呋喃妥因代謝物elisa檢測試劑盒的製作方法
2023-12-08 20:41:31 1
專利名稱：呋喃妥因代謝物elisa檢測試劑盒的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及檢測呋喃妥因代謝物殘留量的試劑盒，特別是檢 測動物源性食品中呋喃妥因代謝物殘留量的酶聯免疫檢測(ELISA)試劑盒，ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbnentAssay)是酶聯免疫吸附劑測定的簡稱，它是繼免疫螢光和放射免 疫技術之後發展起來的一種酶免技術。( 二)背景技術硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動力學的特性，曾經 被廣泛應用，作為禽類、水產和豬促生長的添加劑。但在長時間的實驗研究過程中發現，硝 基呋喃類藥物和代謝物均可以使實驗動物發生癌變和基因突變，正因為如此才導致此類藥 物禁止在治療和飼料中使用。呋喃妥因在1995年被禁用。由於硝基呋喃類藥物在體內很快就能被代謝，而在組織中結合的代謝產物則能存 留較長的一段時間，所以在分析此類藥物的殘留時經常要分析其代謝後的產物，管理部門 就以檢測代謝產物為手段達到檢測硝基呋喃類殘留的目的。呋喃妥因代謝產物AHD ；呋喃 它酮代謝產物AMOZ ；呋喃唑酮代謝產物AOZ ；硝基糠腙(呋喃西林)代謝產物SEM。用來檢測呋喃妥因代謝物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶聯免疫 方法結合了色譜技術，採用AHD衍生物的特異性抗體，具有很高的精確度和靈敏度，較低的 操作技術要求和短暫的檢測時間，檢測樣本量大等特點在檢測中很好的表現出來。(三)實用新型內容本實用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的呋喃妥 因代謝物殘留量檢測試劑盒，其操作簡便，檢測快速、準確、靈敏度高，成本低，穩定性好，需 要的技術含量不高，可進行一次連續多個樣品中呋喃妥因代謝物殘留量的測定，減少了檢 測樣本所需要的時間。本實用新型的技術方案是一種呋喃妥因代謝物ELISA檢測試劑盒，包括盒體和 盒內的一塊96孔的酶標板、一張蓋板膜、15瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋、一份 說明書和一份質檢報告，其特徵在於酶標板採用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微 孔條上預包被呋喃妥因代謝物偶聯抗原製成的檢測板，15瓶試劑分別為-J瓶標準品溶液、 酶標二抗、抗體濃縮液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液，下凹瓶 位共15個。酶標板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆 裝酶標反應微孔條有8個反應孔，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，下凹瓶位由塑料泡沫 製成，以塑料硬膜為蓋板膜，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致，將15瓶試劑用不同大 小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝並固定在下凹瓶位中與酶標板、蓋板膜、自封袋、說明 書、質控報告一同封裝在硬紙盒內，以便攜帶和運輸。15瓶試劑分別為7瓶Iml梯度濃度的 標準品溶液、12ml酶標二抗、Iml抗體濃縮液、7ml顯色液A液、7ml顯色液B液、7ml終止液、 40ml濃縮洗滌液、50ml濃縮復溶液、15. Img2_硝基苯甲醛。每一個試劑盒中的試劑足夠進 行96次測定(包括標準分析孔)，既可進行一次連續多個樣品的檢測，也可以將板孔拆開 多次檢測。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測結果的準確性。 檢測時，樣本中的呋喃妥因代謝物將和酶標板微孔條上預包被的呋喃妥因代謝物偶聯抗原 競爭抗呋喃妥因代謝物抗體，加入酶標二抗後，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含呋喃妥因代謝物的殘留量成負相關，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得 出樣品中呋喃妥因代謝物殘留量，其操作簡便易行。經實驗表明本試劑盒具有很高的靈敏度，為0. 1 μ g/kg 組織、蜂蜜、牛奶樣本檢 測下限為0. 2μ g/kg、蝦、魚等水產組織樣本檢測限為0. 3μ g/kg ；水產、肌肉、肝臟組織 樣本的回收率為75% 士 15% ；蜂蜜樣本的回收率為90% 士 15% ；奶樣的回收率為90% 士 10%。相對於其他呋喃妥因代謝物檢測方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標儀、氮 氣吹乾裝置、渦旋儀、離心機、振蕩機和微量加樣器等，同類實驗室一般均有配備，所需成本 較低。本實用新型的有益效果是能快速、簡便、靈敏、準確地用於呋喃妥因代謝物殘留量的檢測。
圖1為本實用新型酶聯板的側面縱剖面圖(長為8. 55cm)；圖2為本實用新型酶聯板的側面橫剖面圖(長為12. 8cm)；圖3為本實用新型酶聯板的俯視圖；圖4為本實用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實用新型盒體與固定泡沫模具的側視圖。參見附圖酶標反應微孔條(2)預包被呋喃妥因代謝物偶聯抗原(3)固定於酶標 板的外框支撐架(1)上，酶標反應微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用於酶標板置水浴 或恆溫箱內反應時封蓋酶標反應微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標板橫切面大小一致；透明 帽的半透明PE塑料瓶(5)用於封裝40ml濃縮洗滌液；藍色帽的半透明PE塑料瓶(5)用 於封裝50ml濃縮復溶液；白色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用於封裝7ml顯色液A液，紅色 帽(6)的黑色PE塑料瓶(7)用於封裝7ml顯色液B液，黃色帽(6)的白色PE塑料瓶(7) 用於封裝7ml終止液，紅色帽的白色PE塑料瓶(8)用於封裝12ml酶標二抗，綠色帽的白色 PE塑料瓶(8)用於封裝7ml呋喃妥因代謝物抗體工作液，白色帽的棕色玻璃試劑瓶(9)用 於封裝Iml/瓶的標準品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個瓶位，放置位置依次為40ml濃 縮洗滌液瓶位(18)，50ml濃縮復溶液(11)，7ml顯色液A液瓶位(14)，7ml顯色液B液瓶位 (13)，7ml終止液瓶位(12)，Iml呋喃妥因代謝物抗體濃縮液瓶位(16)，12ml酶標二抗瓶位 (15)，7個Iml/瓶各種濃度的標準品溶液和；15. Img 2-硝基苯甲醛瓶位(17)，盒體為(19) 是硬紙盒。
具體實施方式
樣本的前處理1.配液配液1 衍生化試劑向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至IOml (濃度為IOmM)。配液2 :C液0. 36M亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe (CN) 5 · NO · 2H20)溶液稱取12. 5g水合亞硝基鐵氰化鈉加去離子水定容至100ml。D液(供奶樣專用)IM硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20)溶液稱取29. 8g硫酸鋅用去離子水定容至100ml。配液3 :0. IM磷酸氫二鉀溶液稱取22. 8g三水合磷酸氫二鉀加去離子水定容至1L。配液4: IM鹽酸溶液量取8. 3ml濃鹽酸加去離子水定容至IOOml。配液5: IM氫氧化鈉稱取4. Og氫氧化鈉加去離子水定容至IOOml。配液6:甲醇-水溶液量取甲醇90ml加去離子水IOml混勻。配液7:復溶工作液用去離子水將2X濃縮復溶液按1 1體積比進行稀釋(1份2X濃縮復溶液+1 份去離子水)用於提取樣本的復溶，復溶工作液在4°C環境可保存一個月。配液8 洗滌工作液用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 19體積比進行稀釋(1份20X濃縮洗滌液 +19份去離子水)用於酶標板的洗滌，洗滌工作液在4°C環境可保存一個月。2、肌肉、肝臟、水產(魚蝦等)組織前處理方法用均質器均質樣本，取1. 0士0. 05g的均質物至50ml聚苯乙烯離心管中；加入5ml 甲醇-水溶液，用振蕩器振蕩5min，3000g以上離心lOmin，去除全部上清液；(本步驟可 降低樣本基質幹擾)加入細1的去離子水，用渦旋儀渦動溶解，加入0. 5ml IM鹽酸溶液和 100 μ 1衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩；接( 描述方法(標*處)。注樣本應當保存在 陰涼避光之處及冷藏保存。3、牛奶前處理方法取牛奶樣本，3000g以上，10°C離心lOmin，吸除上層脂肪；取出5ml去除脂肪牛奶 樣本至IOml玻璃離心管中；分別加入250 μ 1 C液和250μ1 D液；用振蕩器充分振蕩混合， 3000g以上，4-12°C (39- ° F)離心lOmin。如果沒有恆溫離心機，則先將樣本降溫至大約 8°C (46° F)，然後離心；取牛奶的離心上清液l.lml(相當於Iml奶樣)，分別加入細1的 去離子水用振蕩器振蕩溶解，0. 5ml IM鹽酸和100 μ 1衍生化試劑，充分振蕩aiiin ；接(5) 描述方法(標*處)。4、蜂蜜前處理方法稱取1.0士0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；加入細1的去離子水，用振蕩 器振蕩至蜂蜜全部溶解；0. 5ml IM鹽酸溶液和100 μ 1衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩；接 (5)描述方法(標*處)。5、接上面的方法*在37 °C過夜孵育(大約16h)；分別加入5ml 0. IM磷酸氫二鉀溶液、 0. ^illM氫氧化鈉溶液和5ml的乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s ；3000g以上，室溫 (20-250C/68-77° F)離心IOmin ；取2. 5ml乙酸乙酯相至IOml乾燥的玻璃試管中，於50 60°C氮氣流下吹乾；用Iml的正己烷(或正庚烷)用渦旋儀渦動30s，再加入Iml復溶工作液，用渦旋儀渦動Imin充分混勻；3000g以上，室溫O0_25°C /68-77° F)離心IOmin ；除去 上層有機相，取下層水相50 μ 1用於分析。二、使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環境中取出，置於室溫Q0-25°C )平衡30min以上，注意每種 液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存於2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，並記 錄標準孔和樣本孔所在的位置。5、加標準品工作液/樣本溶液加標準品工作液/樣本溶液50 μ 1到對應的微孔 中，再加入抗體工作液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置於25°C避光環境中反 應 30min。6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩幹，用洗滌工作液250 μ 1/孔，充分洗滌 4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍幹(拍幹後未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。7、加酶標二抗加入酶標二抗100 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置25°C 避光環境中反應30min，取出重複洗板步驟6。8、顯色加入底物液A液50 μ 1/孔，再加底物液B液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻， 用蓋板膜蓋板後置25°C避光環境中反應15min。9、測定加入終止液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀於450nm處(建議用雙 波長450/630nm檢測，請在5min內讀完數據)，測定每孔OD值。(若無酶標儀，則不加終止 液用目測法可進行判定)。三、結果判定結果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣 本吸光值與呋喃妥因代謝物含量成負相關。1、用樣本的平均吸光度值與標準值比較即可得出其濃度範圍(yg/L)。例如樣 本1的吸光度值為0. 236，樣本2的吸光度值為0. 666，標準品吸光度值分別是0 μ g/L 為 1. 949 ；0. 1 μ g/L 為 1. 434 ；0. 3 μ g/L 為· 939 ；0. 9 μ g/L 為 0. 487 ；2. 7 μ g/L 為 0. 157 ； 8. 1 μ g/L為0. 060。則樣本1的濃度範圍是0. 9 μ g/L-2. 7 μ g/L再乘以其對應的稀釋倍數 即可得出樣本中呋喃妥因代謝物殘留的濃度範圍#本2的濃度範圍是0. 3 μ g/L-0. 9 μ g/ L再乘以其對應的稀釋倍數即可得出樣本中呋喃妥因代謝物殘留的濃度範圍。2、定量分析(1)百分吸光率的計算，標準品或樣本的百分吸光率等於標準品或樣本的百分吸 光度值的平均值(雙孔)除以第一個標準(0標準)的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) = - X 100%
B0B-標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值BO-O μ g/L標準溶液的平均吸光度值(2)標準曲線的繪製與計算[0064]以標準品百分吸光率為縱坐標，以呋喃妥因代謝物標準品濃度(μ g/L)的半對數 為橫坐標，繪製標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本 所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中呋喃妥因代謝物實際含量。四、測定前的注意事項1、室溫低於20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20-25°C )會導致所有標準的OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現板孔乾燥的情況，則會出現標準曲線不成線性，重複性 不好的現象。所以洗板拍幹後應立即進行下一步操作。3、每加一種試劑前需將其搖勻。4、反應終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試 齊U，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中 的試劑。6、儲存條件保存試劑盒於2_8°C，不要冷凍，將不用的酶標板微孔板放進自封袋重新密封。標 準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質的跡象發色試劑有任何顏色表明發色劑變質，應當棄之。0標準的吸光度(450/630nm)值 小於0. 5(A450nm < 0. 5)時，表示試劑可能變質。8、在加入底物液A液和底物液B液後，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可 延長反應時間到20min(或更長)，但不得超過30min。反之，則減短反應時間。9、該試劑盒最佳反應溫度為25°C，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度 發生變化。
權利要求1.一種呋喃妥因代謝物ELISA檢測試劑盒，包括盒體和盒內的一塊96孔的酶標板、一 張蓋板膜、15瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個自封袋、一份說明書和一份質檢報告，其特 徵在於酶標板是採用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預包被呋喃妥因代謝 物偶聯抗原製成的檢測板，15瓶試劑分別為-J瓶標準品溶液、酶標二抗、抗體濃縮液、顯色 液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液，下凹瓶位共15個。
2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標 板，放於真空鋁箔袋內；蓋板膜是塑料硬膜；標準品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶，酶標二抗 用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A液用白色帽的 白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶， 濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復溶液用藍色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶 位由塑料泡沫製成。
3.根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於酶標板是由外框支撐架及放置其上的 可拆的12條酶標反應微孔條組成，每個可拆裝酶標反應微孔條有8個反應孔；蓋板膜大小 與酶標板橫切面大小一致；標準品溶液7瓶，Iml/瓶；酶標二抗1瓶，12ml ；抗體濃縮液1 瓶，Iml ；顯色液A液1瓶，7ml ；顯色液B液1瓶，7ml ；終止液1瓶，7ml ；濃縮洗滌液1瓶， 40ml ；濃縮復溶液1瓶，50ml ；2-硝基苯甲醛1瓶，15. Imgo
專利摘要本實用新型涉及一種檢測動物源性食品中呋喃妥因代謝物殘留量的酶聯免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標板、酶標二抗、呋喃妥因代謝物抗體濃縮液、7個濃度的標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復溶液、蓋板膜、自封袋、說明書和質檢報告。採用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被偶聯抗原，樣本中含有的呋喃妥因代謝物將和微孔條上預包被的偶聯抗原競爭抗呋喃妥因代謝物抗體，加入酶標二抗後，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數，即可得出樣品中呋喃妥因代謝物的殘留量。與儀器分析技術相比具有使用方便、高靈敏度等特點，可在動物源性食品中呋喃妥因代謝物的殘留量檢測中發揮重要作用。
文檔編號G01J3/42GK201852833SQ201020586580
公開日2011年6月1日 申請日期2010年10月27日 優先權日2010年10月27日
發明者何麗霞, 何方洋, 餘厚美, 劉福林, 段盈盈, 王建霞, 蒲小容 申請人:北京勤邦生物技術有限公司