可變區和超變區構成的抗體分子的結構部分。
[0102]本文所用的呈其不同語法形式的短語「抗體分子」考慮完整免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分兩者。
[0103]示例性的抗體分子是完整的免疫球蛋白分子、基本完整的免疫球蛋白分子和含有抗原互補位的免疫球蛋白分子的那些部分，包括本領域已知的那些部分，如Fab、Fab』、F(ab』 )2和F(v)，所述部分優選用於本文所述治療方法。
[0104]抗體還可以是雙特異性的，其中抗體的一個結合結構域是本發明的特異性結合成員，另一個結合結構域具有不同的特異性，例如募集效應子功能等。本發明的雙特異性抗體包括其中抗體的一個結合結構域是本發明的特異性結合成員(包括其片段)，另一個結合結構域是截然不同的抗體或其片段，包括截然不同的抗癌或抗腫瘤特異性抗體的結合結構域。另一個結合結構域可以是識別或靶向特定細胞類型的抗體，如神經或神經膠質細胞特異性抗體。在本發明的雙特異性抗體中，本發明抗體的一個結合結構域可與識別特定細胞受體和/或以特定方式調節細胞的其它結合結構域或分子結合，所述其它結合結構域或分子例如免疫調節劑(例如白介素)、生長調節劑或細胞因子(例如腫瘤壞死因子(TNF)，特別是2002年2月13日提交的U.S.S.N.60/355, 838所示TNF雙特異性形式，該文獻以其整體結合到本文中)或毒素(例如蓖麻毒蛋白)或抗有絲分裂劑或抗凋亡劑或因子。因此，本發明的抗FAP抗體可用來使作用劑、標記、其它分子或化合物或抗體導向或靶向間質部位，特別是傷口癒合、炎症、癌症或腫瘤的區域。
[0105]呈其不同語法形式的短語「單克隆抗體」是指只具有一種能夠與特定抗原進行免疫反應的抗體結合部位的抗體。因此單克隆抗體通常對與之起免疫反應的任何抗原顯示單一結合親和力。單克隆抗體還可含有具有多個抗體結合部位的抗體分子，其對不同的抗原各有免疫特異性；例如雙特異性(嵌合)單克隆抗體。
[0106]術語「抗原結合結構域」描述了包含與抗原的部分或全部特異性結合和互補的區域的抗體部分。如果抗原大，則抗體可只與抗原的特定部分結合，該部分稱為表位。可通過一個或多個抗體可變結構域提供抗原結合結構域。優選抗原結合結構域包含抗體輕鏈可變區(VL)和抗體重鏈可變區(VH)。
[0107]本發明的免疫綴合物或抗體融合蛋白(其中用於本發明的抗體、抗體分子或其片段與其它分子或作用劑綴合或連接)還包括但不限於與以下綴合的這類抗體、分子或片段:化學消融劑、毒素、免疫調節劑、細胞因子、細胞毒性劑、化療劑、抗微生物劑或肽、細胞壁和/或細胞膜破碎劑或藥物。
[0108]術語「特異性」可用來指其中特異性結合對的一個成員對不是其特異性結合配偶體的分子將不顯示任何明顯結合的情形。在例如抗原結合結構域對多種抗原攜帶的特定表位有特異性時，該術語同樣適用，在此情況下攜帶抗原結合結構域的特異性結合成員將能夠與攜帶所述表位的各種抗原結合。
[0109]術語「包含」一般以包括的含義使用，也就是說允許一種或多種特徵或組分存在。
[0110]術語「基本由… …組成」是指不與較大產物共價連接的限定殘基數的產物，特別是肽序列。然而，在上述本發明的肽的情況下，本領域技術人員應了解，可考慮肽的N端或C端的少量修飾，例如添加保護基等的末端化學修飾，例如C端的醯胺化。
[0111]術語「分離的」是指其中本發明的特異性結合成員或編碼這類結合成員的核酸按照本發明可呈現的狀態。成員和核酸將不含或基本不含它們與之天然締合的物質，例如它們與之存在於其天然環境或其中製備它們的環境(例如細胞培養)(當這類製備通過體外或體內實施的重組DNA技術時)中的其它多肽或核酸。成員和核酸可用稀釋劑或輔助劑配製，並且仍用於待分離的實際目的——例如如果用來包被微量滴定板，成員通常將與明膠或其它載體混合以用於免疫測定法，或當用於診斷或治療時，將與藥學上可接受的載體或稀釋劑混合。
[0112]本文所用「pg」意指皮克，「ng」意指毫微克，「ug」或「 μ g」意指微克，「mg」意指毫克，「ul 」或「 μ I 」意指微升，「ml 」意指意指毫升，「 I 」意指升。
[0113]本文可使用術語「抗體」、「神經元結合性抗體」、「IgM12抗體」、「IgM42抗體」、「抗體 12」、「抗體 42」、「 sHIgMl2」、「 sHIgM42」、「rHIgMl2」、「rHIgM42」 和未特別列出的任何變體，並且如整個本申請和權利要求書所用的是指蛋白質性物質，包括單一蛋白質或多種蛋白質，並延伸至具有本文所述和圖5和圖6提供的胺基酸序列數據及本文和權利要求書中給出的活性概況的蛋白質。特別是IgM12抗體、抗體12、rHI gMl 2具體是指包含圖5所示序列的多肽或抗體或片段，特別是重組抗體或片段。IgM12抗體、抗體12、rHIgM12具體是指包含SEQIDNO:31-33所示重鏈可變區CDR序列和SEQIDN0:34-36所示輕鏈可變區CDR序列的多肽或抗體或片段，特別是重組抗體或片段。IgM12抗體、抗體12、rHI gMl 2包括具有SEQIDN0:1的重鏈可變區序列和SEQIDNO: 11的輕鏈可變區序列的抗體。特別是IgM42抗體、抗體42、rHIgM42具體是指包含圖6所示序列的多肽或抗體或片段，特別是重組抗體或片段。IgM42抗體、抗體42、rHIgM42具體是指包含SEQIDN0:37-39所示重鏈可變區⑶R序列和SEQIDN0:40-42所示輕鏈可變區⑶R序列的多肽或抗體或片段，特別是重組抗體或片段。IgM42抗體、抗體42、rHIgM42包括具有SEQIDN0:17的重鏈可變區序列和SEQIDN0:27的輕鏈可變區序列的抗體。因此，同樣考慮顯示基本等同的活性或改變的活性的蛋白質。這些修飾可以是有意的，例如通過位點定向誘變獲得的修飾，或可以是意外的，例如在是複合體或其指定亞基的產生者的宿主中通過突變所獲得的修飾。此外，術語「抗體」、「神經元結合性抗體」、「IgMl2 抗體」、「IgM42 抗體」、「抗體 12」、「抗體 42」、「sHIgM12」、「sHIgM42」、「rHIgM12」、「rHIgM42」在其範圍內欲包括本文明確記載的蛋白質以及所有基本同源的類似物和等位基因變異。
[0114]本文所述胺基酸殘基優選呈「L」異構體。然而，呈「D」異構體的殘基可取代任何L-胺基酸殘基，只要多肽保持免疫球蛋白-結合所需的功能性質。NH2是指存在於多肽氨基端的游離氨基。COOH是指存在於多肽羧基端的游離羧基。與標準多肽命名J.Biol.Chem.，243:3552-59 (1969) 一致，下面顯示胺基酸殘基的縮寫。
[0115]對應表:
[0116]對應表
[0117]
【權利要求】
1.一種分離的人IgM抗體或其片段，所述抗體或其片段特異性結合神經元，保護神經元免於細胞死亡，並且不促進髓鞘再生，其中所述抗體或片段包含下列序列: (a)圖5給出的可變重鏈胺基酸CDR結構域序列CDRlGGSVSLYY (SEQ ID N0:31)、CDR2GYIYSSGST (SEQ ID NO: 32)和 CDR3 ARSASIRGffFD (SEQ ID NO: 33)及輕鏈 CDR 序列 CDRlQSISSY (SEQ ID NO:34), CDR2 AAS (SEQ ID NO:35)和 CDR3 QQSYHTPff (SEQ ID NO:36)；或者 (b)圖6給出的可變重鏈胺基酸CDR結構域序列CDRlGFTFSTYA (SEQ ID NO:37)、CDR2 INVGGVTT (SEQ ID N0:38)和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF (SEQ ID NO: 39)及輕鏈 CDR序列 CDRl QGIG (SEQ ID N0:40)、CDR2 TTS (SEQ ID N0:41)和 CDR3 QKYNSAPRT (SEQ IDNO:42)， 所述抗體或其片段用於治療或改善其中神經受損、損傷或損害或有其風險的哺乳動物的疾病或病況。
2.權利要求1的分離抗體，其包含SEQID NO:1所示可變重鏈胺基酸序列和SEQ IDNO: 11所示可變輕鏈胺基酸序列或包含SEQ ID NO: 17所示可變重鏈胺基酸序列和SEQ IDNO:27所示可變輕鏈胺基酸序列。
3.權利要求1的分離抗體或其片段，其包含可變重鏈胺基酸CDR結構域序列CDRlGFTFSTYA (SEQ ID N0:37)、CDR2 I NVGGVTT (SEQ ID N0:38)和 CDR3 VRRSGPDRNSSPADF(SEQ ID NO:39)及輕鏈 CDR 序列 CDRl QGIG (SEQ ID N0:40)、CDR2 TTS (SEQ ID N0:41)和 CDR3 QKYNSAPRT (SEQ ID NO:42)。
4.權利要求3的分離抗體，其包含圖6中給出的SEQID NO: 17所示可變重鏈胺基酸序列和SEQ ID NO:27所示可變輕鏈胺基酸序列。
5.權利要求1、3或4的分離抗體，其是重組抗體rHIgM42。
6.權利要求3的分離抗體或其片段，其是包含重鏈和輕鏈可變區的抗體或抗體片段或者其高度同源的變體，所述重鏈和輕鏈可變區含有選自胺基酸序列SEQ ID NO: 17和27的胺基酸序列，其中所述變體保持神經元結合和神經保護活性。
7.權利要求1的分離抗體或其片段，其包含可變重鏈胺基酸CDR結構域序列CDRlGGSVSLYY (SEQ ID N0:31)、CDR2 GYIYSSGST (SEQ ID NO:32)和 CDR3 ARSASIRGffFD (SEQID NO:33)及輕鏈 CDR 序列 CDRl QSISSY (SEQ ID N0:34)、CDR2 AAS (SEQ ID NO:35)和CDR3 QQSYHTPff (SEQ ID NO:36)。
8.權利要求1或7的分離抗體，其還包含人J鏈序列。
9.權利要求8的抗體，其中所述J鏈包含SEQID NO: 15所示胺基酸序列。
10.權利要求7或8的抗體，其包含SEQID NO:1所示可變重鏈胺基酸序列和SEQ IDNO: 11所示可變輕鏈胺基酸序列。
11.權利要求1、7、8或10的分離重組抗體，其是重組抗體rHIgM12。
12.權利要求7的分離抗體或其片段，其是包含重鏈和輕鏈可變區的抗體完全人抗體或或其片段或者其高度同源的變體，所述重鏈和輕鏈可變區含有選自胺基酸序列SEQ IDNO:1和11的胺基酸序列，其中所述變體保持神經元結合和神經保護活性。
13.用於以下疾病的權利要求1-12中任一項的分離抗體或其片段:脊髓損傷(SCI)、創傷性腦損傷(TBI)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、多發性硬化(MS)、阿爾茨海默病、中風、帕金森病、亨廷頓舞蹈病、產前缺氧/圍產期缺血、大腦性麻痺、腦病、脊髓病或運動神經元疾病。
14.權利要求1的分離抗體，其與髓鞘再生抗體組合配製用於治療或改善其中樞神經系統神經受損、損傷或損害或有其風險的哺乳動物的疾病或病況。
15.權利要求14的分離抗體，其中組合的髓鞘再生抗體選自IgM22和IgM46。
16.權利要求15的抗體，其中組合的髓鞘再生抗體包含SEQID NO:43和44所示重鏈和輕鏈可變區序列，或包含SEQ ID NO:45和46所示重鏈和輕鏈可變區序列。
17.用可檢測標記或功能標記標記的權利要求1-12中任一項的抗體。
18.權利要求17的抗體，其中所述標記是酶、特異性結合配偶體、配體、染料、螢光標籤和/或放射性元素。
19.一種分離核酸，其包含編碼權利要求1-12中任一項的抗體或片段的序列。
20.一種製備權利要求1-12中任一項限定的抗體或片段的方法，所述方法包括在引起所述抗體或片段表達的條件下表達權利要求17的核酸，和回收所述抗體或片段。
21.一種藥物組合物，其包含權利要求1-12中任一項限定的抗體或片段和藥學上可接受的溶媒、載體或稀釋劑。
22.一種用於治療或改善動物受試者的神經細胞損傷、損害或死亡的藥盒，所述藥盒包含權利要求21的藥物組合物的藥物劑型和含有一種或多種其它神經活性劑或治療劑、抗炎劑、神經遞質釋放調節劑、神 經受體配體或激動劑或拮抗劑、鈣通道作用劑、免疫調節劑或其它CNS反應性抗體的單獨的藥物劑型。
23.權利要求22的藥盒，其中所述其它CNS反應性抗體是選自IgM22和/或IgM46的髓鞘再生抗體。
24.一種用於檢測患有導致CNS損害的疾病、病況或併發症的哺乳動物的神經損傷、死亡或損害的存在情況或程度的方法，所述方法包括: A.使來自其中疑似存在神經損傷、死亡或損害的哺乳動物的生物樣品與權利要求1-12中任一項的抗體或片段在允許所述抗體或片段與所述樣品中的神經元結合發生的條件下接觸；和 B.檢測來自所述樣品的所述神經元與抗體間是否發生結合或者測定來自所述樣品的所述神經元與抗體已發生結合的量； 其中檢出結合表明在所述樣品中存在神經細胞損傷、死亡或損害，而結合的量表明神經細胞損傷、死亡或損害的相對量。
25.一種用於靶向並測定哺乳動物CNS中的神經元損傷、死亡或損害或者有其風險的細胞的方法，所述方法包括給予所述哺乳動物可檢測標記量的權利要求1-12中任一項的抗體，並測定所述哺乳動物CNS中標記的量和/或其位置。
【文檔編號】A61K39/395GK103429260SQ201180061125
【公開日】2013年12月4日 申請日期:2011年10月19日 優先權日:2010年10月19日
【發明者】M.羅德裡格斯, A.E.沃林頓, L.R.皮斯 申請人:梅奧醫學教育和研究基金會