植物病毒表達載體及其用於在植物基因組中產生遺傳型變異的用途的製作方法

2023-12-09 09:31:11 1

專利名稱：植物病毒表達載體及其用於在植物基因組中產生遺傳型變異的用途的製作方法
植物病毒表達載體及其用於在植物基因組中產生遺傳型變
異的用途發明的領域和背景本發明在其一些實施方案中涉及植物病毒表達載體，並且更特別但非排它地，涉 及該病毒表達載體用於在植物基因組中產生遺傳型變異的用途。作物的遺傳修飾和改進以及新品種的保護是現代農業的基礎。在過去的若干年 中，從各種大基因組測序工程中獲得了巨量的數據，這使得在農業轉基因技術中產生顯著 的進步。此類技術包括植物基因組序列的基因表達、基因修飾、位點特異性基因誘變和基因 打靶，這發展了基礎植物研究模式並且可直接用於農業上重要的植物物種的遺傳改良和保 護。將源自土壤桿菌(Agrobacterium)的外源DNA分子(例如，T-DNA)整合至植物基 因組中，整合入可通過稀有切割限制性酶產生的天然雙鏈斷裂處(DSB)。這些DSB可通過 植物非同源末端接合(NHEJ)蛋白識別並修復，並且導致了外源DNA頻繁地整合到這些隨機 位點中[Salomon 等，EMBO J(1998) 17 :6086-6095 Jzfira 等，Plant Physiol (2003) 133 1011-1023，Tzfira 等，Trends Genet (2004) 20 :375-383] DSB 還可以導致經改進的在植 物細胞中基於同源重組(HR)的基因打靶[Puchta等，Proc Natl Acad Sci USA(1996) 93 5055-5060]。在鋅指核酸酶(ZFN)作為用於基因組修飾的新工具的領域的最新進展給植物基 因組中DSB的位點特異性誘導和用於植物物種基因打靶及植物保護的基於NHEJ的方法的 發展帶來了新的希望。ZFN是合成的限制性酶，可將其特異地設計為結合併切割dsDNA序列 的幾乎任意的長片段(參見

圖1)。ZFN顯示適於應用非病毒載體在植物物種中位點特異性 地誘導基因組 DSB [Lloyd 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. (2005) 102 :2232-2237 ；Tovkach 等，The Plant Journal (2009) 57,747-757] 在人類[Moehle 等，Proc Natl Acad Sci USA (2007) 104 :3055-3060]和昆蟲基因組[Beumer 等，Genetics (2006) 172 :2391-2403]中 也顯示了類似的效果。植物病毒作為載體以在植物中引入並表達非病毒基因的用途已得到了很好的證 實[例如，Donson 等，Proc Natl Acad Sci USA. (1991)88 :7204-8 ； Chapman 等，Plant J. (1992) 2 :549-57 ；Dolja 等，Virology (1998) 252 :269-74]。用經修飾的病毒感染植 物比再生穩定轉化的植物(如上所述)更簡單且更快，因為植物病毒通常很小(3000至 10，000核苷酸之間)，容易操作，具有進入植物細胞的固有能力，導致異源基因的迅速表達 並且將增殖以產生高拷貝量的目標基因。已改造了病毒載體以用於遞送遺傳材料並在植 物中表達重組蛋白[例如，Pogue, Annu. Rev. Phytopathol. (200 40 :45-74 ;Gleba，等， Curr. Opin. Plant Biol. (2004)7 :182-188 ；Dolja 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89 10208-10212 ；RNA病毒載體的US專利號5316931和US專利號5811653]。病毒表達系統被 認為是瞬時表達系統，因為病毒載體不整合至宿主基因組中，然而，取決於使用何種病毒， 病毒複製和基因表達可維持很長的時間(長達數周或數月)。至今，沒有記載或建議病毒載體用於在植物基因組中引入DSB的用途。
相關技術美國專利7，229，829號公開了攜帶用於遞送至植物中的異源核酸序列的TRV載體 (TRV-RNA1和TRV-RNA2)，其用於轉化植物和植物細胞。具體地，美國專利7，229，829號教 導了誘導基因沉默的病毒(VKS)的載體，包括設計用於抑制宿主植物基因表達(例如，用 於敲除基因表達而不需要遺傳轉化該植物的反義轉錄物)的載體，或設計用於表達異源核 酸(例如，介導基因沉默或基因抑制的核酸)的載體。美國
發明者A·朱克, A·瓦因斯坦 申請人:丹齊格創新有限公司, 耶路撒冷希伯來大學伊森姆研究發展公司