中華蜜蜂AccCDK5基因及AccCDK5r1基因及其應用的製作方法

2023-12-02 00:27:32

本發明涉及分子生物學和生物技術領域，具體涉及中華蜜蜂AccCDK5基因及其AccCDK5r1基因的克隆、重組載體的構建，並首次在中華蜜蜂中驗證了AccCDK5及其激活子AccCDK5r1的互作關係，提供了AccCDK5重組蛋白體外的抗氧化能力定性研究方法。

背景技術：

細胞周期蛋白依賴性激酶-5(cyclin-dependent kinase-5,CDK5)是一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,屬於細胞周期蛋白依賴性激酶家族CDKs。近年來的研究表明，在哺乳動物中，CDK5並不參與細胞周期的調控，而是主要在神經系統中發揮作用，參與神經元遷移、肌動蛋白的運動、微管運輸及其穩定性、細胞粘附、軸突導向、突觸結構可塑性、肌細胞生成和膜運輸等多種細胞活動。CDK5的功能失調和異常分布會導致神經系統障礙，並有可能導致神經退行性疾病。

非周期蛋白素蛋白p35、p39是CDK5的兩個激活子，特異地分布在中樞神經系統中，因此CDK5的激酶活性的激活主要局限於神經系統中。p35具有膜錨定信號基序,從而使CDK5/p35錨定於膜上發揮作用。p35不穩定，半衰期只有20-30min，可通過泛素化途徑被降解失活。此外，p35可在神經性毒性刺激的條件下裂解為p25，p25與p35都具有激活CDK5的能力，不同的是p25缺少膜錨定信號基序，從而導致CDK5/p25複合體定位發生改變，同時由於p25的半衰期要比p35長很多，致使CDK5/p25無節制地磷酸化其下遊底物，最終導致一系列病理變化。此外，有文獻報導，H2O2誘導激活CDK5可以防止細胞在氧化脅迫中死亡。

目前對於CDK5及其激活子的研究大部分集中於哺乳動物的神經性病變、腫瘤發生等病理研究及其他基礎研究中，昆蟲中的相關研究少有報導，在中華蜜蜂中未見相關報導。

中華蜜蜂(Apis cerana cerana)屬於東方蜜蜂的一個亞種，有7000萬年進化史，是我國最具優勢、分布最廣的本土蜂種。長期的進化過程中，中華蜜蜂對我國的氣候、蜜源分布等生態環境產生了極強的適應性，具有善於利用零星蜜源植物、採集力強、抗蟎及抗病能力強等優點。

中華蜜蜂具有良好的經濟效益和重要的生態作用，然而由於近年來西方蜜蜂的引入、病蟲害以及毀林造田、濫施農藥、環境汙染等因素，使中華蜜蜂蜂群數量驟減，種群延續已經受到了極為嚴重的威脅。

技術實現要素：

本發明的發明人針對上述現有技術的情況，提供了中華蜜蜂AccCDK5基因基因在抗氧化過程中的作用及其應用，提供了兩個中華蜜蜂基因AccCDK5與AccCDK5r1的克隆及重組載體構建方法，並提供AccCDK5蛋白與AccCDK5r1蛋白互作的證據及AccCDK5重組蛋白體外的抗氧化能力定性研究方法，為中華蜜蜂優質新品種的選育提供一定的理論基礎，並為中華蜜蜂神經系統相關研究提供基礎。

本發明中，我們用常規方法從中華蜜蜂(Apis cerana cerana)中克隆得到AccCDK5基因及其AccCDK5r1基因，分析了兩個基因的結構域並進行了進化樹分析，標出了其保守結構域；構建了酵母雙雜交實驗相關載體，驗證了其相互作用關係；構建了AccCDK5的原核表達載體，用於誘導蛋白並進行了紙片擴散實驗，發現AccCDK5重組蛋白具有一定的抗氧化功能。本發明初步中華蜜蜂中AccCDK5與其激活子AccCDK5r1的互作關係，驗證了AccCDK5重組蛋白的抗氧化功能。

與現有技術相比，本發明首次查找並克隆得到AccCDK5r1，並首次證明了AccCDK5r1是p35在中華蜜蜂中的同源基因，豐富了蜜蜂神經系統的研究，為研究蜜蜂神經系統發育及神經性病變提供理論基礎，同時為研發蜜蜂神經疾病相關藥物提供靶點。

本發明的具體技術方案是：

發明人首先提供了中華蜜蜂AccCDK5基因和AccCDK5r1基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1與SEQ ID No.3所示，前述基因編碼的胺基酸序列如SEQ ID No.2與SEQ ID No.4所示；上述序列均來源於中華蜜蜂(Apis cerana cerana)，其中AccCDK5r1蛋白為AccCDK5蛋白的激活子。

本發明提供前述基因的選擇及克隆方法。具體為：

以中華蜜蜂基因組中的CDK5序列為參考，設計特異性引物，該引物對序列如SEQ ID No.5、SEQ ID No.6所示，利用PCR技術擴增獲得AccCDK5基因。以哺乳動物CDK5激活子p35、p39的胺基酸序列作為參考序列，使用本地blast(blast-2.3.0+)軟體檢索中華蜜蜂基因組，查找到一個未注釋的蛋白，命名為AccCDK5r1，設計特異性引物，該引物對序列如SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示，利用PCR技術擴增獲得AccCDK5r1基因。

將前述基因編碼的胺基酸序列在GenBank進行檢索並進行了序列比對分析和進化樹分析，發現AccCDK5、AccCDK5r1具有高度保守性，AccCDK5r1具有CDK5激活子所特有的結構域。

獲得上述基因序列後，將AccCDK5和AccCDK5r1的CDS序列分別與pGBKT7、pGADT7 AD載體連接，用於酵母雙雜交實驗，實驗證明兩者具有互作關係。將AccCDK5的CDS序列插入pET-30a(+)，構建原核表達載體，表達AccCDK5重組蛋白，用於紙片擴散實驗，結果發現AccCDK5重組蛋白在體外具有一定的抗氧化作用。

之所以採取上述方法，主要是為了初步驗證AccCDK5r1是AccCDK5的激活子，這樣就豐富蜜蜂神經系統的研究，為研究蜜蜂神經系統發育及神經性病變提供理論基礎，同時為研發蜜蜂神經疾病相關藥物提供靶點。探究AccCDK5重組蛋白的體外抗氧化功能，為今後蜜蜂的轉基因育種工作提供供選基因，從分子生物學角度為中華蜜蜂優質種群的選育提供基礎。

綜上所述，本發明提供了中華蜜蜂AccCDK5與AccCDK5r1基因，並初步證明兩者的相互作用關係，證明了AccCDK5重組蛋白的體外抗氧化功能，對研究中華蜜蜂抗逆分子生物學、蜜蜂神經系統的研究及中華蜜蜂優質蜂群選育有重要意義。

附圖說明

圖1為AccCDK5及AccCDK5r1CDS的PCR擴增電泳圖；

圖中A：AccCDK5的CDS片段；B：AccCDK5r1的CDS片段；Marker為DL 2000 DNA Maker，各條帶分別為2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；結果表明，擴增片段大小正確；

圖2為AccCDK5及AccCDK5r1的胺基酸序列與幾種其它CDK5及CDK5r1胺基酸序列的比較結果，其中相同的胺基酸用黑底表示，保守結構域用黑框標出；

圖中A:AccCDK5與其它CDK5的胺基酸序列比對結果；B:AccCDK5r1與其它幾種昆蟲CDK5r1的胺基酸序列比對結果；結果表明，AccCDK5在物種間具有較高保守性，AccCDK5r1在昆蟲中保守性很高，兩個基因均具有各自的保守結構域；

圖3為AccCDK5及AccCDK5r1的進化樹臨近法分析結果示意圖；

圖中AccCDK5及AccCDK5r1用方框標出，其中A:AccCDK5進化樹分析結果；B：AccCDK5r1與進化樹分析結果；結果表明，這兩個基因與義大利蜜蜂中的對應基因進化關係最近；

圖4為AccCDK5及AccCDK5r1的酵母雙雜交實驗結果；

圖中A：AccCDK5-BD自激活檢測；B:AccCDK5-BD毒性檢測；C:酵母雙雜交實驗。結果表明，AccCDK5-BD無毒性，無自激活現象，AccCDK5與AccCDK5r1互作。

圖5為紙片擴散實驗：過氧化氫異丙苯處理條件下的紙片擴散實驗結果示意圖；

圖中序號1為滅菌ddH2O對照，序號2-5濃度依次增大；結果表明，AccCDK5重組蛋白具有抗氧化功能。

具體實施方式

以下實施例中進一步定義本發明，根據以上的描述和這些實施例，本領域技術人員可以確定本發明的基本特徵，並且在不偏離本發明精神和範圍的情況下，可以對本發明作出各種改變和修改，以使其適用各種用途和條件。除特殊註明外，本發明所採用的均為本領域現有技術。

實施例1：華蜜蜂AccCDK5及AccCDK5r1基因的克隆

以中華蜜蜂cDNA為模板，用正向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.5所示)和反向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.6所示)擴增AccCDK5片段，反應程序如下:94℃預變性10min→(94℃40s，52℃40s)×35cycles→72℃1min→72℃10min。

以哺乳動物CDK5激活子p35、p39的胺基酸序列作為參考序列，設計AccCDK5r1特異性引物以中華蜜蜂cDNA為模板，用上述設計獲得的正向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.7所示)和反向引物(其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.8所示)擴增AccCDK5r1片段，反應程序如下:

94℃預變性10min→(94℃40s，55℃40s)×35cycles→72℃1min→72℃10min。

上述PCR反應結束後，1.0％瓊脂糖凝膠電泳電泳檢測PCR產物並回收正確片段(如圖1所示)，與載體pEASY-T1 simple連接後測序驗證。

得到的中華蜜蜂AccCDK5基因和AccCDK5r1基因其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1與SEQ ID No.3所示，前述基因編碼的胺基酸序列如SEQ ID No.2與SEQ ID No.4所示，將前述基因編碼的胺基酸序列在GenBank進行檢索並使用DNAman軟體進行了序列比對分析(如圖2所示)，利用MEGA軟體了進化樹分析(如圖3所示)，結果表明AccCDK5、AccCDK5r1具有較高的保守性，並與義大利蜜蜂的CDK5、CDK5r1進化關係最近。

實施例2：重組載體構建

得到AccCDK5及AccCDK5r1基因的核苷酸序列後，首先構建了酵母雙雜交實驗所需重組載體和AccCDK5原核表達載體：

首先構建了AccCDK5-BD重組載體：以上述測序正確的質粒為模板，用正向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.9所示(5′-CATATGATGCAAAAATATGAGAAACTCGAG-3′，劃線部分為Nde I酶切位點)和反向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.10所示(5′-GGATCCCTGACAACGATCGTTTTTAATGG-3′，劃線部分為BamH I酶切位點)擴增AccCDK5片段。

反應結束後，對PCR產物進行1.0％瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收並純化目的片段，與載體pEASY-T1 simple連接後測序驗證。將測序正確的質粒用Nde I和BamH I進行酶切，與經相同酶切的載體pGBKT7連接，連接產物轉化DH5α感受態細胞，選取陽性克隆提取質粒酶切驗證，至此AccCDK5-BD重組載體構建完成。

按照上述方法，用正向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.11所示(5′-GGATCCATGCAAAAATATGAGAAACTCGAG-3′，劃線部分為BamH I酶切位點)和反向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.12所示(5′-GTCGACCTGACAACGATCGTTTTTAATGG-3′，劃線部分為Sal I酶切位點)擴增片段，pET-30a(+)連接與構建了AccCDK5原核表達載體；

用正向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.13所示(5′-CATATGATGGGTACCGTGTTGTCGTTC-3′，劃線部分為Nde I酶切位點)和反向引物，其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.14所示(5′-GAGCTCAGCCGCCTTGGTGGGTAC-3′，劃線部分為Sac I酶切位點)擴增AccCDK5r1片段，與pGADT7 AD載體連接，構建了AccCDK5r1-AD重組載體。

實施例3：酵雙雜交實驗

本發明酵母雙雜交採用Matchmaker GoldYeast Two-Hybrid System，本實驗共分為三個部分。

首先進行了AccCDK5-BD重組載體自激活檢測。分別將轉入pGBKT7空載體，AccCDK5-BD重組載體的酵母菌共同塗布於SD/-Trp/-His固體培養基與SD/-Trp/-Ade固體培養基，結果表明都不生長，證明AccCDK5-BD重組載體無自激活現象(如圖4A所示)。

然後進行了AccCDK5-BD重組載體毒性檢測。將分別將轉入pGBKT7空載體，AccCDK5-BD重組載體的酵母感受態細胞共同塗布於SD/-Trp固體培養基，結果表明兩者長勢相同，證明AccCDK5-BD重組載體無毒性(如圖4B所示)。

在確定AccCDK5-BD重組載體無毒性和自激活後，進行了AccCDK5與AccCDK5r1蛋白相互作用的檢測。結果表明轉化AccCDK5-BD與AccCDK5r1-AD重組載體的酵母感受態在SD/Leu/-Trp與SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp固體培養基上均可生長，將陽性菌落在含有X-α-gal的SD/Ade/-His/-Leu/-Trp固體培養基，進行第二次篩選，進一步確認了AccCDK5與AccCDK5r1互作(如圖4C所示)。

此過程中的陽性對照組合為pGBKT7-53+pGADT7-T，陰性對照為pGBKT7-lam+pGADT7-T。

實施例4：AcCDK5重組蛋白的原核表達

將實施例2中構建好的AccCDK5-pET-30a(+)原核表達載體轉化Trans BL21(DE3)化學感受態細胞，鑑定出陽性克隆後在IPTG終濃度為75μg/mL、28℃條件下誘導蛋白，取未加IPTG的菌液作為對照。誘導完成後離心，將上清去除乾淨後加入蛋白上樣緩衝液，混勻後煮沸10min，蛋白變性後用12％的SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)進行檢測。結果表明，在此誘導條件下，AccCDK5重組蛋白誘導成功，可以進行紙片擴散實驗。

實施例5：AccCDK5重組蛋白抗氧化能力分析

本研究利用紙片擴散實驗在大腸桿菌中表達AccCDK5重組蛋白來檢測AccCDK5蛋白在體外的功能，以轉化pET-30a(+)空載的大腸桿菌作為對照。

分別轉化有AccCDK5-pET-30a(+)重組載體與pET-30a(+)空載體的Trans BL21(DE3)細胞塗布於含卡那黴素(50mg/L)的LB固體培養基上培養(細胞數約為5×108)，37℃靜置1h後將濾紙片(直徑7mm)貼於培養基上，在濾紙片上分別滴加3μl不同濃度的過氧化氫異丙苯，以滅菌ddH2O作為對照。37℃倒置培養24h，觀察抑菌圈大小。

紙片擴散實驗實驗結果表明(如圖5所示)，AccCDK5重組蛋白提高了大腸桿菌抗氧化的能力。

山東農業大學

中華蜜蜂AccCDK5基因及AccCDK5r1基因及其應用

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中華蜜蜂

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Val Phe Ile Tyr Met Leu Val Arg Glu Leu Val Asp Gly Asp Glu Ala

245 250 255

Ser Glu Arg Glu Leu Gln Ala Thr Val Leu Thr Cys Leu Tyr Leu Ser

260 265 270

Tyr Ser Tyr Met Gly Asn Glu Ile Ser Tyr Pro Leu Lys Pro Phe Leu

275 280 285

Ile Glu Asp Ser Lys Asp Lys Phe Trp Asp Arg Cys Leu Leu Ile Val

290 295 300

Asn Arg Leu Ser Ser Glu Met Leu Arg Ile Asn Ser Glu Pro Gly Phe

305 310 315 320

Phe Thr Glu Val Phe Thr Glu Leu Lys Ala Cys Gly Ala Gly Asp Arg

325 330 335

Gly Ser Leu Pro Gly Thr Gly Leu Glu Arg Ser Leu Val Val Ser Gly

340 345 350

Val Ala Val Pro Thr Lys Ala Ala

355 360

5

25

DNA

人工序列

5

cgctaaccac ttttcattat tccgc 25

6

19

DNA

人工序列

6

ggtcgttgca ctactcgcg 19

7

20

DNA

人工序列

7

gccaccacca ccgcctcaac 20

8

21

DNA

人工序列

8

cgaggtcgat gcggaggggt c 21

9

30

DNA

人工序列

9

catatgatgc aaaaatatga gaaactcgag 30

10

29

DNA

人工序列

10

ggatccctga caacgatcgt ttttaatgg 29

11

30

DNA

人工序列

11

ggatccatgc aaaaatatga gaaactcgag 30

12

29

DNA

人工序列

12

gtcgacctga caacgatcgt ttttaatgg 29

13

27

DNA

人工序列

13

catatgatgg gtaccgtgtt gtcgttc 27

14

24

DNA

人工序列

14

gagctcagcc gccttggtgg gtac 24