一種幹擾植物內源cle家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽的製作方法
2023-05-01 00:15:01 1
專利名稱：一種幹擾植物內源cle家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，具體地涉及一種幹擾植物內源CLE家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽。
背景技術：
從上世紀90年代初高等植物第一個多肽激素一系統素的發現開始，已有來自包括擬南芥、水稻、大豆等不同植物的20餘種小分子多肽激素被報導，參與包括免疫防禦反應、根瘤形成、細胞分裂、幹細胞維持與分化、氣孔發生、花葯絨氈層發育、花粉-柱頭識別、花粉管導向及花瓣脫落等諸多重要生物學過程。從目前研究結果看，小分子多肽激素主要在近距離信號轉導中起作用，通過與周邊細胞膜表面的LRR-RLK家族的受體激酶相互作用，啟動下遊信號通路，參與植物發育過程中起重要作用的位置信號的建立和逆境應答等。植物多肽激素通常由幾個到幾十個胺基酸組成，一般是由一個較大的原初蛋白經過分泌和剪切加工產生。隨著生物信息學技術的發展，越來越多的植物多肽激素被預測出來，人們也迫切希望對其功能有所了解。而利用目前現有的方法對植物多肽激素進行功能研究還存在許多問題。例如，1:由於編碼多肽激素的基因通常較小，目前的基因突變方法如EMS誘變及T-DNA插入的方法很難突變到它們；2:由於多肽激素在植物體內是作為信號分子發揮作用，含量通常很低，目前的技術手段很難從植物體內分離並檢測到這些多肽激素；3:由於編碼植物多肽激素的基因通常屬於某個基因家族，其編碼的前體蛋白包含有保守的多肽編碼區，功能存在冗餘，即使突變掉其中某個成員也很難看到植物有所異常，因此也無從對其功能進行研究。CLV3/ESR(CLE)多肽激素 家族成員含有一個保守的包括12-14個胺基酸的CLE結構域，在擬南芥、水稻、玉米、大豆、油菜、菸草和包囊線蟲等多個物種中都發現有CLE多肽激素的存在。擬南芥CLE家族有32個成員，CLV3是其中之一，主要參與莖尖分生組織維持，已有報導CLV3突變後莖尖分生組織幹細胞數目增多，相應的營養分生組織和花序及花分生組織變大，花器官如萼片、花瓣、雄蕊及心皮數目均變多。結構域缺失實驗表明，只保留CLV3的信號肽和CLE結構域足以行使CLV3的功能。體外合成對應CLV3CLE結構域12個胺基酸(N-RTVPSGPDPLHH-C)的CLV3多肽能夠行使CLV3的功能，互補clv3突變體的表型，說明該12個胺基酸的CLE結構域是CLV3多肽激素的功能域。擬南芥CLE家族其他多個成員突變後沒有可見表型，過量表達該家族成員表現出植株變矮、叢生及根分生組織分化等類似表型，暗示該家族成員間存在功能冗餘。
發明內容
本發明的目的是建立一個有效產生小分子多肽激素的拮抗多肽的方法，通過轉基因對特定多肽進行功能干擾，阻斷其下遊信號轉導，進而對其進行功能研究，並挖掘其在模式植物擬南芥及作物上的潛在應用價值。
本發明的目的是提供一種幹擾植物內源CLE家族多肽激素的方法及可能的應用。本發明的再一目的是提供小分子多肽激素CLV3的拮抗多肽。本發明的再一目的是提供小分子多肽激素CLEl的拮抗多肽。本發明的再一目的是提供小分子多肽激素CLE8的拮抗多肽。本發明的再一目的是提供小分子多肽激素CLE27的拮抗多肽。根據本發明的幹擾植物內源CLE家族多肽激素的方法，其中，所述方法包括以下步驟:(I)獲得多肽突變體突變小分子多肽激素CLV3的多肽編碼區CLE結構域，將其多肽編碼區CLE結構域(N-RTVPSGPDPLHH-C)第六位的甘氨酸(G)分別置換為丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)、天冬氨酸(D)和穀氨酸(E)後產生有效拮抗多肽；或者突變小分子多肽激素CLEl (N-RLSPGGPDPRHH-C)的多肽編碼區CLE結構域，將其多肽編碼區CLE結構域第六位的甘氨酸(G)置換為蘇氨酸(T);或者突變小分子多肽激素CLE8 (N-RRVPTGPNPLHH-C)的多肽編碼區CLE結構域，將其多肽編碼區CLE結構域第六位的甘氨酸(G)置換為蘇氨酸(T);或者突變小分子多肽激素CLE`27 (N-RIVPSCPDPLHN-C)的多肽編碼區CLE結構域，將其多肽編碼區CLE結構域第六位的半胱氨酸(C)置換為蘇氨酸(T)，(2)將步驟(I)中獲得的多肽突變體的編碼基因轉入植物中表達。根據本發明的幹擾植物內源CLE家族多肽激素的方法，將CLV3多肽第六位的甘氨酸分別替換為亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、天冬醯胺、穀氨酸和賴氨酸後在轉基因植物中產生明顯的拮抗效應；將CLV3多肽激素第六位的甘氨酸替換為蘇氨酸後在轉基因植物中產生更強的拮抗效應。上述方法對於植物生長點的遺傳操作有效，可以產生生長點變大的表型，從而導致花器官數目增加及果實變大，種子數目增加等。基於對CLV3多肽激素的研究表明CLE多肽中的第六位胺基酸是產生顯性負突變的目標位點，即是產生拮抗效應的目標位點。進一步，將該突變技術應用到小分子多肽激素CLEl(N-RLSPGGPDPRHH-C)Jf CLEl第六位的甘氨酸替換為蘇氨酸，對於植物花序分生組織遺傳操作有效，能夠增大植物花序分生組織，從而導致植物花數目變多，相應的果實數目變多等；應用到小分子多肽激素CLE8 (N-RRVPTGPNPLHH-C)Jf CLE8第六位的甘氨酸替換為蘇氨酸，對於植物胚胎的遺傳操作有效，能夠改變植物胚胎發育過程中的細胞分裂模式，導致植物胚胎敗育；應用到小分子多肽激素CLE27 (N-RlVPSCPDPLHN-C)Jf CLE27第六位的半胱氨酸替換為蘇氨酸，對於植物花瓣大小的遺傳操作有效，能夠使植物產生小花瓣。根據本發明的具體實施方式
，將CLV3多肽激素的這些拮抗多肽通過轉基因的方法轉化到野生型植物中，實現增大營養分生組織和花序分生組織大小及增多花器官數目等目的。因此，將CLV3多肽激素的這些拮抗多肽通過轉基因的方法轉化到作物中具有潛在的增大營養分生組織和花序分生組織大小及花器官數目等應用價值。對於小分子多肽激素CLEl (N-RLSPGGPDPRHH-C)，將其多肽編碼區CLE結構域的甘氨酸(G)置換為蘇氨酸(T)，通過轉基因的方法轉化到野生型植物中，實現增大花序分生組織的目的。對於小分子多肽激素CLE8 (N-RRVPTGPNPLHH-C)，將其多肽編碼區CLE結構域的甘氨酸(G)置換為蘇氨酸(T)，通過轉基因的方法轉化到野生型植物中，可以導致胚胎敗育。對於小分子多肽激素CLE27(N-RIVPSCPDPLHN-C)，將其多肽編碼區CLE結構域的半胱氨酸(C)置換為蘇氨酸(T)，通過轉基因的方法轉化到野生型植物中，能夠導致花瓣細胞變小，最終導致花瓣變小。
因此，根據本發明的CLV3的拮抗多肽，通過將置換其多肽編碼區CLE結構域(N-RTVPSGPDPLHH-C)第六位的甘氨酸(G)而獲得，其中，CLE結構域的甘氨酸(G)可以分別置換為丙氨酸(A)、亮氨酸(L)、異亮氨酸(I)、纈氨酸(V)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、脯氨酸(P)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)、絲氨酸(S)、蘇氨酸(T)、酪氨酸(Y)、天冬醯胺(N)、穀氨醯胺(Q)、賴氨酸(K)、精氨酸(R)、組氨酸(H)、天冬氨酸(D)和穀氨酸(E)。通過二維胺基酸置換結合轉基因的方法轉化野生型植物，尋找特定小分子多肽激素的有效拮抗多肽的方法。利用該方法對小分子多肽激素進行研究和應用。根據本發明的具體實施方式
，以擬南芥小分子多肽激素CLV3為基礎，通過二維胺基酸置換的方法得到一系列胺基酸置換後的有效拮抗多肽。這些CLV3拮抗多肽(CLV3e6A，CLV3G6L, CLV3G6I, CLV3G6V, CLV3G6F, CLV3G6ff, CLV3G6P, CLV3G6M, CLV3G6C, CLV3G6S, CLV3G6T, CLV3G6Y, CLV3G6N, CLV3G6Q, CLV3G6K, CLV3G6E, CLV3G6H, CLV3G6D和CLV3e6E)在野生型擬南芥植物中能夠阻斷正常CLV3多肽激素的功能及下遊信號轉導，導致莖尖分生組織變大、花器官數目變多等類似突變體的表型。因此，根據本發明的方法，CLEl拮抗多肽(CLE1t)能夠導致野生型擬南芥植物花分生組織變大，CLE8拮抗多肽(CLE8e6T)能夠導致野生型擬南芥植物胚胎敗育，CLE27拮抗多肽(CLE27e6T)導致野生型擬南芥植物花瓣變小。據此方法可以針對某個特定多肽，將其第六位胺基酸替換為其他胺基酸，轉化野生型植物產生其拮抗多肽，對其進行功能研究和實際應用。本發明實現了對小分子多肽激素的定向改造，能夠針對某個特定多肽激素抑制其功能，進而達到對該多肽激素進行研究和應用的目的。
圖1:CLV3多肽的二維胺基酸置換示意圖，其中，CLV3多肽12個胺基酸被丙氨酸(Alanine, A)逐一替換，然後第六位的甘氨酸(Glycine，G)被18種其他胺基酸逐一替換。圖2:CLV3多肽第六位甘氨酸的胺基酸置換結果，CLV3多肽第六位甘氨酸(G)依次被其它18種胺基酸替換後轉化野生型植物，轉基因植物表現不同比例的顯性負突變(dominant-negative, D-N)類似clv3突變體表型(b)，其中蘇氨酸替換(CLV3e6T)的轉基因植物表現出最高達70%的類似clv3突變體表型(a)。圖3:CLV3G6T轉基因植物表型，a野生型植物的2心皮果莢橫切圖；bCLV3e6T轉基因植物的4心皮果莢橫切圖；c野生型植物的莖尖分生組織(Shoot Apical Meristem, SAM)；dCLV3G6T轉基因植物類似clv3突變體的增大的SAM ;e WUS在CLV3e6T轉基因植物花序分生組織(Inflorescences meristem, IM)和花分生組織(Floral Meristem, FM)中表達；fWUS 在clv3-2突變體花序分生組織和花分生組織中的表達情況。圖4: CLE8G6T轉基因植物胚胎敗育，CLE8G6T轉基因植物表現出胚胎敗育表型。(a )CLESg6t轉基因植物果莢中有部分敗育胚珠，如箭頭所示；(b)野生型植物果莢中正常的胚珠；((3)野生型植物心形期胚胎；((1，64^)0^8(^轉基因植物的敗育胚胎，顯示細胞分裂模式的異常。圖5 =CLEIg6t轉基因植物花序分生組織變大。CLEIkst轉基因植物表現出花序分生組織變大的表型。(a)野生型植物花序；(b) CLEIkst轉基因植物花序；(c)掃描電鏡顯示野生型植物花序分生組織；(d)掃描電鏡顯示CLE1t轉基因植物花序分生組織。圖(a)和(b)中箭頭指示正在開放的花；圖((3)和(d)中陰影標示花序分生組織。圖a和b中箭頭指示開放的花；圖c和d中陰影指示花序分生組織。圖6:CLE27C6T轉基因植物花瓣變小，與Col-O野生型植物相比，CLE27C6T轉基因植物表現出部分花瓣變小的表型。
具體實施例方式實施例11、CLV3多肽激素12個胺基酸的一維丙氨酸掃描通過設計引物及PCR的方法將點突變引入到CLV3基因的多肽激素編碼區CLE結構域(序列為:N-RTVPSGPDPLHH-C)，完成該多肽區域12個胺基酸的逐一丙氨酸(Alanine，A)替換，將PCR產物(包括5』端起始密碼子ATG前1857bp和3』端終止密碼子TGA後1518bp調控序列及基因組序列559bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:ATGGATTCGAAGAGTTTTCTGCTACTACTACTACTCTTCTGCTTCTTGTTCCTTCATGATGCTTCTGGTCTCACTCTCTCTTTCACTCCTCTATATGTCTATAACTCATGTAAATGGATTCTTATAAGTCTCAACATAACTTTTTTTTGTTATTTACTATTTCACCAGATCTCACTCAAGCTCATGCTCACGTTCAAGGACTTTCCAACCGCAAGGTTATCTTCAACTTGTACTCATTAAGGCCTCTCAATATTCATGTGTTATGTTCATGTAGATGTCCGGTCCAGTTCAACAACTGTTTCATTGCTTTAGTTGTCACGAGAAATATTTGTATATATTATTATGGTGTGCAAAACATAGTAAAATGTTGTTCAATTGGCAGATGATGATGATGAAAATGGAAAGTGAATGGGTTGGAGCAAATGGAGAAGCAGAGAAGGCAAAGACGAAGGGTTTAGGACTACATGAAGAGTTAAGGACTGTTCCTTCGGGACCTGACCCGTTGCACCATCATGTGAACCCACCAAGACAGCCAAGAAACAACTTTCAGCTCCCTTGA)克隆到pD0NR221載 體，再亞克隆到pBGWFS7目的載體，得到構建依次命名為CLV3K1A，CLV3T2A，CLV3V3A, CLV3p4A, CLV3S5A, CLV3G6A, CLV3P7A, CLV3艦，CLV3P9A, CV33L10A, CLV3H11A 和 CLV3H12A (圖1)。利用農桿菌轉化結合花序浸泡的方法將這些構建轉化到野生型擬南芥中，通過抗性篩選得到陽性轉基因苗Tl代植株，並對其進行心皮數目統計。其中轉CLV3e6A—株植物表現出多心皮類似clv3突變體的表型，進一步與野生型回交分析證明這一株CLV3e6AR基因植物是顯性表型，且可以穩定遺傳。將CLV3e6A這種能夠在野生型植物中產生類似突變體表型的多肽稱為拮抗多肽(antagonistic peptide)。2、CLV3多肽激素第六位甘氨酸的二維胺基酸掃描由於拮抗多肽CLV3e6A產生顯性負突變效果的效率很低，為得到更高效率的拮抗多肽，我們將CLV3基因的多肽編碼區CLE結構域的甘氨酸(Glycine，G)逐一替換為其他18種胺基酸，即亮氨酸(Leucine, L)、異亮氨酸(Isoleucine, I)、糹顏氨酸(Valine, V)、苯丙氨酸(Phenylalanine, F)、色氨酸(Tryptophan, W)、脯氨酸(Proline, P)、甲硫氨酸(Methionine, Μ)、半胱氨酸(Cysteine, C)、絲氨酸(Serine, S)、蘇氨酸(Threonine, T)、酪氨酸(Tyrosine, Y)、天冬醯胺(Asparagine, N)、穀氨醯胺(Glutamine, Q)、賴氨酸(Lysine,K)、精氨酸(Arginine, R)、組氨酸(Histidine, H)、天冬氨酸(Aspartic acid, D)和穀氨酸(Glutamic acid, E)，依次命名為 CLV3G6L，CLV3G6I, CLV2G6V, CLV3G6F, CLV3G6ff, CLV3G6P, CLV3G6M,CLV3G6C, CLV3G6S, CLV3G6T, CLV3G6Y, CLV3G6N, CLV3G6Q, CLV3G6K, CLV3G6E, CLV3G6H, CLV3G6D 和 CLV3G6E，然後依照步驟一的方法分別克隆到PBGWFS7載體並轉化擬南芥野生型植物，篩選Tl代陽性轉基因苗，並統計心皮數目。結果顯示這18種胺基酸替換產生clv3突變體表型的效率各不相同(圖2)，其中拮抗多肽CLV3e6T的拮抗效率最高，達70%的轉基因植物表現出顯性負突變(dominant-negative, D-N)表型，即類似clv3突變體的表型(圖2)。進一步的實驗證據證明CLV3e6T轉基因植物的表型與clv3突變體一致，表現出心皮數目增多、莖尖分生組織變大及WUS表達區域變大等(圖3)，且這種表型可以穩定遺傳。3、拮抗多肽方法在CLEl多肽激素中的應用
為驗證對CLV3多肽行之有效的拮抗多肽方法對其他多肽是否有效，通過設計引物和PCR的方法，將擬南芥CLEl多肽(N-RLSPGGPDPRHH-C)第六位的甘氨酸突變為蘇氨酸(命名為CLEle6T)，將PCR產物(包括5』端1829bp、3』端1105bp調控序列和基因組序列225bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示:ATGGCTAACTTGAAATTCTTGCTGTGCTTGTTCTTGATCTGCGTTTCCTTATCGCGTTCATCAGCGTCTCGACCGATGTTCCCAAACGCAGACGGGATTAAACGAGGGCG TATGATGATAGAAGCAGAGGAAGTGTTGAAAGCGAGTATGGAGAAGCTAATGGAGAGAGGTTTTAATGAGTCCATGAGACTCAGTCCTGGAGGTCCCGATCCTCGCCATCACTAA)克隆到pBGWFS7載體，然後轉化野生型植物。結果顯示5%轉基因植物表現出花序分生組織變大表型(圖4)。4、拮抗多肽方法在CLE8多肽激素中的應用通過設計引物和PCR的方法，將CLE家族成員之一的CLE8多肽(N-RRVPTGPNPLHH-C)第六位的甘氨酸突變為蘇氨酸(命名為CLE8e6T)，將PCR產物(包括5』端1881bp、3，端1455bp調控序列和基因組序列261bp，如SEQ ID N0.3所不:ATGAAAGTGTTGAAGAGAGATTCGATGTTGTTACTCATAACACTCTATTTCTTGTTGACAACATCAATGGCTCGTCAAGATCCTTTTCTGGTTGGAGTCGAGAAAGACGTTGTCCCAGCTGGAACCGATCTAAAACAGAACAAGGCGAAACCTCATCTTCCTAATTTGTTTCGAACTATGAGAAGAGTTCCTACCGGTCCTAATCCATTACATCACATTTCTCCTCCTCAGCCTGGAAGTCTAAACTATGCTAGGAACTGA)克隆到 pBGWFS7 載體，然後轉化野生型植物。結果顯示10%轉基因植物表現出胚胎敗育表型(圖5)。5、拮抗多肽方法在CLE27多肽激素中的應用通過設計引物和PCR的方法，將CLE家族成員之一的CLE27多肽(N-RlVPSCPDPLHN-C)第六位的半胱氨酸突變為蘇氨酸(命名為CLE27e6T)，將PCR產物(包括5，端1606bp和3，端1201bp調控序列和基因組序列276bp，其核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示:ATGACTCATGCTCGAGAATGGAGAAGCTCTTTGACTACTACACTTCTAATGGTGATCTTGCTTTCTTATATGCTCCATCTCTTCTGTGTATATTCACGGGTAGGGGCAATTCGGATATTTCCAGAAACTCCGGCTTCGGGTAAGAGACAAGAAGAAGATCTAATGAAGAAGTACTTCGGCGCCGGGAAATTTCCACCGGTGGATTCTTTTGTCGGTAAAGGGATCAGTGAGAGTAAAAGAATAGTACCAAGTTGTCCGGATCCTTTGCATAACTAG)克隆到 pBGWFS7 載體，然後轉化野生型植物。結果顯示10%轉基因植物表現出花瓣變小的表型(圖6)。以上例子包括對CLV3、CLE1、CLE8和CLE27多肽激素的研究均證明該拮抗多肽方法能夠針對某個特定多肽，幹擾其功能，從而實現對特定小分子多肽激素的研究和應用。
權利要求
1.擾植物內源多肽激素的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟: (1)將CLV3多肽激素的第六位的甘氨酸分別置換為丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和穀氨酸，所述CLV3多肽激素的序列為N-RTVPSGPDPLHH-C, 突變小分子多肽激素CLEl:N-RLSPGGPDPRHH-C的多肽編碼區CLE結構域，將其多肽編碼區CLE結構域的甘氨酸置換為蘇氨酸；或者 突變小分子多肽激素CLE27:N-RIVPSCPDPLHN-C的多肽編碼區CLE結構域，將其多肽編碼區CLE結構域的半胱氨酸置換為蘇氨酸， (2)通過轉基因方法將步驟(I)中獲得的多肽突變體通過轉基因方法在植物中表達。
2.分子多肽激素CLV3的拮抗多肽，其特徵在於，通過將置換其多肽編碼區CLE結構域:N-RTVPSGPDPLHH-C第六位的甘氨酸為丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、脯氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨酸和穀氨酸而獲得。
3.分子多肽激素CLEl的拮抗多肽，其特徵在於，通過將小分子多肽激素CLEl的多肽編碼區CLE結構域:N-RLSPGGPDPRHH-C第六位的甘氨酸置換為蘇氨酸而獲得。
4.分子多肽激素CLE8的拮抗多肽，其特徵在於，通過將小分子多肽激素CLE8的多肽編碼區CLE結構域的:N-RRVP TGPNPLHH-C第六位的甘氨酸置換為蘇氨酸而獲得。
5.分子多肽激素CLE27的拮抗多肽，其特徵在於，通過將小分子多肽激素CLE27的多肽編碼區CLE結構域:N-RIVPSCPDPLHN-C第六位的半胱氨酸置換為蘇氨酸而獲得。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，具體地涉及一種幹擾植物內源CLE家族多肽激素的方法及小分子多肽激素的拮抗多肽。根據本發明的方法，通過胺基酸置換獲得小分子多肽激素CLV3、CLE1、CLE8、CLE27的有效拮抗多肽，並通過轉基因的方法在植物中表達，實現對特定多肽進行功能干擾，阻斷其下遊信號轉導，進而對其進行功能研究，並挖掘其在模式植物擬南芥及作物上的潛在應用價值。
文檔編號C12N15/82GK103088054SQ20121059019
公開日2013年5月8日 申請日期2012年12月29日 優先權日2012年12月29日
發明者劉春明, 宋秀芬, 國鵬, 任仕超, 徐婷婷 申請人:中國科學院植物研究所