人核糖體蛋白分子hRrp15p及其製備方法與應用的製作方法

2023-05-16 20:35:36 1

專利名稱：人核糖體蛋白分子hRrp15p及其製備方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於人核糖體蛋白分子研究技術領域，涉及人核糖體蛋白分子hRrpl5p決定核仁素(Nucleolin)的核仁定位。更具體的說是一種人核糖體蛋白分子hRrpl5p及其製備方法與應用。
背景技術：
隨著科學技術的快速發展，人們對生命的探索也快速進步，對生命的發生也進行了很多深入的研究，在生命發生過程中離不開各種物質的重要作用。核仁(nucleolus)是真核細胞間期核中最顯著的結構，具有重要功能，是核糖體RNA合成、加工和核糖體亞單位的組裝場所。核仁素(Nucleolin，又稱C2!3)是真核細胞核仁中最主要的一種蛋白質，具有多種生物學功能，它不但直接參與核糖體的生物合成與成熟，還直接或間接參與細胞增殖、 生長、胚胎發生、胞質分裂、染色質複製與核仁的發生等過程。2007年，Kiichi Fukui實驗室研究證實，核仁素是細胞核仁結構形成的決定蛋白分子。應用小分子RNA幹擾技術(RNAi) 抑制核仁素在細胞內的表達，導致間期細胞核仁結構的消失，最終出現細胞分裂周期阻滯， 細胞增殖停滯(Nan Ma, et al. 2007)。但核仁素的核仁定位的決定因素仍不清楚。如能發現細胞內核仁素的核仁定位的決定因素，就可以通過這種因素影響核仁素的核仁定位，從而影響間期細胞核仁結構的形成，進而抑制腫瘤細胞的增殖，為探索臨床腫瘤治療方法尋找新的生物分子靶點。核糖體相關蛋白15(Rrpl5p)最早由Alessandro !^atica實驗室於2005年發現於酵母細胞中，該實驗室研究證實Rrpl5p分子是核糖體大亞基(60 前體的組成成分，並與核糖體大亞基的成熟相關。我們根據蛋白分子胺基酸序列的同源性，對比人基因組，檢索出人核糖體相關蛋白15(hRrpl5p)的基因序列，然後設計PCR引物，從人子宮頸癌細胞HeLa 的cDNA文庫中克隆出hRrpl5p的cDNA。經DNA測序後，與人GenBank對比，證實該cDNA序列。隨後，我們製備了 hRrpl5p的多克隆抗體並構建該蛋白分子的多種突變體，對hRrpl5p 的細胞內表達，亞細胞定位以及該蛋白分子對核仁素核仁定位的影響作用進行深入研究。

發明內容
本發明公開了人核糖體蛋白分子hRrpl5p核苷酸，所述核苷酸包含a) SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或者其互補DNA序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個鹼基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO 1所示的核苷酸，全長為849個鹼基。本發明所述人核糖體蛋白分子hRrpl5p核苷酸序列，其所對應的胺基酸序列如 SEQID NO 2具有282個胺基酸。本發明進一步公開了人核糖體蛋白分子hRrpl5p在決定核仁素的核仁定位方面的應用，其中hRrpl5p的的核仁定位序列為第2 至232胺基酸RKKPK。本發明進一步公開了人核糖體蛋白分子hRrpl5p在製備作為核仁素的核仁定位抑制腫瘤細胞的增殖藥物方面的應用。本發明的研究結果充分證明hRrpl5p決定核仁素的核仁定位，從而解決了核仁素如何定位於核仁結構並促使核仁結構的形成，為細胞內核仁的功能的發揮奠定形態學基石出。本發明更加詳細的製備方法如下方法與結果UhRrpl5p基因的克隆、特異性抗體的製備以及在細胞周期的表達在Gene bank中，通過同源蛋白比對，發現人基因組中酵母細胞Rrpl5p基因的同源基因序列(命名為hRrpl5p，Figure 1A, IB)。根據hRrpl5p的基因序列，設計PCR引物如下引物 1 :5，-CCGGAATTCATGGCAGCCGCCGCTCCGGAC-3，；引物 2 :5，-CCGCTCGAGTGTATCAGAGTCACTTGC-3，.以HeLa細胞的cDNA文庫為模板，應用上述引物進行PCR擴增反應。將擴增的DNA 片段連接至質粒載體PEGFP，進行測序鑑定，與hRrpl5p基因序列完全相同。hRrpl5p基因序列(含TAA終止密碼子849)ATGGCAGCOGCCGCTCOGGACTCAOGTGTGAGTGAGGMGAMACCTGMAMGACCCCMAGMGMGATGMAATGGTMCTGGAGCOGTAGCGTOGGTGCTGGMGACGAGGCCACAGACACTTCTGATAGTGMGGMGCTGTGGATCGGMMGGACCACTTTTATTCTGATGATGAOGCMTAGMGCTGACAGTGAGGGTGATGCTGAGCCCTGTGACMAGMMTGMMTGATGGAGMTCMGTGTTGGGACTMTATGGGCTGGGCAGATGCTATGGCTMAGTCCTCMCMGMMCTCCTGMAGTMACCTACTATTCTGGTCMMATMGMGCTGGMMGGMMAGMMGTTAMGCMGMAGACTAGAGMMTAMACAGOGTGATMGAGGCTGGAGTGGGMATGATGTGCAGAGTMAGCCAGATGTTGTCCMGACMAGAGACAGAGAGMATCTTCAGAGMTTGCMCMGGGGTGTGGTGCMTTATTTMTGCTGTTCAGMACATCMMGMTGTTGATGAMAGGTTMGGMGCTGGMGTTCTATGAGMAGCGTGCTMGTTGATATCMCTGTTTCCMGMAGATTTCATCAGTGTTTTGAGAGGGATGGATGGMGTACMATGAGACTGCTTCMGCAGGMGMACCAMAGCCMACAGACTGMGTGMATCAGMGMGGCCCAGGTTGGACGATCCTACGTGATGATTTCATGATGGGAGCATCTATGMAGACTGGGACMGGMAGTGATGGGCCAGATGACAGCAGACCAGMTCTGCAAGTGACTCTGATACATAAhRrpl5p胺基酸序列082個胺基酸)MAAAAPDSRVSEEENLKKTPKKKMKMVTGAVASVLEDEATDTSDSEGSCGSEKDHFYSDDDAIEADSEG DAEPCDKENEND(ESSV(TNMGWADAMAKVLNKKTPESKPTILVKNKKLEKEKEKLKQERLEKIKQRDKRLEWEM MCRVKPDVVQDKETERNLQRIATRGVVQLFNAVQKHQKNVDEKVKEAGSSMRKRAKLISTVSKKDFISVLRGMDG STNETASSRKKPKAKQTEVKSEEGPGffTILRDDFMMGASMKDWDKESDGPDDSRPESASDSDT應用原核細胞表達載體pHid8a (購自Novagen公司)，構建原核表達His-標記的全長hRrpl5p融合蛋白的載體質粒並將該質粒轉化到hcherichia coli. BL-21 (DE)pLysS 菌株(購自Novagen公司)以誘導融合蛋白His-hRrpl5p的表達，隨後裂解誘導菌株並用 Ni-NTA (亞硝基三乙酸鎳)-瓊脂糖柱層析得到純化的His-hRrpl5融合蛋白。再用純化的蛋白免疫英格蘭大白兔產生兔抗-hRrp 15p抗體血清，最後用Hi s-hRrp 15p融合蛋白Ni-NTA 瓊脂糖珠純化血清中兔抗_hRrpl5p抗體。該抗體將來可以應用於阻斷腫瘤細胞內源性 hRrpl5p的正常作用，進而抑制腫瘤細胞的生長(這裡預示可以治療什麼病？)。應用純化後的hRrpl5p抗體對人乳腺癌細胞MCF7的裂解液進行免疫共沉澱實驗， 隨後對沉澱物進行蛋白電泳(SDSPAGE)及印跡雜交(Western Blot)，證實hRrpl5抗體只識別細胞裂解液中的一個蛋白分子，分子量約40KDa(FigUre 1C)。該蛋白條帶可以通過細胞內轉染hRrp 15p特異性s i RNA而降低或消失(F i gur e 5,6),證明hRrp 15p抗體的特異性。該特異性兔抗hRrpl5p抗體為後續研究hRrpl5p的定位及功能奠定基礎，也為探索以hRrpl5p 為生物靶點治療臨床腫瘤的研究提供了基本實驗材料。對HeLa細胞進行G1A同步化，隨後收集各時期的細胞並裂解，應用蛋白印跡雜交實驗檢測hRrpl5p蛋白在細胞周期各時期的表達情況，顯示hRrpl5p在細胞周期G1期較高表達，M期較低表達(Figure ID, IE)。2、hRrpl5p蛋白分子的亞細胞定位應用特異性hRrpl5p抗體進行細胞免疫螢光染色，研究hRrpl5p在細胞周期各時期中的亞細胞定位。結果顯示，hRrpl5p在細胞分裂間期定位於的細胞內並積聚在一起， 在細胞有絲分裂過程中，該蛋白伴隨染色體運動，並隨染色體分離至子細胞中。在胞質分裂期，hRrpl5p定位於中間體部位(Figure 2A)。應用核仁素抗體與hRrpl5抗體進行共染色，發現hRrpl5p與核仁素在細胞核內共定位，表明hRrpl5p定位在間期細胞核核仁區域 (Figure 2B)。3、hRrpl5p各功能區的亞細胞定位應用基因工程技術及載體質粒pEGFP(購自Clontech公司)，構建hRrpl5p各功能區的真核細胞表達質粒(Figure 3A)，在HeLa細胞內表達hRrpl5p各功能區的綠色螢光蛋白(GFP)融合蛋白(Fiugre ，通過細胞免疫螢光染色方法以核仁素為對照檢測hRrpl5p 各功能區的亞細胞定位。結果顯示，hRrpl5p全長(WT)可以定位於核仁區域；hRrpl5p蛋白氨基端150個胺基酸片段(N150)可以定位於細胞核內，但不能聚集在核仁區；hRrpl5p羧基端175個胺基酸片段￠17 可以定位於核仁區；而hRrpl5p蛋白分子中間107至150胺基酸片段(M4!3)基本定位於細胞質中(Figure 3C)。上述結果表明hRrpl5p蛋白分子的核仁定位序列位於蛋白分子羧基端。4、hRrpl5p蛋白分子核仁定位序列的鑑定hRrpl5p蛋白分子羧基端含有一個核定位序列位於胺基酸2 至232 (RKKPK)，根據上述結果，應用基因工程技術及載體質粒PEGFP，構建hRrpl5p的2觀_232胺基酸缺失的表達質粒pEGFP-hRrpl5pA (Figure 4A)，並在HeLa細胞內表達其綠色螢光蛋白(GFP)融合蛋白GFP-hRrpl5p Δ (Figure 4B)，經細胞免疫螢光染色，顯示該缺失突變體蛋白分子定位於細胞核內，但不能定位於核仁區域(Figure 4C)。該結果表明hRrpl5p的第2 至232 胺基酸(RKKPK)是該蛋白分子的核仁定位序列。該研究方法以及結果可以有助於尋找發現新的具有相似核仁定位序列的其他蛋白，以便進一步研究核仁具體功能。5、抑制hRrpl5p蛋白分子細胞內表達導致核仁素不能在細胞核內聚集形成核仁分析hRrpl5p基因序列，設計以hRrpl5p基因74至93鹼基 (AAATGGTAACTGGAGCCGTA)為靶點的特異性小分子幹擾RNA(siRNA)。細胞內轉染siRNA，三天後收集細胞並裂解，將細胞裂解液進行Western Blot檢測分析，與無意義siRNA對照， hRrpl5p特異性siRNA可以有效抑制hRrpl5p蛋白分子的表達(Figure 5A)。對siRNA轉染的細胞進行免疫螢光染色檢測分析，結果顯示，沒有hRrpl5p蛋白染色的細胞內，核仁素在細胞核內彌散分布，不能集聚形成核仁。相反，無意義RNA轉染的細胞內，hRrpl5p正常表達並與核仁素共定位於核仁區域(Figure 5B)。該實驗結果表明核仁素的核仁定位依賴於hRrpl5p蛋白的正常表達。6、外源性表達hRrp 15p可以恢復hRrp 15p siRNA轉染後的核仁素的核仁定位為了驗證hRrpl5p小分子RNA幹擾實驗結果的特異性，設計製備針對hRrpl5p基因3』端非編碼序列(3』 -UTR)的大腸桿菌核糖核酸酶III酶切的小分子RNA文庫(esiRNAlibrary)。 向細胞內共轉染esiRNA文庫以及質粒pEGFP-hRrpl5p或pEGFP-hRrpl5pA，三天後對細胞裂解液進行Western Blot檢測分析，結果顯示hRrpl5p的siRNA可以有效抑制內源性 hRrpl5p以及外源性GFP-hRrpl5p或的表達，但hRrpl5p的esiRNA文庫轉染的細胞中，內源性hRrp 15p的表達明顯降低，但外源性表達的GFP-hRrp 15p或GFP-hRrp 15ρ Δ不受影響(Figure 6A)。對轉染的細胞進行免疫螢光染色檢測，發現在表達外源性GFP_hRrpl5p 的細胞內，核仁素重新聚集在核仁區域。然而，在外源性表達GFP-hRrpl5pA的細胞內， GFP-hRrp 15ρ Δ定位於細胞核內，但卻無法定位於核仁區域，同時核仁素也不能在細胞核內聚集形成核仁結構(Figure 6B)。對上述轉染實驗的細胞進行統計，結果顯示，在 hRrp 15 esiRNA單獨轉染的細胞中，只有37. 7士7. 31 %的細胞存在核仁素的核仁定位； 在 hRrp比esiRNA 與質粒 pEGFP_hRrpl5p 共轉染的細胞中，66. 5士6. 19 % 的 GFP_hRrpl5p 表達(GFP+)的細胞中可檢測到核仁素的核仁定位，而沒有GFP-hRrpl5p表達(GFP-)的細胞，只有44士8. 45%的細胞可檢測到核仁素的核仁定位；相反，在hRrpMesiRNA與質粒pEGFP-hRrpl5pA共轉染的細胞中，只有47. 5士7. 64%的GFP_hRrpl5p Δ表達的細胞和44. 8士8. 14%的GFP-hRrp 15ρ Δ無表達的細胞中可檢測到核仁素的核仁定位(Figure 6C)。該結果表明，外源性蛋白GFP-hRrpl5p可以恢復hRrpl5p RNAi細胞中的核仁素的核仁定位，相反外源性蛋白GFP-hRrpl5pA不能。因此，hRrpl5p蛋白分子的核仁定位決定核仁素的核仁定位。7、抑制腫瘤細胞內hRrpl5p蛋白分子的表達導致子宮頸腫瘤細胞HeLa發生凋亡。在進行hRrpl5p小分子RNA幹擾試驗中，我們發現轉染後的很多細胞發生細胞膜皺縮，細胞形態改變，原本粘附生長的細胞脫離培養皿底部，懸浮在培養液中。為進一步證實hRrpl5p小分子RNA轉染對細胞的作用，我們對轉染後的細胞進行Armexin V染色檢測。 結果顯示，沒有轉染(mock)或轉染無意義小分子RNA(nonsence siRNA)的細胞被Annexin V染色的比例分別為5. 0%和4. 6%，然而，轉染hRrpl5p小分子RNA的細胞中被Annexin V 染色的比例為38. 7% (Figure 7A，7B)。該結果表明抑制細胞內hRrpl5p蛋白分子的表達可以誘導子宮頸腫瘤細胞HeLa發生凋亡。結論(1)複製人核糖體相關蛋白15(hRrpl5p)的cDNA並製備特異性多克隆抗體證實 hRrpl5p定位於細胞核仁區；(2)發現hRrpl5p蛋白分子的2觀_232胺基酸(RKKPK)是該蛋白分子的核仁定位序列；
(3)發現抑制hRrpl5p的表達導致核仁素無法在細胞核內集聚形成核仁。(4)發現抑制hRrpl5p的表達導致子宮頸腫瘤細胞HeLa發生凋亡。


圖I-A為hRrpl5p蛋白分子理論二級結構模式圖(綠色代表α螺旋，黃代表無規則捲曲，紅色代表核定位序列)；圖I-B為在其他物種中與hRrpl5p同源蛋白比對，顯示該蛋白在進化上高度保守；圖I-C為兔抗hRrpl5p抗體的特異性檢測；圖1_D為流式細胞術檢測細胞周期同步化後各時段細胞內DNA含量變化，以反映各時段細胞所處細胞生活時期；圖I-E為蛋白免疫印跡分析hRrpl5p蛋白在細胞周期各時期蛋白表達變化，PRCl作為周期對照，α-tubulin為蛋白量內參。圖2-A為免疫螢光染色技術檢測hRrpl5p蛋白分子在MCF7細胞各細胞周期時相中的定位(綠色代表hRrpl5p，紅色代表α-tublin，藍色代表核DNA)；圖2-B為免疫螢光染色技術檢測hRrpl5p在MCF7細胞間期的核仁定位(綠色代表hRrpl5p，紅色代表核仁素 NucIeolin，藍色代表核DNA)。圖3-A為hRrpl5p各功能片段模式圖(綠色代表α螺旋，黃色代表無規則捲曲，紅色代表核定位序列)；圖3-Β為蛋白免疫印跡檢測GFP-標記的hRrpl5p各功能片段融合蛋白在MCF7細胞內的表達；圖3-C為免疫螢光染色技術檢測GFP-標記的hRrpl5p各功能片段融合蛋白在MCF7細胞間期細胞內定位(綠色代表hRrpl5p，紅色代表核仁素Nucleolin， 藍色代表核DNA)；圖4-A為hRrpl5p蛋白分子C端核定位序列0觀_232胺基酸)缺失突變體模式圖；圖4-B為蛋白免疫印跡檢測GFP-標記的hRrpl5p蛋白分子C端核定位序列缺失突變體在MCF7細胞內的表達；圖4-C為免疫螢光染色技術檢測GFP-標記的hRrpl5p蛋白分子C 端核定位序列缺失突變體在MCF7細胞間期細胞內定位(綠色代表hRrpl5p，紅色代表核仁素NucIeolin，藍色代表核DNA)；圖5-A為蛋白免疫印跡檢測對MCF7細胞進行成功hRrpl5p RNAi ；圖5-B為免疫螢光染色技術檢測hRrpl5p RNAi對MCF7細胞核仁影響(綠色代表hRrpl5p，紅色代表核仁素NucIeolin，藍色代表核DNA)。圖6-A為蛋白免疫印跡檢測hRrpl5p 3』-UTR esiRNA在MCF7細胞中對內源性 hRrpl5p和外源轉入質粒表達的GFP-hRrpl5/hRrpl5的作用；圖6-B為免疫螢光染色技術檢測MCF7共轉染hRrpl5p 3，-UTR esiRNA和GFP_hRrpl5/hRrpl5 Δ表達質粒對細胞核仁影響(綠色代表hRrpl5p，紅色代表核仁素Nucleolin，藍色代表核DNA)；圖6-C為統計分析各處理組有核仁的細胞所佔百分數。圖7-A為Annexin V免疫螢光染色不同小分子RNA轉染的細胞。Annexin V染色為綠色，Hoechsst 33342染色為藍色，PI染色為紅色；圖7-B為對上述染色的細胞進行統計分析，橫坐標為不同處理方法，縱坐標為Armexin V染色的細胞百分比。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York =Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的條件。特別說明 Escherichia coli. BL-21 (DE)pLysS 與 ToplO的標準菌株均購自Novagen生物公司。為讓本發明之上述和其它目的、特徵和優點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例，並配合附圖，作詳細說明如下。實施例1pEGFP-hRrpl5 載體構建1)設計引物
體系)為模板 PCR 擴增 hRrpl5p cDNA 全長(50 μ 1
HeLa cDNA 文庫 EasvPfu 酶(5U/ μ 1) IOX buffer dNTPs(2mM) Primer 1(10 μ Μ) Primer 2(10 μ Μ) 高壓三蒸ddH20:
5 μ 1 1μ 1 5 μ 1 4μ 1 2μ 1 1μ 1 32 μ 1
95°C~5mins. 95°C-30s, 60°C - 30s, 72°C-60s, 72°C-10mins 30cycles
3)用BioFluxPCR產物純化試劑盒純化PCR產物
-將 100 μ 1 PCR 產物加入 200 μ 1 Binding buffer 混勻； -將混合液全部轉移到Spin Column裡 -6000g，離心lmin，並棄去管內液體
-向 Spin Column 內加入 650 μ 1 Wash buffer 12000g，30_60s 離心；
-重複上步操作一次；
-再次12000g離心lmin，然後將Spin Column轉移到無菌的1. 5ml EP管中 -向 Spin Column 內加 42 μ 1 50°C預熱的 Elution buffer，並於室溫靜置 lmin -於 12000g 離心 Imin ；
-1. 5% Agrose IOOV TAE電泳證明EP管內液體溶有目的片段；
4)酶切純化產物50μ 1體系
權利要求
1.人核糖體蛋白分子hRrpl5p特異核苷酸，所述核苷酸包含a)SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列或者其互補DNA序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個鹼基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO 1所示的核苷酸，全長為849個鹼基。
2.權利要求1所述人核糖體蛋白分子hRrpl5p特異核苷酸，其所對應的胺基酸序列如 SEQ ID NO 2所示；具有282個胺基酸。
3.一種真核細胞表達質粒，其特徵在於含有權利要求1所述人核糖體蛋白分子hRrpl5 特異核苷酸，各功能區的真核細胞表達質粒如Figure 3A所示。
4.權利要求1所述人核糖體蛋白分子hRrpl5p在製備核仁素的核仁定位方面的應用， 其中hRrpl5p的核仁定位序列為第2 至232胺基酸RKKPK。
5.權利要求1所述人核糖體蛋白分子hRrpl5p作為核仁素的核仁定位在製備抑制腫瘤細胞增殖藥物方面的應用。
全文摘要
本發明公開了人核糖體蛋白分子hRrp15p具有的特異核苷酸，所述核苷酸包含a)SEQ ID NO1所示的核苷酸序列或者其互補DNA序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個鹼基、仍具有所述核苷酸功能的核苷酸序列；所述的SEQ ID NO1所示的核苷酸，全長為849個鹼基。其所對應的胺基酸序列如SEQ ID NO2具有282個胺基酸。本發明製備了hRrp15p的多克隆抗體並構建該蛋白分子的多種突變體，對hRrp15p的細胞內表達，亞細胞定位以及該蛋白分子對核仁素核仁定位的影響作用進行深入研究。從而解決了核仁素如何定位於核仁結構並促使核仁結構的形成，為細胞內核仁的功能的發揮奠定形態學基礎。
文檔編號A61K48/00GK102174521SQ20111000066
公開日2011年9月7日 申請日期2011年1月4日 優先權日2011年1月4日
發明者張曉鋒, 張而立, 朱長軍, 田明忠 申請人:天津師範大學