鈉鉀atp酶dr區特異性抗體製備方法及其治療腎臟缺血再灌注損傷中的藥物作用的製作方法

2023-12-10 01:44:26 1

專利名稱：鈉鉀atp酶dr區特異性抗體製備方法及其治療腎臟缺血再灌注損傷中的藥物作用的製作方法
技術領域：
本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及腎臟缺血再灌注的生物醫藥領域。
背景技術：
缺血再灌注損傷是移植器官早期無功能及長期存活的主要因素機體組織器官正常代謝、功能的維持，有賴良好的血液循環。各種原因造成的局部組織器官的缺血，常常使組織細胞發生缺血性損傷。缺血後再灌注具有兩重性，多數情況下，缺血後再灌注使組織、器官功能得到恢復，損傷的結構得到修復。但是有時缺血後再灌注，不僅不能使組織、器官功能恢復，反而加重組織、器官的功能障礙和結構的損傷，這種現象稱為缺血再灌注損傷。該概念首先由詹尼斯於1960年提出。缺血再灌注損傷在許多重要器官包括心、肝、肺、腎、胃腸道等均可發生。腎臟為高灌注器官，對缺血及缺血再灌注均敏感，心臟也是高灌注器官，但是心臟和腎臟在人體的功能不一樣，心肌細胞和腎小管上皮細胞的功能以及細胞內代謝過程有很大區別，目前的研究中在這兩種臟器之間轉用的難度非常大，心臟移植以及腎臟移植有很大的區別，心臟移植的排斥反應遠比腎臟移植少。腎缺血再灌注損傷是缺血性急性腎功能衰竭的重要損傷環節，也是腎移植中影響移植腎早期功能恢復及長期存活的主要因素。腎缺血再灌注損傷損傷的病理生理機制非常複雜，至今尚未徹底闡明。已知至少有3種因素參與活性氧、中性粒細胞、補體系統。此外，活化的內皮細胞所產生的黏附分子、細胞因子、 血小板活化因子、白介素、P選擇素、內皮素等在腎缺血再灌注損傷中也發揮著重要作用。目前防治腎缺血再灌注損傷的措施雖功不可沒，但急需改進迄今為止，對於缺血/再灌注損傷的研究，絕大部分是在實驗動物身上進行的，然而這些實驗資料卻已經為缺血再灌注損傷的臨床防治提供了重要的啟示和借鑑，為臨床研究奠定了重要的基礎。目前，值得臨床上參考的防治措施有1.儘早恢復血流，儘量減少缺血時間。2.注意再灌注時的低流、低壓、低溫。低流低壓的意義在於使灌注氧的供應不至突然增加而引起大量氧自由基的形成；低溫則是使缺血器官代謝降低，代謝產物聚積減少。 3.改善缺血組織的代謝。缺血組織有氧代謝代下，酵解過程增強，因而補充糖酵解底物如磷酸己糖有保護缺血組織的作用；外源性三磷酸腺苷(ATP)作用於細胞表面與ATP受體結合， 或使細胞膜蛋白磷酸化，有利於細胞膜功能恢復，並可穿過細胞膜進入細胞直接供能；針對缺血時線粒體損傷所致的氧化磷酸化受阻，可以應用氫醌、細胞色素C等進行治療，以加強煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)-黃素蛋白-細胞色素鏈的功能，延長缺血組織的可逆性改變期限。實驗證明，細胞色素C能增加線粒體的二磷酸腺苷(ADP)磷酯化；醌類化合物則能加速電子傳遞或將電子直接傳遞給氫。4.清除自由基。實驗證明，外源性超氧化物歧化酶 (SOD)、黃嘌呤氧化酶抑制劑別嘌呤醇(allopurinol)、維生素E、維生素C、過氧化氫酶、二甲基亞碸(dimethyl sulfoxide, DMS0)等自由基清除劑對缺血/再灌注損傷的心肌有防護作用。例如，外源性SOD能顯著地降低缺血所致的血管通透性增高。預先用SOD給動物作靜脈內注射，然後進行腸管缺血實驗，則血管通透性無大變化。又如，在氧自由基中起主要作用的是繼發於02_的0H.。如預先用0H.清除劑DMSO處理腸管，可以明顯地減輕缺血所致的血管通透性增高。近年來，越來越多的研究發現，一些與細胞存活相關的激酶如Akt激酶，ERK激酶， PKC ε激酶等，在被激活的情況下可以對缺血再灌注損傷有一定的保護作用。有研究者發現缺血再灌注損傷可引起腎小管上皮細胞凋亡，Akt活性降低及GSK-3 β活性升高，影響半胱天冬酶3(CaSpaSe;3)依賴的外源性凋亡途徑可能是其凋亡機制之一。重組人紅細胞生成素 (rHuEPO)可通過增強Akt活性，降低GSK-3 β及半胱天冬酶3酶活性，減少細胞凋亡，對人腎小管上皮細胞系(ΗΚ-2)缺血再灌注損傷有一定的保護作用。本項目組在以往的工作中發現ERK激酶，PKCe激酶的活化對心肌細胞及神經母細胞瘤細胞(SH-SY5Y)的缺血再灌注損傷以及其它藥物導致的損傷有一定的保護作用。因此，開發活化細胞信號傳導通路中細胞存活相關激酶的生物製品藥物，來優化防治腎缺血再灌注損傷的措施具有非常廣闊的應用前景。鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體在缺血再灌注損傷中的保護作用鈉鉀ATP酶，又被稱為鈉鉀泵，幾乎分布於所有哺乳動物細胞膜上。主要由α和 β亞單位構成，主要通過對細胞內外鈉鉀離子濃度的調節，來維持細胞靜息電位，調節細胞體積等功能。近年來，很多不同的試驗室幾乎同時發現，鈉鉀ATP酶除了具有離子運輸的功能外，在心肌細胞內信號通路傳導中發揮著重要的作用。鈉鉀ATP酶通過傳遞哇巴因結合到細胞膜的信號來調控蛋白酪氨酸磷酸化，哇巴因觸發的蛋白磷酸化事件的下遊信號包括絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路的激活，線粒體活性氧(ROS)的產生以及磷脂酶 C(PLC)和三磷酸肌醇(IP； )的受體激活(ΙΡ3受體)。蛋白質相互作用在鈉鉀ATP酶介導的信號轉導中發揮著非常重要的作用。例如，鈉鉀ATP酶直接與非受體型酪氨酸激酶Src相互作用，形成信號受體複合物。Src激酶是由鈉鉀ATP酶所抑制的，而當哇巴因與鈉鉀ATP 酶結合，Src激酶的活化域被釋放然而激活。在此理論的基礎上，NaKtide, 一個從鈉鉀ATP 酶衍生的Src激酶的肽抑制劑，發展成為一個功能性哇巴因拮抗劑。鈉鉀ATP酶還與錨蛋白(ankyrin)，ΙΡ3受體，PI3K，PLC-y和絲切蛋白(cofilin)相互作用的。鈉鉀ATP酶α亞單位的第897DVEDSYGQQWTYEQR911的胺基酸，又稱為DR區域，是鈉鉀ATP酶的活化區域。然而，以上所有的現有技術具有如下缺陷1.鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體沒有具體的生產與製備方法，大大限制了其在醫療領域的應用，也為產業化造成了一定的阻礙，尤其是其藥用成份的作用，更是沒有得到驗證與開發；2.尚無人將其在治療腎臟缺血再灌注損傷中的保護機理與保護作用加以研究並揭示，因為不同臟器之間的構造與生理過程不一樣，因此可能會出現完全不同的情況，腎臟缺血再灌注中急需一種包含特異性抗體的生物保護製劑。為了行文方便，以下DR區特異性多抗(r-DRSAb)；人工合成的鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)耦合的DR區多肽肽鏈順序為SYGQ ；文中所述的各英文均為本領域公知常識，以下給出部分對照表。中英對照表
權利要求
1.鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體製備方法，其特徵在於包含鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體的製備與鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體的純化兩個步驟以單只大鼠為單位(1)鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體的製備A.初步免疫乳劑配置將人工合成的鑰孔蟲戚血藍蛋白(KLH)耦合的DR區多肽 ΙΟΟμ L(1 μ g/μ L)加 100 μ L 弗氏完全佐劑(Freunds complete adjuvant, FCA)充分混勻成乳劑QOO μ L)；B.初步免疫分別於大鼠背部靠後左右兩個部位皮下注射免疫；C.加強免疫乳劑的配置隨後加強免疫為50yL(0.5yg/yL-lyg/yL)的KLH耦合的DR區多肽免疫加弗氏不完全佐劑(Freunds incomplete adjuvant, FIA)充分混勻成乳劑 OOO μ L)；D.加強免疫進行三次以上的加強免疫，每隔7天免疫注射一次，免疫部位同上；Ε.檢測ELISA方法檢測抗體滴度，達到1 10000後進行步驟F，未達到的話繼續步驟D。F.保存備用-80°C -10°C的環境下進行保存，以備提純；(2)鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體的純化a採用蛋白UProtein L)抗體結合柱純化DR區特異性多抗，用磷酸鹽緩衝液以2 1 比例(ν/ν)稀釋免疫血清；b加入平衡好的ftOtein L抗體結合柱純化25-45min，經過洗滌後，用0. IM甘氨酸pH 3.0洗脫，迅速調節洗脫蛋白濃度至pH 8.0，過濾滅菌後濃縮，-80°C -20°C保存備用。
2.如權利要求1所述的鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體製備方法，其特徵在於所述步驟 (1)中C中50 μ LKLH耦合的DR區多肽免疫優選1 μ g/ μ L。
3.如權利要求1所述的鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體製備方法，其特徵在於所述步驟 (1)中F中保存溫度優選-80°C。
4.如權利要求1所述的鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體製備方法，其特徵在於所述步驟(1)中步驟B和D中所述的注射方式採用單邊注射、左右均量注射或者左右不均量注射。
5.如權利要求1所述的鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體製備方法，其特徵在於所述步驟(2)中步驟b中純化時間為30min。
6.如權利要求1所述的鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體製備方法，其特徵在於所述步驟 (2)中步驟b中保存備用的時間為-80°C。
7.如權利要求1-6任一所述的方法製造的鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體在製備治療腎臟缺血再灌注損傷的藥物中的作用。
全文摘要
本發明公開了鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體製備方法及其治療腎臟缺血再灌注損傷中的藥物作用，缺血再灌注損傷是移植器官早期無功能及長期存活的主要因素，目前防治腎缺血再灌注損傷的措施雖功不可沒，但急需改進，本發明通過大鼠鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體的製備以及純化，並控制相關參數，提供了鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體的具體的生產與製備方法與儲藏方法，驗證了其藥用成份的作用；在充分認識不同臟器生理差別的基礎上，明確鈉鉀ATP酶DR區特異性抗體(r-DRSAb)對腎缺血再灌注損傷的保護，大膽突破不同臟器細胞的不同的界限，取得了意想不到的技術效果，解決了人們長期以來期望解決，但是沒有解決的技術問題。
文檔編號C07K1/16GK102286102SQ201110219400
公開日2011年12月21日 申請日期2011年8月2日 優先權日2011年8月2日
發明者丁小明, 丁晨光, 侯軍, 馮新順, 李楊, 潘曉鳴, 燕航, 田曉輝, 田普訓, 薛武軍, 鄭瑾, 項和立 申請人:鄭瑾