使用硫酸鹽通透酶表達增強的微生物製備甲硫氨酸及其前體高絲氨酸或琥珀醯高絲氨酸...的製作方法

2023-04-27 02:46:41

專利名稱：：使用硫酸鹽通透酶表達增強的微生物製備甲硫氨酸及其前體高絲氨酸或琥珀醯高絲氨酸...的製作方法
技術領域：
：本發明涉及通過在包含碳源和硫源的適當培養基中培養微生物來生產曱硫氨酸或其衍生物的方法。要求保護的微生物以下述方式修飾半胱氨酸和/或Cl單位的產生被增強和/或Cl單位向高半胱氨酸上的轉移潛力被提高或優化。還要求保護從發酵培養基中分離甲硫氨酸或其衍生物。
背景技術：
：含硫的化合物例如半胱氨酸、高半胱氨酸、甲硫氨酸或S-腺普曱硫氨酸對於細胞代謝是關鍵性的，並被工業生產以用作食品或飼料添加劑和藥物。尤其是甲硫氨酸(一種不能由動物合成的必需胺基酸)在許多身體功能中起重要作用。除了其在蛋白質生物合成中的作用以外，曱硫氨酸還涉及轉曱基作用以及硒與鋅的生物利用率。甲硫氨酸也被直接用於治療病症如變態反應和風溼熱。儘管如此，所生產的大部分甲硫氨酸被添加進動物飼料中。BSE和禽流感導致動物來源蛋白質的使用減少，因此對純甲硫氨酸的需求提高。從化學上講，D,L-甲硫氨酸普遍由丙烯醛、甲基硫醇和氰化物產生。然而例如在雞飼料添加劑中，外消旋混合物不如純L-曱硫氨酸功效好(Saunderson,C丄.，(1985)BritishJournalofNutrition54，621-633)。純L-甲硫氨酸可由外消旋甲硫氨酸產生，例如通過用醯基酶處理N-乙醯基-D，L-甲硫氨酸來產生，這顯著提高了生產成本。與環境因素相關而對純L-甲硫氨酸逐漸增加的需求使得曱硫氨酸的微生物生產很有吸引力。微生物已經發展出高度複雜的調節機制，所述機制精細地調節細胞組分的生物合成，從而允許最大的生長速度。因此，只有需要量的代謝物(例如胺基酸)被合成，並且通常不能在野生型菌林的培養上清液中檢測到。細菌主要通過酶的反饋抑制和基因轉錄的阻抑或激活來控制胺基酸生物合成。這些調節途徑的效應物在多數情況下是相關途徑的最終產物。因此，用於在微生物中過量生產胺基酸的策略需要解除這些控制機制的調節。L-甲硫氨酸合成的途徑在許多微生物中是公知的。甲硫氨酸來自胺基酸天冬氨酸，但是其合成需要匯聚兩個其它途徑一一半胱氨酸生物合成和Cl代謝(N-甲基四氫葉酸)。天冬氨酸通過一系列三個反應轉化為高絲氨酸。高絲氨酸可隨後進入蘇氨酸/異亮氨酸或甲硫氨酸生物合成途徑。在大腸桿菌中，進入甲硫氨酸途徑需要將高絲氨酸醯化成琥珀醯高絲氨酸。該活化步驟允許隨後與半胱氨酸縮合，產生含石危醚的胱硫醚，胱硫醚水解得到高半胱氨酸。通過812依賴性或812非依賴性甲基轉移酶進行最後產生曱硫氨酸的甲基轉移。大腸桿菌中的甲硫氨酸生物合成受到MetJ和MetR蛋白分別阻抑和激活曱硫氨酸生物合成基因的調節(綜述於Neidhardt,F.C.(主編)，R.CurtissIII，J.L.Ingraham，E.C.C.Lin,K.B.Low,B.Magasanik,W.S.Reznikoff,M.Riley,M.Schaechter，以及H.E.Umbarger(編輯)，1996,EscherichiacoliandSalmonella:CellularandMolecularBiology.AmericanSocietyforMicrobiology;Weissbach等，1991Mol.Microbiol.,5,1593-1597)。已知MetJ與其輔阻抑物S-腺普甲硫氨酸調節基因we,A、附CB、附WC、附CE和w"F。編碼涉及甲石危氨酸產生的酶的其它基因(例如gfyA、附WE、附e沮和w^F)由MetR激活，而附CA被MetR阻抑。相應的酶均參與Cl單位的產生及其從絲氨酸到甲硫氨酸的轉移。GlyA編碼的絲氨酸羥甲基轉移酶催化絲氨酸轉化成甘氨酸以及輔酶四氫葉酸(THF)上Cl單位的並發轉移。亞甲基-THF形式的Cl單位需要還原成甲基-THF，然後才能轉移到高半胱氨酸上，得到甲硫氨酸。該反應由MetF蛋白催化。甲基的轉移由MetH通過維生素B12催化或直接由MetE催化。已知MetH酶的催化速率比MetE酶高一百倍。在沒有B12、因此也沒有活性MetH時，MetE可構成細胞總蛋白的多達5%。活性MetH的存在很可能通過減少高半胱氨酸的量來降低MetE活性，高半胱氨酸通常通過MetR激活附WE的轉錄。因此，由於不表達大量的MetE，經由MetH的曱石危氨酸產生為細胞節約了重要的資源。高半胱氨酸的累積對於大腸桿菌是有毒的(Tuite等，2005J.Bacterid,187,13,4362-4371.),同時對經由MetR的柳CA表達具有負調節效應。因此，酶MetH和/或MetE的強表達顯然是高效產生曱硫氨酸所需要的。在大腸桿菌中，還原的硫整合進半胱氨酸中，然後轉移至甲硫氨酸前體O-琥珀醯高絲氨酸上，該過程稱作轉硫化作用(transulfuration)(綜述於Neidhardt,F.C.(主編),R.CurtissIII,J.L.Ingraham,E.C.C.LinK.B.Low,B.Magasanik,W.S.Reznikoff,M.Riley,M.Schaechter以及H.E.Umbarger(編輯).1996.EscherichiacoliandSalmonella:CellularandMolecularBiology.AmericanSocietyforMicrobiology)。半脫氛酸由O-乙醯絲氨酸和H2S通過硫化氫解作用來產生。該過程受到產物半胱氨酸的負反饋調節，半胱氨酸作用於由CysE編碼的絲氨酸轉乙醯基酶。由O-乙醯絲氨酸自發產生的N-乙醯絲氨酸與轉錄因子CysB—起激活編碼下述酶的基因，所述酶涉及轉運疏化合物、將其還原成H2S和將其整合進入有機硫化合物半胱氨酸，半胱氨酸像甲硫氨酸一樣是必需胺基酸。不存在半胱氨酸時，MetB催化將曱硫氨酸前體O-琥珀醯高絲氨酸轉化成氨、a-酮丁酸(ketobutyrate)和琥珀酸，該反應稱作，消除(Aitken&Kirsch，2005,ArchBiochemBiophys433,166-75)。a國酮丁酸可隨後轉化成異亮氨酸。該副反應對曱硫氨酸的工業生產而言是不想要的，因為兩種胺基酸難以分離。因此，低，消除活性是甲硫氨酸工業生產的一個重要方面。2005年2月7日提交的臨時專利申請US60/650,124描述了如何通過優化酶MetB來降低y-消除。優化半胱氨酸生物合成流也能夠降低y-消除，從而降低副產品異亮氨酸的產生，這構成本發明的一個實施方案。
發明內容本發明涉及在發酵過程中使用微生物生產曱硫氨酸、其前體或其衍生產物的方法，所述微生物具有提高的半胱氨酸產生，並在確定的碳源和硫源上生長。甲硫氨酸前體定義為屬於甲硫氨酸特異性代謝途徑一部分的代謝物，或者可來自於這些代謝物。甲硫氨酸特異性途徑開始於高絲氨酸琥珀醯基轉移酶(MetA)將高絲氨酸轉化為琥珀醯高絲氨酸。來自曱硫氨酸的產物來源於甲硫氨酸轉化和/或降解途徑。為了提高半胱氨酸生產，發明人已經增強了涉及半胱氨酸生產的基因的表達。術語"增強的"在本文中描述相應DNA所編碼酶活性的胞內活性的提高，例如通過增加基因的拷貝數、使用強啟動子或使用具有提高活性的等位基因以及在可能情況下這些手段的組合來實現。術語"提高的表達"或"增強的表達"在本文中均有使用並具有相似的含義。為了提高基因的表達，其可被染色體編碼或染色體外編碼。染色體編碼時，基因組上可以有一個或若干個可通過本領域技術人員已知的重組方法引入的拷貝。染色體外編碼時，基因可以被不同類型的質粒負載，所述質粒在複製起點方面不同，從而在細胞中的拷貝數不同。它們可以以l-5個拷貝存在，約20個或高達500個拷貝存在，對應於具有嚴緊型複製的低拷貝數質粒(pSC101,RK2)、低拷貝數質粒(pACYC，pRSF1010)或高拷貝數質粒(pSKbluescript11)。在本發明一個優選的實施方案中，所述基因可以使用具有不同強度的啟動子來表達，所述啟動子需要或不需要通過誘導物分子來誘導。這些啟動子可以是同源的或異源的。實例為啟動子Ptrc、Ptac、Plac、X啟動子cl或本領域技術人員已知的其它啟動子。靶基因的表達可以被使相應信使RNA(Carrier和Keasling(1998)Biotechnol.Prog.15,58國64)或蛋白質(例如GSTtags,AmershamBiosciences)穩定或去穩定的元件加強或降低.本發明還涉及微生物，所述微生物含有本發明待增強基因的一個或若干個等位基因。在本發明一個具體的實施方案中，增強了半胱氨酸產生所涉及基因的表達。半胱氨酸產生所涉及基因包括編碼硫源輸入、硫源轉化為硫化氬以及硫化氫同化作用或硫源進入半胱氨酸或其衍生物所需蛋白質的基因。在大腸桿菌中，這些蛋白質由以下基因(後面是登錄號和相應多肽的功能)編碼在本發明的描述中，使用大腸桿菌中相應基因的命名來標識基因和蛋白質。然而，除非另有說明，這些名稱的使用具有本發明更普遍的含義，並涵蓋其它生物(更特別地是微生物)中所有的相應基因和蛋白質。PFAM(比對和隱Markov模型的蛋白質家族資料庫；合。每個PFAM使得有可能顯示多重比對、察看蛋白質結構域、評價在生物間的分布、進入其它資料庫，以及顯示已知的蛋白質結構。COG(clustersoforthologousgroupsofproteins,蛋白質直系同源組聚類；http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/)通過比較來自66個完全測序的基因組(其代表了30條主要的種系發生線)的蛋白質序列而獲得。每個COG通過至少三條線來定義，這樣可以鑑定出以前的保守結鑑定同源序列及其同源性百分比的手段是本領域技術人員公知的，功能硫酸鹽通透酶好u酸鹽ABC轉運體的組件膜結合的闢u酸鹽轉運蛋白cysK上遊的ORFATP硫酸化酶好b酸腺香醯轉移酶腺苷醯硫酸激酶腺苷醯-危酸還原酶亞石克酸鹽還原酶，a亞基亞硫酸鹽還原酶，P亞基絲氨酸乙醯基轉移酶半胱氨酸合酶0-乙醯基絲氨酸硫化氫解酶石克酸鹽轉運周質硫酸鹽結合蛋白，Z，NcysZsbp構域。尤其是可在網站http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/上使用的BLAST程序，其以該網站上標明的默認參數使用。然後可以使用例如程序CLUSTALW(http:〃www.ebi.ac.uk/clustalw/)或MULTALIN(http:〃prodes.toulouse.inra.fr/multalin/cgi國bin/multalin.pl)，使用那些網站上標明的默認參數來利用(例如比對)獲得的序列。使用GenBank上針對已知基因給出的參考，本領域技術人員能夠確定在其它生物、細菌菌林、酵母、真菌、哺乳動物、植物等中的等價基因。該常規工作有利地使用可如下確定的共有序列來完成與來自其它微生物的基因進行序列比對，以及設計筒並探針以克隆另一生物中的相應序列。這些分子生物學常規方法是本領域技術人員公知的，並描述於例如Sambrook等(1989MolecularCloning:aLaboratoryManual.2nded.ColdSpringHarborLab.，ColdSpringHarbor,NewYork.)中。作為一個優選的實施方案，修飾本發明方法中使用的微生物以提高本發明還涉及含有編碼本發明絲氨酸轉乙醯基酶的一個或多個等位基因的微生物。這些菌林通過下述事實來表徵它們所具有的半胱氨酸代謝通過提供用於"胱硫醚合成(由MetB催化的反應)的底物濃度提高而允許朝向曱硫氨酸的通量提高。在低半胱氨酸濃度下，MetB酶從琥珀醯高絲氨酸生產氨、琥珀酸和a-酮丁酸，這是稱作，消除的反應。提高的半胱氨酸濃度減少了所產生的a-酮丁酸的量，因此提高了朝向甲硫氨酸的流量。絲氨酸轉乙醯基酶活性的增強表達可以在使用絲氨酸和乙醯CoA的酶測試中驗證。通過添加含絲氨酸轉乙醯基酶活性的蛋白質提取物來開始反應，並在蛋白質沉澱和用矽烷化試劑衍生後通過GC-MS監測O-乙醯絲氨酸的形成。本發明還涉及編碼O-乙醯絲氨酸硫化氫解酶的cysM基因的增強表達，這允許提高硫代硫酸鹽進入硫代半胱氨酸的整合，這加強了半胱氨酸的產生。本發明因此要求保護一種方法，其中通過優化半胱氨酸的生產來降低，消除，並從而降低異亮氨酸的產生。本發明的異源啟動子應理解為修飾的野生型啟動子或者來自另一生物的任何啟動子或者完全合成的啟動子。優選地，異源啟動子是強啟動子，例如Ptrc、Ptac、Xcl或本領域技術人員已知的其它啟動子。在本發明另一優選的實施方案中，要求保護一種方法，其中將微生物用於生產甲硫氨酸或其衍生物，其中提高或優化表達涉及C1單位產生和/或其向高半胱氨酸上轉移的潛力的基因。根據本發明，通過將目的基因的表達水平以獲得最高甲硫氨酸產生的方式進行適應性改造來實現優化。在多數情況下，這通過使用例如異源啟動子創建相關基因的表達文庫並篩選最佳生產者來完成。根據本發明，術語C1單位描述單個碳原子，所述碳原子作為甲基、亞甲基、次甲基或曱醯基與運載體分子四氫葉酸結合。術語"轉移潛力，，描述了微生物將Cl單位轉移至高半胱氨酸上的能力。該潛力通過已經被發明人增強和/或優化的MetF和/或MetH的活性來測定。涉及Cl單位產生的基因列於以下tableseeoriginaldocumentpage12涉及將Cl單位轉移至高半胱氨酸上的基因列於以下:/nefF17903775,10-亞甲基四氫葉酸還原酶/&H179(M50B12-依賴性高半胱氨酸-N5-曱基四氫葉酸轉甲基酶ot"E2367304四氪蝶醯三穀氨酸甲基轉移酶在本發明特別優選的一個實施方案中，修飾用於生產甲硫氨酸的微生物以提高挑CF或附WH或二者的表達，或從異源啟動子表達wCF。增強的維生素B12依賴性甲硫氨酸合酶(MetH)活性可以在酶測試中在維生素B12和SAM存在下使用甲基-THF和高半胱氨酸來進行驗證。通過添加含亞曱基四氫葉酸還原酶活性的蛋白質提取物來開始反應，並在蛋白質沉澱和用珪烷化試劑衍生後通過GC-MS監測曱硫氨酸的形成。可以通過提高甲硫氨酸生物合成中所涉及其它基因的表達來進一步提高甲硫氨酸產生，這也是本發明的一個目的。這些基因列於以下膨fAl790443高絲氨酸琥珀醯轉移酶附e氾1790375胱At醚-y—合酶/neiC1789383胱硫醚-^-裂合酶meff17903775,10-亞曱基四氬葉酸還原酶附e汲17卯262metE、metH和metF的正調節基因另外，可以降低降解甲硫氨酸或偏離甲硫氨酸生產途徑的途徑中基因的表達，或者可以缺失所述基因。印eD1786311S-腺香曱硫氨酸脫羧酶印eC1789337鳥氨酸脫羧酶加A1788043精氨酸琥珀醯基轉移酶鄉A1788823二氫p比咬二羧酸合酶可以通過表達以下基因來加強回補反應。邵c1790393磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶p/wI787"4磷酸烯醇式丙酮酸合酶可以通過過表達以下基因來加強消耗乙酸的反應。flcs1790505乙醯CoA合成酶L-甲硫氨酸、其前體或其衍生化合物的產生可通過過表達一個或多個下列基因來實現額外的提高例如來自菜豆才艮瘤菌(i/^M/ww"//)的丙酮酸羧化酶(pyc，U51439)或其同系物之一，由基因f/^A(高絲氨酸脫氫酶/天冬氨酸激酶，1786183)(優選具有降低的反饋敏感性)、w^L(高絲氨酸脫氫酶/天冬氨酸激酶，g1790376)或/pC(天冬氨酸激酶，1790455)和flW(天冬氨酸半醛脫氫酶)編碼的高絲氨酸合成酶。L-甲硫氨酸、其前體或其衍生化合物的產生通過缺失阻抑蛋白MetJ的基因來實現進一步提高，該阻抑蛋白如JP2000157267-A/3(也參見GenBank17卯373)所述負責下調甲石克氨酸調節子。通過使用高絲氨酸琥珀醯轉移酶等位基因來進一步提高曱硫氨酸生產，所述等位基因對其抑制劑SAM和甲硫氨酸的反饋敏感性降低，如專利申請WO2005/111202(併入本文中)中所述。可以通過弱化以下基因之一的活性或缺失以下基因之一來提高L-甲硫氨酸、其前體或其衍生化合物的產生。弱化在本文中描述通過下列手段降低酶的胞內活性，例如降低其表達、降低酶的穩定性、提高其降解和/或本領域技術人員已知的其它解決方案。基因(ew&""A:條目活性1788633乙酸激酶1788635磷酸轉乙醯基酶1786304丙酮酸脫氳酶E11786305丙酮酸脫氳酶E2/;^1786307丙酮酸脫氬酶E31786948琥珀醯CoA合成酶，p亞基犯cD1786949琥珀醯CoA合成酶，a亞基1789807磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶W"1788160丙酮酸激酶IIp,1787965丙酮酸激酶I1787096丙酮酸氧化酶"vB1790104乙醯鞋酸合酶I,大亞基z7vN1790103乙醯羥酸合酶I,小亞基z7vG1790202乙醯羥酸合酶n，大亞基1790203z雄1790204乙醯羥酸合酶n，小亞基!7vl1786265乙醯羥酸合酶in，大亞基z7vH1786266乙醯羥酸合酶in，小亞基aroF1788953DAHP合成酶aroG1786969DAHP合成酶1787996DAHP合成酶f純1786184高絲氨酸激酶ArC1786185蘇氨酸合酶1788116絲氨酸脫氨酶1789161絲氨酸脫氨酶可通過使用改變的metB等位基因來進一步提高甲硫氨酸產生，所述等位基因優選地或排他地使用H2S並因此從O-琥珀醯高絲氨酸生產高半胱氨酸，如專利申請WO2004/076659(其內容通過參考併入本文)中所述。用於發酵生產L-甲硫氨酸、其前體或其衍生化合物的硫源可以是以下任何一種或其組合硫酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化氫、二硫代硫酸鹽、連二亞石克酸鹽、亞-危酸鹽。在本發明的一個優選的實施方案中，硫源是硫酸鹽和/或硫代硫酸鹽。本發明還涉及用於生產L-曱硫氨酸、其前體或其衍生化合物的方法，所述方法包括發酵如上所述的產甲石危氨酸的微生物，濃縮甲硫氨酸、其前體或衍生物，以及分離發酵液中的目的產物。根據本發明，術語"培養"和"發酵，，可無差別地使用，表示微生物在含有簡單碳源的適當培養基上生長。根據本發明，筒單碳源是本領域技術人員用於獲得微生物(尤其是細菌)正常生長的碳源。特別地，它可以是可同化的糖，例如葡萄糖、半乳糖、蔗糖、乳糖或糖蜜，或這些糖的副產物。特別優選的簡單碳源是葡萄糖。另一優選的筒單碳源是蔗糖。本領域技術人員能夠確定用於本發明微生物的培養條件。特別地，在20"C和55t:之間、優選25X:和40"C之間的溫度下發酵細菌，更特別地，對穀氨酸棒桿菌(Cg/i/toiif/ci/附)而言約30匸，對大腸桿菌而言約發酵通常在含有具有適應所使用細菌的已知確定組成的無機培養基的發酵罐中進行，所述培養基含有至少一種簡單碳源，以及必要時產生該代謝物所需的共底物(co-substrate)。特別地，大腸桿菌的無機培養基可以與M9培養基(Anderson,1946,Proc.Natl.Acad.ScLUSA32:120-128)和M63培養基(Miller,1992;AShortCourseinBacterialGenetics:ALaboratoryManualandHandbookforEscherichiacoliandRelatedBacteria,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork)或例如由Schaefer等(1999,Anal.Biochem.270:88-96)所定義的培養基具有相同或相似的組成。類似地，用於穀氨酸^^桿菌的無機培養基可以與BMCG培養基(Liebl等，1989，Appl.Microbiol.Biotechnol.32:205-210)或例如Riedel等(2001,J.Mol.Microbiol.Biotechnol.3:573-583)所述的培養基具有相同或相似的組成。可以補充培養基以補償由突變引入的營養缺陷(auxotrophy)。發酵L-甲硫氨酸、其前體或其衍生化合物後，將其回收和純化(必要時)。用於回收和純化培養基中產生的化合物(例如甲硫氨酸)的方法是本領域技術人員的。任選地，在純化發酵產物期間可保留從0°/。到100%的生物量。本發明還涉及經優化用於發酵生產曱硫氨酸的微生物。術語"優化的微生物，，描述了這樣的微生物其中整合了上述修飾，從而生產目的代謝產物時具有最佳的工業性能以及有可能副產物的生產最低。在一個優選的應用中，所述生物為大腸桿菌或穀氨酸棒桿菌或釀酒酵在最優選的應用中，所述生物為大腸桿菌。發明詳述2004年5月12日提交的PCTN。PCT/IB04/001901中描述了一種大腸桿菌菌株，其中由metJ基因編碼的甲硫氨酸阻抑物被氯黴素盒代替(A附WJ::Cm)，並具有挑"A等位基因，所述附WA等位基因對甲減歲酸和SAM(附WA"1)具有的反饋敏感性降低。向該菌林中引入以下遺傳修飾。MG1655wCA*llA附&J::CmP^r畫柳"F::Km的構建為了克隆位於異源P加啟動子控制下的基因，使用Datsenko&Wanner(2000)描述的同源重組策略。該策略允許在目的基因附近插入氯黴素或卡那黴素抗性盒。為此，^使用以下的寡核苷酸PtrcmetFR(SEQIDNO1)GCCAGGCTCTGATTCAGGGCATCCCGCTGGCTGGCGTGAAAAAAGCTCATafltotoccfcc加ttccacac敏atocgagcc欲啤a加aflf扭cflflcagcfcTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其具有-與基因metF(網站http:〃genolist,pasteur.fr/Colibri/上的參照序列)的序列(4130259-4160195)同源的區域(大寫)-與具有RBS(黑體)和-35與-10盒(黑體)的啟動子Ptrc序列同源的區域(斜體)-用於擴增卡那黴素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner,B丄"2000，PNAS,97:6640-6645中的參照序列)的區域(大寫)Ptrc-metFF(SEQIDNO2)ccttcatetttacatctggacgtctaaacggatagatgtgcacaacacaacatataactacaagcgattgatgaggtaaggtfcaca"gg"caccttc鄉敏gcc麵gcCATATGAATATCCTCCTTAG其具有-與基因metF(網站11:〃8611011814)3816111*.&/(:010)11/上的參照序列)區域的序列(4130114-4130195)同源的區域(小寫)-與噬菌體T7末端序列(GenbankV01146)同源的區域(斜體，小寫)-用於擴增卡那黴素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner,B丄"2000,PNAS，97:6640-6645中的參照序列)的區域(大寫)使用寡核苷酸Ptrc-metFF和Ptrc-metFR從質粒pKD4中擴增卡那黴素抗性盒。然後通過電穿孔將獲得的PCR產物引入菌^MG1655m"A*llA附"J(pKD46)中，其中表達的Red重組酶允許進行同源重組。選擇卡那黴素抗性轉化體，並使用下文定義的Ptrc-metFvF和Ptrc-metFvR通過PCR分析來驗證抗性盒的插入。Ptrc-metFvF(SEQIDNO3):GCCCGGTACTCATGTTTTCGGGTTTATGG(與來自4129866到4129894的序列同源)Ptrc-metFvR(SEQIDNO4):CCGTTATTCCAGTAGTCGCGTGCAATGG(與來自4130524到4130497的序列同源)。得到的菌林稱為MG1655im^A*11A附"jP^r-w^F:Km。質粒pME101-thrA*l-cysE的構建pME101-thrA*l為了加強高絲氨酸的產生，使用啟動子P&c從質粒pCL1920(Lerner&Inouye,19卯，NAR18，15p4631)中表達編碼thrA*，其編碼對蘇氨酸的反饋抗性降低的天冬氨酸激酶/高絲氨酸。為了構建質粒pME101-thrA*l，使用以下的寡核苷酸M因組DNA中PCR擴增鄉HlthrA(SEQIDNO5):ttaTCATGAgagtgttgaagttcggcggtacatcagtggcS廳lthrA(SEQIDNO6):ttaCCCGGGccgccgccccgagcacatcaaacccgacgc用限制性酶5s/;HI和切割PCR擴增片段，並克隆進載體pTRC99A(Stratagene)的7V"I/S附"I位點中。為了從低拷貝載體中表達，如下構^"粒pME101。使用寡核苷酸PME101F和PME101R來PCR擴增質粒pCL1920,並將來自載體pTRC99A的帶有基因和P化c啟動子的5對Z17I-JV附wI片段插入所擴增的栽體中。用jpfll和限制性處理所得載體和帶有幼rA基因的載體，並將含有幼rA的片段克隆進載體pME101中。為了將ThrA從反饋抑制中釋放，使用寡核苷酸ThrAFF318S和ThrARF318S通過定點誘變(Stratagene)引入突變F318S，得到載體pME101-thrA*l。PME101F(SEQIDNO7):CcgacagtaagacgggtaagcctgPME101R(SEQIDNO8):AgcttagtaaagccctcgctagThrAFF318S(Smal)(SEQIDNO9):CcaatctgaataacatggcaatgtccagcgtttctggQ^ggggThrARF318S(Smal)(SEQIDNO10):CccgggccagaaacgctggacattgccatgttattcagattggpME101-thrA*l-cysE為了構建pME101-thrA*l-cysE,使用寡核苷酸OmeB001和OmeB002通過PCR擴增cysE基因，用限制性酶戶v"II切割PCR產物並克隆進載體pME101-tiirA*l的Smal位點中，得到載體pME101-ttirA*l-cysE。OmeB001—cysER-PvuII(SEQIDNO11)GGAGGGAC4CCrGATACGAAAGAAGTCCGCGAACTGGCGCOmeB002—cysEF國PvuII(SEQIDNO12)Atacgcagc她gacattagatcccatccccatactcaaatgtatgg戶v"II位點加有下劃線。黑體序列對應於cysE(Colibri)(3780423-3780397)MG1655/w^A*llAmetJ::CmP"c-wetH::Km的構建為了加強甲硫氨酸的產生，使用P加啟動子it^達附e沮基因。使用以下寡核苷酸進行構建DiclR-metHF(SEQIDNO13)gcaccagaatacgttcatttaactgcgcacgcagttgttccactttgctgctcatGTCrGrCCTCC4GTJG4rGC14CCCC4C4C47T47^CG4GCCGG^rG^77^7TGrC44C4GCrCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG其具有畫與基因附"H(網站http:〃genolist.pasteur.fr/Colibri/上的參照序列)的序列(4221461-4221408)同源的區域(小寫)-與具有RBS(黑體)和-35與-10盒(黑體)的啟動子Ptrc序列同源的區域(斜體，大寫)畫用於擴增卡那黴素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner，B丄"2000,PNAS,97:6640-6645中的參照序列)的區域(大寫)iclR-metHF(SEQIDNO14)CGrGTCGG(24GC^4G7X:ATATGAATATCCTCCTTAG其具有國與基因wWR(網站http:〃genolistpasteur.fr/Colibri/上的參照序列)區域的序列(4221327-4221406)同源的區域(斜體，大寫)畫用於擴增卡那黴素抗性盒(Datsenko，K.A.&Wanner,B丄"2000,PNAS，97:6640-6645中的參照序列)的區域(大寫)。使用寡核苷酸DiclR-metHF和iclR-metHF從質粒pKD4擴增卡那黴素抗性盒。然後通過電穿孔將獲得的PCR產物引入菌林MG1655/w"A*llAw"J(pKD46)中，其中表達允許同源重組的Red重組酶。選擇卡那黴素抗性轉化體並使用下文定義的寡核苷酸iclF和iclR通過PCR分析驗證抗性盒的插入。iclF(SEQIDNO15):CCTTTGAGGTCGCATGGCCAGTCGGC(與從4221558到4221533的序列同源)。iclR(SEQIDNO16):GCTTTTTAATAGAGGCGTCGCCAGCTCCTTGCC(與從4219917到4219949的序列同源)。得到的菌林稱為MG1655i"A*llA附CJP"c-w"F:Km。MG1655iCA*llAwi"J::CmP^r畫iwCF:KmPfro附WH的構建為了構建菌林MG1655metA*llAwd:CmP^r國w^F:KmPfrc-w&H，將氯黴素和卡那黴素抗性盒從菌林MG1655w"A*llAwi^J::CmP^r-iw"H:Km中去除。將帶有FLP重組酶的質粒pCP20通過電穿孔引入該重組菌林中，所述FLP重組酶作用於氯黴素抗性盒的FRT位點。在42"C的一系列培養後，通過PCR分析證實兩個盒的缺失。保留的菌林命名為MG1655/M^A*11A附CJP加-附e沮。為了將啟動子構建體P^r::w"F:Km轉移進菌林MG1655i^A*llA附"JP加-we沮中，使用噬菌體P1轉導法。所遵循的方案在2個步驟中實現製備菌林MG1655MG1655iWA*llA挑"JP^r-附^F::Km的噬菌體裂解液並l^轉導進菌林MG1655iii&AniA附WJP"c-m"H中。製備嗟菌體裂解液P1:畫用100pi菌林MG1655m^A*11A附"JP^r國附"F:Km的過夜培養物接種10mlLB+Km50ng/ml+葡萄糖0.2%+CaCl25mM國在37C下搖動孵育30分鐘。-添加100nl用菌林MG1655製備的噬菌體裂解液Pl(約1.109個嗟菌體/ml)。-在37"C搖動3小時直到所有的細胞被裂解。-添加200nl氯仿並振蕩。-在4500g離心10分鐘以去除細胞淬片。-轉移上清液至無菌管中並添加200nl氯仿。-將裂解液儲存於4x:。轉導-將5ml菌林MG1655metA*11A柳CJPtrc-w"H在LB培養基中的過夜培養物在1500g離心10分鐘。—將細胞沉澱懸浮於2.5ml10mMMgS04、5mMCaCl2中-對照管lOOnl細胞100nl菌林MG1655iWA*llA附^JPftr-附WF:Km的噬菌體PI一測試管100nl細胞+100nl菌林MG1655t"A*llA附CJP^r-w&F:Km的噬菌體PI-在30C不搖動孵育30分鐘。—向每管中添加100jil1M梓檬酸鈉並振蕩。—添加1mlLB。-在37匸搖動孵育1小時。-將管在7000rpm離心3分鐘後塗布在平板LB+Km50照/ml上。-在37"C孵育過夜。菌抹的驗證選捧卡那黴素抗性轉化體並使用上述寡核苷酸Ptrc-附WFvF和Ptrc-附CFvR通過PCR分析驗證啟動子構建體Pftr-w"F:Km的存在。保留的菌林命名為MG1655w^A*llA附WJ::CmP&c-附e沮P加-柳&F:Km。MG1655iCA*llAwi"J::CmPrtr-Q^M::Km的構建為了克隆位於異源P^r啟動子控制下的基因，使用Datsenko&Wanner(2000)描述的同源重組策略。該策略允許在相關基因附近插入氯黴素或卡那黴素抗性盒。為此^f吏用以下的寡核苷酸Ptrc-cysMFgcctgatgcgacgcttgcgcgtcttateaggtctacaggttacaaaccttgccata她似c故c加ccacaca加tocgagccgg啤a"aa鄉caacflg"cCATATGAATATCC;TCCTTAG(SEQIDNO17)其具有-與基因cpM(網站http:〃genolist,pasteur.fr/Colibri/上的參照序列)的序列(2537627-2537681)同源的區域(小寫)-與具有RBS(黑體)和-35與-10盒(黑體)的啟動子PM序列同源的區域(斜體，小寫)畫用於擴增卡那黴素抗性盒(Datsenko,K.A.&Wanner,B丄"2000，PNAS,97:6640-6645中的參照序列)的區域(大寫)Ptrc隱cysMRggttgagtgaatgttaaacgcccggaggcgcttcccgcgatecgggctttt7^rC4C4CrGGCrC4CC7TCCGGTGGGCC7TrcrGCTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG(SEQIDNO18)其具有-與基因gsM(網站http:〃genolist.pasteur.fr/Colibri/上的參照序列)區域的序列(2537734-2537684)同源的區域(小寫)-與噬菌體T7末端序列(GenbankV01M6)同源的區域(斜體，大寫)畫用於擴增卡那黴素抗性盒(Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.,2000，PNAS,97:6640-6645中的參照序列)的區域(大寫)。使用寡核苷酸Ptrc-cysMF和Ptrc-cysMR從質粒pKD4中擴增卡那黴素抗性盒。然後通過電穿孔將獲得的PCR產物引入菌林MG1655w^A*llA附WJ(pKD46)中，其中表達允許同源重組的Red重組酶。選擇卡那黴素抗性轉化體並^f吏用下文定義的寡核苷酸Ptrc-cysMvF和Ptrc-cysMvR通過PCR分析驗證抗性盒的插入。Ptrc-cysMvF:ggtgacaagaatcagttccgc(與來自2537262到2537282的序列同源)。(SEQIDN019)Ptrc-cysMvR:GCGTTTATTCGTTGGTCTGC(與來自2537833到2537814的序列同源)。(SEQIDNO20)得到的菌林稱為MG1655w^A*llAm"JJP&c-c^sM::Km。MG1655i"A*llAiijWJP"c-wiCFP^r誦ni"HP^c-cj;sM:Km的構建為了構建菌林MG1655metA*llA附^JP"c-附"FP"c-附CHP&c-c"M:Km，如上所述使用質粒pCP20將氯黴素和卡那黴素抗性盒從菌抹MG1655wCA*llA附WJ::CmP^c-附^F:KmP^r-/m"H中去除。得到的菌株命名為MG1655me,A*llA/w"JP&c-附WFP"c-附CH。為了將啟動子構建體P&c-o;sM:Km轉移進菌林MG1655w^A*llA附WJP"c-附"FP^c-附"H中，使用噬菌體Pl轉導法。所遵循的方案在2個步驟中完成製備菌林MG1655MG1655w^A*llAm^JP^r-c"M::Km的謹菌體裂解液，以及隨後轉導進菌林MG1655i"A*llA附&JP^c-附WFP&owiCH中。獲得的菌株命名為MG1655i^A*llA附"JP"c-附"FP加國附"HP加-c"M::Km。用等位基因w"A*ll和A附WJ將增強cpE和附WH表達與優化w&F和為了構建菌林MG1655/iiCA*llA附"J::Cm(pME101-ArA*l)、MG1655i^A*llAwid:CmP^r-i"H:Km(pME101-^/*A*l-cj;sE)、MG1655mCA^llA附^J::CmPfrc誦m^HPfrc-w^F:Km(pME101-ArA^l國o;sE)和MG1655iw^A*llAwiWJP"oiifWFP"o/m^HP^r-c"M:Km(pME101-ArA*l-cj;sE),將質粒(pME101-^^A*l)或(pME101*A*l-c"E)通過轉化引入菌林MG1655附"A"1A柳"J::Cm、MG1655/uWA*llA附WJ::CmP&c-附"H:Km、MG1655附&A^11Ain^J::CmP^r-附CHP^r-iWF:Km和MG1655/mc^A*11Aiw^JP"c-附CFP"c-附CHP^r-cjsM:Km中。評價甲硫氨酸生產菌林，所述菌林具有異源啟動子控制下增強的c"E、/mWH和/或c_ysM和/或附WF|達首先在小錐形瓶中評價生產菌林。在含有2.5g/1葡萄糖的LB培養基中培養預培養物，並用於接種基本培養基PC1中的過夜培養物。該培養物用於在培養基PC1中接種50ml培養物至OD600為0.2,所述培養基PC1中補充有0.01g丄"的維生素B12。如果指明的話，將硫酸銨替換為5.6g/1的硫代硫酸銨。適當時，以100mg/1的濃度添加大觀黴素。在4.5到5的OD600下，在OPA/Fmoc衍生化後通過HPLC定量細胞外胺基酸，並在矽烷化後使用GC-MS分析其它相關代謝物。表1.基本培養基pc1的組成tableseeoriginaldocumentpage26如表2中所示，甲石危氨酸的量隨著過表達c"E、與柳CH或者cpE、w^H與附WF表達改變而增加。增強cysM的i達可進一步提高曱硫氨酸產生。某些菌林在硫代硫酸鹽存在下生產更大量的甲硫氨酸。當c"E、cpM和w^H過表達、附&F表達位於P&c啟動子的控制下且存在硫代硫酸鹽時，獲得最高的甲硫氨酸生產。c^E和附WH表達時異亮氨酸生產被強烈降低，指示"消除活性的降低。在過表達cysE和metH並從異源啟動子表達附"F的k林中，cysM的過表達降低y-消除。表2.在使用硫酸鹽(S)或硫代硫酸鹽(T)作為硫源的分批培養中，由上述菌林生產的以mmol/gDW計的曱硫氨酸和異亮氨酸，n.d.,未測定。tableseeoriginaldocumentpage273.測定CysE和MetH的酶活性改變為了驗證CysE表達和MetH表達的改變，在粗提物中測定相應酶的活性。為了體外測定酶活性，在如上所述的基本培養基中培養大腸桿菌並在對數中期(midlogphase)收集。將細胞重懸於冷的磷酸鉀緩衝液中並在水上超聲處理(Branson超聲波儀，70W)。離心後，定量上清液中含有的蛋白質(Bradford,1976)。為了測定絲氨酸乙醯基轉移酶活性(CysE)，在100mM磷酸鉀pH7.5、4mM乙醯CoA、30mML-絲氨酸中將10nl提取物於25匸下測定10分鐘。用丙酮沉澱蛋白質並在用矽烷化試劑衍生化後通過GC-MS檢測O-乙醯基絲氨酸。為了測定維生素B12依賴性甲硫氨酸合酶活性(MetH),在100mM砩酸鉀pH7.2、lmM高半胱氨酸、0.25mM甲基四氫葉酸、50維生素B12、20nMS-腺苷甲硫氨酸和25mMDTT中將100jil提取物於37C下測定10分鐘。用丙酮沉澱蛋白質並在用矽烷化試劑衍生化後通過GC-MS檢測產生的甲硫氨酸。如表3所示，基因cysE和metH的過表達提高相應的酶活性。因此，這些基因活性的提高導致曱硫氨酸產生的提高。表3.在硫代硫酸鹽存在下培養的甲硫氨酸生產菌林中以mUI/gDW計的絲氨酸乙醯基轉移酶(CysE)和曱硫氨酸合酶(MetH)活性tableseeoriginaldocumentpage28驗證發酵條件下的甲硫氨酸生產隨後使用分批補料方案，在300ml發酵罐(DASGIP)中在生產條件下測試生產大量目的代謝物的菌林。為此，使用在含2.5g/1葡萄糖的LB培養基中培養8小時的培養物來接種基本培養基PC1(見上文)中的過夜預培養物。用150ml基本培養基(B1)填充發酵罐並用1.5ml濃縮的預培養物(9g/1和12g/1之間)接種至近0.09g/1的生物量濃度。表4.基本培養基B1的組成tableseeoriginaldocumentpage29表5.Tl型基本培養基FBtableseeoriginaldocumentpage30表6.S型基本培養基FBtableseeoriginaldocumentpage30保持培養溫度恆定在37X:，並使用NH4OH溶液將pH恆定調節至6.5和8之間的值，優選6.7。分批期(batchphase)期間將攪動速率維持在600rpm並在分批補料期結束時提高到多至1000rpm。通過使用氣體控制器將溶解氧濃度維持在20%和40%之間、優選30%的飽和度。當細胞量達到0.9g/1到1.2g/1的濃度時，以0.1ml/h和1.5ml/h之間(優選0.43ml/h)的起始流速開始分批補料，並S形(24小時)提高至0.5ml/h和5.8ml/h之間(優選1.7ml/h)的流速。確切的補料條件通過下式計算嫩=-+1+其中Q(t)是對於150ml批體積的補料流速(以mL/h計)Pl為0.025至0.35，優選0.100。P2為0.400至5.600，優選1.600。P3為0.068至0.95，優選0.270。P4為1.250至17.5,優選5.000。在該情況下，使用含有濃度為300g/l至800g/1(優選500g/L)葡萄糖的FB培養基。當生物量的濃度達到20g/1至50g/1(優選35g/L，40至80h)的值時停止發酵，並使用HPLC測定細胞外甲硫氨酸和異亮氨酸濃度。表7.在下述菌林的分批補料發酵中獲得的曱硫氨酸效價，所述菌林在異源啟動子下過表達^E，以及附CH或附"F，或三者的組合。參照對應於MGl655wCA*llA附WJ。菌林在硫代硫酸鹽(T)或硫酸鹽(S)存在下生長。tableseeoriginaldocumentpage32如表7所示，在異源啟動子控制下增強cpE;和柳CH以及c"E、附WH和附&F的表達或者在硫代硫酸鹽存在下培養菌林可顯著地提高曱石克氨酸生產。異亮氨酸生產被cysE和/或metH的過表達顯著降低。隨後使用分批補料方案在2.5L發酵罐(PIERREGUERIN)中於生產條件下對在300ml發酵罐中生產最大量甲硫氨酸的菌林進行測試。為此，使用在含2.5g/l葡萄糖的LB培養基中培養了8小時的培養物來接種基本培養基PC1中的過夜預培養物。用600ml基本培養基(B2)填充發酵罐並用6ml濃縮的預培養物(9g/1至12g/1展種至0.9g/1的生物量o將培養物的溫度維持恆定在37*C，並使用NH4OH28%溶液將pH恆定調節至6.3至8、優選6.8。在分批階段將最初的攪動速率設定在200rpm並在補料分批期時提高至至多1200rpm。分批期將最初的氣流速度設定為40Nl/h並在分批補料期時提高到多至250Nl/h。通過提高攪動速度和氣流速度將溶解氧濃度維持在20%至40%(優選30%)飽和度。當生物量濃度達到1.2g/1到1.5g/1時，以0.5ml/h至4ml/h(優選1.0ml/h)的起始流速開始分批補料，並指數式提高(15小時)到3ml/h至35ml/h(優選20.1ml/h)的流速。在該點，將流速維持恆定10到45個小時，優選30h。對於補料而言，使用含有濃度300g/l至800g/1(優選750g/1)葡萄糖的FB型T2(見表8)。當生物量的濃度達到40g/l和UOg/l之間(優選卯g/L)的值時停止發酵，並使用HPLC測定細胞外甲硫氨酸濃度。在這些條件下菌林MG1655附"A"1A附"JP&c-挑"HP"c-附&F(pMElOl-thrA*l-cysE)生產169mM甲硫氨酸。表8.基本培養基FBT2complextableseeoriginaldocumentpage33表9.基本培養基B2的組成tableseeoriginaldocumentpage34權利要求1.用於生產甲硫氨酸、其衍生物或前體的方法，所述方法通過在含有碳源和硫源的適當培養基中培養微生物並從培養基中回收甲硫氨酸來實現，其中所述微生物被修飾以增強半胱氨酸的生產。2.權利要求l的方法，其中涉及半胱氨酸生產的至少一個基因的表達被提高。3.權利要求2的方法，其中所述涉及半胱氨酸生產的至少一個基因選自磁b酸鹽通透酶cysT硫酸鹽ABC轉運體的組件"■sW膜結合的硫酸鹽轉運蛋白cysZcysK上遊的ORF0NATP硫酸化酶，D硫酸腺苷醯轉移酶腺香醯闢u酸激酶腺苷醯硫酸還原酶，1亞轎u酸鹽還原酶，a亞基一亞石危酸鹽還原酶，p亞基絲氨酸乙醯基轉移酶，K半胱氨酸合酶cysMo-乙醯基硫化氬解酶eysZ好u酸鹽轉運sbp周質硫酸鹽結合蛋白4.權利要求2的方法，其中至少的表達被提高。5.權利要求2的方法，其中至少q;sM的表達被提高。6.權利要求l到5中任一項的方法，其中涉及C1單位的產生以及向高半胱氨酸上進行轉移的潛力的至少一個基因的表達被提高和/或被異源啟動子驅動。7.權利要求6的方法，其中涉及C1單位的產生以及向高半胱氨酸上進行轉移的潛力的至少一個基因選自編碼5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶的柳"F編碼絲氨酸羥甲基轉移酶的g(vA編碼甘氨酸切割複合體的gcvTHP，//^/。8.權利要求7的方法，其中附WE、附CH和/或的表達被提高和/或至少所述基因之一由異源啟動子表達。9.權利要求1到8中任一項的方法，其中通過優化半胱氨酸生物合成流來維持低，消除活性，並因此減少副產物異亮氨酸的產生。10.權利要求l到9中任一項的方法，其中提高了涉及甲硫氨酸產生的另外基因的表達。11.權利要求1到10中任一項的方法，其中弱化了減少甲硫氨酸產生的基因的表達。12.權利要求l到11中任一項的方法，其中由w^J基因編碼的甲硫氨酸阻抑物被缺失或突變，和/或高絲氨酸琥珀醯基轉移酶(MetA)等位基因被整合進菌林中，所述等位基因編碼對S-腺苷甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反饋敏感性降低的酶。13.權利要求1到12中任一項的方法，其中培養基中的硫源是;P克酸鹽、硫代硫酸鹽、硫化氫、二硫代硫酸鹽、連二亞硫酸鹽、亞硫酸鹽或所述不同來源的組合。14.權利要求13的方法，其中培養基中的硫源是硫酸鹽或硫代硫酸鹽或二者的混合物。15.權利要求1到14中任一項的方法，所述方法包括下述步驟分離任選地部分或全部(0-100%)保留在終產物中的所需胺基酸/發酵液組分和/或生物量。16.用於發酵生產甲硫氨酸或其衍生物的微生物，其中所述微生物被優化以增強半胱氨酸的產生。17.權利要求16的微生物，其中涉及半胱氨酸產生的至少一個基因的表達被提高。18.權利要求17的微生物，其中涉及半胱氨酸產生的至少一個基因選自硫酸鹽通透酶，U，cysT石危酸鹽ABC轉運體的組件膜結合的硫酸鹽轉運蛋白，ZcysK上遊的ORFcysNATP碌u酸化酶，D石危酸腺苷醯轉移酶，C腺香醯為t酸激酶，H腺普醯好b酸還原酶一亞好u酸鹽還原酶，a亞基亞^P克酸鹽還原酶，0亞基絲氨酸乙醯基轉移酶g^K半胱氨酸合酶0-乙醯基硫化氫解酶cysZAt酸鹽轉運sbp周質^Tu酸鹽結合蛋白19.權利要求17的微生物，其中至少cysE的表達被提高。20.權利要求17的微生物，其中至少cysM的表達被提高。21.權利要求16到20中任一項的微生物，其中涉及C1單位的產生和至高半胱氨酸上的轉移潛力的至少一個基因的表達被提高和/或受外源啟動子驅動。22.權利要求21的微生物，其中涉及C1單位的產生以及向高半胱氨酸上的轉移潛力的至少一個基因選自編碼5,10-亞甲基四氫葉酸還原酶的附WF編碼絲氨酸羥甲基轉移酶的g/jA編碼甘氨酸切割複合體的gcvTHP，23.權利要求21的微生物，其中metE、metH和/或附"F的表達被提高和/或至少所述基因之一由異源啟動子表達。24.權利要求16到23中任一項的微生物，其中通過優化半胱氨酸生物合成流來維持低Y-消除活性，並因此降低副產物異亮氨酸的產生。25.權利要求16到24中任一項的微生物，其中涉及甲硫氨酸產生的另外基因的表達被提高。26.權利要求16到25中任一項的微生物，其中減少曱硫氨酸產生的基因的表達被弱化。27.權利要求16到26中任一項的微生物，其中缺失或突變了由附WJ基因編碼的甲硫氨酸阻抑物，和/或整合了高絲氨酸琥珀醯基轉移酶(MetA)等位基因，所述等位基因編碼對S-腺苷基甲硫氨酸和/或甲硫氨酸的反饋敏感性降低的酶。全文摘要本發明涉及通過在包含碳源和硫源的適當培養基中培養微生物來生產甲硫氨酸或其衍生物的方法。要求保護的微生物以下述方式被修飾半胱氨酸和/或C1單位的生產被增強和/或C1單位向高半胱氨酸上的轉移的潛力被提高或優化。還要求保護甲硫氨酸或其衍生物從發酵培養基中的分離。文檔編號C12P13/12GK101351558SQ200680050326公開日2009年1月21日申請日期2006年1月4日優先權日2006年1月4日發明者塞利娜·雷諾,法比安·盧克斯,米歇爾·沙託,菲利普·蘇卡勒,雷納·菲格申請人:代謝探索者公司