人胚胎幹細胞的分化的製作方法

2023-05-16 04:59:01 1

專利名稱：人胚胎幹細胞的分化的製作方法
技術領域：
本發明提供方法來促進多能幹細胞分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞，這些細胞共表達PDX1、NKX6. 1，但不表達⑶X2和NGN3。
背景技術：
用於I型糖尿病的細胞替代療法的進展以及可移植胰島的缺乏已使得注意力集中在開發適於移植物移入的胰島素生成細胞或β細胞的來源上。一種方法是從多能幹細胞例如胚胎幹細胞產生功能性β細胞。在脊椎動物的胚胎發育中，多能幹細胞可在稱為原腸胚形成的過程中產生包括三個胚層(外胚層、中胚層和內胚層)的細胞群體。諸如甲狀腺、胸腺、胰腺、腸和肝臟之類的組織將從內胚層，經由中間階段發育而來。該過程中的中間階段是形成定形內胚層。定形內胚層細胞可表達多種標誌物，如HNF3 0、GATA4、MIXL1、CXCR4和S0X17。定形內胚層分化成胰腺內胚層導致形成胰腺。胰腺內胚層細胞表達胰-十二指腸同源盒基因PDX1。在不存在PDXl時，胰腺形成腹胰芽和背胰芽後不再發育。因而，PDXl表達標誌著胰腺器官發生中的一個關鍵步驟。除了其他細胞類型，成熟的胰腺還包括外分泌組織和內分泌組織。外分泌和內分泌組織來自胰腺內胚層的分化。據報導，從小鼠的胚胎細胞衍生出了帶有胰島細胞特徵的細胞。例如，Lumelsky等人(Science 292:1389,2001)報導了小鼠胚胎幹細胞向類似於胰島的胰島素分泌結構的分化。Soria等人(Diabetes 49 =157,2000)報導，小鼠胚胎幹細胞衍生的胰島素分泌細胞使鏈脲佐菌素誘導的糖尿病小鼠血糖恢復正常。在一個例子中，Hori等人(PNAS 99 16105，2002)公開了用磷酸肌醇3-激酶的抑制劑(LY^4002)處理小鼠胚胎幹細胞得到了類似β細胞的細胞。又如，Blyszczuk等人(PNAS 100 =998,2003)報導了從組成型表達1^x4的小鼠胚胎幹細胞產生產胰島素的細胞。Micallef等人報導，視黃酸可以調控胚胎幹細胞定向形成PDXl陽性胰腺內胚層。 在對應於胚胎的原腸胚形成末期的期間，加入胚胎幹細胞分化第4天的培養物中時視黃酸在誘導 Pdxl 方面最有效(Diabetes 54 =301,2005)。Miyazaki等人報導過表達Pdxl的小鼠胚胎幹細胞系。他們的結果顯示，外源Pdxl 表達在所得的分化細胞中明顯增強了胰島素、生長抑素、葡糖激酶、神經元素3、p48、Pax6 和 HNF6 基因的表達(Diabetes 53 :1030,2004)。Skoudy等人報導，激活素A (TGF-β超家族的成員)能上調小鼠胚胎幹細胞中的胰腺外分泌基因(Ρ48和澱粉酶)和內分泌基因(Pdxl、胰島素和胰高血糖素)的表達。使用 InM激活素A時觀察到了最大的效果。他們還觀察到，胰島素和Pdxl mRNA的表達水平不受視黃酸的影響；然而，3nM FGF7處理導致了 Pdxl的轉錄水平升高(Biochem. J. 379 :749， 2004)。Shiraki等人研究了能特異性增強胚胎幹細胞分化成Pdxl陽性細胞的生長因子的作用。他們觀察到，TGF-β 2可再現地產生更高比例的Pdxl陽性細胞(Genes Cells. 2005 年 6 月；10 (6) =503-16)。Gordon等人闡明了在不存在血清的情況下和在存在激活素連同Wnt信號轉導抑制劑的情況下從小鼠胚胎幹細胞誘導braChyUry[陽性]/HNF3i3 [陽性]內胚層細胞(US 2006/0003446A1)。Gordon 等人(PNAS，第 103 卷，第 16806 頁，2006 年)聲稱「Wnt 禾口 TGF-β /nodal/ 激活素信號轉導同時為前原條的產生所必需」。然而，胚胎幹細胞發育的小鼠模型可能不會完全模擬高等哺乳動物(例如人)中的發育程序。Thomson等人從人胚泡分離出了胚胎幹細胞(Science 282:114,1998)。同時， Gearhart及其同事從胎兒生殖腺組織衍生出了人胚胎生殖(hEG)細胞系(Shamblott等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726,1998)。與可簡單通過與白血病抑制因子(LIF) 一起培養來防止分化的小鼠胚胎幹細胞不一樣，人胚胎幹細胞必須維持在非常特殊的條件下 (美國專利 No. 6, 200, 806 ；WO 99/20741 ；WO 01/51616)。D'Amour等人描述了在高濃度激活素和低血清的存在下產生人胚胎幹細胞衍生的定形內胚層的富集培養物(Nature Biotechnology 2005)。將這些細胞移植到小鼠的腎囊下，導致分化成具有某些內胚層器官的特性的更成熟細胞。在加入FGF-10之後，人胚胎幹細胞衍生的定形內胚層細胞可進一步分化成Pdxl陽性細胞(US 2005/0266554A1)。D，Amour 等人(Nature Biotechnology-24，1392-1401 (2006))聲稱「我們已開發出一種將人胚胎幹(hEQ細胞轉化成能夠合成胰腺激素如胰島素、胰高血糖素、生長抑素、 胰多肽和生長素釋放肽的內分泌細胞的分化方法。該方法通過引導細胞經過通向能表達內分泌激素的細胞的類似定形內胚層、腸管內胚層、胰腺內胚層和內分泌前體的各階段，來模擬體內胰腺器官發生」。又如，Fisk等人報導了用於從人胚胎幹細胞產生胰島細胞的系統 (US2006/0040387A1)。在這種情況下，分化途徑分成三個階段。首先用丁酸鈉和激活素A的組合使人胚胎幹細胞分化成內胚層。然後將細胞與TGF-β拮抗劑(如成頭蛋白(Noggin)) 結合EGF或β細胞素一起進行培養，以產生Pdxl陽性細胞。通過煙醯胺誘導終末分化。在一個例子中，Benvenistry等人聲稱「我們得出結論認為，Pdxl的過表達提高了胰腺富集基因的表達，胰島素表達的誘導可能需要另外的僅存在於體內的信號」 (Benvenistry 等人，Stem Cells 2006 ；24 :1923-1930)。又如，Grapin-Botton等人聲稱「Ngn3的早期活化幾乎完全誘導胰高血糖素陽性細胞，同時耗竭了胰腺祖細胞庫。從Ell. 5開始，PDXl祖細胞具備了分化成胰島素[陽性] 和 PP [陽性]細胞的能力」(Johansson KA 等人，Developmental Cell 12，457-465，2007 年 3月)。因此，仍明顯需要開發用於建立能擴增以滿足目前臨床需要，同時又保持分化成胰腺內分泌細胞、胰腺激素表達細胞或胰腺激素分泌細胞的潛力的多能幹細胞系的條件。我們已採取備選方法，通過產生表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞群來提高人胚胎幹細胞向胰腺內分泌細胞分化的效率，其中所述細胞群共表達PDX1、NKX6. 1，但不表達 CDX2 禾口 NGN3。

發明內容
在一個實施例中，本發明提供一種方法將多能幹細胞群分化成表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞群，該細胞群共表達PDX1、NKX6. 1，但不表達⑶X2和NGN3，所述方法包括以下步驟a.培養多能幹細胞，b.使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，以及c.通過用補充有FGF7的第一培養基處理表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，然後將所述細胞在補充有FGF7、能夠抑制BMP的因子、激活素A、視黃酸和刺蝟蛋白信號傳導通路抑制劑的第二培養基中培養，使表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，所述表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞共表達PDXl、NKX6. 1，但不表達CDX2和NGN3。


圖1示出了在根據實例1所述方法處理的細胞中，在第3階段第4天時，激活素A 對NKX6. UPDXUPTFla和ARX的表達的影響。收集重複樣品用於實時PCR分析。該圖表示各基因相對於對照組(淺灰色柱條)的誘導倍數。深灰色柱條表示用FGF7、環巴胺-KAAD、 視黃酸、20ng/ml激活素A和成頭蛋白處理過的細胞。黑色條表示用FGF7、環巴胺-KAADJS 黃酸、50ng/ml激活素A和成頭蛋白處理過的細胞。圖2示出了免疫螢光圖象，顯示了 NKX6. 1(分圖a、c和e)和NGN3 (分圖b、d和f) 在下列細胞中的表達用FGF7+成頭蛋白+視黃酸+KAAD-環巴胺處理過的細胞(分圖a和 b)或用FGF7+成頭蛋白+視黃酸+KAAD-環巴胺+20ng/ml激活素A處理過的細胞(分圖c 和d)，以及用FGF7+成頭蛋白+視黃酸+KAAD-環巴胺+Alk5抑制劑II處理的細胞(分圖 e 和 f)。圖3示出了免疫螢光圖象，顯示了 PDXl (分圖a和c)、⑶X2(分圖b和d)在下列細胞中的表達用含有B27+FGF7+成頭蛋白+視黃酸+KAAD-環巴胺+20ng/ml激活素A 的DMEM-高葡萄糖處理過的細胞(分圖a和b)，以及用含有1 % B27+FGF7+成頭蛋白+視黃酸+KAAD-環巴胺+20ng/ml激活素A的DMEM/F12-高葡萄糖處理過的細胞(分圖c和d)。
具體實施例方式為了以不受限制的方式清晰說明本公開，將本發明的具體實施方式
分成下列描述或闡明本發明某些特徵、實施例或應用的小節。^X幹細胞是由它們在單細胞水平上既自我更新又分化產生子代細胞的能力來定義的未分化細胞，包括自我更新祖細胞、非更新祖細胞和末端分化細胞。幹細胞還由它們的以下能力來表徵從多個胚層(內胚層、中胚層和外胚層)體外分化成多種細胞譜系的功能細胞的能力，以及在移植後產生多個胚層的組織的能力和在注射到胚泡後基本上促成大多數的組織(如果不是所有的組織的話)的能力。幹細胞根據其發育潛能分為⑴全能，指能夠產生所有的胚胎和胚胎外細胞類型；( 多能，指能夠產生所有的胚胎細胞類型；C3)專能，指能夠產生細胞譜系的亞群，但在特定組織、器官或生理系統內能產生所有的細胞(例如造血幹細胞(HSC)可產生的後代細胞包括HSC(自我更新)、局限於血細胞的寡能祖細胞以及作為血液正常組分的所有細胞類型和成分(如血小板))；(4)寡能，指能夠產生比多能幹細胞更有限的細胞譜系亞群； 以及(5)單能，指能夠產生單一細胞譜系(如生精幹細胞)。分化是未特化的(「未定向的」)或特化不足的細胞獲得特化細胞(如神經細胞或肌肉細胞)的特徵的過程。分化的細胞或誘導分化的細胞是已經在細胞譜系中佔據更特化的(「定向的」)位置的細胞。術語「定向的」當應用到分化的過程時，指在分化途徑中已經進行到這麼一種程度的細胞在正常環境下，它會繼續分化成特定的細胞類型或細胞類型子集，且在正常環境下不能分化成另一細胞類型或回復到分化不足的細胞類型。去分化指細胞回復到細胞的譜系當中特化(或定向)不足的地位的過程。本文所用的「細胞的譜系」 限定細胞的遺傳關係，即它來自哪些細胞和它能產生什麼細胞。細胞譜系將細胞定位於發育和分化的遺傳計劃內。譜系特徵性標誌指與所關注譜系的細胞的表型明確相關的特徵， 可用來評估未定向細胞向所關注譜系的分化。如本文所用，「表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞」或「第1階段細胞」或 「第1階段」是指表達下列標誌物中的至少一種的細胞S0X-17、GATA4、HNF3 3、GSC、CER1、 Nodal、FGF8、Brachyury, Mix 樣同源盒蛋白、FGF4CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、 GATA6、CXCR4、C_Kit、⑶99或0TX2。表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞包括原條前體細胞、原條細胞、中內胚層細胞和定形內胚層細胞。如本文所用，「表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞」是指表達下列標誌物中的至少一種的細胞PDX1、HNF1 β ,PTFl α、HNF6、NKX6. 1或HB9。表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞包括胰腺內胚層細胞、原腸管細胞和後前腸細胞。如本文所用，「定形內胚層」指具有在原腸胚形成過程中從上胚層產生的細胞的特性並形成胃腸道及其衍生物的細胞。定形內胚層細胞表達下列標誌物HNF3i3、GATA4、 S0X17、Cerberus、0TX2、goosecoid、C-Kit, CD99 和 MIXLl。如本文所用，「標誌物」是在所關注細胞中差異表達的核酸或多肽分子。關於這一點，差異表達意指陽性標誌物的水平增加，而陰性標誌物的水平降低。標誌物核酸或多肽的可檢測水平，在所關注細胞中充分地高於或低於在其他細胞中，使得可使用多種本領域公知的方法中的任何一種將所關注細胞與其他細胞鑑別和區分開來。如本文所用，「胰腺內分泌細胞」或「胰腺激素表達細胞」指能夠表達下列激素中的至少一種的細胞胰島素、胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。多能幹細胞的分離、擴增和培養多能幹細胞的表徵多能幹細胞可以表達一種或多種階段特異性胚胎抗原(SSEA)3和4，以及可使用稱為Tra-1-60和Tra-1-81的抗體檢測的標誌物(Thomson等人，Science 282 :1145 1998)。多能幹細胞體外分化導致喪失SSEA-4、Tra 1-60和 ει1-81的表達(如果存在的話)，並增加SSEA-I的表達。未分化的多能幹細胞通常具有鹼性磷酸酶活性，該酶可通過用 4%多聚甲醛固定細胞，然後用Vector Red作為底物顯影來檢測，如生產商所描述(Vector Laboratories,Burlingame Calif)。未分化的多能幹細胞還通常表達0ct_4和TERT，這可通過RT-PCR檢測。增殖的多能幹細胞的另一理想表型是分化成所有三個胚層即內胚層、中胚層和外胚層組織的細胞的潛能。多能幹細胞的多能性可例如通過這樣來證實將細胞注射進重症聯合免疫缺陷(SCID)小鼠中，用4%多聚甲醛固定所形成的畸胎瘤，然後對它們進行組織學檢驗以確定是否存在來自三個胚層的細胞類型。作為另外一種選擇，可以通過產生胚狀體並評估胚狀體中三個胚層相關的標誌物的存在來確定多能性。可以使用標準G帶技術並與已公布的相應靈長類物種的核型相比較來分析增殖的多能幹細胞系的核型。希望獲得具有「正常核型」的細胞，其意指細胞為整倍體，其中所有人染色體都存在並且沒有明顯的改變。多能幹細胞的來源可使用的多能幹細胞的類型包括從妊娠後形成的組織衍生而來的確立多能細胞系，包括在妊娠期間任何時間取得的胚前組織(例如胚泡)、胚胎組織或胎兒組織，所述時間通常是但不一定是在大約10-12周妊娠前。非限制性例子是確立的人胚胎幹細胞系或人胚胎生殖細胞系，例如人胚胎幹細胞系HI、H7和H9 (WiCell)。也可設想的是，在此類細胞的初始建立或穩定期間使用本公開的組合物，在此情況下，源細胞將是直接取自源組織的原代多能細胞。另外合適的是取自已在不存在飼養細胞的情況下培養的多能幹細胞群體的細胞。同樣合適的是突變型人胚胎幹細胞系，例如BGOlv (BresaGen，Athens, GA)。在一個實施例中，人胚胎幹細胞根據Thomson等人(美國專利No. 5，843，780 ； Science 282 :1145,1998 ；Curr. Top. Dev. Biol. 38 133 ff. ，1998 ；Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. 92 :7844,1995)所述的方法進行製備。多能幹細胞的培養在一個實施例中，通常在飼養細胞層上培養多能幹細胞，飼養細胞可以多種方式支持多能幹細胞。作為另一種選擇，在培養系統中培養多能幹細胞，所述培養系統基本上不含飼養細胞，但同樣支持多能幹細胞的增殖而不會進行實質分化。使用通過此前培養另一細胞類型而調理過的培養基來支持多能幹細胞在無飼養細胞的培養物中生長而不分化。作為另一種選擇，用化學成分確定的培養基來支持多能幹細胞在無飼養細胞的培養物中生長而不分化。例如，Reubinoff 等人(Nature Biotechnology 18:399—404(2000))禾口 Thompson 等人(Science，1998年11月6日第282卷，第5391期，第1145-1147頁)公開了用小鼠胚胎成纖維細胞飼養細胞層來培養來自人胚泡的多能幹細胞系。Richards 等人(Stem Cells 21 :546_556，200 評價了一組共 11 種不同的人成體、胎兒和新生兒飼養細胞層在支持人多能幹細胞培養方面的能力。Richards等人聲稱 「在成人皮膚成纖維細胞飼養層上培養的人胚胎幹細胞系保持了人胚胎幹細胞形態並保持了多能性」。US20020072117公開了可產生支持靈長類多能幹細胞在無飼養細胞的培養物中生長的培養基的細胞系。所採用的細胞系是從胚胎組織獲得或從胚胎幹細胞分化而來的間質細胞系和成纖維細胞樣細胞系。US20020072117還公開了所述細胞系作為原代飼養細胞層的用途。又如，Wang等人(Stem Cells 23 1221-1227，2005)公開了使人多能幹細胞在衍生自人胚胎幹細胞的飼養細胞層上長期生長的方法。又如，Stojkovic等人(Stem Cells 2005 23 :306-314,2005)公開了衍生自人胚胎幹細胞自發分化的飼養細胞體系。在另一個例子中，Miyamoto等人(Stem Cells 22 :433-440,2004)公開了得自人胎盤的飼養細胞來源。Amit等人(Biol. R印rod 68 :2150_2156，2003)公開了衍生自人包皮的飼養細胞層。又如，Inzunza等人(Stem Cells 23 =544-549,2005)公開了來自人出生後包皮成纖維細胞的飼養細胞層。US6642048公開了可支持靈長類多能幹(pPQ細胞在無飼養細胞的培養物中生長的培養基以及可用於產生這種培養基的細胞系。US6642048聲稱「本發明包括從胚胎組織獲得或從胚胎幹細胞分化而來的間質細胞系和成纖維細胞樣細胞系。在本公開中描述並闡明了用於衍生這種細胞系、處理培養基以及用該調理培養基培育幹細胞的方法」。又如，W02005014799公開了用於哺乳動物細胞維持、增殖和分化的條件培養基。 W02005014799聲稱「通過鼠細胞(特別是分化並永生化的轉基因肝細胞，稱為MMH (Met鼠肝細胞))的細胞分泌活性對根據本發明製備的培養基進行調理」。又如，Xu等人(Stem Cells 22 =972-980,2004)公開了一種從人胚胎幹細胞衍生物獲得的調理培養基，所述幹細胞衍生物已經過遺傳修飾而過表達人端粒酶逆轉錄酶。又如，US20070010011公開了一種用於維持多能幹細胞的化學成分確定的培養基。一種備選的培養系統採用補充有能促進胚胎幹細胞增殖的生長因子的無血清培養基。例如，Cheon 等人(BioR印rod DOI :10. 1095/biolreprod. 105. 046870，2005 年 10 月 19日)公開了一種無飼養細胞的無血清培養系統，其中胚胎幹細胞維持在補充有能引發胚胎幹細胞自我更新的不同生長因子的未經調理的血清替代(SR)培養基中。又如，Levenstein等人(Stem Cells 24 :568-574,2006)公開了使用補充有 bFGF 的培養基，在不存在成纖維細胞或調理培養基的情況下長期培養人胚胎幹細胞的方法。又如，US20050148070公開了一種在無血清且無成纖維細胞飼養細胞的成分確定的培養基中培養人胚胎幹細胞的方法，該方法包括在含有白蛋白、胺基酸、維生素、礦物質、至少一種轉鐵蛋白或轉鐵蛋白替代品、至少一種胰島素或胰島素替代品的培養基中培養幹細胞，該培養基基本上無哺乳動物胎兒血清且含有至少約lOOng/ml能激活成纖維細胞生長因子信號轉導受體的成纖維細胞生長因子，其中該生長因子的供給來源不是僅為成纖細胞飼養層，該培養基支持幹細胞在無飼養細胞或調理培養基的情況下以未分化狀態增殖。又如，US20050233446公開了一種用於培養幹細胞，包括未分化的靈長類原始幹細胞的限定培養基。在溶液中，此培養基與培養中的幹細胞相比基本上是等滲的。在給定的培養物中，特定的培養基包含基礎培養基和各為一定量的bFGF、胰島素和抗壞血酸，所述一定量的bFGF、胰島素和抗壞血酸為支持原始幹細胞進行實質上非分化性生長所必需的。
又如，US6800480聲稱「在一個實施例中，提供了用於以基本上未分化狀態培養靈長類來源的原始幹細胞的細胞培養基，其包括低滲透壓、低內毒素基礎培養基，此培養基對於支持靈長類來源的原始幹細胞的生長是有效的。該基礎培養基混合了有效支持靈長類來源的原始幹細胞生長的營養血清和選自飼養細胞和衍生自飼養細胞的胞外基質組分的基質。該培養基還包含非必需胺基酸、抗氧化劑和選自核苷和丙酮酸鹽的第一生長因子」。又如，US20050244962描述「在一個方面，本發明提供了一種培養靈長類胚胎幹細胞的方法。在基本上不含哺乳動物胎血清(優選也基本上不含任何動物血清)的培養物中，並在存在由不只是成纖維細胞飼養層的來源提供的成纖維細胞生長因子情況下培養幹細胞。在優選的形式中，通過添加足量的成纖維細胞生長因子，使得之前為維持幹細胞培養物所需的成纖維細胞飼養層變為非必需的」。在另外的例子中，W020050653M公開了一種基本上無飼養細胞和無血清的成分確定的等滲培養基，其包含a.基礎培養基；b.bFGF，其量足以支持實質上上未分化的哺乳動物幹細胞生長；c.胰島素，其量足以支持實質上未分化的哺乳動物幹細胞生長；和d.抗壞血酸，其量足以支持實質上未分化的哺乳動物幹細胞生長。又如，W02005086845公開了一種維持未分化的幹細胞的方法，所述方法包括使幹細胞暴露於轉化生長因子-β (TGF-β)蛋白家族的成員、成纖維細胞生長因子(FGF)蛋白家族的成員或煙醯胺(NIC)，所述成員或煙醯胺的量足以維持細胞處於未分化狀態達足以實現所需結果的一段時間。可將多能幹細胞接種至合適的培養基質上。在一個實施例中，合適的培養基質是胞外基質成分，例如衍自基底膜的成分，或者可形成黏著分子受體-配體偶聯物的一部分的成分。在一個實施例中，合適的培養基質是MATRIGEL (Becton Dickenson)。MATRIGEL 是得自Engelbreth-Holm Swarm腫瘤細胞的可溶性製劑，其在室溫下膠凝而形成重構的基底膜。其他的細胞外基質組分和組分混合物適合作為替代物。取決於所擴增的細胞類型，這可包括單獨的層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖、巢蛋白、硫酸乙醯肝素等或者它們的各種組合。可在存在可促進細胞存活、增殖和保持理想特性的培養基存在的情況下，以合適的分布將多能幹細胞接種於所述基質上。所有這些特性可得益於對接種分布的認真考慮並可容易地由本領域技術人員確定。合適的培養基可由下列組分製成，例如達爾伯克氏改良伊格爾培養基 (Dulbecco' s modified Eagle' s medium，DMEM)，Gibco 貨號 11965-092 ；敲除達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Knockout Dulbecco' s modified Eagle' s medium, KO DMEM), Gibco 貨號 10擬9-018 ；Ham' s F12/50% DMEM 基礎培養基；200mM L-穀氨醯胺，Gibco 貨號15039-027 ；非必需胺基酸溶液，Gibco 11140-050 ； β -巰基乙醇，Sigma貨號Μ7522 ；人重組鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)，Gibco貨號13256-029。由多能幹細胞形成表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞在一個實施例中，本發明提供了由多能幹細胞產生表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞的方法，該方法包括以下步驟a.培養多能幹細胞，
b.使所述多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，以及c.使所述表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。在本發明的一個方面，表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞共表達PDX1、 NKX6. 1，但不表達 CDX-2 和 NGN3。多能幹細胞向表汰定形內胚層譜系特徵件標誌物的細胞的分化表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞的形成可通過在進行特定方案之前或之後檢測該標誌物的存在來確定。多能幹細胞通常不表達這類標誌物。因而，當細胞開始表達它們時即檢測到多能細胞的分化。可通過本領域的任何方法或通過本發明提出的任何方法，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據D，Amour 等人，Nature Biotechnology 23，1534-1541 (2005)中公開的方法，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據Shinozaki 等人，Development 131,1651-1662(2004)中公開的方法，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據McLean等人，Stem Cells 25,29-38(2007)中公開的方法，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據D，Amour 等人，Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中公開的方法，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可通過將多能幹細胞在含有激活素A的培養基中在不存在血清的情況下培養，然後將所述細胞與激活素A和血清一起培養，再然後將所述細胞與激活素A和另一濃度的血清一起培養，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。此方法的一個例子在 Nature Biotechnology 23，1534-1541 (2005)中進行了公開。例如，可通過將多能幹細胞在含有激活素A的培養基中在不存在血清的情況下培養，然後將所述細胞與激活素A和另一濃度的血清一起培養，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。此方法的一個例子在D』 Amour等人，Nature Biotechnology, 2005 中進行了公開。例如，可通過將多能幹細胞在含有激活素A和Wnt配體的培養基中在不存在血清的情況下培養，然後移除Wnt配體並將所述細胞與激活素A和血清一起培養，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。此方法的一個例子在Nature Biotechnology 24，1392-1401 (2006)中進行了公開。例如，可根據轉讓給Lif必can，Inc.的系列號為11/736,908的美國專利申請中公開的方法處理多能幹細胞，使多能幹細胞分化為表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據轉讓給Lif必can，Inc.的系列號為11/779,311的美國專利申請中公開的方法處理多能幹細胞，使多能幹細胞分化為表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據系列號為60/990，529的美國專利申請中公開的方法處理多能幹細胞，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。
例如，可根據系列號為61/076,889的美國專利申請中公開的方法處理多能幹細胞，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據系列號為No. 61/076，900的美國專利申請中公開的方法處理多能幹細胞，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據系列號為61/076,908的美國專利申請中公開的方法處理多能幹細胞，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可根據系列號為61/076,915的美國專利申請中公開的方法處理多能幹細胞，使多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。表汰定形內胚層譜系特徵件標誌物的細胞向表汰胰腺內胚層譜系特徵件標誌物的細胞的分化在一個實施例中，通過在補充有FGF7的第一培養基中培養表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，然後將所述細胞在補充有FGF7、能夠抑制BMP的因子、激活素A、視黃酸和刺蝟蛋白信號傳導通路抑制劑的第二培養基中培養，使表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，所述表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞共表達PDX1、NKX6. 1，但不表達⑶X2和NGN3。在一個實施例中，FGF7可以按約50pg/ml至約50 μ g/ml的濃度使用。在一個實施例中，FGF7按50ng/ml的濃度使用。在一個實施例中，能夠抑制BMP的因子為成頭蛋白。成頭蛋白可以按約500ng/ml 至約500μ g/ml的濃度使用。在一個實施例中，成頭蛋白以lOOng/ml的濃度使用。激活素A可以按約2ng/ml至lOOng/ml的濃度使用。在一個實施例中，激活素A 按20ng/ml的濃度使用。在一個備選實施例中，激活素A按50ng/ml的濃度使用。視黃酸可以按約InM至約ImM的濃度使用。在一個實施例中，視黃酸按1 μ M的濃度使用。在一個實施例中，刺蝟蛋白信號傳導通路抑制劑為環巴胺-KAAD。環巴胺-KAAD可以按約0. 025mM至約2. 5 μ M的濃度使用。在一個實施例中，環巴胺-KAAD按0. 25 μ M的濃
度使用。可通過將處理過的細胞群體暴露於可特異性識別由表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞表達的蛋白質標誌物的試劑(如抗體)來確定分化效率。用於評估蛋白質標誌物和核酸標誌物在培養的或分離的細胞中的表達的方法是本領域的標準方法。這些方法包括定量逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)、RNA印跡、原位雜交 (參見例如 「Current Protocols in Molecular Biology」(Ausubel 等人編輯，2001 年增刊))，以及免疫測定如切片材料的免疫組織化學分析、蛋白質印跡，以及對於可在完整細胞中觸及的標誌物，有流式細胞分析(FACS)(參見例如，Harlow和Lane，Using Antibodies A Laboratory Manual, New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press(1998))。多能幹細胞的特徵是本領域技術人員熟知的，並且其他特徵有待繼續辨別。多能幹細胞標誌物包括(例如)下列標誌物中的一種或多種的表達ABCG2、cripto、F0XD3、 C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、Nanog、hTERT、UTFU ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60、Tra 1-81。在用本發明方法處理多能幹細胞後，可通過使處理過的細胞群體暴露於特異性識別由表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞表達的蛋白質標誌物(如CXCR4)來純化分化的細胞。適用於本發明的多能幹細胞包括(例如)人胚胎幹細胞系H9 (NIH代碼WA09)、 人胚胎幹細胞系Hl (NIH代碼WA01)、人胚胎幹細胞系H7(NIH代碼WA07)以及人胚胎幹細胞系SA002(Cellartis，Sweden)。表達下列多能細胞特徵性標誌物中的至少一種的細胞也適用於本發明ABCG2、cripto、CD9、F0XD3、C0NNEXIN43、C0NNEXIN45、0CT4、S0X2、Nanog、 hTERT、UTFl、ZFP42、SSEA-3、SSEA-4、Tra 1-60 和 Tra 1-81。定形內胚層譜系特徵性標誌物選自S0X17、GATA4、HNF3 3、GSC、CER1、N0DAL、FGF8、 Brachyury、Mix樣同源盒蛋白、FGF4 CD48、脫中胚蛋白(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、 C-Kit,⑶99和0TX2。適用於本發明的是表達至少一種定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。在本發明的一個方面，表達定形內胚層系特徵性標誌物的細胞為原條前體細胞。在另一方面，表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞是中內胚層細胞。在另一方面，表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞是定形內胚層細胞。胰腺內胚層譜系特徵性標誌物選自PDX1、HNF1 β ,PTFl α、HNF6、HB9和PR0X1。適用於本發明的是表達至少一種胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞。在本發明的一個方面，表達胰內胚層系特徵性標誌物的細胞為胰內胚層細胞。徹4普胃紐龍;M勿_胞』_成,在一個實施例中，還可以使由本發明方法產生的表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞(共表達PDX1、NKX6. 1，但不表達⑶X2和NGN!3)進一步分化為表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。可通過本領域的任何方法或通過本發明提出的任何方法，使表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。例如，可通過將根據本發明的方法得到的表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞在含有毒蜥外泌肽-4的培養基中進行培養，然後除去含有毒蜥外泌肽-4的培養基，並隨後將所述細胞在含有毒蜥外泌肽1、IGF-I和HGF的培養基中進行培養，來使表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。此方法的一個例子在D，Amour等人，Nature Biotechnology, 2006中進行了公開。例如，通過在含有DAPT(Sigma-Aldrich，M0)和毒蜥外泌肽4的培養基中培養表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，使根據本發明方法獲得的表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。此方法的一個例子在 D，Amour 等人，Nature Biotechnology, 2006 中進行了公開。例如，通在含有毒蜥外泌肽4的培養基中培養表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，使根據本發明方法獲得的表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。此方法的一個例子在D』 Amour等人，Nature Biotechnology, 2006 中有所公開。例如，根據轉讓給Lif必can，Inc.的系列號為11/736,908的美國專利中公開的方法，通過用抑制Notch信號傳導通路的因子處理表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，使根據本發明的方法得到的表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。
例如，根據轉讓給Lif必can，Inc.的系列號為11/779,311的美國專利中公開的方法，通過用抑制Notch信號傳導通路的因子處理表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，使根據本發明的方法得到的表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。例如，根據轉讓給Lif必can，Inc.的系列號為60/953，178的美國專利中公開的方法，通過用抑制Notch信號傳導通路的因子處理表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，使根據本發明的方法得到的表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。例如，根據轉讓給Lif必can，Inc.的系列號為60/990，529的美國專利中公開的方法，通過用抑制Notch信號傳導通路的因子處理表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，使根據本發明的方法得到的表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞進一步分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。胰腺內分泌譜系特徵性標誌物選自NGN3、NEUR0D、ISLl、PDXl、NKX6. 1、PAX4、NGN3 和PTF-I α。在一個實施例中，胰腺內分泌細胞能夠表達以下激素中的至少一種胰島素、 胰高血糖素、生長抑素和胰多肽。適用於本發明的是表達至少一種胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞。在本發明的一個方面，表達胰內分泌系特徵性標誌物的細胞為胰內分泌細胞。胰內分泌細胞可為表達胰激素的細胞。作為另外一種選擇，胰內分泌細胞可為分泌胰激素的細胞。在本發明的一個方面，胰腺內分泌細胞是表達β細胞譜系特徵性標誌物的細胞。 表達β細胞譜系特徵性標誌物的細胞表達PDXl以及下列轉錄因子中的至少一種NGN3、 ΝΚΧ2. 2、ΝΚΧ6. U NEUROD, SL1、HNF3 β、MAFA, ΡΑΧ4 和 ΡΑΧ6。在本發明的一個方面，表達 β 細胞譜系特徵性標誌物的細胞是β細胞。 Μ在一個方面，本發明提供了一種用於治療患有1型糖尿病，或有發展1型糖尿病風險的患者的方法。在一個實施例中，本方法涉及對多能幹細胞進行培養，使多能幹細胞體外分化成β-細胞譜系，以及將β-細胞譜系的細胞移植到患者體內。在一個替代實施例中，本方法涉及對多能幹細胞進行培養，使多能幹細胞體外分化成表達胰腺內胚層細胞譜系特徵性標誌物的細胞(共表達PDX1、NKX6. 1，但不表達⑶X2和NGN!3)，以及將所述共表達 PDXU NKX6. 1但不表達⑶X2和NGN3的胰腺內胚層譜系的細胞移植到患者體內。在另一個方面，本發明提供了一種用於治療患有2型糖尿病，或有發展2型糖尿病風險的患者的方法。在一個實施例中，本方法涉及對多能幹細胞進行培養，使多能幹細胞體外分化成β-細胞譜系，以及將β-細胞譜系的細胞移植到患者體內。在一個替代實施例中，本方法涉及對多能幹細胞進行培養，使多能幹細胞體外分化成表達胰腺內胚層細胞譜系特徵性標誌物的細胞(共表達PDX1、NKX6. 1，但不表達⑶X2和NGN!3)，以及將所述共表達 PDXU NKX6. 1但不表達⑶X2和NGN3的胰腺內胚層譜系的細胞移植到患者體內。如果合適，可用有利於該植入細胞存活和功能的藥劑或生物活性劑對患者進行進一步處理。這些試劑可包括(例如)胰島素、TGF-β家族的成員(包括TGF-β 1、2和3)、骨形態發生蛋白(ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、ΒΜΡ-7、BMP-IU BMP-12 和 BMP-13)、成纖維細胞生長因子-1和_2、血小板衍生生長因子-AA和-BB、血小板富集血漿、胰島素生長因子(IGF-I、II)、生長分化因子(⑶F-5、GDF-6、⑶F-7、⑶F_8、GDF-10, GDF-15)、血管內皮細胞衍生生長因子(VEGF)、多效蛋白(pleiotrophin)、內皮素等等。其他藥物化合物可包括(例如)煙醯胺、高血糖素樣肽-I (GLP-I)和高血糖素樣肽-II、GLP-1和2模擬體、毒蜥外泌肽_4、視黃酸、甲狀旁腺激素、MAPK抑制劑例如美國已公布的專利申請2004/0209901 和美國已公布的專利申請2004/01327 中所公開的化合物。可使多能幹細胞在移植進接受者前分化成胰島素生成細胞。在一個特定的實施例中，在移植進接受者之前，使多能幹細胞完全分化成細胞。作為另一種選擇，可將多能幹細胞以未分化狀態或部分分化的狀態移植進接受者中。可在該接受者中發生進一步分化。可將定形內胚層細胞或，作為另一選擇，胰腺內胚層細胞，或作為另一種選擇，β 細胞作為分散細胞進行移植，或可使這些細胞形成簇，可將這些細胞簇輸注進肝門靜脈內。 作為另一種選擇，可將細胞設置在生物相容性的可降解聚合物型支持物中、多孔的非可降解性裝置中或可進行封裝以保護其免受宿主免疫應答的破壞。可將細胞移植進接受者中的合適位置內。植入位點包括(例如)肝臟、天然的胰腺、腎包膜下空間、網膜、腹膜、漿膜下空間、腸、胃或皮下袋。為了增強植入細胞的進一步分化、存活率或活性，可在施用細胞之前、與之同時或之後施用額外的因子，例如生長因子、抗氧化劑或抗炎劑。在某些實施例中，利用生長因子使所施用的細胞在體內分化。這些因子可由內源性細胞分泌並原位暴露於所施用的細胞。 可通過本領域已知的內源生長因子或外源給予的生長因子的任意組合來誘導植入細胞進行分化。移植中所用的量取決於多種因素，包括患者的狀況和對該療法的響應，並且可由本領域技術人員確定。在一個方面，本發明提供了一種用於治療患有糖尿病，或有發展糖尿病風險的患者的方法。該方法涉及培養多能幹細胞、使培養的細胞體外分化成細胞譜系，以及將該細胞摻入三維支持物中。在移植進患者前，可使細胞在該支持物上體外維持。作為另一種選擇，可將容納有該細胞的支持物直接移植進患者中而無需進行額外的體外培養。可任選將至少一種有利於植入細胞的存活和功能的藥劑摻入該支持物中。適用於本發明目的的支持材料包括可用於組織修復的組織模板、導管、屏障物和貯器。具體地講，已經在體外和體內用於生物組織重建或再生，以及用於遞送趨化劑來誘導組織生長的泡沫、海綿、凝膠、水凝膠、紡織物和非織造結構形式的合成材料和天然材料適用於實踐本發明的方法。參見，例如在美國專利5，770，417、美國專利6，022，743、美國專利5，567，612、美國專利5，759，830、美國專利6，626，950、美國專利6，534，084、美國專利 6，306，424、美國專利6，365，149、美國專利6，599，323、美國專利6，656，488、美國已公布的專利申請2004/0062753Α1、美國專利4，557，264和美國專利6，333，029中所公開的材料。為了形成摻有藥劑的支承體，可在形成支承體前將藥劑與聚合物溶液混合。作為另一種選擇，可將藥劑塗覆於制好的支持物上，優選在存在藥物載體的情況下進行。藥物可以液體、細分固體或任何其他合適的物理形式存在。作為另一種選擇，可將賦形劑添加至支持物中以改變藥劑的釋放速率。在一個備選實施例中，將至少一種為抗炎化合物的藥物化合物(例如在美國專利6，509，369中所公開的化合物)摻入支持物中。
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可將至少一種為抗凋亡化合物的藥物化合物(例如在美國專利6，793，945中所公開的化合物)摻入支持物中。可將至少一種為纖維變性抑制劑的藥物化合物(例如在美國專利6，331，298中所公開的化合物)摻入支持物中。支持物還可摻有至少一種能夠增強血管生成的藥物化合物，例如美國已公布的專利申請2004/0220393和美國已公布的專利申請2004/0209901中所公開的化合物。支持物還可摻有至少一種為免疫抑制化合物的藥物化合物，例如美國已公布的專利申請2004/0171623中所公開的化合物。支持物還可摻有至少一種為生長因子的藥物化合物，例如TGF- β家族的成員(包括 TGF-β 1、TGF-β 2 和 TGF-β 3)、骨形態發生蛋白(ΒΜΡ-2、ΒΜΡ-3、ΒΜΡ-4、ΒΜΡ-5、ΒΜΡ-6、 ΒΜΡ-7、BMP-11、BMP-12和ΒΜΡ-13)、成纖維細胞生長因子_1和_2、血小板衍生生長因子-AA 和-ΒΒ、血小板富集血漿、胰島素生長因子(IGF-I、IGF-II)、生長分化因子(⑶F-5、⑶F-6、 ⑶F-8、⑶F-10、⑶F-15)、血管內皮細胞衍生生長因子(VEGF)、多效蛋白、內皮素等等。其他藥物化合物可包括(例如)煙醯胺、缺氧誘導因子l-α、高血糖素樣肽-I(GLP-1)、GLP_1和 GLP-2模擬體、毒蜥外泌肽-4、nodal、成頭蛋白、NGF、視黃酸、甲狀旁腺激素、腱生蛋白-C、 彈性蛋白原、凝血酶衍生的肽、凱薩林菌素(cathelicidin)、防禦素(defensin)、層粘連蛋白、含有粘附性細胞外基質蛋白例如纖粘蛋白和玻璃粘連蛋白的細胞結合結構域和肝素結合結構域的生物肽、MAI3K抑制劑(例如在美國已公布的專利申請2004/0209901和美國已公布的專利申請2004/01327 中所公開的化合物)。可通過將細胞簡單地沉積在該支架上來實現將本發明細胞摻入支架中。細胞可通過簡單擴散進入支架中(J. Pediatr. Surg. 23(1 Pt 2) :3-9(1988)) 0已經發展了若干其他方法來增強細胞接種的效率。例如，已經將轉瓶用於將軟骨細胞接種於聚乙醇酸支架上(Biotechnol. Prog. 14(2) 193-202 (1998))。用於細胞接種的另一種方法是利用離心，這種離心產生最小的應力給接種的細胞並增強接種效率。例如，Yang等人開發了一種細胞接種方法(J. Biomed. Mater. Res. 55(3) :379-86 Q001))，稱為離心細胞固定 (Centrifugational Cell Immobilization, CCI)。本發明通過(但不限於)以下實例進一步說明。實例1人多能幹細朐,向表達J夷腺^lKHIi普系Φ寺徵+牛標;勿的細朐,(共表達PDX1、 NKX6. 1，但不表達CDX2和NGN3)的分化本實例說明，激活素A可與成頭蛋白和視黃酸聯合使用來促進NKX6. 1表達的上調。簡言之，將人胚胎幹細胞系Hl的細胞在MATRIGEL (1 30稀釋)塗布的平皿和補充有 2% BSAU00ng/ml 激活素 A、20ng/ml WNT_3a、8ng/ml bFGF 的 RPMI 培養基上培養一天， 然後用補充有2% BSAU00ng/ml激活素A、8ng/ml bFGF的RPMI培養基再處理兩天(第1 階段)，接下來a.用 DMEM/F12+2% BSA+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環巴胺-KAAD 處理三天(第 2 階段)，然後b.用 DMEM-高葡萄糖 +1 % B27+50ng/ml FGF7+0. 25 μ M 環巴胺-KAAD+2 μ M 視黃酸 (RA) +100ng/ml成頭蛋白+20ng/ml激活素A或50ng/ml激活素A處理四天(第3階段)。
作為對照，用補充有B27、50ng/ml FGF7、0. 25 μ M環巴胺_KAAD、2 μ M視黃酸 (RA)和lOOng/ml成頭蛋白的高葡萄糖DMEM處理單獨的細胞群。在第3階段的第4天對培養物進行取樣，一式兩份，然後用實時PCR對胰腺標誌物的表達進行分析。如圖1所示，在第3階段的第4天，用激活素A處理使NKX6. 1的表達水平升高，比未接受激活素A的細胞所觀察到的表達水平更高。由激活素A介導的NKX6. 1的表達水平與激活素A的劑量成比例增加。在第3階段的第4天也觀察到了細胞中NGN3表達的下調。為了確定TGF-β通路是否參與促進表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞 (共表達PDX1、NKX6. 1，但不表達⑶X2和NGN!3)的形成，按下列步驟處理細胞將人胚胎幹細胞系Hl的細胞在MATRIGEL 塗布的平皿(1 30稀釋)上培養，然後利用以下方案進行分化a.在補充有 2% BSA(目錄號152401，MP Biomedical,Ohio)禾Π 100ng/ml 激活素 A (R&D Systems, MN)力卩 20ng/ml WNT-3a (目錄號1324-WN-002，R&D Systems, MN)加 8ng/ ml bFGF(目錄號:100_18B，PeproTech, NJ)的 RPMI 培養基(目錄號:22400, Invitrogen, Ca)中培養一天，然後用補充有2% BSA和lOOng/ml激活素A加8ng/mlbFGF的RPMI培養基再處理兩天(第1階段)，接下來b.用 DMEM/F12(目錄號11330，Invitrogen, Ca) +2% BSA+50ng/ml FGF7 處理三天(第2階段)，然後c.進行處理 1 用 DMEM(高葡萄糖)+1% B27 (Invitrogen, CA)+50ng/ml FGF7、 0. 25 4 11環巴胺-以40、2 4 11視黃酸(RA)和100ng/ml成頭蛋白處理四天，或d.進行處理 2 用 DMEM(高葡萄糖)+1 % B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml FGF7、 0. 25 μ M環巴胺-KAAD、2 μ M視黃酸(RA)、100ng/ml成頭蛋白、20ng/ml激活素A處理四天， 或e.進行處理 3 用 DMEM(高葡萄糖)+1 % B27(Invitrogen，CA)+50ng/ml FGF7、 0. 25 μ M環巴胺-KAAD、2 μ M視黃酸(RA)、100ng/ml成頭蛋白、1 μ M ALK5抑制劑11處理四天。在第3階段的第4天對培養物進行取樣，一式兩份，然後用實時PCR對胰腺標誌物的表達進行分析。還平行固定培養物，以進行免疫螢光分析。表1示出了用本實驗的最低條件(處理1)進行歸一化時ΝΚΧ6. UNGN3和PDXl在第3階段第4天的相對表達水平。表 權利要求
1. 一種使多能幹細胞群分化成表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞群的方法，所述表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞群共表達PDX-1、NKX-6. 1，但不表達⑶X-2和 NGN-3，所述方法包括下列步驟a.培養所述多能幹細胞，b.使所述多能幹細胞分化成表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，以及c.通過用補充有FGF7的第一培養基處理表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞， 然後將所述細胞在補充有FGF7、能夠抑制BMP的因子、激活素A、視黃酸和刺蝟蛋白信號傳導通路抑制劑的第二培養基中培養，使所述表達定形內胚層譜系特徵性標誌物的細胞分化成表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞，所述表達胰腺內胚層譜系特徵性標誌物的細胞共表達PDXl、NKX6. 1，但不表達CDX2和NGN3。
全文摘要
本發明提供促進多能幹細胞分化成表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞的方法，所述表達胰腺內分泌譜系特徵性標誌物的細胞共表達PDX1、NKX6.1，但不表達CDX2和NGN3。
文檔編號C12N5/071GK102597219SQ201080033700
公開日2012年7月18日 申請日期2010年7月20日 優先權日2009年7月20日
發明者J·延森, J·徐 申請人:克裡夫蘭診所基金會, 詹森生物科技公司