單純皰疹病毒Ⅱ型基因重組減毒活疫苗及其製備方法
2023-12-09 02:03:26 2
專利名稱：單純皰疹病毒Ⅱ型基因重組減毒活疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物醫藥技術領域，具體涉及一種能夠防治單純皰疹病毒II型感染所致疾病的基因重組減毒活疫苗及其製備方法。
背景技術：
單純皰疫病毒(herpes simplex virus, HSV)是一種經皮膚和黏膜密切接觸傳播的病毒，包括單純皰疹病毒I型(簡稱HSV-1)和單純皰疹病毒II型(簡稱HSV-2)，兩種病毒具有83%以上的共同基因特徵，50%以上的基 因同源性。其中I型在人群的感染率可高達80%以上，並長期潛伏於感覺神經節內，雖然大多數HSV-I感染者沒有明顯症狀，但少數感染者可產生終生的反覆發作的面口皰疹、致盲性很高的眼內眼炎以及致命性的皰疹性肺炎和皰疹腦炎。HSV-2是生殖器皰疹的主要病原體，佔生殖器皰疹原發感染的90%以上。II單純皰疹病毒感染人類後主要引起生殖系統原發性和復發性皰疹，可以終生潛伏在神經節內，在機體免疫力降低時復發。孕婦感染HSV-II型病毒後易發生流產，也可致胎兒先天畸形或智力低下。新生兒在分娩時感染可導致高熱、呼吸困難或中樞神經系統病變，其中60% -70%的新生兒可能死亡。此外，有研究表明，生殖器皰疹可將愛滋病感染風險增加2-3倍，並促進愛滋病病毒的傳播。研究表明安全套並不能有效預防皰疹病毒感染，世界範圍內生殖器皰疹發病率在逐年上升，據美國最新統計數據顯示，美國成人生殖器皰疹患病率已經上升到了 16%以上，在紐約已經上升至25%以上，目前並無單純皰疹病毒感染，尤其是復發性感染的特效治療方法，抗病毒藥物常規用藥雖能緩解一些臨床症狀，但不能徹底清除體內潛伏的病毒，也不能減少復發次數，因此迫切需要開發能有效防治單純皰疹病毒感染的疫苗。近數十年來世界各國HSV疫苗的研究結果表明，傳統的滅活疫苗和亞單位疫苗免疫原性弱，僅能誘導體液免疫應答，細胞免疫誘導效果較差；新型DNA疫苗雖能同時誘導體液和細胞免疫，但是其轉染效率較低，經黏膜免疫誘導有效的黏膜免疫應答能力更低。而在單純皰疹病毒的免疫應答過程中，細胞免疫和黏膜免疫發揮著更大的作用，但上述幾類疫苗均不能有效誘導細胞免疫和黏膜免疫應答，因此，到目前為止，尚無可以在臨床上應用的疫苗上市，單純皰疹病毒疫苗基本上都處於臨床前或臨床研究階段。病毒減毒活疫苗是最為經典的疫苗形式，這種類型的疫苗如天花疫苗、脊髓灰質炎疫苗等在人類抵抗感染性疾病的歷史上發揮了不可替代的作用，為人類的健康做出了不可磨滅的貢獻。減毒活疫苗基本上包含病毒的全部或大部分抗原，並且具有野生型病毒一樣的感染和複製特性，但沒有致病作用，此類疫苗可以有效地誘導機體產生全面的免疫應答，相對於其它種類的疫苗而言，免疫原性強，保護效果好。傳統的減毒活疫苗主要是通過連續培養篩選得到的，但這種方法耗時費力，用這種方法很難得到致病性降低的單純皰疹病毒毒株。近年來，研究者開始採用現代分子生物學技術，將HSV基因組的特定基因進行敲除以獲得重組株。本發明則是利用現代分子生物學技術，以Genebank中的HSV-I和HSV-2基因組參考序列(HSV-1登錄號NC_001806，HSV-2登錄號NC_001798)為藍本，通過聯合敲除多個基因，篩選出了 HSV-I型和HSV-2型重組減毒株，它們的致病能力均發生了不同程度的降低，可用以有效地防治HSV-I和HSV-2感染所
致疾病。
發明內容
本發明的目的是提供能夠預防和治療單純皰疹病毒II感染所致疾病的重組減毒活疫苗及所述疫苗的製備方法。 本發明涉及的單純皰疹病毒II型重組株，均由野生HSV-2經過重組、篩選和純化得來的。所採用的技術方案是取水泡較為明顯的口唇皰疹和生殖器皰疹患者的水泡液，分離鑑定出野生型HSV-I和HSV-2 ;擴大培養後提取病毒完整基因組；和含有螢光表達基因及擬定敲除的HSV基因左右兩側700bp至2000bp的同源側翼序列的穿梭載體共同轉染Veix)細胞；在螢光顯微鏡下使用一種或者聯合使用多種螢光蛋白基因作為標記挑選出重組病毒，經過空斑純化後可獲得所需要的重組減毒活疫苗。可以獲得一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，特徵是敲除了其基因組中的 UL43、UL44、UL45、UL46 和 UL47 基因的 HSV-2 重組株。可以獲得一種如上所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，在於聯合敲除了其基因組中的UL43 UL47基因和其它複製或感染非必需基因片段的HSV-2重組株所述其它複製或感染非必需基因片段是US9 US12基因。用類似的方法在上述重組株的基礎上可進一步敲除其它如基因獲得致病性進一步減低的重組株。作用在小鼠身上可證明，上述的重組株病毒致病能力均有不同程度的減弱，可以保護小鼠免受致死量單純皰疹病毒I型或II型的攻擊；作用在豚鼠身上證明重組株可以預防和治療豚鼠生殖器皰疹。上述重組株可以作為重組單純皰疹病毒減毒活疫苗以防治單純皰疹病毒感染所致相關疾病。本發明用以構建同源重組穿梭質粒的pShuttle-CMV質粒購自Stragene公司，序列和物理圖譜見該公司的產品目錄。本發明所用螢光標記基因是綠色螢光蛋白表達盒和紅色螢光蛋白表達盒。本發明的有益效果相比傳統疫苗而言，本發明製備的減毒活疫苗均是經過基因工程重組後的減毒活疫苗，不易發生毒力回復，其它生物學特性和野生型單純皰疹病毒相似，但進入機體後僅能刺激機體產生免疫應答而無致病作用，具有良好的安全性；本疫苗保留了單純皰疹病毒II型的大部分抗原，具有較高的免疫原性，能很好地模擬野生型HSV-2，有效地誘導機體黏膜和體液免疫應答，構建機體抵抗皰疹感染的第一道防線，降低人群發病率；激發細胞免疫應答，構建機體的第二道防線，有可能清除已感染病毒，控制皰疹的復發和傳播。
圖I重組單純皰疹病毒減毒活疫苗的構建策略示意2重組單純皰疹病毒減毒II型活疫苗JSH02L結構示意圖
圖3重組單純皰疹病毒減毒II型活疫苗JSH02LS結構示意圖
具體實施例方式本發明技術方案中單純皰疹病毒II型重組減毒活疫苗的總體構建策略參見附圖I。提取野生型HSV-I和HSV-2完整基因組；構建含有綠色或紅色螢光表達基因及擬定敲除的HSV基因左右兩側700bp至2000bp的側翼序列的同源重組穿梭載體，二者共同轉染Vero細胞，在螢光顯微鏡下挑選表現相應顏色螢光的重組病毒，經過空斑純化後可獲得敲除了 HSV-I或HSV-2重組減毒活疫苗。其中敲除了HSV-2UL43、UL44、UL45、UL46和UL47基因的HSV-2 重組株，命名為 JSH02L ；敲除了HSV-2UL43、UL44、UL45、UL46 和 UL47 與 US9、US10、USll 和 US12 基因的HSV-2重組株，命名為JSH02LS。用類似的方法在上述重組株的基礎上可進一步敲除其它如基因獲得致病性進一步減低的重組株。實施例I重組單純皰疹病毒II型減毒活疫苗JSH02L構建I.按照本案原專利申請號為201010253601. 5的實施例I中HSV-1基因組提取方法提取HSV-2基因組。2.構建同源重組穿梭載體pShuttle_02L_GFP。(I)參考NCBI上登錄號為NC_001798的HSV-2基因組的UL43-UL47的序列，分別設計UL43基因的左側側翼序列和UL47基因的右側側翼序列的擴增引物。⑵UL43側翼序列的引物設計在UL43左側翼序列上遊引物的5』末端添加NotI位點和三個保護鹼基，在UL43左側翼序列下遊引物的5』末端添加Pmel、AseI位點和三個保護鹼基，PCR擴增30個循環後回收目的條帶。(3) UL47側翼序列的弓丨物設計UL47右側翼序列上遊引物5』末端添加PmeI和MluI位點和三個保護鹼基，UL47右側翼序列下遊引物5』末端添加HindIII位點和三個保護鹼基，PCR擴增30個循環後回收目的條帶。 (4) PCR擴增GFP表達質粒pLKO-GFP (由本公司自己構建)上的GFP表達盒，上遊引物5』末端添加AseI位點和三個保護鹼基，下遊引物的5』末端添加PmeI位點和三個保護鹼基，PCR擴增30個循環後回收目的條帶。(5)用AseI和PmeI切GFP的PCR產物，回收備用。(6)用NotI和PmeI酶切UL43側翼序列PCR產物，PmeI和HindIII酶切UL47偵^翼序列PCR產物，回收酶切產物。(7)分兩步將步驟2. 5)和2. 6)中回收的產物克隆至pShuttle-CMV載體即構建成功 pShuttle-02-GFP。
3.同源重組生產HSV-2敲除株JSH02L(I)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle_02L_GFP質粒。(2)用脂質體2000將HSV-2基因組和pShuttle-02L_GFP質粒共轉染至vero細胞。
(3)在倒置螢光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉移至含有IML培養基的EP管中。(4)將EP管在_80°C和37°C反覆凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在螢光顯微鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化後獲得HSV-I敲除株JSH02L(圖2)。(6)用Veix)細胞增殖後用TCID5tl法測定滴度。實施例2應用綠色和紅色螢光標記構建HSV-2重組減毒活疫苗JSH02LSJSH02LS的構建策略和方法類似本案原專利申請號為201010253601. 5的先前的JSHOILS的構建方法，具體詳述如下 I.構建US9、US10、US11和US12基因聯合敲除的HSV-2重組株JSH02S。(I)構建同源重組穿梭載體pShuttle-02-RED。I. I)參考NCBI上登錄號為NC_001798的HSV-2基因組的US區US9-US12的序列，分別設計US9基因的左側側翼序列和US12基因的右側側翼序列的擴增引物。I. 2)US9側翼序列的引物設計在US9左側翼序列上遊引物的5』末端添加NotI位點和三個保護鹼基，在US9左側翼序列下遊引物的5』末端添加Pmel、AseI位點和三個保護鹼基，PCR擴增30個循環後回收目的條帶。I. 3) US12側翼序列的引物設計US12右側翼序列上遊引物5』末端添加PmeI和MluI位點和三個保護鹼基，US12右側翼序列下遊引物5』末端添加HindIII位點和三個保護鹼基，PCR擴增30個循環後回收目的條帶。I. 4)用 BglII 和 BamHI 雙酶切 pDsredl-cl,連接,轉化,得 pDsredbb 質粒。I. 5)用AseI和MluI切pDsredbb質粒，電泳回收I. 5kb片段I. 6)用NotI和PmeI酶切US9側翼序列PCR產物，PmeI和HindIII酶切US12側翼序列PCR產物，回收酶切產物。I. 7)分兩步將I. 5)和I. 6)步驟中回收的產物克隆至pShuttle-CMV載體後即構建成功 pShuttIe-012-REDo(2)同源重組生產HSV-2敲除株JSH02S2. I)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShutt I e_02L_RED質粒。2. 2)用脂質體2000將HSV-2基因組和pShutt I e_02L-RED質粒共轉染至vero細胞。2. 3)在倒置螢光顯微鏡下將紅色CPE處的細胞吸出，轉移至含有IML培養基的EP管中。2. 4)將EP管在_80°C -37°C反覆凍融三次。2. 5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在螢光顯微鏡下挑出紅色空斑，進行5輪空斑純化後獲得HSV-2敲除株JSH02S。2. 6)用Vero細胞擴增JSH02S後提取基因組備用。2.構建HSV-2重組減毒活疫苗JSH02LS——同源重組生產HSV-2敲除株JSH02LS(I)用Axygen質粒小提試劑盒按其說明書提取pShuttle_02L_GFP質粒。
(2)用脂質體2000將JSH02S基因組和pShutt I e_02L_GFP質粒共轉染至vero細胞。(3)在倒置螢光顯微鏡下將綠色CPE處的細胞吸出，轉移至含有IML培養基的EP管中。(4)將EP管在_80°C和37°C反覆凍融三次。(5)將病毒稀釋至合適的滴度，用低熔點瓊脂糖覆蓋法進行空斑純化，在螢光顯微鏡下挑出綠色空斑，進行5輪空斑純化後獲得HSV-2敲除株JSH02LS，參見附圖3。實施例3重組單純皰疹病毒II型活疫苗對小鼠的免疫保護實驗I.實驗材料
野生型單純皰疹病毒II型和重組單純皰疹病毒減毒活疫苗同上述實施例。正常細胞裂解液培養皿中正常培養的Veix)細胞刮下後在_80°C和37°C反覆凍融後過濾。普通級別實驗小白鼠50隻，雌性，體重20 土 2g，每一隻都在其身體的不同部位做好標記，在將相應標記轉化為1-50共50個阿拉伯數字，按隨機化原則分為10隻/組，分為陰性組、JSH02L、JSH02LS 組。2.免疫及攻毒方案免疫劑量106TCID50重組病毒；途徑鼻腔滴注，即第5周(35天)用野生型HSV-2進行攻擊試驗，計算小鼠死亡率，確定保護效果。3.操作步驟(I)小鼠隨機分組後，陰性對照組經鼻腔滴注途徑給於50微升正常細胞裂解液，其它組分別給於50微升JSH02L、JSH02LS，觀察小鼠情況。(2)第5周，攻毒實驗；I)用 ImL 注射器吸取 0. Iml HSV-2 病毒(含 IO6IU)。2)小鼠腹腔內注射HSV-2 0. 1ml。3)觀察小鼠情況4、結果陰性對照組小鼠攻毒後第5天開始出現死亡情況，第13後全部死亡，其它組全部存活。其它組和陰性組差別顯著，疫苗可抵抗致死量病毒攻擊。實施例4重組單純皰疹病毒II型活疫苗對豚鼠生殖器皰疹的免疫保護實驗I、實驗材料野生型單純皰疹病毒II型用Vero細胞擴增HSV-2後測定滴度，滴度約為IX 107IU/ml ;重組單純皰疹病毒減毒活疫苗JSH02L、JSH02LS、:用Vero細胞擴增後將滴度均調整約為I X 107IU/ml ；普通級別實驗豚鼠50隻，雌性，體重275 土 5g，每一隻都在其身體的不同部位做好標記，在將相應標記轉化為1-50共50個阿拉伯數字，按隨機化原則分為10隻/組，分為對照組、JSH02L、JSH02LS 組。2、免疫及攻毒方案免疫劑量=IO5TCID5tl重組活疫苗；途徑鼻腔滴注，在0周實施初次免疫，2周(14天)以後進行加強免疫一次，再過兩周以後，即第5周(35天)用野生型HSV-2進行攻擊試驗，計算豚鼠外陰皮損累計積分，確定保護效果。3、操作步驟(I)第0周，初次免疫豚鼠隨機分組後陰性對照組經鼻腔滴注途徑給於50微升細胞裂解液；陽性組同樣方法分別給於50微升JSH02L、JSH02LS，觀察豚鼠情況。(2)第2周，加強免疫陰性對照組經鼻腔滴注途徑給於100微升細胞裂解液；陽性組同樣方法給於100微升JSH02L、JSH02LS,觀察豚鼠情況。(3)第5周，攻毒實驗；I)用棉籤蘸生理鹽水擦洗豚鼠外陰。2)用ImL注射器配上灌胃針頭吸取0. 2mlHSV_2病毒(含IO6IU)。
3)將針頭伸入陰道內陰道穹隆後將病毒液注入，緩慢退出。4)用明膠海棉塞住陰道維持病毒液體24h。豚鼠出現症狀紅腫、起皰、潰瘍、結痂。評分標準0無症狀0.5，僅輕微紅腫；I. 0,紅腫明顯，無水皰；I. 5，單個小水皰(彡2mm)；2. 0，單個大水皰(> 2mm)；2. 5，多個小水皰和/或陰道潰瘍(出血)；3.0，多個大水皰；3. 5，嚴重外陰腫脹；4. 0，多個小/大疤融合；4. 5，後肢癱瘓；5.0，外陰潰瘍，後肢癱瘓4、實驗結果預期攻毒後陰性對照組發病情況攻毒後3天全部出現初發感染症狀，大約6 7天，豚鼠皮損程度最嚴重，逐漸減輕，第10天後基本消失。中間偶有豚鼠病重死亡。初次發病後13天後出現復發感染，整體評分較大；各陽性組預期偶有豚鼠出現輕微紅腫症狀，無其它明顯症狀，整體評分較小。陽性組和陰性組差別顯著，疫苗可預防生殖器皰疹。實施例5重組單純皰疹病毒I I型活疫苗對豚鼠生殖器皰疹的免疫治療實驗I、實驗材料同上述實施例2、實驗方法用HSV-2病毒攻擊豚鼠後第5天，將豚鼠隨機分為5組，分別經鼻腔途徑給予JSH02L、JSH02LS各50微升；第一次免疫治療後的14天，同途徑和劑量進行第二次免疫治療，兩周後再免疫一次，待豚鼠初發感染症狀消退後用紫外燈照射豚鼠外陰10分鐘以誘發復發感染，觀察豚鼠復發情況，計算皮損指數。3、實驗結果預期給藥後對照組復發症狀明顯，評分較大，各陽性組復發症狀輕微，評分較小，本疫苗在豚鼠身上對復髮型生殖器皰疹有一定的治療作用，可以減輕復發症狀。
權利要求
1.一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特徵在於敲除了其基因組中的UL43 UL47基因。
2.一種如權利要求I所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗，其特徵在於聯合敲除了其基因組中的UL43到UL47基因和其它複製或感染非必需基因片段；所述其它複製或感染非必需基因片段是US9到US12基因。
3.一種如權利要求I或2所述的單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗的製備方法，其特徵在於 步驟ー取皰疹患者的水泡液，分離鑑定出野生單純皰疹病毒II型； 步驟ニ 擴大培養後提取病毒完整基因組設計引物擴增出單純皰疹病毒II型病毒基因組的UL43基因左側700bp至2000bp的同源側翼序列和單純皰疹病毒II型病毒基因組的UL47基因右側700bp至2000bp的同源側翼序列； 步驟三將步驟ニ所述同源側翼序列和螢光蛋白基因克隆至PShuttle-CMV載體，使螢光蛋白基因位於同源側翼序列之間，再和單純皰疹病毒II型基因組共轉染至Veix)細胞中，進行同源重組； 步驟四在螢光顯微鏡下使用ー種或者聯合使用多種螢光蛋白基因作為標記挑選出重組病毒；經過空斑純化後可獲得單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗。
全文摘要
本發明公開了一種單純皰疹病毒II型基因重組減毒活疫苗及其製備方法，在於敲除了其基因組中的UL43～UL47基因。採用取水泡較為明顯的口唇皰疹和生殖器皰疹患者的水泡液，分離鑑定出野生型HSV-1和HSV-2；擴大培養後提取病毒完整基因組；和含有螢光表達基因及擬定敲除的HSV基因左右兩側700bp至2000bp的同源側翼序列的穿梭載體共同轉染Vero細胞；在螢光顯微鏡下使用一種或者聯合使用多種螢光蛋白基因作為標記挑選出重組病毒，經過空斑純化後可獲得所需要的重組減毒活疫苗。本疫苗有效地誘導機體黏膜和體液免疫應答，降低人群發病率；激發細胞免疫應答，有可能清除已感染病毒，控制皰疹的復發和傳播。
文檔編號A61P31/22GK102671193SQ20121015932
公開日2012年9月19日 申請日期2010年8月16日 優先權日2010年8月16日
發明者劉景偉 申請人:鄭州金森生物科技工程有限公司