一種檢測分枝桿菌屬細菌存在的方法以及及其所用的試劑盒和抗體的製作方法
2023-12-01 10:15:26
專利名稱：一種檢測分枝桿菌屬細菌存在的方法以及及其所用的試劑盒和抗體的製作方法
背景技術：
本發明涉及到一種基於免疫學技術的，及其所用分枝桿菌屬細菌存在的方法，以及用於試劑盒和抗體。
已經知道，多種已知的分枝桿菌屬細菌能引起人和動物的多種傳染性疾病。有一種分枝桿菌屬細菌，結核分枝桿菌，能引起人結構病。
結核病被認為是在全世界大部地區的主要可傳染性疾病。儘管醫學科學取得了巨大的進展，有時產生了這種疾病已經被徵服的印象，以及儘管有國際間有組織的共同努力，但是，結核病仍然是佔壓倒多數的世界性健康問題。僅1990年，全世界報告的新病例有8百多萬，死亡3百多萬(Snider，1994)。世界衛生組織預測，到2000年，每年新病例數將上升到1020萬，死亡數上升到350萬，亞洲和亞-撒哈拉非洲是受影響的最主要地區(Dolim，Raviglione and Koch，1994)。當前十年間，結核病例估計數和同期死亡估計數的全球分布情況，分別在
圖1和圖2中顯示(Dolin，Raviglione and Koch，1994)。 圖1估計1990-1999年累計結核病例的全球分布 圖2估計1990-1999年累計結核病 致死人數的全球分布資料證明，結核病和愛滋病之間有密切的關係，這二種疾病常常相伴同時存在的情況，使形勢更加嚴峻(Torres et al，1990；De Cook 1994；Cantwell and Binkin，1994；Murray，1994)。在結核分枝桿菌的不同株和其它非典型分枝桿菌中，多重藥物抗性的出現，更增加了對付這個巨大問題的艱巨性(Blumberg，Miller and Koornhof，1994；Morse，1994)。
為制訂對抗這些疾病的更有成效的全球戰略計劃，迫切需要準確和及時地檢測結核病和與分枝桿菌有關的疾病。
傳統的實驗室檢測法的主要缺點是，或者不能區分活菌和死菌(快速簡例的Ziehl-Neelsen染色法)，或者假如方法能證實存在活菌(直接培養法)，但是完成實驗室檢測需要幾個星期。這本身就延誤了治療，並且有可能導致疾病進一步擴散。
較新近的技術是基於通過如血清學試驗，淋巴細胞對分枝桿菌抗原的增殖反應試驗，或通過測定腺苷脫氨酶含量的方法，來測定病人對感染的反應，或者是基於用免疫測定法如ELISAs(酶聯免疫吸附試驗法)，用氣相和液相色譜法質量光譜法測定分枝桿菌的抗原和組分。更現代的分子技術包括聚合酶鏈反應(PCR)，DNA探針或DNA指紋法(Musial et al，1988，Godfrey-Faussett，1994)。
但是，上述列舉的方法都不能滿足能鑑別死、活分枝桿菌細胞的快速、簡便和可靠測定的所有要求。發明概述本發明提供了一種通過用免疫學方法檢測樣品中的至少一種分枝桿菌細胞內種抗原，來檢測和鑑定動物生物樣品中的分枝桿菌屬細菌的診斷測定法。
「細胞內分枝桿菌抗原」在此定義為分枝桿菌屬細菌的一種非表面抗原或一種代謝產物。
細胞內分枝桿菌抗原的優選檢測法是，將生物樣品暴露於分枝桿菌細胞內抗原特異性的一種或多種抗體。
優選的本檢測法包括溶菌步驟，在樣品與抗體接觸之前，使存在於樣品中的至少一些分枝桿菌細胞，釋放出存在於它們細胞壁中的至少一些抗原。
優選的本檢測法還包括，在使分枝桿菌細菌溶菌之前，對生物樣品的處理步驟，使分枝桿菌細胞從可能包裹它們的任何器官碎片中釋放出來，並使生物樣品去汙染，清除其中存在的不希望有的微生物。
優選的細胞內分枝桿菌抗原，是存在於分枝桿菌細菌細胞壁中的分枝菌酸混合物，每種分枝菌酸都具有如下的一般結構 優選的生物樣品是痰，血，腦-脊液，糞便，尿，胃洗出液，唾液，組織，咽喉拭子或皮膚傷口滲出液。
優選的本檢測法還包括，在與標記抗體接觸之前，用固相化抗體親和性處理技術，對樣品中分枝菌酸的濃縮步驟。優選的濃縮步驟是用免疫親和性柱進行的。
本發明的另一方面，一種從提取的分枝桿菌分枝菌酸和汙染成分的混合物中，對具有上述一般結構的分枝桿菌分枝菌酸進行組份分離和進一步純化的方法包括如下步驟將分枝菌酸和汙染成分的混合物溶解於雙相溶劑中，然後將對此混合物進行液-液相分離。優選的情況是，純化的分枝菌酸以後不受化學衍生化處理。優選的雙相溶劑系統含有氯仿，甲醇和水。
優選的情況是，雙相溶劑系統包含有上相和下相。
優選的方法也包括使上、下相混合和平衡的步驟。
優選的情況是，上相的組成是12-18％氯仿，45-55％甲醇和20-40％水。更優選的情況是，上相的組成是15％氯仿，52％甲醇和3％水。
優選的情況是，下相的組成是50-80％氯仿，15-40％甲醇和2-8％水。更優選的情況是，下相液的組成是68％氯仿，27％甲醇和5％水。
優選的純化過程是在反流儀或其它任何液-液萃取裝置上進行。
本發明的另一方面，提供了一種具有如下一般結構的，經過組份分離和純化的純化分枝菌酸 本發明的另一方面，提供了一個針對細胞內分枝桿菌抗原的抗體。
該抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體，並且優選地是動物來源的抗體。
優選的抗體是一個，針對一通過上述方法純化的分枝菌酸產生的分離多克隆抗體。
本發明的另一方面，提供了一種細胞內分枝桿菌抗原和載體的結合物。
優選的細胞內抗原是一種分枝菌酸，並且優選的是吸附在載體上。
該載體可以是一種蛋白質，如牛血清白蛋白(BSA)，明膠或鑰孔帽貝血蘭蛋白(KLH)。
根據本發明的另一方面，一種用於檢測生物樣品中分枝桿菌屬細菌存在的試劑盒包括一個針對通過上述方法純化的分枝菌酸而產生的抗體，並對此抗體作了可測定性標記。
該試劑盒還可能包括適量的分枝桿菌分枝菌酸和載體的結合物，以及任選地還包括一個固相化抗體。發明詳述本發明的目的是建立一種診斷檢測方法，用於證實在來源於人或動物的生物樣品中存在分枝桿菌，生物樣品可以是如下種類痰，腦脊液，血，尿，糞便或組織樣品，胃洗出液，唾液，咽喉拭子或傷口滲出液。
該檢測法是基於用免疫學方法檢測來源於分枝桿菌的一種或多種細胞抗原和分枝菌酸。該檢測法還可能基於使用標記抗體，標記物可以是酶，螢光染料，乳膠顆粒或其它任何適合的標記物。
分枝菌酸是高分子量的α-羥基脂肪酸，在α-位置具有中等長度的α鏈。
因為已經知道，分枝桿菌屬的每種細菌可以通過獨特類型的分枝菌酸來鑑別(Butler，Jost and Kilburn，1991，Butler and Kilburn，1988)，因此用本測定法提供的特異性抗體來區分本屬細菌中的各個成員應該是可能的。實施例1構成本發明基礎的試驗研究，包括如下步驟並據此提供了一種用於檢測和鑑定生物樣品中分枝桿菌屬細菌的方法第1步 獲得分枝桿菌屬菌株。培養物購自American Type CultureCollection(ATCC)。
第2步 從分枝桿菌屬菌培養物中分離出分枝菌酸，藉助高效液相色譜(HPLC)分析法對分枝菌酸進行鑑定和純化。
第3步 用BSA，KLH和明膠作載體分子，製備分枝菌酸結合物。
第4步 免疫實驗動物，產生對分枝菌酸的特異性抗體。並對抗體作質量鑑定。
第5步 計劃建立一種診斷檢測法(使抗原-抗體反應能夠測定)。
第6步 接著對診斷檢測法進行評價證實該檢測法的特異性、靈敏度和測定範圍，並與現有的檢測法相比較。
本試驗研究的材料(包括實驗動物)，方法和結果敘述如下。實驗材料培養物用於本實驗的菌株是，結核桿菌H37Rv ATCC 27294-有毒菌株，來源於一個感染病人的肺。
該培養物是以冷凍乾燥的形式購自Americam Type CultureCollection(ATCC)，Maryland，USA。培養基如下培養基被用於培養結核桿菌液體培養基Dubos肉湯固體培養基Lowenstein-Jensen(LJ)培養基Middlebrook 7H-10培養基配製這些培養基必需成分的詳細組成以及建議的滅菌條件，見(結核病研究方法實驗指南)Laboratory Manual of Tuberculosis Methods，Tuberculosis Research Institute of the SA Medical ResearchCouncil(1980，Chapter 6，pp 83-105；Second Edition，revised byEE Nel，HH Kleeberg and EMS Gatner)。此培養基是由Pretori大學病理研究所，醫學微生物研究室配製的。試劑下列試劑用於對分枝菌酸的皂化，萃取，衍生化和高效液相色譜(HPLC)分析試劑A62.5g KOH(分析純)，溶於125ml水中，加入125ml甲醇(BDH，HPLC級)。試劑B濃鹽酸(BDH，分析純)，用水1∶1稀釋。試劑C溶於甲醇-水(1∶1)中的2％碳酸氫鉀稱取10g碳酸氫鉀(BDH，分析純)，溶於250ml水中，加入250ml甲醇。試劑D將溶於冠醚(Pierce Chemicel Co，Cat，No 48891)中的對-溴代苯醯基溴，按每份500μl的量，分裝於玻璃小瓶內，此瓶具有Teflon塗膜並帶有琥珀色螺旋帽。擰緊小瓶螺旋帽，並用Parefilm封口，試劑D存於4℃。試劑E試劑E是將試劑B與甲醇1∶1混合配製而成。HPLC標準品高分子量內標物(C-100)來自Ribi ImmunoChem ResearchCompany，Cat No R-50。將1mg此標準品混懸於2.0ml二氯甲烷(BDH HPLC級)中，按350μl等分量分裝於具有Teflon塗膜的開鞘螺旋帽小瓶中，小瓶用Parafilm封口，4℃貯存。
為阻止二氯甲烷揮發，使用時將分裝的HPLC標準品放置在冰浴內。
氯仿(Associated Chemical Enterpriser，化學純)二氯甲烷(BDH，HPLC-級)試劑A，B，C和E，均在實驗前新鮮配，制並準備所有必要的安全預防措施。
這些試劑均用雙蒸餾去離子水配製。
下列試劑用於純化提取的分枝菌酸氯仿(Saarchem，分析純)甲醇(Merck，化學純)下列試劑用於免疫實驗動物牛血清白蛋白(BSA)，Sigma批號11H1040分枝菌酸-BSA結合物鑰孔帽貝血蘭蛋白(KLH)，Sigma免疫化學藥品分枝菌酸-KLH結合物福氏不完全佐劑(FIA)AdjuPrime免疫調控因子(Pierce Chemical Company，Cat No77138)滅菌鹽水-0.85％(m/v)NaCl溶液，用雙蒸水配製。
下列試劑用於進行ELISA試驗，檢測分枝菌酸特異性抗體牛血清白蛋白(BSA)-Sigma批號11H1040明膠(Serva批號22151，Reinst-研究級明膠-MA分枝菌酸結合物PBS-磷酸緩衝鹽水(pH7.4)，含有NaCl(Unilab，化學純，批號28159)Na2HPO4·12H2O(Merck，化學純)KCl(Merck，化學純，批號6420150)KH2PO4(Merck，化學純，批號6332422)檸檬酸緩衝液(pH4.5)，含有0.1M檸檬酸(Merck，批號775A)0.1M檸檬酸三鈉(Merck，批號8533833)酪蛋白(Merck，批號0100336 V279342)鄰苯三胺(二氫氯化物)(Sigme，批號59F-5021)甲醇(Saarchem，分析純，批號3126)羊抗小鼠單克隆抗體-過氧化物酶結合物(Cappel，批號37081)底物8mg脲氫過氧化物酶10mg鄰苯二胺，溶於0.1M檸檬酸鹽緩衝液。
5隻免疫小鼠和三隻對照小鼠的血清樣品被用於本實驗中。
實驗動物6周齡雄性Balb-C小鼠用於免疫試驗。該小鼠由Johannesburg(約翰尼斯堡)南非醫學研究所動物中心飼養。
ELISA反應板Nunc Immunoplates(Maxisorp)反應板用於ELISA試驗。
反流分離儀實驗研究中使用的反流分離儀是由H O POST，InstrumentCompany Inc.，Middle Village，New York生產。方法用於本實驗的方法如下菌株培養細菌在37℃用如下培養基培養Dubos肉湯Lowenstein-Jensen培養基(斜面培養基)和Middlebrook 7H-10瓊脂培養基(斜面培養基)從細菌樣品製備分枝菌酸細菌樣品製備包括三步培養獲得分枝桿菌細胞，皂化和萃取分枝菌酸按Butler，Jost and Kilburn(1991)所述的方法，對分枝菌酸作皂化，萃取和衍生化處理，方法稍有改進，將在有關的項目下敘述。
用於對分枝菌酸作萃取、衍生化處理和HPLC分析的玻璃器材均用2％(v/v)Contrad(Merck)洗，再用水衝洗，然後用氯仿，水，技術級乙醇，水涮洗，最後用雙蒸去離子水衝洗。洗過的玻璃器在熱空氣乾燥箱內乾燥。
收集細菌的方法是從培養基斜面表面刮取細菌生物物(用無菌塑料環)。在試劑A中製備同源菌懸液，用無菌玻璃小珠或旋轉振搖收集的細菌細胞。
在壓力反應器內，121℃下，對試劑A中的分枝桿菌皂化處理1小時。
分枝菌酸的萃取包括如下步驟使樣品冷卻，每個樣品加入1.5ml試劑B。旋轉搖均後，檢查每個樣品的pH，如果需要，用試劑B校準至pH1。
隨後，對每個樣品加入2.0ml氯仿，並旋轉振蕩30秒。靜置分層。用巴士德吸管吸出底層液轉移至WISP小瓶內，在氮氣流下，在熱功能蒸發器內，85.℃蒸發乾燥。為了中和帶入的微量酸，對每個樣品加入100μl試劑C，再在氮氣流下，在熱功能蒸發器內85℃蒸發乾燥。衍生化處理作HPLC分析的分枝菌酸被萃取的分枝菌酸衍生化處理的方法如下向每個冷卻的樣品內加入1.0ml氯仿，接著加入50ml試劑D。將此加蓋的樣品小瓶旋轉振搖30秒，在熱功能蒸發器內85℃加熱20分鐘。然後使樣品冷卻，加入1.0ml試劑E。將樣品旋轉振搖30秒，靜置分層。用巴士德吸管吸出底層液，轉移至WISP小瓶內。將此小瓶放入熱功能蒸發器內，在85℃用氮氣流使樣品蒸發乾燥。
將此殘留物再懸浮於0.212g(相當於160μl)二氯甲烷中，加蓋，旋轉振搖。向每個重新構成的樣品加入5μl HPLC內標物，然後通過0.45μl孔徑的膜濾器過濾，使濾液裝入琥珀色的WISP小瓶內。將此加蓋的小瓶存放於4℃，準備進行HPLC分析。分枝菌酸的HPLC分析和定量從每個樣品中取25μl作HPLC分析(操作過程中樣品被置於冰上)。每批樣品分析之前，先用對照樣品，即25μl過濾二氯甲烷，上樣分析。如果有大批樣品需要分析，為了確認HPLC儀器的可靠性，每分析3個或4個待測樣品之後，用對照樣品上樣分析一次。
反相HPLC分析是用Beckman系統Gold高效液相色譜儀進行的，由下列部件組成泵(Beckman 110B溶劑排送模件)檢測器(可編程檢測器模件166或168)柱(Nova-Pak C18 4μl 3.9×150mm)及一個與鋼管柱配合的未端接頭運行條件是流動相溶劑AHPLC級甲醇溶劑BHPLC級二氯甲烷流速2.5ml/分鐘柱溫30℃檢測器設置在260nm波長HPLC的起始梯度包括98％(v/v)甲醇(溶劑A)和2％(v/v)二氯甲烷(溶液B)。在1分鐘，梯度線性地增加至80％A和20％B，在10分鐘為35％A和65％B，維持30秒鐘，然後在大於30秒後下降回到98％A和20％B。在注入下一個樣品之前，使這種比率保持4分鐘，以便使系統穩定。
通過將測定樣品的組合峰面積與引入量的高分子量HPLC內標準品峰面積相比較，可對分枝菌酸作數學定量。分枝菌酸的純化和其它脂肪酸的組份分離一個包括25管的，編號0-24，反流分布序列被用於本實驗。將大約900ml上相液導入緩衝儲存器中。
將由大量萃取試驗(30-150mg)得到的，溶於10ml下相液和10ml上相液的粗製結核桿菌細胞提取物樣品，導入0號管中。將10ml等份量下相液導入其餘24個管中。上相液以每次循環10ml的體積自動地分配進0號管中，重複地循環25次以上，運行大約16小時。就這樣，進行25次反流循環，每次循環由20次混勻振動和40分鐘相分離時間組成。
隨著每次轉移，凡是來自樣品，存在於上相液的溶質都被帶入連續排列的管中。完成25次轉移之後，被分離的溶質組分將沿著25個序列管分布收集。
為了確定脂肪酸在25支管中的分布，可觀察序列管內脂肪酸在上相液和下相液中的乳化式樣，並對各組分進行相應的測定。
然後用一支帶有Teflon管的50ml注射器，從各管中將反流分離物取出。將分離物依次混合成7個組份，分別置於Buchi蒸發器內，在70℃真空乾燥，將乾燥物再溶解於氯仿，甲醇或水中(大約5ml)，然後轉入琥珀色帽的WISP小瓶內，4℃保存備用。反流分離純化分枝菌酸的產率為了計算純化/分離的大致產率，可將反流分離/純化後得到的樣品中分枝菌酸的重量，與導入反流儀的細胞粗提物中這些化合物的重量相比較，從在細胞粗提物HPLC色譜圖中分枝菌酸峰群的相對峰面積和標準品的峰面積來計算。分枝菌酸的反流純化發現按照Butler，Jost和Kilbwrn(1991)提出的分離分枝菌酸的方法，結核桿菌提取物中分枝菌酸的含量小於10％(表1)。為了分枝菌酸具有免疫原性，必須使純化的分枝菌酸附著在載體分子如牛血清白蛋白上。要做到這點，一個重要的條件是分枝菌酸在適當的溶劑中的可溶性比例。
用上述的相系統，對結核桿菌H37Rv ATCC 27294分枝菌酸粗提物的反流純化過程，進行了25次以上的循環。
在對序列管作最後的相液混合併使之靜置幾分鐘之後，可以觀察乳化式樣，它能夠相當精確地顯示純化物在序列管中的分布情況。
用HPLC對組分1，2，3，4和5進行了分析，峰1和峰2顯示為分枝菌酸特性峰，峰4和峰5為短鏈脂肪酸特性峰(圖1)。
圖1顯示細胞粗提物，組分1和組4的HPLC分布圖。 曲線圖1.細胞粗提物(1a)以及反流純化組分1(1b)和組分4(1c)的HPLC分布圖組分6和7由於它們不溶於氯仿，不能用HPLC分析。
質量分布情況(表1)表明，達到了將分枝菌酸從比它更具極性的汙染成分中分離的基線分離標準，而8％的產率也與分枝菌酸從粗提物中分離的理論產率相對應，在實驗誤差範圍之內。
圖1顯然表明，組分1確實含有純化的分枝菌酸。 反流純化物第1組分的HPLC分析分枝菌酸-BSA結合物的製備先配製5mg BSA溶於500μl 0.1N NaHCO3(pH8.3)的溶液。將反流純化的分枝菌酸(4.5mg)樣品溶解於450μl氯仿中。再將BSA溶液緩慢地加入200μl分枝菌酸溶液中，在室溫下操作，歷時超過1分20秒。並在加液過程中，使混合物旋轉振搖。加完後繼續旋轉振搖30秒鐘，並將樣品在冰浴中放置15分鐘。然後加入冰冷卻的丙酮(2ml)，加液過程超過2分鐘，操作時樣品仍在冰浴中。再將此混合物放置半小時。
隨後取出1/4的樣品液，放入另一小瓶內，用作HPLC分析(0.5mg)，其餘樣品用3個10秒鐘短離心脈衝離心，沉澱用丙酮洗2次。然後將沉澱轉移回WISP小瓶中，在空氣中乾燥，並復蓋金屬薄膜，4℃保持過夜。將取出用於HPLC分析的樣品加熱乾燥。
按如下方法加入佐劑將AdjuPrime免疫調控因子(10mg)用玻璃棒研磨，加入經乾燥處理的分枝菌酸-BSA結合的樣品。共同研磨，得到均勻的粉末，稱取1mg溶於1ml無菌生理鹽水中。剩餘的AdjuPrime/BSA-分枝菌酸混合物真空密封，用金屬膜包裹，4℃保存。
此生理鹽水溶液用Branson超聲波細胞攪碎器B-30作超聲波處理，先作十次10秒-脈衝循環處理，間隔10秒，接著作一次30秒脈衝循環，得到均勻一致的分散微粒。超聲處理過程是在冰浴上進行。按照廠商所附的說明，在用於免疫之前，需將此生理鹽水溶液在4℃下放置4小時。
取出免疫動物所需量免疫原之後，向剩餘的生理鹽水溶液中加入過量的冰冷丙酮，以便使蛋白質沉澱出。用冷丙酮洗沉澱2次，在丙酮內，金屬膜容器中4℃貯存。分枝菌酸-明膠結合物的製備製備5mg明膠溶於2ml 0.1N NaHCO3(pH8.3)的溶液。將500μl的一等份明膠液加入到600μl甲醇中，混勻。再先將2mg分枝菌酸溶於50μl氯仿，然後將明膠混合液逐滴加入分枝菌酸溶液中，歷時1分20秒以上，同時旋轉振搖。然後再將此樣品液旋轉振搖30秒鐘，在冰浴中放置15分鐘。
將樣品液移至100ml的Schott瓶內，加入80ml冰冷的丙酮。將此Schott瓶及其內容物在冰浴中放置30分鐘。生成的含有分枝菌酸吸附於明膠的沉澱用丙酮洗2次。此樣品4℃貯存於丙酮內。小鼠免疫按照如下方案對小鼠進行免疫時間 操作種類 操作部位第1天 第1次免疫腳掌第14天第2次免疫皮下第21天第1次採血尾靜脈第28天第3次免疫皮下第35天第2次採血尾靜脈第49天第3次免疫皮下第59天第3次採血尾靜脈每次免疫步驟都同時作對照試驗，即對一組2隻小鼠僅用載體分子和相應的佐劑注射，以同樣的方式、部位注射。第一次免疫時，對5隻雌性Balb/C小鼠的雙後腳掌注射等量分枝菌酸-結合物的佐劑的混合物。每支腳註射混合物約50μl。在以後的免疫過程中，均以此相同量的分枝菌酸結合物和佐劑的混合物作皮下注射。第一次和以後各次採血，均是從每隻小鼠的尾靜脈採幾滴血，包括對照小鼠也同樣操作。對抗體產生的監測製備血清為了監測抗體產生情況，從每隻小鼠的尾靜脈採集幾滴血。第一次採血時，將5隻免疫小鼠和3隻對照小鼠的血分別混合，分別注入2支Eppendorff’s管中，混勻並使之凝固。用Eppendorff’s臺式離心機將血液離心10分鐘，分離出血清。收集上層血清，4℃保存。以後採集的血液樣品也分別收集血清，分別滴定。製備ELISA試驗板用含有BSA或者分枝菌酸-明膠結合物的包被液包被ELISA試驗板，包被液中BSA或分枝菌酸-明膠結合物的濃度為10μg/ml，用PBS緩衝液(pH7.4)配製。
對ELISA試驗板每孔加入50μl BSA或分枝菌酸-明膠包被液；然後ELISA試驗板在室溫下溫育16小時。
再每孔加入以PBS緩衝液(pH7.4)配製的0.5％(m/v)酪蛋白200μl，在室溫下對ELISA試驗板封閉處理1小時。輕輕摔去封閉液，使試驗板乾燥。血清滴定將免疫小鼠的血清用0.5％ m/v酪蛋白PBS緩衝液(pH7.4)稀釋，每個稀釋度分別加入ELISA試驗板的3個孔內。對照小鼠血清，即以BSA AdjuPrime免疫的小鼠血清和非免疫小鼠血清，同樣以0.5％m/v酪蛋白PBS緩衝液(pH7.4)稀釋，並分別加入ELISA試驗板的3個孔內，每孔50μl。
為了證實抗體的特異性，可用抑制試驗對以BSA-分枝菌酸結合物免疫小鼠的血清進行直接滴定。在此抑制試驗中，BSA-分枝菌酸結合物是作為競爭性抗原，以0.32mg/ml的濃度加入ELISA試驗板的抗血清中，並進行溫育。
試驗板置於搖床上，在室溫下溫育1小時。然後除去血清，將試驗板用Anthos自動衝洗器，以0.5％ m/v酪蛋白PBS緩衝液(pH7.4)衝洗3次。
將1∶4000稀釋的過氧化物酶標記羊抗小鼠單克隆抗體加入ELISA試驗板(每孔50μl)，並將試驗板在搖床上，在室溫下溫育60分鐘。輕輕摔去孔中的過氧化物酶結合物溶液，並用0.5％ m/v酪蛋白PBS緩衝液(pH7.4)衝洗試驗板三次，以除去全部剩餘的結合物，配製底物，滴加至孔內，每孔50μl。
溫育反應1.5小時後，用SLT 340 ATC ELISA測定儀，測定每個孔的光密度。ELISA免疫試驗的結果和討論圖3中的圖表顯示出通過用分枝菌酸-BSA結合物免疫小鼠得到的抗體反應。連續的直框圖代表記錄的光密度讀數(×103)，並標有每個稀釋度一式3份的標準差。對BSA載體得到了強反應(右行所示)，對分枝菌酸得到了較弱的反應(左行所示)。
進入免疫程序的第59天後，5隻免疫小鼠中的2隻，產生了對分枝菌酸具有特異性抗體活性的抗血清，如在與0.32mg/ml可溶性BSA-分枝菌酸結合的混合的，1∶50稀釋度的抗血清，對ELISA-信號顯示出24％的抑制作用。此抑制作用的產生是由於在溶液中與BSA配位結合的分枝菌酸，阻塞了分枝菌酸特異性抗體的結合位點，因此減少了結合於ELISA試驗板的分枝菌酸特異性抗體的數量。
當用BSA作為包被抗原時，得到強ELISA信號，表明5隻小鼠具有高免疫度。通過將抗血清與0.32mg/ml的可溶性BSA-分枝菌酸結合物共同溫育，可觀察到它對從顯示抗-分枝菌酸活性的小鼠得到的抗血清1∶50稀釋度的信號無抑制作用。這可能是由於存在高濃度的抗-BSA抗體，使對抗-載體BSA抗體的抑制作用，超出了靈敏度範圍。
對於抗-分枝菌酸免疫反應，需要一段較長的免疫時間，反應才能達到適當的成熟，這將導致抗體濃度增加和/或對抗體的親和性增加。此外，還能用小鼠產生對分枝菌酸具有單一特異性的單克隆抗體。 ELISA信號×103(光密度450mm)圖3.進入免疫程序第59天後，用ELISA測定的小鼠對分枝菌酸-BSA的免疫反應參考文獻Blumberg，L.，B.Miller and H.J.Koornhof，1994。多量藥物抗性結核分枝桿菌。結核病-走向2000。文摘書科學討論會和專題討論會，關於在發展中國家，特別是非洲，不久將來的結核病，Pretoria，南非，1994，3月，13-17，p9。Butler，W.R.and J.O.Kilburn，1988。通過用高效液相色譜分析其分枝菌酸來鑑定緩慢生長的主要病原分枝桿菌和戈特氏分枝桿菌。
J.Clin Microbiol.26，(1)，50-53。Butler.W.R.K.C.Jost and J.O.Kilburn.1991用高效液相色譜鑑定分枝桿菌。J.Clin Microbiol.29，(11)，2468-2472。Cantwell，M.C.and N.J.Binkin 1994。在次撒哈拉非洲的結核病和人免疫缺損病毒感染(HIV)好的結核病控制計劃有作用嗎？結核病-走向2000文摘一書科學討論會和專題討論會，關於在發展中國家，特別是非洲，不久將來的結核病。
Pretoria，南非，1994，3月，13-17，p8。De Cock，k.M.1994。與HIV相互作用的衝擊 In結核病回到未來pp35-52，編輯Edited by J.D.H.Porter and K.P.W.J.
Mc Adam.
出版者John Wiley Sons.Ltd，Chichester，New Tork，Brrsbane，Toronto，Singapore.Dolin.P.J.M.C.Raviglione and A.Koch，1994。1990-2000期間全球結核病的發病率和死亡率。
Bulletin of the World Health Organization 72(2)，213-220。Godfery-Fanssett P.1994。在分子和人之中結核病檢測的過去，現在和將來。In結核病回到未來，pp79-98。
編輯J.D.H.Porter and K.P.W.J.Mc Adem.
出版者John Wiley Sons.Ltd，Chichester，New Tork，Brrsbane，Toronto，Singapore.結核病方法實驗手冊。
SA Medical Research Council結核病研究所(1980，Chapter6，pp83-105，第二版，修訂EE.Nel，H.H.Kleeberg and E.M.S.
Gatner.Morse，D.L.1994多重抗藥性-紐約經驗。
In結核病回到未來，pp225-237。
編輯J.D.H.Porter and K.P.W.J.Mc Adem.
出版者John Wiley Sons.Ltd，Chichester，New Tork，Brrsbane，Toronto，Singapore.Murray，D.B，1994.關於由於愛滋病引起的分枝桿菌傳播的最新資料。J.of IntravenousNursing 17，(4)，217-219Musial，C.E，L.S.Fice，L.Stockman and G.D.Roberts，1988。對鳥分枝桿菌複合體和結核分枝桿菌複合體基因探針快速診斷系統鑑定培養物中的分枝桿菌 J.Clin Mierobiol，26，2120-2123.Snider，D.E.1994結核病世界形勢。該病的歷史和與它鬥爭的努力。In結核病回到未來，pp13-33。
編輯J.D.H.Porter and K.P.W.J.Mc Adem.
出版者John Wiley Sons.Ltd，Chichester，New Tork，Brrsbane，Toronto，Singapore.Torres，R.A.，S.Mani，T.Altholz and P.W.Brickner 1990。在一個紐約城市收容所無家可歸者中的人免疫缺損病毒(HIV)感染。
Arch Intem Med，150，2030-2036。
權利要求
1.一種通過免疫學方法檢測樣品中至少一種分枝桿菌細胞內分枝桿菌抗原，來檢測和鑑定動物生物樣品中的分枝桿菌屬細菌的診斷測定法。
2.一種根據權利要求1的診斷測定法，其中細胞內分枝桿菌抗原的測定，是通過將生物樣品暴露於對細胞內分枝桿菌抗原特異性的抗體。
3.一種根據權利要求1或2的診斷測定法，包括在樣品與抗體接觸之前，使存在於樣品中的至少一些分枝桿菌細胞溶菌的步驟。
4.一種根據權利要求3的診斷測定法，還包括在使分枝桿菌細胞溶菌之前，對生物樣品的處理步驟，使分枝桿菌細胞從可能包裹它們的任何器官碎片中釋放出來，並使生物樣品去汙染，清除其中存在的不希望有的微生物。
5.一種根據權利要求1至4中任何一項的診斷測定法，還包括在與標記抗體接觸之前，用固相化抗體親和性處理技術，對樣品中細胞內分枝桿菌抗原的濃縮步驟。
6.一種根據前述權利要求中任何一項的診斷測定法，其中細胞內分枝桿菌抗原是存在於分枝桿菌屬細菌細胞壁中的分枝菌酸混合物，每種分枝菌酸都具有如下的一般結構
7.一種根據前述權利要求中任何一項的診斷測定法，其中生物樣品是痰，血，腦脊液，糞便，尿，胃洗出液，唾液，組織，咽喉拭子或皮膚傷口滲出液。
8.一種從提取的分枝桿菌分枝菌酸和汙染成分的混合物中，對具有如下一般結構的分枝桿菌分枝菌酸進行組份分離和進一步純化的方法， 包括如下步驟將分枝菌酸和汙染成分的混合物溶解於雙相溶劑中；然後將此混合物進行液-液相分離。
9.一種根據權利要求8的方法，其中純化的分枝菌酸以後不受化學衍生化處理。
10.一種根據權利要求8或9的方法，其中雙相溶劑系統含有氯仿，甲醇和水。
11.一種根據權利要求8至10中任何一項的方法，其中雙相溶劑系統包含有上相和下相。
12.一種根據權利要求11的方法，其中的方法也包括使上、下相混合和平衡的步驟。
13.一種根據權利要求11或12的方法，其中上相的組成是12-18％氯仿，45-55％甲醇和20-40％水。
14.一種根據權利要求13的方法，其中上相的組成是15％氯仿，52％甲醇和3％水。
15.一種根據權利要求11至14中任何一項的方法，其中下相的組成是50％-80％氯仿，15-40％甲醇和2-8％水。
16.一種根據權利要求15的方法，其中下相的組成是68％氯仿，27％甲醇和5％水。
17.一種根據權利要求8至16中任何一項的方法，其中純化過程是用反流分離儀或任何其它液-液萃取裝置進行。
18.一種具有如下一般結構，已經按照權利要求8至17中任何一項的方法進行了組分分離和純化的純化分枝菌酸。
19.一種針對存在於分枝桿菌屬細菌細胞壁中的分枝菌酸混合物分離抗體，每種分枝菌酸都具有如下一般結構
20.一種根據權利要求19的分離抗體，可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
21.一種根據權利要求20的分離抗體，是動物來源的多克隆抗體。
22.一種根據權利要求19至21中任何一項的分離抗體，其中分枝菌酸是按照權利要求8至17中任何一項的方法純化的。
23.一種細胞內分枝桿菌抗原載體結合物，其中細胞內抗原是吸附在載體上。
24.一種根據權利要求23的細胞內分枝桿菌抗原-載體結合物，其中細胞內抗原是分枝菌酸的混合物，每種分枝菌酸具有如下一般結構
25.一種根據權利要求23或24的細胞內分枝桿菌抗原/載體結合物，其中載體是牛血清蛋白，明膠或鑰孔帽貝血蘭蛋白。
26.一種用於檢測生物樣品中分枝桿菌屬細菌存在的試劑盒，包括一個對分枝桿菌分枝菌酸混合物產生的，並作了可測定標記的抗體，這種分枝菌酸混合物是用根據權利要求8至17中任何一項的方法純化過的。
27.一種根據權利要求26的試劑盒，還包括適量的，根據權利要求23至25中任何一項中的分枝桿菌分枝菌酸-載體結合物，以及任選地還包括一個固相化抗體。
全文摘要
本發明是關於檢測和鑑定存在於人和動物的生物樣品中的分枝桿菌屬和細胞的一種診斷測定法。該測定法是基於用免疫學方法檢測來源於分枝桿菌屬細菌的一種或多種抗原。為了檢測抗體抗原反應，可以用酶或螢光染料標記這些抗原的特異性抗體，或者使抗體吸附於乳膠顆粒或其他合適的標記物。可以用ELISA進行診斷測定，在實際測定之前，需要或者不需要預行濃縮分析桿菌屬細菌抗原。本發明包括選擇並獲得合適的分枝桿菌種和株，分離純化抗原並用各種載體分子製備必需的抗原結合物，用於免疫實驗動物，建立一種用於監測分枝桿菌抗體產生，對分枝桿菌一種或多種抗原的特異性抗體進行鑑定的檢測方法，以及開發建立一種診斷檢測法和診斷試劑盒。
文檔編號C07C51/48GK1150840SQ95193609
公開日1997年5月28日 申請日期1995年4月13日 優先權日1994年4月14日
發明者J·A·韋斯初爾, S·N·拜伊 申請人:阿德科克因格拉姆有限公司