一種利用兼性厭氧菌發酵制氫的方法

2023-04-23 07:25:36 4

專利名稱：：一種利用兼性厭氧菌發酵制氫的方法
技術領域：
：本發明涉及一種生物制氫的方法，尤其是一種利用兼性厭氧菌制氫的方法。
背景技術：
：隨著經濟的快速發展和人民生活水平的不斷提高，我國能源消費總量也迅速增力口。在目前所用的商品能源中95%是化石能源，但是由於化石能源開發利用過程中引起的環境問題，嚴重製約著可持續發展。在世界化石能源資源快速消耗，環境汙染日益嚴重和氣候變暖威脅逐漸增大的形勢下，為了支持中國政府提出的到2020年單位國內生產總值二氧化碳排放比2005年較少40%至45%的目標，氫等可再生能源的開發利用尤其要受到高度重視。氫作為一種清潔的新型能源，大大地減輕了對環境的汙染，保護了自然界的生態平衡，而且它本身可再生，儲量十分豐富，能量密度高，是汽油的2175倍，熱轉化率也很高。因此，它最有希望成為未來人類的清潔能源。相對於日益完善的氫能利用下遊體系，氫氣卻沒有在以可再生資源為原料生產方面實現突破。目前，氫氣主要來源還是化石燃料的重整轉化(佔96%)和電解水制氫(佔4%)，這顯然未能擺脫原有的化石能源體系。因此，如何可持續地從自然界獲取氫氣尤其受到人們的關注。生物制氫是解決這一問題的重要途徑之一。現代生物制氫的研究始於20世紀70年代的能源危機，到90年代隨著對溫室效應的進一步認識，生物制氫作為可持續發展的工業技術再次引起人們的重視。生物制氫包括光碟機動制氫和厭氧發酵制氫兩種路徑。與光合生物制氫相比，厭氧發酵制氫具有產氫率高、產氫速率快、產氫持續穩定、反應裝置的設計操作簡單、原料來源廣泛且成本低等特點，更易於實現規模化生產，因而成為生物制氫研究的主要方向。厭氧發酵制氫菌種包括專性厭氧菌和兼性厭氧菌，其中，專性厭氧菌的培養、運輸及工業化條件苛刻，而兼性厭氧菌具有廣泛的適應性，是生物制氫工業化更理想的細菌。目前，兼性厭氧菌種類比較單一，缺乏新型菌種，產氫效率偏低，並且制氫條件待進一步優化。通過專利檢索，目前已有專利主要是對發酵底物和發酵裝置的研究，如植物秸稈生物制氫發酵液的製備方法(01140458.2沈建權等)，一種汙泥與有機垃圾混合生物制氫的方法(申請號200710032658·0周少奇等)，生物發酵制氫裝置(申請號00231651·X沈建權)和高效發酵法生物制氫膨脹床設備(申請號=03260012.7任南琪等)等，而對於發酵菌種特別是高效產氫菌種的篩選研究相對薄弱，僅有一種生物制氫方法及其專用菌(申請號200910088408.8邢新會等)，但該方法所用菌種是通過基因導入後的重組菌，操作較複雜，且發酵條件要求嚴格厭氧，不易推廣。所以，對於兼性厭氧新型菌種的篩選以及制氫工藝條件的探索優化迫在眉睫。
發明內容為了解決現有技術存在的生物制氫法操作複雜，發酵條件要求嚴格的問題，本發明主要包括一種利用兼性厭氧菌制氫的方法，該方法是在非嚴格厭氧條件下，，使用產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293，以葡萄糖為發酵底物，採用分批發酵的方式，20小時即可高效完成制氫過程。本發明的技術方案是本發明所選用的兼性厭氧菌具體為腸桿菌禾鬥(Enterobacteriaceae)腸桿菌屬(Enterobacter)的產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293，該菌屬原養型兼性厭氧革蘭氏陰性菌，購自中國工業微生物菌種保藏中心(ChinaCenterofIndustrialCultureCollection，CICC)。—種利用兼性厭氧菌發酵制氫的方法，使用兼性厭氧菌為腸桿菌禾鬥(Enterobacteriaceae)腸桿菌屬(Enterobacter)的產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293,以蛋白腖、牛肉膏、氯化鈉、水的混合液為培養基，以葡萄糖為發酵底物，在發酵初期，最好能夠保證處於厭氧或是近厭氧環境，採用分批發酵的方法，製備得到氫氣，其中，所述的培養基中蛋白腖的濃度為46g/L，牛肉膏為24g/L，NaCl為46g/L，在產生氣體後的發酵中就不需要保證處於厭氧或是近厭氧環境了，此時對環境中的氧氣濃度沒有什麼要求。具體方法為無菌操作下，配製培養基並滅菌，將產氣腸桿菌的高濃縮菌液以2%5%體積比例接種於培養基，所述的高濃縮菌液的菌液濃度為Sxio9NSxio11ceIl/mL,在溫度為2050°C、維持pH在58，170r/min的搖床振蕩培養2448h後，將得到的培養好的菌液轉移到已滅菌的濃度為560g/L葡萄糖發酵底物中，封閉後繼續在溫度2050°C、轉速170r/min搖床振蕩培養，並連接氫氣收集裝置收集氫氣。更優選的方法是在無菌操作下，按照560g/L比例向培養基中添加葡萄糖發酵底物，滅菌後得到培養發酵基，將產氣腸桿菌的高濃縮菌液以2%5%體積比例接種至培養發酵基，封閉後於溫度為2050°C、pH在58的範圍內，170r/min的搖床振蕩培養，並連氫氣接收集裝置氫氣。在培養基中添加K2HPO411.5g/L,FeSO4·4Η200·10.2g/L產氫效果會更好。反應中控制反應過程pH在67產氫特性更佳。產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293為兼性厭氧菌，對培養環境氧氣要求不嚴格。影響厭氧發酵產氫的主要因素是菌種接種方式、培養基配置、發酵底物濃度，PH和溫度等。本發明經過對多種發酵條件組合配置試驗，對比分析發現以下最佳工藝條件可以達到產氫效率的最優化培養基配製具體為蛋白腖5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，K2HPO4L5g/L，FeSO4·4H200.2g/L；葡萄糖為發酵底物，濃度為20g/L；發酵pH為6.07.0;採用最基本的分批發酵方式，在40°C條件下進行恆溫振蕩培養，振蕩頻率為170r/min，培養時間約為20h，至氣體產生停止。經試驗，產氫量可達到134mLH2/100mL液體培養基，產氫效率高，對發酵條件要求低，具有廣闊的應用前景。有益效果首先，在現有的各種產氣菌種中挑選出一種效果最好的發酵制氫菌種，此菌種為兼性厭氧菌，具有生長迅速，產氫效率高，對厭氧條件要求低等優點；其次，只在發酵初期要求在厭氧或是近厭氧環境，產生氣體後，對環境的要求就沒有那麼嚴格了，非厭氧條件下就一樣可以正常發酵；再次，詳盡地優化了該菌種的最佳發酵工藝條件，達到發酵底物的利用率和產氫效率最大化，確定發酵底物為濃度是20g/L的葡萄糖，培養基配製為蛋白腖5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，K2HPO4L5g/L，FeS04·4Η200.2g/L，在pH為6.07.0，溫度為40°C條件下採用分批發酵的方式進行恆溫振蕩培養，振蕩頻率為170r/min，培養時間約為20h，產氫量可達到134mLH2/100mL液體培養基。圖1為本發明所用實驗裝置簡圖。其中，1為液體取樣口，2為反應瓶，3為氣體純化瓶，4為氣體取樣口，5為氣體收集裝置，6為水準瓶。圖2為產氫量隨時間變化圖。圖3為不同發酵底物濃度產氫量圖。圖4為不同溫度下產氫量圖。圖5為不同pH值下產氫量隨時間變化圖。具體實施例方式高濃縮菌液的製備將菌株產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293接種到牛肉膏蛋白腖培養液裡，每升培養液含有蛋白腖46g、牛肉膏24g、氯化鈉46g，蒸餾水IOOOmL,並控制pH為68，於30°C下培養2448h，得到高濃縮菌液，菌液濃度為5XIO9SXio11CelVmL本發明所用實驗裝置簡圖如圖1所示，其中，1為液體取樣口，2為反應瓶，3為氣體純化瓶，4為氣體取樣口，5為氣體收集裝置，6為水準瓶。反應瓶2中盛有培養基和作為底物的葡萄糖。氣體純化瓶3中盛有飽和氫氧化鈉溶液，氣體收集裝置用來收集氣體。實施例1菌種接種方式的選擇確定培養基組分為蛋白腖5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，調節初始pH=7.0,以此作為基礎培養基；所有滅菌均為115°C高溫滅菌25min；(1)方案一配製基礎培養基並滅菌，將Enterobacteraerogenes高濃縮菌液以2%5%體積比例接種於基礎培養基(無菌操作)，在溫度為30°C、170r/min的搖床振蕩培養2448h後，將得到的培養好的菌液轉移到已滅菌的濃度為20g/L葡萄糖發酵底物中，發酵液總量為450mL，封閉後繼續在溫度40°C、轉速170r/min搖床振蕩培養，並連接氫氣收集裝置。(2)方案二按照20g/L比例向基礎培養基添加葡萄糖作為發酵底物，滅菌後得到培養發酵基，將Enterobacteraerogenes高濃縮菌液以2%5%體積比例直接接種至培養發酵基(無菌操作)，發酵液總量為450mL，封閉後於溫度為40°C、170r/min的搖床振蕩培養並連氫氣接收集裝置。發酵初期，均以氮氣吹洗髮酵產氫裝置35min，保證裝置處於厭氧或者近厭氧狀態。在培養過程中，收集氣體並實時記錄氣體產量，定時取發酵液樣測定PH和葡萄糖分解率等指標；氫氣含量測量採用氣相色譜儀TCD熱導器檢測；pH測定採用pH酸度計；葡萄糖分解率採用菲林比色法測定。實驗結果表明方案一產氣總持續時間約6小時，產氣速度快，pH迅速降低，產氫量212mL，氫氣比率20%，葡萄糖分解率為71%；方案二產氣總持續時間約20小時，初始為菌種的繁殖階段，產氣速率低，在616小時產氣速率最高，pH值緩慢降低，產氫量494mL，氫氣比率34.5%，葡萄糖分解率為83.05%。對比發現，方案二具有較高的產氫效率優勢，適合於發酵過程中應用。實施例2最佳發酵基組分配置的確定依據實施例1的結果，在應用方案二基礎上，進一步對發酵條件進行優化，探索最佳的發酵培養基組分配置，進行下面的試驗分別配製3種發酵培養基，編號為13，其組成分別見下表tableseeoriginaldocumentpage6調節發酵培養基初始pH=7.0，於115°C高溫滅菌25min，將Enterobacteraerogenes高濃縮菌液以2%5%體積比例接種(無菌操作)，發酵液總量為450mL，發酵條件均相同。在培養開始之前，均以氮氣吹洗35min至厭氧或近厭氧環境後置於溫度為40°C,170r/min的搖床振蕩培養並連接氫氣收集裝置，持續時間為20小時。發酵過程中收集氣體，並實時記錄氣體產量；氫氣含量測量採用氣相色譜儀TCD熱導器檢測；pH測定採用PH酸度計；葡萄糖分解率採用菲林比色法測定，產氫量隨時間變化見附圖2。通過實驗發現，編號1、2、3培養基氫氣產量分別為229mL、337mL、494mL。葡萄樣分解率為55.3%、76%、83.05%。實驗表明，一定量緩衝溶液K2HPO4，可明顯降低pH值下降的速度和幅度，使酸度維持在適合產氣腸桿菌生長活性的範圍中，利於產氫過程的發生；同時如文獻中所述添加適當濃度的Fe2+促進了產氫酶的產生，促進產氫；與編號1相比較，編號3的發酵培養基組分配置可提高氫氣產量50%以上。實施例3最佳發酵底物濃度的確定依據實施例1和2的結果，通過改變發酵底物初始濃度，探索提高產氫效率的可能。配製基礎培養基，組成為蛋白腖5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，K2HPO4L5g/L，FeSO4·4H200.2g/L，設置4組平行實驗，分別設定初始底物葡萄糖濃度為5、10、20、30、40和60g/L，總發酵液量為450mL，其他發酵條件均相同。在培養開始之前，均以氮氣吹洗35min至厭氧或近厭氧環境，置於溫度為40°C，170r/min的搖床振蕩培養並連接氫氣收集裝置，持續時間為20小時。發酵過程中收集氣體，並實時記錄氣體產量；氫氣含量測量採用氣相色譜儀TCD熱導器檢測；pH測定採用pH酸度計；葡萄糖分解率採用菲林比色法測定，不同發酵底物濃度產氫量見附圖3。通過試驗發現，不同濃度底物產氫量分別為234mL、329mL、494mL、466mL、414mL、322mL，當底物濃度為20g/L時，產氫量最高。底物濃度較低時，可被利用葡萄糖量較少，底物濃度過高，產氫量程迅速降低趨勢，這是因為底物濃度會造成發酵方式或者氣體動力擴散的改變。實施例4最佳發酵溫度的確定依據實施例1、2和3的結果，按照最佳培養基組分配置配製，在發酵底物濃度條件下，調節初始PH為7.0，總發酵液量為450mL，設置5組平行試驗，分別設置環境溫度20、30、35、40、50°C，在170r/min的搖床振蕩培養並連接氫氣收集裝置，持續時間為20小時。在培養開始之前，均以氮氣吹洗35min至厭氧或近厭氧環境。發酵過程中收集氣體，並實時記錄氣體產量；氫氣含量測量採用氣相色譜儀TCD熱導器檢測；pH測定採用pH酸度計；葡萄糖分解率採用菲林比色法測定，不同溫度下產氫量見附圖4。實驗表明，40°C條件下產氫效率最高，達到494mL，溫度過高或者過低都會因影響菌的活性而導致產氫能力降低。實施例5最佳發酵pH確定(1)依據實施例1和2的結果，為探索最佳發酵pH條件，進行以下試驗發酵培養基組分為實施例2中編號3的培養基組分配置，設置4組平行實驗，通過添加適量NaOH和HCl分別調節初始pH為5、6、7和8，發酵液總量為450mL其他發酵條件均相同。在培養開始之前，均以氮氣吹洗35min至厭氧或近厭氧環境置於溫度為40°C，170r/min的搖床振蕩培養並連接氫氣收集裝置，時間為20小時。發酵過程中收集氣體，並實時記錄氣體產量；氫氣含量測量採用氣相色譜儀TCD熱導器檢測；pH測定採用pH酸度計；葡萄糖分解率採用菲林比色法測定，產氫量隨時間變化見附圖5。通過實驗發現，發現初始pH為6、7時，產氫量分別為428mL、494mL，具有較高的產氫效率。(2)在上述試驗基礎上，進一步進行下面試驗發酵培養基組分為實施例2中編號3的培養基組分配置，設置2組對比試驗，均調節初始PH值為7.0，發酵液總量為450mL發酵條件均相同。在培養開始之前，均以氮氣吹洗35min至厭氧或近厭氧環境置於溫度為40°C，170r/min的搖床振蕩培養並連接氫氣收集裝置，時間為20小時。其中一組將設計通過pH酸度計實時測定發酵液pH值，並通過添加酸鹼調節PH約保持67範圍之內，另一組不做處理，作為對照；發酵過程中收集氣體，並實時記錄氣體產量；氫氣含量測量採用氣相色譜儀TCD熱導器檢測；pH測定採用pH酸度計；葡萄糖分解率採用菲林比色法測定，產氫量隨時間變化見附圖5。通過實驗發現，保持發酵液酸度在67範圍產氫量達600mL，葡萄糖分解率為97%，利於發酵產氫的持續和高效進行，而對照組pH降低迅速，pH值的降低影響菌的活性而導致產氫能力降低。綜上所述，產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293作為兼性厭氧產氫菌種，可用於發酵底物為葡萄糖的發酵制氫過程中，通過試驗發現，其最佳的發酵工藝條件是①最佳菌種接種時機未基礎培養基與發酵底物共存時；②最佳培養基配製為蛋白腖5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L，K2HPO4L5g/L，FeS04·4H200.2g/L③最佳發酵底物葡萄糖的濃度為20g/L④最佳發酵溫度為40°C；⑤最佳發酵初始pH為7，且維持發酵發酵pH的平衡利於產氫的發生。權利要求一種利用兼性厭氧菌發酵制氫的方法，其特徵在於，使用兼性厭氧菌為腸桿菌科(Enterobacteriaceae)腸桿菌屬(Enterobacter)的產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293，以蛋白腖、牛肉膏、氯化鈉、水的混合液為培養基，以葡萄糖為發酵底物，採用分批發酵的方法，製備得到氫氣，其中，所述的培養基中蛋白腖的濃度為4～6g/L，牛肉膏為2～4g/L，NaCl為4～6g/L。2.根據權利要求1所述利用兼性厭氧菌發酵制氫的方法，其特徵在於，具體方法為無菌操作下，配製培養基並滅菌，將產氣腸桿菌的高濃縮菌液以2%5%體積比例接種於培養基，所述的高濃縮菌液的菌液濃度為5X109SxiO11ceIVmL,在溫度為2050°C、維持PH在58，170r/min的搖床振蕩培養2448h後，將得到的培養好的菌液轉移到已滅菌的濃度為560g/L葡萄糖發酵底物中，封閉後繼續在溫度2050°C、轉速170r/min搖床振蕩培養，並連接氫氣收集裝置收集氫氣。3.根據權利要求2所述利用兼性厭氧菌發酵制氫的方法，其特徵在於，無菌操作下，按照560g/L比例向培養基中添加葡萄糖發酵底物，滅菌後得到培養發酵基，將產氣腸桿菌的高濃縮菌液以2%5%體積比例接種至培養發酵基，封閉後於溫度為2050°C、pH在58的範圍內，170r/min的搖床振蕩培養，並連氫氣接收集裝置氫氣。4.根據權利要求13任一所述利用兼性厭氧菌發酵制氫的方法，其特徵在於，在培養基中添加K2HPO4I1.5g/L,FeSO4·4Η200·10.2g/L。5.根據權利要求4所述利用兼性厭氧菌發酵制氫的方法，其特徵在於，pH在67。6.根據權利要求5所述利用兼性厭氧菌發酵制氫的方法，其特徵在於，所述的發酵培養基中各成分的濃度為蛋白腖5g/L，牛肉膏3g/L，NaCl5g/L,K2HPO41.5g/L，FeSO4·4H200.2g/L；葡萄糖底物濃度為20g/L；在pH為6.O7.O、溫度為40°C條件下採用分批發酵的方式進行恆溫振蕩培養，振蕩頻率為170r/min，培養時間20h。全文摘要本發明提供了一種利用兼性厭氧菌發酵制氫的方法，具體涉及到菌種篩選和發酵條件優化兩個方面。篩選出兼性厭氧菌為產氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)CICC10293；經過試驗得到，該菌種最佳發酵工藝條件是培養基配製具體為蛋白腖4～6g/L，牛肉膏2～4g/L，NaCl4～6g/L，K2HPO41～1.5g/L，FeSO4·4H2O0.1～0.2g/L；發酵底物為葡萄糖，濃度為20g/L；發酵採用分批發酵的方式；在pH為6.0～7.0，溫度為40℃條件下進行恆溫振蕩培養，振蕩頻率為170r/min；培養時間約為20h，至氫氣產生停止。產氫量可達到134mLH2/100mL液體培養基，產氫效率高，對發酵環境條件要求低，具有廣闊的應用前景。文檔編號C12R1/01GK101824437SQ201019026129公開日2010年9月8日申請日期2010年3月2日優先權日2010年3月2日發明者王瑞興,袁曉明,錢春香申請人:東南大學