一種文心蘭病毒檢測引物及方法

2023-12-09 06:38:06 3

一種文心蘭病毒檢測引物及方法
【專利摘要】本發明根據建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列，分別設計合成了三對相應的特異性引物；並同時公開了利用該三對特異性引物同時對文心蘭葉片中的建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒和菜豆黃花葉病毒進行檢測的方法。本發明建立了一種通過一次反應就能同時檢測出3種文心蘭病毒即建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒和菜豆黃花葉病毒的檢測方法，具有檢測效率高、所需成本低的特點，且即使樣本中3種文心蘭病毒的RNA含量很低，本發明也能檢測出來，因而本發明具有很高的檢測靈敏度。
【專利說明】-種文心蘭病毒檢測引物及方法 【【技術領域】】
[0001] 本發明涉及生物學領域的一種植物病毒檢測引物及方法，具體涉及一種文心蘭病 毒檢測引物及方法。 【【背景技術】】
[0002] 建蘭花葉病毒（Cymbidium mosaic virus，CyMV)、齒蘭環斑病毒（Odontoglossum ringspot virus，0RSV)和菜豆黃花葉病毒（Bean yellow mosaic virus，BYMV)是危害文 心蘭的三種主要病毒。
[0003] 文心蘭（Oncidium)花形優美，花期長，是目前極具競爭力和發展潛力的一種高經 濟價值的花卉。但病毒病的危害嚴重影響其觀賞和利用價值，使植株表現出花葉、壞死、畸 形、花瓣變色、花穗短小以及花期縮短等症狀，使其品質嚴重下降，已成為制約文心蘭產業 發展的主要限制因素。目前國際上還沒有防治植物病毒病的有效藥劑，因此，有針對性地進 行隔離檢疫、銷毀病株，或培育無毒種苗等，是防控病毒病的重要措施。而這些都需要對種 苗及植株進行病毒檢測，建立快速有效地檢測方法顯得尤為重要。
[0004] 目前，文心蘭病毒檢測大多採用基於抗血清的酶聯免疫吸附技術（即ELISA方 法），但抗血清不僅價格較高、一種抗血清只能檢測一種病毒、檢測程序繁瑣，而且還存在一 定程度的假陽性反應、檢測靈敏性相對較低等問題。近年來，為了提高病毒檢測效率，基於 PCR技術的病毒檢測技術正在迅速發展，但單重PCR檢測技術，一個反應只能檢測一種病 毒，若應用于田間多種病毒複合侵染的文心蘭病毒的檢測，則存在著耗時、耗力、費用高的 問題；有鑑於此，近年來，國內外研究者逐步將多重RT-PCR技術運用到植物病毒檢測，與單 重PCR檢測方法相比，多重PCR檢測技術具有在一個mRT-PCR反應中可同時檢測多種病毒， 操作更為簡單，縮短了檢測時間與降低了實驗成本等優點。但是，目前尚未發現採用多重 PCR檢測技術同時檢測文心蘭葉片中的CyMV、ORSV和BYMV的相關文獻報導。 【
【發明內容】
】
[0005] 本發明所要解決的技術問題在於提供一種文心蘭病毒檢測引物，並同時揭露了利 用所述檢測引物檢測文心蘭三種相應病毒的檢測方法。
[0006] 本發明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：一種文心蘭病毒檢測引物，其 具體包括如下三個引物對：
[0007] 建蘭花葉病毒引物對：正向引物5' -GAAATCAAGGCCATAACCCA-3'，反向引物 5'-CCACACGCCTTATTAAGTTTG-3' ；
[0008] 齒蘭環斑病毒引物對：正向引物5' -CTGATGTTTGGCAGCCGGTT-3'，反向引物 5'-GAAGAGGTCCAAGTAAGTCCAG-3' ；
[0009] 菜豆黃花葉病毒引物對：正向引物5' -AATGTTGGAACAGACGAGGAGA-3'，反向引物 5,-ACCCTGTCAGAGTAGAGAGAATGA-3,。
[0010] 進一步地，所述建蘭花葉病毒引物對對建蘭花葉病毒PCR擴增出571bp的產物；所 述齒蘭環斑病毒引物對對齒蘭環斑病毒PCR擴增出325bp的產物；所述菜豆黃花葉病毒引 物對對菜豆黃花葉病毒PCR擴增出212bp的產物。
[0011] 進一步地，利用上述三個引物對對文心蘭病毒進行檢測，其檢測方法如下：根據建 蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒及菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列分別 設計合成出如權利要求1中所述建蘭花葉病毒引物對、齒蘭環斑病毒引物對、菜豆黃花葉 病毒引物對；然後建立mRT-PCR檢測體系，並利用建蘭花葉病毒引物對對文心蘭葉片中的 建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒引物對對文心蘭葉片中的齒蘭環斑病毒、菜豆黃花葉病毒引 物對對文心蘭葉片中的菜豆黃花葉病毒進行mRT-PCR反應，最後將反應產物進行1 %瓊脂 糖凝膠電泳分析和克隆測序比對。
[0012] 進一步地，所述mRT-PCR反應的反應體系和反應程序如下：
[0013] 反應體系：反應體系的總體積為25 μ L，含有0· 15 μ L5U/ μ L的Taq酶、2. 5 μ L的 IOXTaq 酶 buffer、2 μ L2. 5mmol/L 的 dNTPs、1 μ L 模板、0· 2 μ L 濃度為 10 μ mol/L 的建蘭 花葉病毒正向引物、〇. 2yL濃度為lOymol/L的建蘭花葉病毒反向引物、0.8yL濃度為 10 μ mol/L的齒蘭環斑病毒引物正向引物、0· 8 μ L濃度為10 μ mol/L的齒蘭環斑病毒反向 引物、0· 8 μ L濃度為10 μ mol/L的菜豆黃花葉病毒正向引物、0· 8 μ L濃度為10 μ mol/L的 菜豆黃花葉病毒反向引物，其餘成分為滅菌雙蒸水；
[0014] 反應程序：94°C預變性5min ;94°C變性30s，48-60°C退火30s，72°C延伸45s，循環 35次；72°C延伸IOmin ;4°C終止反應。
[0015] 需要說明的是，反應體系中，每對引物對中的正向引物和反向引物的濃度均相等。
[0016] 本發明的有益效果在於：
[0017] 針對建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的 核苷酸序列，分別設計合成了三對相應的特異性引物，並利用該三對特異性引物同時對文 心蘭葉片中的建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒和菜豆黃花葉病毒進行mRT-PCR反應，建立了 一種通過一次反應就能同時檢測出3種文心蘭病毒即建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒和菜豆 黃花葉病毒的檢測方法，不僅具有檢測效率高、所需成本低的特點，且即使樣本中3種文心 蘭病毒的RNA含量很低，本發明也能檢測出來，即本發明檢測方法具有很高的檢測靈敏度。 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0018] 下面參照附圖結合實施例對本發明作進一步的描述。
[0019] 圖1為本發明中實施例一的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0020] 圖2為本發明中實施例二的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0021] 圖3為本發明中實施例三的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。 【【具體實施方式】】
[0022] 本發明列舉了以下幾個代表性實施例，這些實施例僅是示例性的，且不用於限制 本發明的範圍，這些實施例僅用於說明本發明的實施方法。
[0023] 實施例一
[0024] 本發明一種文心蘭病毒的檢測方法，根據建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒和菜豆黃 花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的保守核苷酸序列分別設計合成了建蘭花葉病毒引物 對、齒蘭環斑病毒引物對及菜豆黃花葉病毒引物對，然後建立mRT-PCR檢測體系，並利用建 蘭花葉病毒引物對對文心蘭葉片中的建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒引物對對文心蘭葉片中 的齒蘭環斑病毒、菜豆黃花葉病毒引物對對文心蘭葉片中的菜豆黃花葉病毒進行mRT-PCR 反應，最後將反應產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳分析和克隆測序比對。
[0025] 其中，各引物對具體為：（1)建蘭花葉病毒引物對（如SEQ ID NO :1、2所示）：正 向引物 5' -GAAATCAAGGCCATAACCCA-3'，反向引物 5' -CCACACGCCTTATTAAGTTTG-3' ；（2)齒 蘭環斑病毒引物對（如SEQ ID N0:3、4所示）：正向引物5'-CTGATGTTTGGCAGCCGGTT-3'， 反向引物5'-GAAGAGGTCCAAGTAAGTCCAG-3' ；（3)菜豆黃花葉病毒引物對（如 SEQ ID N0:5、6 所示）：正向弓丨物 5'-AATGTTGGAACAGACGAGGAGA-3'，反向弓丨物 5,-ACCCTGTCAGAGTAGAGAGAATGA-3,。
[0026] 另外， 申請人:為方便描述，以下可將建蘭花葉病毒簡稱為CyMV，齒蘭環斑病毒簡稱 為0RSV，菜豆黃花葉病毒簡稱為BYMV。且本發明文心蘭病毒檢測方法的具體操作步驟如 下：
[0027] 步驟100 :根據建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒和菜豆黃花葉病毒三種病毒的外殼 蛋白基因核苷酸序列，並應用Primer5. 0引物設計軟體設計出三對特異性引物（即所述建 蘭花葉病毒引物對、齒蘭環斑病毒引物對及菜豆黃花葉病毒引物對），再用DNAman軟體對 所設計的三對特異性引物進行校正，證實三對引物間不存在自身匹配和競爭性擴增，以確 保上述三種病毒能擴增出差異明顯的特異性片段，且由上海生工生物工程有限公司合成上 述三對特異性引物。
[0028] 步驟200 :RNA提取：將同時被CyMV、0RSV和BYMV三種病毒複合侵染的文心蘭葉片 〇. 2g、健康葉片0. 2g分別進行RNA提取，並以健康葉片為陰性對照。RNA提取採用Trizol 法：0. 2g文心蘭帶病毒葉片或健康葉片放入研缽中，加入液氮研磨成粉狀；接著將粉狀葉 片置於第一離心管中，再加入ImL Trizol並劇烈震蕩20?30S，然後將第一離心管置於室 溫下靜置5min以使葉片充分裂解，接著將第一離心管於IOOOOrpm下離心5min，將上清液移 至第二離心管中；往第二離心管中加入200uL氯仿，並振蕩混勻，於室溫下放置3min，接著 在4°C、IOOOOrpm下離心15min，然後吸取上層水相至第三離心管中；往第三離心管中加入 0. 5mL異丙醇混勻，並於室溫下放置lOmin，接著將第三離心管於4°C、IOOOOrpm條件下離心 lOmin，並棄去上清液，則RNA沉於管底；之後加 lmL75 %乙醇（DEPC處理水配製）於第三離 心管中並溫和振蕩第三離心管，得到懸浮液，再於4°C、IOOOOrpm條件下離心5min，並棄去 上清液，然後將第三離心管置於冰上晾乾lOmin，最後用30uL DEPC處理水溶解RNA樣品。
[0029] 步驟300 :反轉錄cDNA :將經步驟200處理所得的RNA反轉錄成cDNA，具體內容為： 將反應管置於冰上，加入 IuL Primer 01igo(dt)、luL dNTP 混合物（10mmol/L)、4uL DEPC 處理水、4uL RNA樣品至反應管中，輕輕混勻再進行稍微離心，接著將反應管置於65°C水浴 中加熱5min後，立即將反應管置於冰上5min，接著將反應管稍微離心後再將反應管置於冰 上，並加入4uL5 X反轉錄酶緩衝液、0. 5uL20U/uL的RNAase抑制劑、luL200U/uL反轉錄酶、 4. 5uL DEPC處理水至反應管中，然後將反應管置於42°C水浴中加熱60min,再將反應管置 於70°C下熱擊IOmin,最後終止反應。
[0030] 步驟400 :PCR擴增：以經步驟300處理所得的cDNA為模板，並以步驟100中獲得 的三對引物為引物對同時進行PCR擴增反應，得到PCR擴增產物。
[0031] 為了進行對比，本實施例同時進行了單重PCR擴增反應和多重PCR擴增反應，其 中，單重PCR擴增反應和多重PCR擴增反應的反應程序一致而反應體系不同。PCR擴增反應 的反應體系和反應程序具體內容如下：
[0032] 單重PCR反應體系：反應體系的總體積為25 μ L，包括0. 15 μ L5U/ μ L的Taq酶、 2· 5μ L 的 IOXTaq 酶 buffer、2y L2. 5mmol/L 的 dNTPs、l μ L 模板、1 μ LlOymol/LCyMV 或 ORSV或BYMV的正向引物、1 μ LlOy mol/L CyMV或ORSV或BYMV的反向引物，其餘成分為滅 菌雙蒸水。
[0033] 多重PCR反應體系：反應體系的總體積為25 μ L，含有0. 15 μ L5U/ μ L的Taq酶、 2. 5μ 10 X Taq SI buffer, 2 μ L2. 5mmol/L ^ dNTPsU μ L 2 μ L IOymol/ L的建蘭花葉病毒正向引物、0. 2 μ L濃度為10 μ mol/L的建蘭花葉病毒反向引物、0. 8 μ L濃 度為10 μ mol/L的齒蘭環斑病毒引物正向引物、0· 8 μ L濃度為10 μ mol/L的齒蘭環斑病毒 反向引物、〇· 8 μ L濃度為10 μ mol/L的菜豆黃花葉病毒正向引物、0· 8 μ L濃度為10 μ mol/ L的菜豆黃花葉病毒反向引物，其餘成分為滅菌雙蒸水。
[0034] PCR反應程序：94°C預變性5min、94°C變性30s、52°C退火30s、72°C延伸45s，循環 35次；72°C延伸IOmin ;4°C終止反應。
[0035] 步驟500 :取5 μ L PCR產物以1 %瓊脂糖凝膠（螢光染料）為電泳支持介質，在 0. 5 X TBE和130V電壓下電泳35min，然後在0. 5 μ g/mL溴化乙錠染色液中染色8min，用紫 外透射儀觀察，具體實驗結果見圖1。
[0036] 本實施例1 %瓊脂糖凝膠電泳實驗結果如圖1所示，CyMV引物對的單重PCR擴增 反應結果如圖1中的標識1所示，ORSV引物對的單重PCR擴增反應結果如圖1中的標識2 所示，BYMV引物對的單重PCR擴增反應結果如圖1中的標識3所示，由CyMV引物對、ORSV 引物對、BYMV引物對的三對引物參與的多重PCR擴增反應結果如圖1中的標識4所示，健 康葉片的單重PCR擴增反應結果如圖1中的標識5所示。由圖1可知，CyMV引物對的單重 PCR擴增反應得到擴增片段長度為571bp的條帶，ORSV引物對的單重PCR擴增反應得到擴 增片段長度為325bp的條帶，BYMV引物對的單重PCR擴增反應得到擴增片段長度為212bp 的條帶，由CyMV引物對、ORSV引物對、BYMV引物對三對引物參與的多重PCR擴增反應，可同 時得到擴增片段長度571bp、325bp和212bp的三條明亮清晰的條帶，可見，本發明可以一次 性同時檢測出球根鳶尾的CyMV、0RSV、BYMV三種病毒，且特異性好、檢測效率高。
[0037] 實施例二
[0038] 將實施例一步驟400中的多重PCR反應體系得到的PCR擴增產物經割膠回收，然 後分別與PMD18-T simple vector進行體外連接，再挑取陽性克隆，最後提取質粒測序，以 檢查CyMV、ORSV和BYMV三種病毒的擴增結果。
[0039] 且測序結果為：CyMV、0RSV和BYMV的擴增產物分別是由571、325和212個核苷酸 組成的序列，其中所述CyMV擴增產物序列如SEQ ID NO :7所示，所述ORSV擴增產物序列如 SEQ ID NO :8所示，所述BYMV擴增產物序列如SEQ ID NO :9所示。用NCBI分析同源性結果 表明，所得的擴增產物序列SEQ ID NO :7與參考序列即CyMV的外殼蛋白基因序列的同源率 達到99%，序列SEQ ID NO :8與參考序列ORSV的外殼蛋白基因序列的同源率達到100%，序 列SEQ ID NO :9與參考序列BYMV的外殼蛋白基因序列的同源率達到100%。由此可見，所 得的擴增產物 SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :8 和 SEQ ID NO :9 序列分別為 CyMV、ORSV 和 BYMV 的外殼蛋白基因的部分序列，從而證明了本發明檢測方法結果的可靠性。
[0040] 此外，為了考察本發明球根鳶尾病毒的檢測方法的靈敏度， 申請人:對實施例一 步驟200中的RNA樣品進行10'10'10'10'1〇4-系列的梯度稀釋，然後經過多重 mRT-PCR擴增反應，再進行1 %瓊脂糖凝膠電泳實驗，具體結果如圖2所示。由圖2可知， CyMV、0RSV和BYMV三種病毒在樣品濃度稀釋100倍後均仍能擴增出特異條帶，由此可見本 發明具有很高的靈敏度。
[0041] 實施例三
[0042] 多重mRT-PCR同時檢測CyMV、ORSV和BYMV的應用：
[0043] 步驟1 :取樣地點為福建省農科院花卉研究中心種質資源圃。隨機選取8個大田 中有帶毒症狀的文心蘭葉片樣品，且8個文心蘭葉片樣品均為0. 2g ;接著對各樣品進行RNA 提取（操作同實施例一的步驟200)，並將RNA反轉錄成cDNA (操作同實施例一的步驟300)。
[0044] 步驟2 :以處理所得的cDNA為模板，並以本發明所述的三對引物為引物對同時進 行單重與多重mRT-PCR擴增反應，且具體步驟同實施例一的步驟400。
[0045] 步驟3 :取5μ L PCR產物以1 %瓊脂糖凝膠（螢光染料）為電泳支持介質，在 0· 5 X TBE和120V電壓下電泳40min，然後在0· 5 μ g/mL溴化乙錠染色液中染色lOmin，用紫 外透射儀觀察，具體實驗結果見圖3。
[0046] 本實施例的1 %瓊脂糖凝膠電泳實驗如圖3所示，利用本實施例mRT-PCR體系對8 個文心蘭葉片樣品進行檢測時，樣品1、6、7、8攜帶CyMV病毒，樣品5攜帶CyMV、BYMV兩種 病毒，樣品2、3、4攜帶CyMV、0RSV、BYMV3種病毒，得到擴增片段長度571bp、325bp和216bp 的三條明亮清晰的條帶，與單重PCR檢測結果一致，可見本發明檢測方法特異性好、檢測效 率高。
[0047] 本發明針對CyMV、ORSV和BYMV三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列，分別設 計合成了三對相應的特異性引物，並利用該三對特異性引物同時對文心蘭葉片中的CyMV、 ORSV和BYMV進行mRT-PCR反應，建立了一種新的PCR反應體系和反應程序，使mRT-PCR反 應得到了大小差異明顯，長度分別為571bp、325bp和212bp的三條CyMV、0RSV和BYMV的擴 增片段序列；本發明實現了一次反應就能同時檢測出3種文心蘭病毒即CyMV、0RSV和BYMV 的目標，因而本發明檢測效率高，本發明所用試劑為分子生物學常用試劑，所需成本低，且 即使樣本中3種文心蘭病毒的RNA含量很低，本發明也能檢測出來，因而本發明具有很高的 檢測靈敏度。
【權利要求】
1. 一種文心蘭病毒檢測引物，其特徵在於：具體包括如下三個引物對： 建蘭花葉病毒引物對：正向引物5' -GAAATCAAGGCCATAACCCA-3'，反向引物 5'-CCACACGCCTTATTAAGTTTG-3' ； 齒蘭環斑病毒引物對：正向引物5' -CTGATGTTTGGCAGCCGGTT-3'，反向引物 5' -GAAGAGGTCCAAGTAAGTCCAG-3'； 菜豆黃花葉病毒引物對：正向引物5' -AATGTTGGAACAGACGAGGAGA-3'，反向引物 5,-ACCCTGTCAGAGTAGAGAGAATGA-3,。
2. 根據權利要求1所述一文心蘭病毒檢測引物，其特徵在於：所述建蘭花葉病毒引物 對對建蘭花葉病毒PCR擴增出571bp的產物；所述齒蘭環斑病毒引物對對齒蘭環斑病毒 PCR擴增出325bp的產物；所述菜豆黃花葉病毒引物對對菜豆黃花葉病毒PCR擴增出212bp 的產物。
3. -種文心蘭病毒檢測方法，其特徵在於：根據建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒及菜豆 黃花葉病毒三種病毒的外殼蛋白基因的核苷酸序列分別設計合成出如權利要求1中所述 建蘭花葉病毒引物對、齒蘭環斑病毒引物對、菜豆黃花葉病毒引物對；然後建立mRT-PCR檢 測體系，並利用建蘭花葉病毒引物對對文心蘭葉片中的建蘭花葉病毒、齒蘭環斑病毒引物 對對文心蘭葉片中的齒蘭環斑病毒、菜豆黃花葉病毒引物對對文心蘭葉片中的菜豆黃花葉 病毒進行mRT-PCR反應，最後將反應產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳分析和克隆測序比對。
4. 根據權利要求3所述一種文心蘭病毒檢測方法，其特徵在於：所述mRT-PCR反應的 反應體系和反應程序如下： 反應體系：反應體系的總體積為25iiL，含有0. 15iiL 5U/iiL的Taq酶、2. 5iiL的 10父了&9酶1311打61'、21112.5臟〇1/1的（1階1^、11114莫板、0.2111濃度為1011111〇1/1的建 蘭花葉病毒正向引物、〇. 2 y L濃度為10 y mol/L的建蘭花葉病毒反向引物、0. 8 y L濃度為 10 ii mol/L的齒蘭環斑病毒引物正向引物、0? 8 ii L濃度為10 ii mol/L的齒蘭環斑病毒反向 引物、0? 8 y L濃度為10 y mol/L的菜豆黃花葉病毒正向引物、0? 8 y L濃度為10 y mol/L的 菜豆黃花葉病毒反向引物，其餘成分為滅菌雙蒸水； 反應程序：94°C預變性5min ;94°C變性30s，48-60°C退火30s，72°C延伸45s，循環35 次；72°C延伸10min ;4°C終止反應。
【文檔編號】C12N15/11GK104372108SQ201410591218
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年10月29日 優先權日:2014年10月29日
【發明者】黃敏玲, 樊榮輝, 鍾淮欽, 葉秀仙, 羅遠華, 吳建設, 林兵 申請人:福建省農業科學院作物研究所