液－固兩相發酵生產飼料用高活性纖維素酶的方法
2023-06-26 10:56:26 4
專利名稱：液－固兩相發酵生產飼料用高活性纖維素酶的方法
技術領域：
本發明涉及一種內切纖維素酶、外切纖維素酶、葡萄糖糖苷酶三類酶酶譜全的高活性纖維素酶的製備方法，可做為飼料專用酶製劑，屬於生物工程技術領域。
背景技術：
農作物秸稈數量巨大，每年各類秸稈有10億噸，至今未能很好的利用，大量秸稈被焚燒，既造成環境汙染，又極大的浪費了資源，因此，尋求秸稈高值生態化利用，是目前急待解決的問題。
作為可再生的生物質資源降解轉化作用的主要酶種，纖維素酶長期受到科技界的高度重視，已開展了深入廣泛的基礎和應用研究。但研究多以降解纖維產糖、發酵生產能源和化工產品為主要目標。由於廉價石油和糧食的競爭，遲遲未能轉入工業化生產。然而，近幾年來，纖維素酶作為工業酶製劑已開始在紡織印染、製漿造紙、飼料加工、洗滌劑等行業中得到廣泛的應用。例如作為酶整理劑，明顯提高了棉麻織物質量，使產品高檔化；用做廢紙脫墨劑，改善了再生漿質量，減少了對環境的汙染；用作飼料添加劑，增進了飼料的可消化性，提高了畜牧業效益等。從而使纖維素酶成為酶製劑工業中發展最快的新酶種之一，同時也有力地推動了上述產業的技術進步和產品的更新換代，產生巨大的經濟效益和社會效益。
絲狀真菌分泌的纖維素酶是包括內切纖維素酶、外切纖維素酶、葡萄糖苷酶等多酶複合物，這多酶的協同，有利於完成纖維素的完全降解。對於飼料用酶，目的在於最大限度的消除飼料原料中的纖維素、半纖維素等抗營養因子的抗營養作用，提高飼料的可消化性，提高飼料利用率。因此，對於飼料纖維素酶的生產，除了開發高效的生產技術外，需要篩選或應用生物技術手段構建高產且內切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖糖苷酶三類酶酶譜全的工程菌株，開發飼料專用的纖維素酶製劑，以滿足飼料生產的需要，最大限度的發揮作用。
由於纖維素酶需經纖維材料誘導而產生，又受葡萄糖等易代謝糖類的阻遏。國外纖維素酶生產主要採用纖維素粉或乳糖等作為碳源，補加蛋白腖、吐溫80等高價輔料，並且採用液體深層發酵的方式生產。液體深層發酵，能耗高，發酵周期長，體積生產效率低，後處理工藝複雜，生產成本很高，並且發酵液易汙染環境。相比之下，固體發酵技術，體積生產效率高，能耗低，後處理工藝簡單，不汙染環境，其難點在於發酵條件難於控制，易汙染。國內已建成的十餘家以固體發酵方式生產纖維素酶的發酵廠家都因技術工藝落後，均處於產酶不穩定、汙染嚴重、生產不正常狀態，不能形成工業化。因此，液固兩相發酵生產纖維素酶的技術急需突破。
發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種液—固兩相發酵生產飼料專用高活性纖維素酶的方法。
本發明利用玉米秸杆、麥秸農作物廢棄物秸稈等廉價原料，利用高產內切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖糖苷酶三類酶酶譜全和高抗代謝物阻遏的木黴工程菌株，應用發酵工程、酶工程和生化工程技術，發酵生產並進一步提取製備高活性、高純度的飼料用纖維素酶，應用於飼料行業，具有優良效果。
本發明的纖維素酶的製備方法步驟如下(1)採用高抗代謝物(葡萄糖)阻遏且內切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖糖苷酶三類酶酶譜全的康寧木黴(Trichoderma koningii V6)為菌株，接種三角瓶液體菌種，以麩皮汁為培養基，液體發酵灌發酵製備生產用液體菌種；(2)以玉米秸粉、小麥秸粉、麩皮為主要原料，配以硫酸銨和水，滅菌，接種康寧木黴(Trichoderma koningii V6)生產用液體菌種，轉入無菌的固體發酵曲池，通無菌風，厚層通風發酵製備纖維素酶發酵培養物；(3)將發酵培養的纖維素酶發酵培養物加水浸泡，過濾，上清液為纖維素酶的提取液；(4)將纖維素酶提取液經濃縮，製得高活性的液體纖維素酶。將濃縮的纖維素酶經噴霧乾燥，即得到高活性的粉狀纖維素酶。
下面對本發明的纖維素酶的製備方法的各步驟具體說明如下(1)生產用液體菌種的製備。
培養基麩皮9～11份、土豆4～6份，水100份，均為重量份，下同。煮沸，過濾，加蛋白腖0.41～0.6份、Na2HPO40.4～0.5份和KH2PO40.03～0.04份，滅菌，冷卻，接種康寧木黴(Trichoderma koningii V6)的二級液體菌種，5～10份，通風攪拌，培養24～36小時，作為生產用液體種子待用。
(2)厚層通風發酵製備纖維素酶製劑培養物。
玉米秸粉和或小麥秸粉60～70份，麩皮30～40份，硫酸銨1～2份，均為重量份，潤水，原料∶水＝1∶2.8～3.0(重量比)，滅菌，冷卻，接種接種步驟(1)的康寧木黴生產用液體菌種5～7份，轉入無菌固體發酵曲池中，通以無菌風，在25～28℃，空氣相對溼度80～85％下發酵，24～30小時翻曲一次，發酵4～5天，即得到纖維素酶的發酵物。所得發酵物纖維素酶活性(CMC酶活性)可達到500～700IU/g幹曲。
(3)纖維素酶的提取上述纖維素酶的發酵培養物按1∶(9～11)的重量比加水浸泡10～13小時，過濾，過濾液即為纖維素酶的提取液。
(4)將上述濾液濃縮至原來體積的2/10～3/10，濃縮液經噴霧乾燥製成高活性纖維素酶粉。酶活性可達到8000～10000IU/g幹品(CMC酶活性)。
最後，經粉碎、質檢、包裝成品。
上述康寧木黴的二級液體菌種製作可按已有技術。本發明提供如下具體操作步驟A.斜面菌種(固體)將土豆去皮洗淨，切成小片，放在水中，土豆∶水＝1∶(3～6)重量比，80±1℃浸泡1小時，或煮沸半小時，用濾布煮沸過濾，濾液加水稀釋至原來的體積。再加糖1～2份，瓊脂1.5～2份，自然pH值，8磅滅菌。劃線接種康寧木黴，28～30℃培養。
B.二級菌種(液體)
培養基配方同斜面，只不加瓊脂，自然pH值，裝瓶，8磅滅菌，接斜面菌種的菌懸液3～5％重量百分比，28～30℃下，搖床培養。
本發明選用的康寧木黴在含8～10％葡糖糖纖維素平板上，仍然具有分泌纖維素酶的能力，並且內切纖維素酶、外切纖維素酶、葡萄糖糖苷酶酶譜全，從而滿足飼料領域的應用要求。
本發明的優良效果在於選用高抗代謝物(葡萄糖)阻遏的高產纖維素酶且內切纖維素酶、外切纖維素酶、葡萄糖糖苷酶酶譜全的木黴工程菌株，利用發酵工程技術、液-固兩相發酵生產纖維素酶，發酵物酶活性可達到500～700IU/g幹曲(CMC酶活)。纖維素酶發酵物經系列生化工程技術，製備高純度的纖維素酶粉，活性可達到8000～10000IU/g乾粉(CMC酶活)。農作物秸杆是儲量巨大的農業廢棄物資源之一，到目前為止，因為沒有有效的資源化利用技術，使得這一資源的利用率很大，每年的大量秸杆被焚燒，不僅浪費了資源，而且對空氣造成了嚴重的汙染，成為我國目前亟待解決的問題。本發明在開發利用秸杆資源的的同時，無三廢排出，避免秸杆焚燒對環境造成的嚴重汙染，是一條農業廢棄物資源化、高值化、生態化利用的有效途徑。
本發明採用抗降解物阻遏且內切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖糖苷酶三類酶酶譜全的木黴工程菌株，可在含廢棄物的可溶性糖的培養基上快速生長，而又不受易代謝糖類對通常菌株所產酶的阻遏作用影響。使用這些工農業廢液廢渣製備培養基既降低了原料成本，又縮短了發酵周期。採用液固兩相發酵技術，在溫、溼氣可控的無菌條件下發酵生產纖維素酶，提高了體積發酵效率，減少了汙染，大大降低了運轉成本。同時，該工程菌株分泌的纖維素酶，內切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖糖苷酶三類酶酶譜全，三類酶的協同作用，可高效消除飼料原料中粗纖維的抗營養作用，從而滿足飼料領域對纖維素酶的要求，最大限度的發揮纖維素酶的作用。
具體實施方式
實施例1康寧木黴的二級液體菌種的製備，具體操作步驟如下A.斜面菌種(固體)將土豆去皮洗淨，切成小片，放在水中，土豆∶水＝1∶4重量比，80℃浸泡1小時，用濾布煮沸過濾，濾液加水稀釋至原來的體積。再加糖2份，瓊脂1.5份，自然pH值，8磅滅菌。劃線接種康寧木黴(Trichoderma koningii V6)菌株，28～30℃培養。
B.二級菌種(液體)培養基配方同斜面，只不加瓊脂，自然pH值，裝瓶，8磅滅菌，接上述斜面菌種的菌懸液4％重量百分比，28～30℃搖床培養。
實施例2纖維素酶的製備(1)生產用液體菌種的製備培養基麩皮10份、土豆5份，水100份，均為重量份，下同。煮沸，過濾，加蛋白腖0.5份、Na2HPO40.45份和KH2PO40.035份，滅菌，冷卻，接種康寧木黴的二級液體菌種6份，通風攪拌，培養30小時，做為生產用液體菌種待用。
康寧木黴的二級液體菌種的製備如實施例1所述。
(2)厚層通風發酵製備纖維素酶製劑培養物原料玉米秸粉25份和小麥秸粉40份，麩皮40份，硫酸銨1份，均為重量份，潤水，原料∶水＝1∶2.8(重量比)，滅菌，冷卻，接種步驟(1)的生產用液體菌種6份(重量)，轉入無菌固體發酵曲池中，通以無菌風，在25～28℃，空氣相對溼度80～85％下發酵，24小時翻曲一次，發酵4天，即得到纖維素酶製劑培養物。
所得發酵物纖維素酶活性(CMC酶活性)700IU/g幹曲。
(3)纖維素酶的提取上述纖維素酶的發酵培養物按1∶10的重量比加水浸泡12小時，過濾，過濾液即為纖維素酶的提取液。
(4)將上述濾液濃縮至原來體積的2/10，濃縮液經噴霧乾燥製成高活性纖維素酶粉。酶活性9500IU/g幹品(CMC酶活性)。
最後經粉碎、質檢、包裝成品。
實施例3纖維素酶的製備如實施例2所述，所不同的是(1)生產用液體菌種的製備培養基麩皮11份、土豆6份，水100份，均為重量份，下同。煮沸，過濾，加蛋白腖0.6份、Na2HPO40.5份和KH2PO40.04份，滅菌，冷卻，接種康寧木黴的二級液體菌種10份，通風攪拌，培養34小時，作為生產用液體菌種待用。
(2)厚層通風發酵製備纖維素酶製劑培養物原料小麥秸粉60份，麩皮35份，硫酸銨2份，均為重量份，潤水，原料∶水＝1∶3.0(重量比)，滅菌，冷卻，接種步驟(1)的生產用液體菌種7份(重量)，轉入無菌固體發酵曲池中，通以無菌風，在25～28℃，空氣相對溼度80～85％下發酵，25小時翻曲一次，發酵4.5天，即得到纖維素酶製劑培養物。所得發酵物纖維素酶活性(CMC酶活性)650IU/g幹曲。
其他同實施例2。
實施例4纖維素酶的製備如實施例2所述，所不同的是步驟(2)厚層通風發酵製備纖維素酶製劑培養物原料玉米秸粉35份和小麥秸粉35份，麩皮30份，硫酸銨2份，均為重量份，潤水，原料∶水＝1∶2.9(重量比)，滅菌，冷卻，接種步驟(1)的生產用液體菌種5.5份(重量)，轉入無菌固體發酵曲池中，通以無菌風，在25～28℃，空氣相對溼度80～85％下發酵，28小時翻曲一次，發酵5天，即得到纖維素酶製劑培養物。所得發酵物纖維素酶活性(CMC酶活性)600IU/g幹曲。
實施例5纖維素酶的製備如實施例2所述，所不同的是步驟(3)纖維素酶的提取是將步驟(2)的纖維素酶製劑培養物按1∶11的重量比加水浸泡11小時，過濾，過濾液即為纖維素酶的提取液。
步驟(4)將上述濾液濃縮至原來體積的3/10，濃縮液經噴霧乾燥製成高活性纖維素酶粉。酶活性8500IU/g幹品(CMC酶活性)。
權利要求
1.纖維素酶的製備方法，步驟如下(1)採用高抗代謝物阻遏且內切纖維素酶、外切纖維素酶和葡萄糖糖苷酶三類酶酶譜全的康寧木黴為菌株，接種三角瓶液體菌種，以麩皮汁為培養基，液體發酵灌發酵製備生產用液體菌種；(2)以玉米秸粉、小麥秸粉、麩皮為主要原料，配以硫酸銨和水，滅菌，接種康寧木黴生產用液體菌種，轉入無菌的固體發酵曲池，通無菌風，厚層通風發酵製備纖維素酶發酵培養物；(3)將發酵培養的纖維素酶發酵培養物加水浸泡，過濾，上清液為纖維素酶的提取液；(4)將纖維素酶提取液經濃縮，製得高活性的液體纖維素酶，將濃縮的纖維素酶經噴霧乾燥，即得到高活性的粉狀纖維素酶。
2.如權利要求1所述的纖維素酶的製備方法，其特徵在於，步驟(1)生產用液體菌種的製備如下培養基麩皮9～11份、土豆4～6份，水100份，均為重量份，煮沸，過濾，加蛋白腖0.41～0.6份、Na2HPO40.4～0.5份和KH2PO40.03～0.04份，均為重量份，滅菌，冷卻，接種康寧木黴的二級液體菌種，5～10份，重量份，通風攪拌，培養24～36小時。
3.如權利要求1所述的纖維素酶的製備方法，其特徵在於，步驟(2)厚層通風發酵製備纖維素酶製劑培養物具體如下玉米秸粉和或小麥秸粉60～70份，麩皮30～40份，硫酸銨1～2份，均為重量份，潤水，原料∶水＝1∶2.8～3.0，重量比，，滅菌，冷卻，接種接種步驟(1)的康寧木黴生產用液體菌種5～7份，重量份，轉入無菌固體發酵曲池中，通以無菌風，在25～28℃，空氣相對溼度80～85％下發酵，24～30小時翻曲一次，發酵4～5天。
4.如權利要求1所述的纖維素酶的製備方法，其特徵在於，步驟(3)中纖維素酶的發酵培養物加水浸泡，是按1∶9～11的重量比加水浸泡10～13小時。
5.如權利要求1所述的纖維素酶的製備方法，其特徵在於，步驟(4)中濾液濃縮至原來體積的2/10～3/10。
全文摘要
液－固兩相發酵生產飼料用高活性纖維素酶的方法，屬於生物工程技術領域。選用高抗代謝物阻遏的高產纖維素酶且內切纖維素酶、外切纖維素酶、葡萄糖糖苷酶酶譜全的康寧木黴工程菌株，利用體發酵工程技術、液－固兩相發酵生產纖維素酶，發酵物酶活性可達到500～700IU/g幹曲，纖維素酶發酵物經系列生化工程技術，製備高純度的纖維素酶粉，活性可達到8000～10000IU/g乾粉。應用於飼料行業。本發明在開發利用秸稈資源的的同時，無三廢排出，避免秸稈焚燒對環境造成的嚴重汙染。
文檔編號C12N1/14GK1648244SQ200410036448
公開日2005年8月3日 申請日期2004年12月7日 優先權日2004年12月7日
發明者張玉忠, 孫彩雲, 陳秀蘭, 劉玉慶, 陳蕾蕾, 宋桂經 申請人:山東大學