徑向色譜柱用金屬螯合親和膜色譜介質的合成方法
2023-12-09 04:29:36 1
專利名稱：徑向色譜柱用金屬螯合親和膜色譜介質的合成方法
技術領域：
本發明提供一種以短棉纖維為基質，通過某種活性高分子聚合物與纖維接枝後，再引入可螯合過渡金屬離子的配體---亞氨二乙酸，製成適於生物大分子分離純化用的金屬螯合膜色譜介質的方法。
生物工程和基因工程的迅速發展為社會提供了越來越多的生物產品，然而只有經過分離純化並達到一定純度的生物產品才能為人們所利用，特別是用於臨床的生化藥品。以軟凝膠為基質的經典的生物大分子分離純化技術由於流速慢、壓降大、分離時間長、大規模處理時不易放大等缺點，已遠遠不能適應當今發展的需要。80年代中期推出了徑向膜色譜技術，它是將膜色譜技術與色譜分離原理結合起來，採用徑向流動技術，克服了傳統色譜技術的缺點，可以在較小床層高度時，獲得較大的處理量，還可以達到較大流速，另外，它可以進行線性放大，即在保持柱徑不變而只增加柱長時，可按比例增加樣品的處理量，因此，徑向膜色譜技術是一種較理想的生物工程大規模分離提純的有效工具。
親和色譜技術是分離純化生物大分子的重要手段，其特點是選擇性好、純化倍數高。以過渡金屬離子為通用性配體的金屬螯合親和色譜以其製造成本低、通用性好、純化倍數較高而被廣泛用於生物產品的分離純化。把親和色譜技術與上述徑向膜色譜技術結合起來將會形成一種新型的分離技術，我們稱之為徑向親和膜色譜技術，它兼有徑向膜色譜技術流速快、處理量大、易線性放大和親和色譜技術高選擇性的優點。是一種非常有潛力的分離技術。纖維素的非特異性吸附較小，有合適的孔徑結構，它可以通過酯化、醚化、氧化等方法，把活性基團或親和配基引入纖維素骨架上而製成纖維素親和介質，但這幾種方法只能在不破壞纖維素結構的情況下得到很有限的結合容量，使得相應的柱子的柱容量很小，給這類介質在徑向色譜柱中的應用帶來困難。
本發明的目的是提供一種適於生物大分子的選擇性分離純化採用的徑向色譜柱填料一金屬螯合型親和介質的合成方法，該合成方法利用的原料便宜易得、反應條件簡單，易控制。
本發明的徑向色譜柱用金屬螯合色譜介質的合成方法，是採用以甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯進行自聚反應得到聚合物，再與纖維素進行接枝反應，然後加入亞氨二乙酸作為螯合配基進行開環反應，最後加入金屬離子溶液進行反應的過程，自聚和接枝反應在水介質中進行，反應溫度為50～90℃。並在上述反應中加入引發劑，例如偶氮二異丁腈，正丁基鋰或過硫酸銨與硫代硫酸鈉，引發劑加入量為聚合單體重量的1～5％。此外，上述反應中螯合配基亞氨二乙酸酸開環反應控制在pH為8～13，反應溫度為40～80℃，並可通過加入無機鹽，例如氯化鈉或硫酸鈉作為開環反應促進劑來提高開環反應的轉化率，以提高所合成的螯合介質上的配基濃度。開環反應的母液可循環套用。上述反應過程中的其它過程，勻可參照公知的技術進行。具體地說，本發明的合成方法按下步驟進行1.甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯進行自聚反應合成聚合物；2.纖維素與聚合物進行接枝反應3.加入螯合試劑進行開環反應；4.加入過渡金屬離子(如Cu2+、Zn2+、Fe3+、Ni2+等)溶液進行螯合反應。
在上述1，2反應中，控制反應溫度為50～90℃，自聚反應時間0.5～2小時，接枝反應時間為0.5～2.5小時。反應在去離子水中進行。在反應過程中，為提高聚合產物與纖維素的接枝反應產物上的環氧含量，(甲基)丙烯酸環氧丙酯的用量應當過量，反應物按(重量)纖維素(甲基)丙烯酸環氧丙酯＝1∶2～10加入。同時為加速反應，可加入引發劑以誘發反應，如可採用陰離子聚合反應的引發劑偶氮異丁腈、正丁基鋰或硫代硫酸鈉與過硫酸銨，引發劑的加入量為聚合單體的1～5％。開環反應溫度控制在40～80℃，反應時間可根據所需獲得的配基濃度控制在0.5～8小時。開環反應在弱鹼性介質中進行，pH值控制在8～13。開環物即螯合配基，如亞氨二乙酸(IDA)的加入量應超過聚合接枝後改性纖維素上的環氧基團的量，以1～5∶1為宜。為進一步提高連接到改性纖維素上的螯合配基的濃度，可向反應混合物中加入適量的無機鹽，如氯化鈉，硫酸鈉等，無機鹽的加入重量為纖維素量的1～10％，反應後的母液經過濾後可循環套用，以降低成本。下面通過實例對本發明的合成反應給予進一步的說明。
實例1.亞氨二乙酸型(IDA)金屬螯合介質的製備亞氨二乙酸型金屬螯合介質的合成過程按下述化學反應進行
在上述開環反應3中，開環反應物為亞氨二乙酸(IDA)，反應中以2mol/1的碳酸鈉溶液控制反應混合物的pH＝8～13，反應溫度控制在40～80℃，無機鹽的加入量為反應液總體積的1～5％。實驗過程為，在裝有攪拌器，溫度計及冷凝器的5立升三口燒瓶中加入65克短棉纖維，3000毫升去離子水，攪拌下升溫至80℃，充分攪拌均勻，隨後加入300毫升的甲基丙烯酸環氧丙酯，攪拌10分鐘後，再加入含過硫酸銨和硫代硫酸鈉各10克的混合溶液作引發劑，保溫反應2小時，然後降溫至70℃，加入亞氨二乙酸溶液進行開環反應，並用碳酸鈉溶液調節反應混合物的pH＝8～13，保溫反應1～8小時，停止反應後，用大量去離子水洗至中性，然後用丙酮或乙醇浸泡，洗去改性纖維素表面的殘餘物，再用大量去離子水洗。加入2％(重量/體積)的硫酸銅溶液，攪拌～2小時，過濾，用大量去離子水洗至無銅離子。真空乾燥，所得改性纖維素的接枝率為140％(重量)，用氮元素分析法或原子吸收光譜法測定金屬螯合介質的配基濃度為150μmol/g幹介質。螯合反應4也可以在纖維素介質做成膜以後再進行。
實例2金屬螯合介質的應用將實例1中所製備的IDA型銅離子螯合介質用造紙技術製成紙狀膜，填充到徑向(或軸向)色譜分離柱中，用含1mol/l氯化鈉的0.05mol/l磷酸鹽緩衝液(pH＝7.0)平衡柱子，對牛肝過氧化氫酶粗品溶液(1000U/mg蛋白)上樣進行分離，用含1mol/l氯化鈉的0.01mol/l咪唑洗脫，純化後的牛肝過氧化氫酶的純度提高了7倍，回收率達70％。螯合介質經0.005mol/l EDTA-NaCl再生後，可多次反覆使用，分離性能保持穩定。
由上述實例，採用本發明提供的合成方法可以方便地製備徑向(或軸向)色合成的螯合介質對蛋白質或酶的結合容量大，易於再生，可反覆多次使用。應用該螯合介質填充的徑向(或軸向)色譜柱可對許多表面富有組氨酸、半光氨酸、色氨酸等殘基的蛋白質或酶，例如，血清白蛋白，免疫球蛋白、尿激酶、過氧化物酶等進行選擇性分離純化，不僅處理量大、流速快、保持活性好，而且選擇性較好，純化倍較高。本發明為徑向色譜介質增添了新的種類，所提供的徑向金屬螯合親和膜色譜介質的合成方法是一種很有工業應用前景的生化分離技術。
權利要求
1.一種徑向色譜柱用金屬螯合色譜介質的合成方法，其特徵在於是採用以甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯進行自聚反應得到聚合物，再與纖維素進行接枝反應，然後加入亞氨二乙酸作為螯合配基進行開環反應，最後加入金屬離子溶液進行反應的過程，自聚和接枝反應在水介質中進行，反應溫度為50～90℃。
2.按權利要求1所述的合成方法，其特徵在於反應物甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯的用量應當過量，反應物重量按甲基丙烯酸環氧丙酯或丙烯酸環氧丙酯，纖維素＝2～10∶1比例。
3.按照權利要求1所述的合成方法，其特徵在於反應中加入引發劑，偶氮二異丁腈、正丁基鋰或過硫酸銨與硫代硫酸鈉，引發劑加入量為聚合單體重量的1～5％。
4.按照權利要求1所述的合成方法，其特徵在於螯合配基亞氨二乙酸酸開環反應控制在pH為1～13，反應溫度為40～80℃。並可通過加入無機鹽，例如氯化鈉或硫酸鈉作為開環反應促進劑來提高開環反應的轉化率，以提高所合成的螯合介質上的配基濃度，開環反應的母液可循環套用。
5.按照權利要求4所述的合成方法，其特徵在於螯合配基亞氨二乙酸的加入量應超過聚合按枝後改性纖維素上的環氧基的量，其比值為1～5∶1。
6.按照權利要求1所述的合成方法，其特徵在於開環反應加入無機鹽氯化鈉或硫酸鈉作開環反應促進劑，其加入重量為纖維素量的1～10‰。
7.按照權利要求1所述的合成方法，其特徵在於加入過渡金屬離子Cu2+，Zn2+，Fe3+或Ni2+溶液進行螯合反應。
全文摘要
徑向色譜柱用金屬螯合親和膜色譜介質的合成方法是利用甲基丙燃酸環氧丙酯進行自聚反應製得聚合物後與棉纖維進行接枝反應,然後與亞氨二乙酸進行開環反應,最後過渡金屬離子進行螯合反應。該方法利用的原料便宜易得,反應條件簡單,易控制,製得的螯合介質的結合容量大。應用該介質填充的徑向色譜柱對人血清白蛋白、過氧化氫酶、尿激酶等生物大分子進行分離純化處理,具有處理量大、流速快、純化倍數高、便於線性放大等優點。
文檔編號G01N30/38GK1188681SQ9710505
公開日1998年7月29日 申請日期1997年1月24日 優先權日1997年1月24日
發明者楊利, 賈凌雲, 郭玉夙, 鄒漢法, 張玉奎 申請人:中國科學院大連化學物理研究所