一種製備l-乳酸的方法及其專用菌劑的製作方法

2023-05-07 00:51:46

專利名稱：：一種製備l-乳酸的方法及其專用菌劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種製備L-乳酸的方法及其專用菌劑。
背景技術：
：隨著石油資源的不斷減少以及不可再生資源價格的節節攀升，開發利用對環境更友好的生物基產品已成為轉變經濟增長方式、保障生態鏈良性循環和實現經濟社會可持續發展的戰略需求。乳酸是一種重要的、多用途的生物基平臺化合物，有兩種異構體，即L-(+)乳酸和D-(-)乳酸。作為一種重要的生物化工材料，L-乳酸被廣泛地應用於食品、醫藥、現代農業、日用化工和有機化工等領域，涵蓋大量產品。其中最重要、最廣泛的工業應用是用於生產可降解聚合物-聚乳酸(PLA)。聚乳酸具有生物相容性、生物可降解性以及優良的機械性能和物理性能，因而被產業界認為是新世紀最有發展前途的新型可再生材料，是石油基產品的重要替代品之一。L-乳酸的生產成本和市場價格偏高是聚乳酸市場開拓受阻的一個主要因素，根據國內外文獻和專利的報導，目前利用微生物生產乳酸的方法主要有兩種，即根黴發酵和乳桿菌發酵生產乳酸。採用根黴發酵具有如下缺點(1)需要較高的空氣系統及攪拌動力系統，對電、蒸汽等能源消耗較大，生產成本較高；(2)由於根黴發酵是乳酸的異型發酵，因此在發酵乳酸的過程中根黴同時進行其它路徑的代謝，有大量的雜酸伴生，使發酸轉化率低，產品質量低。因此，目前工廠更多地採用乳桿菌進行乳酸發酵生產。
發明內容本發明的目的是提供一種製備L-乳酸的專用菌劑。本發明所提供的製備L-乳酸的專用菌劑，其活性成分為鼠李糖乳桿菌(Zacto6ac/〃iwAawwfwus)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(Aa"o6flc〃/wwz/hw7&)SMB-06CGMCCWs3123和副乾酪乳桿菌(Xacto6a".〃usjraracasef)SMB-07CGMCC抬3124。上述菌劑在具體應用時，可根據需要在其中添加其他的輔料。本發明的第二個目的是提供一種製備L-乳酸的方法。本發明所提供的製備L-乳酸的方法，是發酵培養鼠李糖乳桿菌0^c^^"7/MW^m"(w";y)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(丄acto6ac〃/M犯/Zvan'ws)SMB-06CGMCC3123和副乾酪乳桿菌CLflcto6ac/〃tw/araca"/)SMB-07CGMCC3124，得到L-乳酸。上述方法中，所述鼠李糖乳桿菌(丄a"okzc77/wAamwoy船)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(ZactoZac/〃Mra/hw/w)SMB-06CGMCCWs3123和副乾酪乳桿菌(丄acto6a"7/Mjp"racose/)SMB-07CGMCC3124的cfu比為(1-3):(1-2):1。上述方法中，所述發酵培養鼠李糖乳桿菌(丄a"o6ac/〃wWzam"(w^)SMB-05CGMCCJV23122、唾液乳桿菌(丄acto6ac〃/ws^//van'船)SMB-06CGMCCJVb3123禾口副乾酪乳桿菌(丄acto6ac〃/usparacase/)SMB-07CGMCCWe3124的發酵培養基每升的組成為葡萄糖180~200g/L、蛋白腖10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸鈉2g/L、MgS04'7H200.58g/L、MnS04'4H200.25g/L、Tween-801ml/L、用於控制發酵液pH值的中和劑，其餘為水。發酵過程中控制pH範圍在5.0-5.5。上述方法中，所述中和劑為CaC03或氨水。所述中和劑為CaC03，所述CaC03在發酵培養基中的終濃度為30g/L。上述方法中，所述發酵培養鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃wAam"omy)SMB-05CGMCCWs3122、唾液乳桿菌(丄acto6ac/〃wsa"van&)SMB-06CGMCC3123禾口副乾酪乳桿菌(丄acto^"7/uy;flracflje/)SMB-07CGMCCW3124的條件為35-42°C厭氧培養37-60小時，具體可為37°C厭氧培養37小時。所述發酵培養的方式為分批補料發酵培養，在發酵培養12小時後，每3小時補加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次。本發明所提供的鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃MAamwomy)SMB-05、唾液乳桿菌(Lacto6ac/〃us■sa/Zvan'MiOSMB—06禾口畐U幹酷乳桿菌(Xacto6ac〖〃z^/aracase/)SMB—07均是從人的口腔唾液中篩選得到的，分別鑑定為鼠李糖乳桿菌(Z"ctoZ>""7/MAawwwws)、唾液乳桿菌(丄a"otec/〃ussa/hw/us)SMB-06和副乾酪乳桿菌(丄a"o6a"7/"51paramse/)SMB-07。鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃wsW^m"(ww^)SMB-05、唾液乳桿菌(丄acto6a"7/w■sa/hw/M)SMB-06和副乾酪乳桿菌CLacto6acf〃^paracaw/)SMB-07均已於2009年6月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，鼠李糖乳桿菌5(丄acto^c/〃wW^mwosM5)SMB-05的保藏登記號為CGMCCWs3122，唾液乳桿菌aacto6acz'〃Msa"wWus)SMB-06的保藏登記號為CGMCC3123，副乾酪乳桿菌a""o6ac/〃^;araca^')SMB-07的保藏登記號為CGMCCNs3124。鼠李糖乳桿菌(丄acto6ac/〃wWzamwww)SMB-05CGMCC3122為革蘭氏陽性菌、菌落乳白色、菌落的邊緣整齊、光滑；唾液乳桿菌aactok7"7/w犯/Zvfln'uy)SMB-06CGMCCW3123為革蘭氏陽性菌、菌落淡乳白色、菌落邊緣整齊、光滑；副乾酪乳桿菌aa"o6ac說twparacaw/)SMB-07CGMCCW3124為革蘭氏陽性菌、菌落淡乳白色、菌落較小、邊緣整齊光滑。本發明利用鼠李糖乳桿菌(Xactotoc/〃w^amwos^)SMB-05CGMCCW3122、唾液乳桿菌(ZactoZ)flc///^sfl/hw/w)SMB-06CGMCC3123和副乾酪乳桿菌(丄flcto6ac說usSMB-07CGMCCJY23124發酵生產L-乳酸，結果表明，發酵37小時，發酵液中總乳酸的量為216-241g/L，L-乳酸的光學純度為98-99%，發酵產率為2.2-6.5g/L*h。本發明通過混合發酵技術提高了L-乳酸的產量和產率，極大地降低了L-乳酸的成本，具有重要的工業應用價值。具體實施例方式下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得；所述百分含量，如無特別說明均為質量百分含量。實施例l、鼠李糖乳桿菌aacto6a"7/wsAammm^)SMB-05、唾液乳桿菌(Z^cto6a"7/wjsa/〖van'wj)SMB—06禾口畐U乾酪孚L桿菌(Z^cto6ac〃/M/aracase/)SMB—07的分離、純化及鑑定1、菌種的分離和純化收集不同類型人的口腔唾液於無菌的生理鹽水中充分混勻，然後將上述稀釋後的口腔唾液加入到MRS液體培養基中，37t:厭氧富集培養48小時，獲得pH〈4.0的富集液；取上述富集液，10倍梯度稀釋後塗布於含4%(質量百分含量)CaC03的MRS固體培養基上，37'C厭氧培養24小時，挑取透明圈較大的單菌落分別接種於MRS液體培養基中厭氧培養24小時，觀察是否產氣，篩選得到不產氣的菌株，即同型發酵乳酸菌；將上述篩選得到得同型發酵乳酸菌分別接種於復篩培養基上，37'C厭氧培養48小時，通過高效液相色譜檢測總乳酸的產量，獲得高產的乳酸菌;將上述獲得的乳酸菌通過乳酸檢測試劑盒(購自德國拜爾公司)檢測L-乳酸的光學構型，最終得到三株L-乳酸光學純度為98。/。的菌株，即鼠李糖乳桿菌aa加k"7toAflmwosus)SMB-05、唾液乳桿菌(丄acto6ac/〃w^//va〃'ws)SMB-06和副乾酪乳桿菌aacto^cz7/M/flracase/)SMB-07，經多次傳代後發酵測試，總乳酸產量、L-乳酸的純度沒有明顯變化。MRS液體培養基的組成為葡萄糖20g/L，蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，擰檬酸二銨2g/L，乙酸鈉2g/L，吐溫801mL/L，MgS04*7H200.58g/L，MnS04*4H200.25g/L。發酵過程中控制pH範圍在5.5~6.2。115'C條件下滅菌20分鐘。含4%質量百分含量CaC03的MRS固體培養基的組成為葡萄糖20g/L，蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，檸檬酸二銨2g/L，乙酸鈉2g/L，吐溫801mL/L，MgS04*7H200.58g/L，MnS04*4H200.25g/L，CaC0340g/L，瓊脂15g/L。發酵過程中控制pH範圍在5.56.2。115"C條件下滅菌20分鐘。復篩培養基的組成為葡萄糖120g/L，蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L,檸檬酸二銨2g/L，乙酸鈉2g/L，吐溫801mL/L，MgS04'7H200.58g/L，MnS04'4H200.25g/L，CaCO340g/L。發酵過程中控制pH範圍在5.5~6.2。115'C條件下滅菌20分鐘。2、菌株的鑑定將上述步驟1篩選得到的鼠李糖乳桿菌a"cto6ac〃/z^Wzam朋ms)SMB-05、唾液乳桿菌(Xfl"o6flc"/wra/hw/us)SMB-06和副乾酪乳桿菌(Xfl"o6ac/〃us;aracase/)SMB-07分別進行形態特徵、生理生化試驗和16SrDNA序列鑑定，具體過程如下鼠李糖乳桿菌(Xacto6ac/〃wr/zam"ams)SMB-05CGMCCJVfs3122為革蘭氏陽性菌、菌落乳白色、菌落的邊緣整齊、光滑；唾液乳桿菌aacto6ac///^加/hw/us)SMB-06CGMCCJSf23123為革蘭氏陽性菌、菌落淡乳白色、菌落邊緣整齊、光滑；副乾酪乳桿菌(￡a"oZ>fl"7/usparaawe/)SMB-07CGMCC3124為革蘭氏陽性菌、菌落淡乳白色、菌落較小、邊緣整齊光滑。鼠李糖乳桿菌(丄actoZ)ac/〃船Wwwwoms)SMB-05、唾液乳桿菌(丄"cto6ac/〃w^//vaW船)SMB-06和副乾酪乳桿菌(丄"cto6ac〃/附;araawe/)SMB-07的生理生化特徵如表1-表3所示。表i鼠李糖乳桿菌(Z^cto6ac/〃wr/^m"ay^)SMB-05的生理生化特性檢測指標結果接觸酶-過氧化氫酶-明膠液化-耐6%NaCl+耐硝酸鹽+葡萄糖發酵不產氣L-半胱氨酸-L-精氨酸-15。C生長45。C生長G+C含量46.14%表2唾液乳桿菌aacto6ad//usa/Zvan'^)SMB-06的生理生化特性檢測指標結果接觸酶一過氧化氫酶-明膠液化一耐6%NaCl+耐硝酸鹽+葡萄糖發酵不產氣L-半胱氨酸—L-精氨酸-15°C生長45°C不生長G+C含量45.14%8表3副乾酪乳桿菌aacto6acf//i犯"van'MS)SMB-07的生理生化特性tableseeoriginaldocumentpage9表l-表3中，"+"表示結果為陽性，"-"表示結果為陰性。鼠李糖乳桿菌(丄a"o6ac"^Aam"ostw)SMB-05的16SrDNA的核苷酸序列如序列表中序列1示，唾液乳桿菌(￡flcto6ac/〃iSMB-06的16SrDNA的核苷酸序列如序列表中序列2示，副乾酪乳桿菌(Xflcto6flc/〃^/7arac^e/)SMB-07的16SrDNA的核苷酸序列如序列表中序列3示。菌株SMB-05的16SrDNA與鼠李糖乳桿菌V3(GQ253959.1)的同源性最高，其同源性為95%;菌株SMB-06的16SrDNA與唾液乳桿菌RA2115(AY389803.1)的同源性最高，其同源性為93%;菌株SMB-07的16Sr咖A與副乾酪乳桿菌L7(EU526815.1)的同源性最高，其同源性為96%。基於以上特徵，將上述步驟1篩選得到的菌株SMB-05鑑定為鼠李糖乳桿菌CLflcto^c///^Aflwmw附)，將上述步驟1篩選得到的菌株SMB-06鑑定為唾液乳桿菌(丄a"o6fl"7/^^fl/h^n&)，將上述步驟1篩選得到的菌株SMB-07鑑定為副乾酪乳桿菌(丄flcto^"7/w;^raawe/)。上述三株菌均於2009年6月16日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，鼠李糖乳桿菌aacto6ac/〃ww/wmwoms)SMB-05的保藏登記號為CGMCC3122，唾液乳桿菌aactoZ^"7/w犯"vaWuy)SMB-06的保藏登記號為CGMCCW23123，副乾酪乳桿菌aacto6ac/〃M;wacasd)SMB-07的保藏登記號為CGMCC3124。實施例2、利用鼠李糖乳桿菌(丄flcto6ac/〃wsAam"osw)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌aa"o6flc/〃w5犯/Zv『/z^)SMB-06CGMCC3123和副乾酪乳桿菌(Za"oZ)ac///w5paracase/)SMB-07CGMCC3124發酵生產L-乳酸該實施例中所用培養基的組成如下MRS液體培養基葡萄糖20g/L，蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，牛肉膏10g/L，K2HP042g/L，擰檬酸二銨2g/L，乙酸鈉2g/L，吐溫801mL/L,MgS04'7H200.58g/L，MnSO4*4H2O0.25g/L。發酵過程中控制pH範圍在5.5~6.2。115。C條件下滅菌20分鐘。發酵培養基葡萄糖190g/L、蛋白腖10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸鈉2g/L、MgS04.7H200.58g/L、MnS04.4H200.25g/L、Tween-801ml/L，CaC0330g/L。pH5.0~5.5。115。C條件下滅菌20分鐘。發酵培養基中加入CaC03的目的是作為中和劑以控制發酵液的pH值。將上述實施例1篩選得到的鼠李糖乳桿菌CLflcto6ac/〃MAamwoms)SMB-05CGMCCWe3122、唾液乳桿菌aacto6flc〃/wssa/Zvank)SMB—06CGMCC3123禾口副乾酪乳桿菌(丄acto6ac/〃Mparacfl^/)SMB-07CGMCCWs3124分別接種到MRS液體培養基中，37。C厭氧培養到對數生長期，使菌液濃度達到1091011cfu/mL。將上述三種乳桿菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳桿菌aacto^"7/wrftammwMS)SMB一05CGMCCW3122、唾液乳桿菌(Xa"o^c/〃ws犯/zVan.w"SMB—06CGMCCJVb3123和副乾酪乳桿菌aactoZ^c/〃wpflraca"/)SMB-07CGMCC3124的cfb比為1:1:1，得到種子液。將上述種子液以10%的接種量接種到裝有20LMRS液體培養基的種子發酵罐中，37'C厭氧培養到對數生長期，使菌液濃度達到1091011cfii/mLo在裝有120L上述發酵培養基的200L發酵罐中按照10%的體積比接入上述發酵種子液。發酵過程中，初始24小時通過氨水調節發酵液的pH為6.0進行發酵，然後通過發酵培養基中的碳酸鈣調節pH為5.0-5.5。採用分批補料的方式進行發酵培養，即在發酵培養12小時後，每3小時補加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次，35'C厭氧發酵60小時，結束髮酵。發酵過程結束後，通過高效液相色譜法檢測發酵液中總乳酸的產量和葡萄糖的含量。具體的檢測條件如下採用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定總乳酸的含量，有機酸分離柱AminexHPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300ram)，流動相為0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，進樣量20uL，紫外檢測器，檢測波長210nm，操作溫度4(TC。L-乳酸的含量通過L-乳酸檢測試劑盒(購自德國拜爾公司)檢測。標準乳酸樣品購買自Sigma公司。按照下述公式計算出發酵液中總乳酸的濃度、L-乳酸的光學純度和發酵產率。總乳酸的濃度=(總乳酸所佔面積/標準樣品所佔面積)X標準樣品質量濃度;L-乳酸的光學純度=L-乳酸濃度/總乳酸濃度；發酵產率=總乳酸濃度/發酵總時間。實驗設3次重複，3次重複的平均值如表4所示。表4不同發酵時間下的總乳酸產量:和L-乳酸光學純度發酵時間(h)總乳酸產量(g/L)L-乳酸光學純度128499%2413899%3718998%6021698%結果表明，當鼠李糖乳桿菌(丄acto^c/〃MAammwM)SMB-05CGMCCW3122、唾液乳桿菌(X""o6ac/〃wsa//vank)SMB-06CGMCCJV23123和副乾酪乳桿菌(丄acto6flc"/^;aracase/)SMB-07CGMCC3124的cfu比為1:1:1時，在60小時內總乳酸的產量為216g/L，卜乳酸的光學純度為98%，發酵產率為2.2g/L，h。實施例3、利用鼠李糖乳桿菌(丄a"o&c/〃w5Wzflm"oyz^)SMB-05CGMCCWs3122、唾液乳桿菌(丄actotec/〃w犯/zVan'^)SMB-06CGMCC3123和副乾酪乳桿菌(丄flcto6ad〃M;aracaw/)SMB-07CGMCC3124發酵生產L-乳酸該實施例中所用培養基的組成同實施例2。將上述實施例1篩選得到的鼠李糖乳桿菌(Xa"o6ad〃wH/2fl/W7oms)SMB-05CGMCCWe3122、唾液乳桿菌(丄acto6flc/〃Mra/hw/w)SMB-06CGMCCJN"23123禾口副乾酪乳桿菌(Z^"o^"7/wspflracwe/)SMB-07CGMCCW3124分別接種到MRS液體培養基中，37t:厭氧培養到對數生長期，使菌液濃度達到10tl0"cfii/mL。將上述三種乳桿菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳桿菌aaCtoZ^C///ir/wwmo犯s)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(丄acto6ac〃/wSMB-06CGMCCJY23123和副乾酪乳桿菌(Zacto6ac/〃wspflracase/)SMB-07CGMCCXb312411的cfU比為2:1:1，得到種子液。將上述種子液以10%的接種量接種到裝有20LMRS液體培養基的種子發酵罐中，37'C厭氧培養到對數生長期，使菌液濃度達到1091011cfu/mLc在裝有120L上述發酵培養基的200L發酵罐中按照10%的體積比接入上述發酵種子液。發酵過程中，初始24小時通過氨水調節發酵液的pH為6.0進行發酵，然後通過發酵培養基中的碳酸鈣調節pH為5.0-5.5。採用分批補料的方式進行發酵培養，即在發酵培養12小時後，每3小時補加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次，42"C厭氧發酵37小時，結束髮酵。發酵過程結束後，通過高效液相色譜法檢測發酵液中總乳酸的產量和葡萄糖的含量。具體的檢測條件如下採用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定總乳酸的含量，有機酸分離柱AminexHPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流動相為0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，進樣量20pL，紫外檢測器，檢測波長210nm，操作溫度4(TC。L-乳酸的含量通過L-乳酸檢測試劑盒(購自德國拜爾公司)檢測。標準乳酸樣品購買自Sigma公司。按照下述公式計算出發酵液中總乳酸的濃度、L-乳酸的光學純度和發酵產率。總乳酸的濃度=(總乳酸所佔面積/標準樣品所佔面積)X標準樣品質量濃度；L-乳酸的光學純度二L-乳酸濃度/總乳酸濃度；發酵產率=總乳酸濃度/發酵總時間。實驗設3次重複，3次重複的平均值如表5所示。表5不同發酵時間下的總乳酸產量和L-乳酸光學純度發酵時間(h)總乳酸產量(g/L)L-乳酸光學純度1210199%2417898%3723799%結果表明，當鼠李糖乳桿菌(丄a"o6ac/〃wAamwww)SMB-05CGMCCW3122、唾液乳桿菌CLfl"oZ^c/〃w^f"wzn'w5)SMB-06CGMCCWe3123和副乾酪乳桿菌(Zacto6ad〃M;(3racwe/)SMB—07CGMCCWs3124的cfu比為2:1:1日寸，在37小時內總乳酸的產量為237g/L，卜乳酸的光學純度為99%，發酵產率為6.4g/L'h。實施例4、利用鼠李糖乳桿菌aactoZ^c〃/wr/zaw"oms)SMB-05CGMCCJV2123122、唾液乳桿菌(丄actoZ)ac/〃w^"va〃'z^)SMB-06CGMCC3123和副乾酪乳桿菌afl"oZwc/〃M/aracwe/)SMB-07CGMCC3124發酵生產L-乳酸該實施例中所用培養基的組成同實施例2。將上述實施例1篩選得到的鼠李糖乳桿菌(丄actokc/〃MAawzomy)SMB-05CGMCCWe3122、唾液乳桿菌(Xacto6ac/〃wra//van*)SMB-06CGMCC3123禾口副乾酪乳桿菌CLacto6ac!7/wSMB-07CGMCCW3124分別接種到MRS液體培養基中，37。C厭氧培養到對數生長期，使菌液濃度達到1091011cfU/mL。將上述三種乳桿菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳桿菌(丄actote"7/wr/wmwcw^)SMB-05CGMCCJV23122、唾液乳桿菌(丄a"o6a"'〃z^sa/ZwW^)SMB-06CGMCCWs3123和副乾酪乳桿菌CLflcto6ac/〃M;7aram^/)SMB-07CGMCCW3124的cfli比為3:2:1，得到種子液。將上述種子液以10n/。的接種量接種到裝有20LMRS液體培養基的種子發酵罐中，37"C厭氧培養到對數生長期，使菌液濃度達到1091011cfU/mLo在裝有120L上述發酵培養基的200L發酵罐中按照10%的體積比接入上述發酵種子液。發酵過程中，初始24小時通過氨水調節發酵液的pH為6.0進行發酵，然後通過發酵培養基中的碳酸鈣調節pH為5.0-5.5。採用分批補料的方式進行發酵培養，即在發酵培養12小時後，每3小時補加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次，37"C厭氧發酵37小時，結束髮酵。發酵過程結束後，通過高效液相色譜法檢測發酵液中總乳酸的產量和葡萄糖的含量。具體的檢測條件如下採用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定總乳酸的含量，有機酸分離柱AminexHPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流動相為0.0005mol/L硫酸，流量0.5ml/min，進樣量20ixL，紫外檢測器，檢測波長210nm，操作溫度40'C。L-乳酸的含量通過L-乳酸檢測試劑盒(購自德國拜爾公司)檢測。標準乳酸樣品購買自Sigma公司。按照下述公式計算出發酵液中總乳酸的濃度、L-乳酸的光學純度和發酵產率。總乳酸的濃度=(總乳酸所佔面積/標準樣品所佔面積)X標準樣品質量濃度;L-乳酸的光學純度=卜乳酸濃度/總乳酸濃度；發酵產率=總乳酸濃度/發酵總時間。實驗設3次重複，3次重複的平均值如表6所示。表6不同發酵時間下的總乳酸產量和L-乳酸光學純度tableseeoriginaldocumentpage14結果表明，當鼠李糖乳桿菌(丄flcto^a7/^Aflmwomy)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(Za"o^c/〃w^//vank)SMB-06CGMCCW3123和副乾酪乳桿菌(丄""o6ac/〃w/flracaw/)SMB-07CGMCCW3124的cfu比為3:2:1時，在37小時內總乳酸的產量為240g/L，卜乳酸的光學純度為98%，發酵產率為6.5g/L'h。實施例5、利用鼠李糖乳桿菌aa"o6ac"/^W^w"omy)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(Z^ctoZac/〃^■ya/Zvank)SMB-06CGMCC3123和副乾酪乳桿菌aa"o6ad〃wparaca"/)SMB-07CGMCCJV23124發酵生產L-乳酸該實施例中所用培養基的組成如下MRS液體培養基同實施例2。發酵培養基葡萄糖200g/L、蛋白腖10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸鈉2g/L、MgS04.7H200.58g/L、MnS044H200.25g/L、Tween-801ml/L，CaC0330g/L。pH5.0~5.5，115"C條件下滅菌20分鐘。發酵培養基中加入CaC03的目的是作為中和劑以控制發酵液的pH值。將上述實施例1篩選得到的鼠李糖乳桿菌aflctok/c/〃t^Mflmwww)SMB-05CGMCCJV23122、唾液乳桿菌(丄acto6a"'〃wssa"va"'MS)SMB—06CGMCC3123禾口副乾酪乳桿菌C^"o6ac/〃w/aracae/)SMB-07CGMCCJV23124分別接種到MRS液體培養基中，37。C厭氧培養到對數生長期，使菌液濃度達到1091011cfu/mL。將上述三種乳桿菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳桿菌CL""o6ac///^r/wmwayus)SMB—05CGMCC3122、唾液乳桿菌(丄a"o6ac〃/wssa/hw/us)SMB—06CGMCCJVf23123和副乾酪乳桿菌CL"cto6ac/〃w;aracaye/)SMB-07CGMCCJVs3124的cfu比為3:2:1，得到種子液。將上述種子液以10。/。的接種量接種到裝有20LMRS液體培養基的種子發酵罐中，39'C厭氧培養到對數生長期，使菌液濃度達到10910"cfu/mL。在裝有120L上述發酵培養基的200L發酵罐中按照10%的體積比接入上述發酵種子液。發酵過程中，初始24小時通過氨水調節發酵液的pH為6.0進行發酵，然後通過發酵培養基中的碳酸鈣調節pH為5.0-5.5。採用分批補料的方式進行發酵培養，即在發酵培養12小時後，每3小時補加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次，37"C厭氧發酵37小時，結束髮酵。發酵過程結束後，通過高效液相色譜法檢測發酵液中總乳酸的產量和葡萄糖的含量。具體的檢測條件如下:採用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定總乳酸的含量，有機酸分離柱AminexHPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流動相為O.0005raol/L硫酸，流量0.5ml/rain，進樣量20yL，紫外檢測器，檢測波長210nm，操作溫度4(TC。L-乳酸的含量通過L-乳酸檢測試劑盒(購自德國拜爾公司)檢測。標準乳酸樣品購買自Sigma公司。按照下述公式計算出發酵液中總乳酸的濃度、L-乳酸的光學純度和發酵產率。總乳酸的濃度=(總乳酸所佔面積/標準樣品所佔面積)X標準樣品質量濃度；卜乳酸的光學純度=卜乳酸濃度/總乳酸濃度；發酵產率=總乳酸濃度/發酵總時間。實驗設3次重複，3次重複的平均值如表7所示。表7不同發酵時間下的總乳酸產量和L-乳酸光學純度發酵時間(h)總乳酸產量(g/L)L-乳酸光學純度129498%2417998%3723398%結果表明，當發酵培養基中葡萄糖濃度為210g/L時，37t:厭氧發酵37小時內總乳酸的產量為233g/L，L-乳酸的光學純度為98X，發酵產率為6.3g/L，h。實施例6、利用鼠李糖乳桿菌aa"o6ac/〃wSMB-05CGMCC她3122、唾液乳桿菌(Xactotoc/〃w■yaZ/vfln'M)SMB-06CGMCC処3123和副千酪乳桿菌(丄acto^d〃wsparacase/)SMB-07CGMCCJN"23124發酵生產L-乳酸該實施例中所用培養基的組成如下MRS液體培養基同實施例2。發酵培養基葡萄糖180g/L、蛋白腖10g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉5g/L、K2HP043g/L、KH2P043g/L、乙酸鈉2g/L、MgS04'7H200.58g/L、MnS04'4H200.2515g/L、Tween-801ml/L，CaC0330g/L。pH5.0~5.5，115。C條件下滅菌20分鐘。發酵培養基中加入CaC03的目的是作為中和劑以控制發酵液的pH值。將上述實施例1篩選得到的鼠李糖乳桿菌CLa"o6a"7/wr/wm"o^^)SMB-05CGMCCJN"23122、唾液乳桿菌(丄a"o^"7/us犯"wn^)SMB-06CGMCC3123禾口副乾酪乳桿菌(丄""okc/〃w;aracme/)SMB-07CGMCCW3124分別接種到MRS液體培養基中，37。C厭氧培養到對數生長期，使菌液濃度達到1091011cfo/mL。將上述三種乳桿菌按照一定的比例混合，使混合菌液中鼠李糖乳桿菌CLadoZ^a7/^Wzamwoyt^)SMB-05CGMCC3122、唾液乳桿菌(丄fl"o6ac/〃Mra/zVa"'附)SMB-06CGMCCJV"23123和副乾酪乳桿菌(丄fl"o6ac/〃w/aracaw/)SMB-07CGMCC3124的cfo比為3:2:1，得到種子液。將上述種子液以10%的接種量接種到裝有20LMRS液體培養基的種子發酵罐中，39C厭氧培養到對數生長期，使菌液濃度達到109~10n在裝有120L上述發酵培養基的200L發酵罐中按照10%的體積比接入上述發酵種子液。發酵過程中，初始24小時通過氨水調節發酵液的pH為6.0進行發酵，然後通過發酵培養基中的碳酸鈣調節pH為5.0-5.5。採用分批補料的方式進行發酵培養，即在發酵培養12小時後，每3小時補加5.8L濃度為1kg/L的葡萄糖一次，37'C厭氧發酵37小時，結束髮酵。發酵過程結束後，通過高效液相色譜法檢測發酵液中總乳酸的產量和葡萄糖的含量。具體的檢測條件如下釆用Agilent1100液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)測定總乳酸的含量，有機酸分離柱AminexHPX-87H(Bio-Rad公司，7.8IDX300mm)，流動相為0.0005mol/L硫酸，流量0.5ral/min，進樣量20yL，紫外檢測器，檢測波長210nm，操作溫度4(TC。L-乳酸的含量通過L-乳酸檢測試劑盒(購自德國拜爾公司)檢測。標準乳酸樣品購買自Sigma公司。按照下述公式計算出發酵液中總乳酸的濃度、L-乳酸的光學純度和發酵產率。總乳酸的濃度=(總乳酸所佔面積/標準樣品所佔面積)X標準樣品質量濃度;L-乳酸的光學純度=L-乳酸濃度/總乳酸濃度；發酵產率=總乳酸濃度/發酵總時間。實驗設3次重複，3次重複的平均值如表8所示。表8不同發酵時間下的總乳酸產量和L-乳酸光學純度發酵時間(h)總乳酸產量(g/L)L-乳酸光學純度129898%2418598%3724198%結果表明，當發酵培養基中葡萄糖濃度為180g/L時，37"C厭氧發酵37小時內總乳酸的產量為241g/L，卜乳酸的光學純度為98%，發酵產率為6.5g/L'h。17序列表〈110〉中國科學院微生物研究所—種製備L-乳酸的方法及其專用菌劑〈130>CGGNARZ924181440<212〉DNA1cagca_gtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtga60agaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgt120tgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggt180aatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttt240tttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagtgcatcggaaactgggaaac300ttgagtgcagaagaggacagtggaactaaatgtgtagcggtg犯atgcgtagatatatgg360aagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcga犯gca420tgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggt480gttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggag540tacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcat600gtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttttgatcacct660gagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagct720cgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgcca780gcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatga840cgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaa900cgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgta960ggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcgg1020cgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgcca1080gcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatga1140gcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatga1200cgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtac犯1260cgagttgcgagaccgcgaggtxaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgta1320cgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgta1380ggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatc已gcacgccgcgg1440〈210〉2DNA〈213>唾液乳桿菌(i:a"oZ>^/〃wra//ran'z^)〈400〉2agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaat8catgc犯gtcg肌c60gaaactttcttacaccgaatgcttgcattcatcgtaagaagttgagtggcggacgggtga120gtaacacgtgggtaacctgcctaaaagaaggggataacacttggaaacaggtgctaatac180cgtatatctctaaggatcgcatgatccttagatgaaagatggttctgctatcgcttttag240atggacccgcggcgtattaactagttggtggggtaacggcctaccaaggtgatgatacgt300agccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgg360gaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtga420gtgaagaaggtcttcggatcgtaaaactctgttgttagagaagaacacgagtgagagtaa480ctgttcattcgatgacggtatctaaccagcaagtceicggctaactacgtgccagcagccg540cggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagggaacgcaggcg600gtcttttaagtctgatgtgaaagccttcggcttaaccggagtagtgcattggaaactgga660agacttgagtgcagaagaggagagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatat720atggaagaacaccagtggcgaaagcggctctctggtctgtaactgacgctgaggttcgaa780agcgtgggtagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgct840aggtgttggagggtttccgccct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